3  Material und Methoden

Es wurden 122 PatientInnen, die zwischen 1982 und 1995 an einem Rezidiv einer akuten lymphoblastischen Leukämie erkrankten, in die Studie aufgenommen. Die DNA der Leukämiezellen (vorrangig durch Knochenmarkpunktion gewonnen) wurde zum Nachweis einer Rekombination des TEL- Gens untersucht. Ebenfalls untersucht wurden DNA- Proben von Ersterkrankungen, die hauptsächlich von PatientInnen, die in der pädiatrischen Hämatologie/ Onkologie der Charité Campus Virchow Klinikum und in der Kinderklinik des Klinikum Berlin Buch behandelt wurden, stammten. Die Proben der RezidivpatientInnen rekrutierten sich aus dem Material, das die an der multizentrischen Therapiestudie für ALL- Rezidive bei Kindern (ALL- REZ BFM) beteiligten Kliniken dem Labor der pädiatrischen Hämatologie/ Onkologie der Charité Campus Virchow Klinikum zuschickten.

Es wurden archivierte Nylonmembranen sowohl von Ersterkrankungen, als auch von Rezidiven vieler PatientInnen untersucht, die in der Routine des molekulargenetischen Labors für Southern Blot Hybridisierungen bis 1995 hergestellt wurden. Des weiteren wurden archivierte kryokonservierte DNA- Proben einer Southern Blot Analyse unterzogen, wenn keine archivierten Membranen vorlagen oder deren durch die Lagerung bedingter Zustand eine Rehybridisierung nicht mehr erlaubte. Es wurde ausschließlich Material vom Zeitpunkt der Diagnose berücksichtigt.

Die DNA- Isolierung der frisch aufgearbeiteten positiven und negativen Kontrollproben erfolgte nach der Methode der Firma Gentra Systems mit dem Puregene® DNA Isolation Kit. DNA- Proben ab 1993 wurden über „Qiagensäulen“ der Firma QIAgen gewonnen und die davor datierten DNA- Proben mittels der „Phenolchloroformmethode“, die hier beispielhaft für die Technik der DNA- Isolierung ausführlicher beschrieben werden soll.

Um die Erythrozyten selektiv zu lysieren wird Knochenmark mit dem 3- fachen Volumen Erythrozytenlysepuffer vermischt. Die Leukozyten werden nach der vollständigen Erythrozytenlyse 30 Minuten bei g= 265 (1200rpm) zentrifugiert. Das sedimentierte Leukozytenpellet wird in TEN- Puffer resuspendiert. Anschließend wird die Probe mit Proteinase K und 1/10 Vol 20% SDS versetzt und unter Bewegung bei 37°C für ca. 12 Stunden inkubiert. Die so durch die Auflösung der Kern- und Zellmembranen der Leukozyten freigesetzte DNA wird danach von den Zellproteinen durch Extraktion mit ½ Vol Phenol und ½ Vol Chloroform/ Isoamylalkohol für zehn Minuten gereinigt. Der durch die darauffolgende Zentrifugation (15 Minuten bei 5000rpm) sich bildende Überstand wird in ein neues Gefäß dekantiert und dieser Vorgang mehrmals wiederholt bis die Interphase keine Proteine mehr enthält. In der Probe verbleibende Reste von Phenol werden durch Extraktion mit ½ Vol Chloroform/Isoamylalkohol entfernt. Die Präzipitation der DNA erfolgt durch die Zugabe von 3 Vol absolutem Ethanol und 1/10 Vol 2M Natriumacetat. Anschließend folgt ein Waschgang mit 70%igem Ethanol. Mit unterschiedlicher Menge an Tris- Puffer wird die gewonnene DNA abschließend, je nach gewünschter Konzentration der Probe, gelöst. Die letztendliche Konzentration der DNA wird mittels UV- Spektrophotometer bestimmt indem eine Verdünnung der [Seite 25↓]jeweiligen DNA- Lösung in Aqua dest. hergestellt und die Absorption bei 260 nm (A₂₆₀) und 280°nm (A₂₈₀) gemessen wird.

Plasmide sind extrachromosomal vorkommende, ringförmige DNA- Moleküle. Das Einklonieren eines PCR- Produktes in einen vorgegebenen Klonierungsvektor (Insertion) – im vorliegenden Fall pCR 2,1- TA Cloning Vector - und das anschließende Einbringen dieses Plasmids in das Zytoplasma kompetenter E.coli- Stämme (Transfektion) ermöglicht die Vermehrung der Zielsequenz. Es erfolgt eine zweifache Selektion der Bakterienkolonien. Der Klonierungsvektor enthält die Gensequenz für Antibiotikaresistenz gegen Ampicillin und Kanamycin. Die Agarmedien für die Bakterienkolonien enthalten eines dieser beiden Antibiotika. Somit können sich nur diejenigen E.coli- Stämme, die das Plasmid enthalten und damit antibiotikaresistent sind, vermehren. Um Bakterienkolonien zu unterscheiden,die einen leeren Vektor oder einen mit dem zu klonierenden DNA- Produkt enthalten, enthält der Vektor die genetische Information der ersten 146 Aminosäuren des β- Galaktosidasgens. In dieser Sequenz liegt die Insertionsstelle für das zu klonierende DNA- Produkt (multiple cloning site). Solche Vektoren werden für Wirtszellen benutzt, welche für das carboxy- terminale Ende der β- Galaktosidase kodieren. In einem Prozess, der als α- Komplementierung bezeichnet wird, ergeben die Proteinfragmente des β- Galaktosidasegens sowie die der Wirtszelle ein enzymatisch aktives Enzym, welches in Anwesenheit von 5- bromo- 4- chloro- 3- indolyl- β- D- Galaktosidase zur Blaufärbung der Bakterienkolonien führt. Kommt es zu einer Insertion des zu klonierenden DNA- Produktes, so verhindert diese die α- Komplimentierung und die Bakterienkolonien erscheinen weiß.

Mit Hilfe des TOPO™ TA Cloning® Kits können cDNA- Fragmente innerhalb weniger Minuten in den Klonierungsvektor inseriert werden. Die Ligation zwischen dem Vektor und dem Insert wird durch die Transferase- Aktivität der Taq- Polymerase vermittelt. Sie fügt an das 3’- Ende des synthetisierten PCR- Produkts ein einzelnes Desoxyadenosin (A) an, welches dann kovalent mit dem am 3’- Ende des linearisierten Vektors befindlichen Desoxythymidin (T)- Restes bindet. Der verwendete pCR 2,1- TA Cloning Vector besitzt eine ColE1 origin zur Replikation von E. coli, einen versatilen Polylinker, Gene für die Ampicillin- und Kanamycin- Resistenz und ein lacZ- alpha- Komplement zur blau- weiß- Selektion der Transformanten. Die bakterielle Expression des lacZ- alpha- Fragmentes zur alpha- Komplementierung wird durch den lac- Promotor reguliert. Nachdem die Ligation des PCR- Produktes in den Vector in einem ersten Schritt durch die Integration in seinen versatilen Polylinker erfolgt, findet die Transformation von E. coli und die Selektion der transformierten Zellen auf LB- Agaroseplatten, die zuvor mit Ampicillin versetzt wurden, statt. Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Danach pickt man 10 weiße Kolonien und kultiviert wiederum über Nacht. Um zu überprüfen, ob es zur Transfektion gekommen ist, schließt sich eine Kontroll- PCR an.

	Abbildung 7: Vektorskizze.

Die Plasmid- DNA wird aus dem Zytoplasma, der in der Kontroll- PCR positiven Bakterienstämme, gewonnen. Dies geschieht mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit Protokolls.

Um die Spezifität des Verfahrens zu erhöhen, muss für die Digoxigenin- Markierung bei der Inkorporierung von Digoxigenin- 11- dUTP während der PCR eine möglichst reine Template- DNA eingesetzt werden, da verbleibende Vektorsequenzen (Plasmid) in der Ausgangs- DNA für die Sondenherstellung zu unspezifischen Hybridisierungssignalen führen können. Dafür wird das zuvor einklonierte TEL- Gen (Nukleotide 21387) aus dem Plasmid möglichst nah an den Primerbindungssequenzen mit dem Restriktionsenzym EcoRI, welches seine Schnittstellen direkt beiderseits der Topo- Cloning Region aufweist und auch keine Schnittstelle innerhalb des TEL- Gens hat, ausgeschnitten.

Tabelle 3: Herkunft und Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease EcoRI.

Nach dem Verdau wird die Probe über ein Agarosegel aufgetrennt, die sichtbare Bande ausgeschnitten und über den QIAquick Gel Extraction Kit aufgereinigt.

Die TEL- Sonde entspricht der TEL- cDNA von Nukleotid 487 bis 1072 (Exon 5 und 6). Sie hat eine Länge von 585bp. In diesem Abschnitt liegt keine Schnittstelle von BamHI. Es ist eine doppelsträngige DNA- Sonde, die mit 11- dUTP- Digoxigeninmarkiert ist. Das Nachweisprinzip wird im Zusammenhang mit der Southern Blot Untersuchung beschrieben.

Mittels der PCR - einer in vitro Nukleinsäuresynthese, die im Prinzip eine Nachahmung der in vivo DNA- Replikation darstellt - kann spezifisch der Abschnitt des TEL- Gens der cDNA auf ein Vielfaches amplifiziert und gleichzeitig nicht- radioaktiv markiert werden. Folgende Komponenten sind für die Amplifikation von DNA in der Polymerasekettenreaktion nötig: DNA, DNA- Polymerase, Primer (Oligonukleotide mit 15-30 Basen, die komplementär zu den Enden der definierten DNA- Sequenz sind, die amplifiziert werden soll) und ein Gemisch von dNTPs (Desoxyribonucleotidtriphosphate als Bausteine der zu synthetisierenden DNA), in dem 11- dUTP- Digoxigenin im Austausch zu TTP enthalten ist. Das Prinzip der Polymerasekettenreaktion ist eine vielfache Hintereinanderreihung dreier Reaktionen, die sich nur in ihrer Inkubationstemperatur unterscheiden. Im ersten Schritt wird die DNA denaturiert, so dass Einzelstränge vorliegen. Beim zweiten Schritt - auch Annealing genannt - lagern sich zugegebene Oligonukleotide (Primer) an die komplementären DNA- Sequenzen. Der dritte und letzte Schritt im Zyklus der PCR ist die Synthese eines komplementären DNA- Stranges durch die DNA- Polymerase. Das Enzym synthetisiert vom 3’-Ende der angelagerten Primer ausgehend einen zur Ursprungs- DNA komplementären DNA- Strang. In jedem weiteren Zyklus dienen die an der Ursprungs- DNA synthetisierten DNA- Stränge wiederum als Matrize zur weiteren Amplifikation von DNA durch die Polymerase. So kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung des zwischen den Primern gelegenen DNA- Abschnittes. Durch die Verwendung der hitzestabilen Polymerase aus dem Bakterium Thermophilus aquaticus ist die Automatisierung der Temperaturzyklen möglich, da nicht bei jeder Hitzedenaturierung der DNA das Enzym zerstört wird und anschließend neu hinzugefügt werden muss.

Um ein möglichst reines Ausgangsprodukt für die Hybridisierungssonde und damit eine erhöhte Spezifität und Effektivität zu erlangen, wird eine PCR in zwei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt (sogenannte nested- PCR). Im ersten PCR- Ansatz (externe PCR) wird das durch die Plasmidaufreinigung erhaltene Produkt – TEL Nukleotid 2 bis 1374 - in einer Verdünnung mit Aqua dest. von 1:2000 für die Sondenherstellung eingesetzt. Um die unspezifische Hybridisierung durch verschiedene PCR- Nebenprodukte ferner zu vermeiden, wird das Produkt der externen PCR wiederum erst nach einer 1:10000 Verdünnung in den zweiten Ansatz (interne PCR) eingesetzt, welche nur für Exon 5 und 6 des TEL- Gens von den Nukleotiden 487 bis 1072 amplifiziert. Dabei erfolgt die Digoxigenin- Markierung. In dem Schritt der internen PCR wird Digoxigenin- 11- dUTP im Austausch zu TTP in einem Verhältnis von 1:19 inkorporiert. Ein detection assay wird direkt an die PCR angeschlossen, um die labeling- Effizienz in der PCR zu überprüfen und damit die spätere Hybridisierungssensitivität abschätzen zu können. Die aufgeführte Tabelle Nr. 4 stellt einen Reaktionsansatz von 50µl der externen PCR dar und listet die einzelnen Reaktionsschritte mit Temperatur und Dauer auf.

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Tabelle 4: Externe PCR – Reagenzien auf 50µl und Amplifikationsbedingungen.

Die aufgeführte Tabelle Nr. 5 stellt einen Reaktionsansatz von 50µl der internen PCR dar und listet die einzelnen Reaktionsschritte mit Temperatur und Dauer auf.

Tabelle 5: Interne PCR – Reagenzien auf 50µl und Amplifikationsbedingungen.

Um zur RNA komplementäre DNA (cDNA) zu gewinnen, die dann in die PCR eingesetzt werden kann, wurde die RNA dem im folgenden angeführten Reaktionsansatz der reversen Transkription unterzogen.

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Tabelle 6: RT- PCR – Reagenzien eines Reaktionsansatzes von 20µl und Amplifikationsbedingungen.

Die Produkte aus der Sonden- PCR wurden mit 1/3 Volumen eines Gelladepuffers (Orange G) versetzt und in die Slots eines Agarosegels einpipettiert. Parallel dazu wurde ein DNA- Längenstandard aufgetragen (BIO- RAD, Precision Molecular Mass Standard), der die Größenzuordnung der im Gel aufgetrennten DNA- Fragmente erlaubte. Anschließend erfolgte die Konzentrationsbestimmung mittels des Molecular Analyst® (BIO- RAD). Bei der Agarosegelelektrophorese wandern DNA- Moleküle entsprechend ihrer Größe und Ladung in einem konstanten elektrischen Feld. Die Auftrennung erfolgt in einem 3%igen mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel bei 120 Volt über einen Zeitraum von ca. 30 Minuten. Durch den Zusatz von Ethidiumbromid werden die im Agarosegel aufgetrennten DNA- Fragmente auf dem UV- Transilluminator anschließend sichtbar. Die Dokumentation der Ergebnisse erfolgt mit einer Polaroidkamera.

Um die Sensitivität der hergestellten Sonde festzustellen, wurde eine Hybridisierungsanalyse der in der PCR hergestellten DIG- 11- dUTP markierten doppelsträngige cDNA- Sonde mittels einer Dot Blot Reaktion durchgeführt. Die Sonde hybridisiert zum sense und antisense Zielgen- Strang. Der erste Schritt bestand in der Prähybridisierung einer Verdünnungsreihe von TEL 487-1250 haltiger cDNA (10pg bis 0,01pg) auf einer Nylonmembran für 2 Stunden. Danach wurde mit der Zugabe der markierten DNA bei 65°C über Nacht hybridisiert. Anschließend wurde in zwei Waschgängen die unspezifisch gebundene DIG- 11- dUTP markierte DNA- Sonde beseitigt.

Waschschritte:

2 x mit „2 x Washing Solution“ (2 x SSC/ 0,1% SDS) für je 5 min bei Raumtemperatur

2 x mit „0,5 x Washing Solution“ (0,5 x SSC/ 0,1% SDS) für je 15 min bei 65°C

Es folgte die Detektion durch Chemolumineszenz wie sie im Abschnitt der Southern Blot Darstellung ausführlich beschrieben ist.

Um eine TEL- Genrekombination in der Southern Blot Analyse richtig beurteilen zu können, ist es nötig jeweils einen negativen und einen positiven Standard mit zu hybridisieren. Als negatives Kontrollmaterial wurde DNA aus Leukozyten gesunder SpenderInnen eingesetzt, und als TEL- AML1 positives Kontrollmaterial wurde DNA der Zellinie REH der humanen prä- B- Zell- ALL, deren nicht transloziertes TEL- Allel deletiert ist, zur Hybridisierung verwendet.

Bei einer Temperatur von 37°C und einem CO2 Gehalt von 5% wurden die Zellen der REH- Zellinie im RPMI 1640 Medium mit folgenden Zusätzen kultiviert:

10% FCS

20 mM Hepes

2 mM Glutamin

100 U/ml Penicillin

100 µg/ml Streptomycin

Zur Southern Blot Analyse wird die DNA als erstes durch eine Restriktionsendonuklease in handhabbare Fragmente geschnitten. Um Genveränderungen beurteilen zu können, dürfen keine Schnittpunkte im gewünschten Genabschnitt sein. Durch Verdau und Auftrennung der Fragmente über ein Agarosegel entsteht ein Schmier von Fragmenten (Restriction Smear).

Die DNA wurde dementsprechend mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten. 10µg DNA wurden mit bis zu 120 Units/µl des Restriktionsenzyms in geeigneten Restriktionspuffern inkubiert.

Tabelle 7: Herkunft und Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease BamHI.

Zur Überprüfung des Verdaues wurde die geschnittene PatientInnen DNA mit einem Gelladepuffer versetzt und in ein 0,6%iges mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel pipettiert. Die Auftrennung erfolgte über 2,5 Stunden bei 70 Volt. Bei unvollständigem Verdau wurde unter Zusatz von BamHI für weitere ca. 6 Stunden inkubiert.

Nach dem vollständigen Verdau wurde die geschnittene PatientInnen DNA mit ½ Volumen eines Gelladepuffers versetzt und in ein 0,6%iges mit Ethidiumbromid versetztes Agarosegel pipettiert. Zur Bestimmung der germline- DNA- Konfiguration wurde parallel eine verdaute Buffy Coat- Probe aufgetragen und als Positivkontrolle, Zellen der REH- Zellinie. Zusätzlich wurde ein DNA- Längenstandard (λ- DNA/ HindIII) aufgetragen, der die Größenzuordnung der aufgetrennten DNA- Fragmente erlaubte. Die Auftrennung erfolgte über Nacht bei 4°C und 40 Volt. Die Dokumentation der DNA Restriktionsmuster erfolgte auf dem UV- Transilluminator bei 254nm mittels einer [Seite 31↓]Polaroidkamera.

Entsprechend der 1975 von Southern beschriebenen Methode ist es möglich über eine spezifische Sonde, im vorliegenden Fall die Digoxigenin- markierte TEL- Sonde, eine korrespondierende Gen- Sequenz zu finden.[137] Die Darstellung der Fragmente ist aber nicht direkt auf dem Agarosegel möglich. Es ist vielmehr ein Medium nötig, auf dem die Hybridisierungsreaktion stattfinden kann. Deshalb wird die doppelsträngige DNA, nachdem sie über das Gel aufgetrennt worden ist, anschließend für 30 Minuten in 0,25 M HCl bei Raumtemperatur depuriniert, 30 Minuten in einer 0,5M NaOH- Lösung denaturiert und anschließend für wiederum 30 Minuten in einer 1,5 M NaCl- Lösung neutralisiert, um die dadurch vorliegenden einzelsträngigen Fragmente vom Gel auf eine Nylonmembran transferieren zu können. Das Gel wird auf ein Filterpapier (Whatmann 3MM Papier), das durch hochkonzentrierte Salzlösung (20 x SSC) getränkt wird, gelegt. Auf das Gel wird anschließend die Nylonmembran (bei den neu hergestellten Membranen handelte es sich um positiv geladene Nylonmembranen) und darüber saugfähiges trockenes Papier gelegt und das Ganze mit etwas Druck beschwert. Die Salzlösung wird durch das trockene Papier angezogen. Dabei gelangt sie erst durch das Gel und dann an die Nylonmembran. Die DNA steigt mit der Salzlösung auf, wird aber durch die Nylonmembran aufgehalten und bleibt so in der gleichen Konfiguration wie sie im Gel bestand an der Membran haften. Die Bindung der DNA durch die Nylonmembran hängt u.a. vom quantitativen Salzgehalt der Transportlösung ab. Der Transfer der DNA auf die Nylonmembran wurde entsprechend dem Aufbau von Southern durchgeführt (siehe Abbildung Nr. 8). Nach einer Transferzeit von maximal 24 Stunden wurde die DNA durch 15- minütiges Trocknen bei 80°C und anschließendem Auto- Crosslinken (Stratolinker von Stratagene) von beiden Seiten kovalent an die Membran gebunden und danach kurz in 2 x SSC gewaschen. Die so an der Nylonmembran fixierte und immobilisierte DNA kann nun mit einer spezifischen, im vorliegenden Fall mit einer nicht- radioaktiven, Sonde hybridisiert werden. Nur die Fragmente, die komplementär zu einer genauen Sonde sind, werden mit ihr hybridisieren. In der vorliegenden Arbeit wurde die Sonde über Antikörperbindung und Chemolumineszenz sichtbar gemacht. Jede komplementäre Sequenz erscheint mit einer markierten Bande an der bestimmten Position der Größe des jeweiligen DNA- Fragmentes. Die Trennmuster der DNA- Fragmente im Gel bleiben erhalten, so dass der Filter eine exakte Replik des ursprünglichen Gels darstellt.

	Abbildung 8: Veranschaulichung der Southern Blot Analyse.

Der wie beschrieben vorbereitete Filter wird anschließend bei 38°C für 4 Stunden mit der DNA- Seite nach innen zeigend in einem Hybridisierungsgefäß prähybridisiert, wobei der hohe Salzgehalt aus der Membran gewaschen wird, der von dem Southern Blot Prozess noch übrig ist und die unspezifischen Bindungen werden mittels Salmon sperm- DNA abgesättigt. Anschließend erfolgt eine Hybridisierung mit der bei 95°C denaturierten markierten Sonde für mindestens acht Stunden bei 41°C. Die formamidhaltige Hybridisierungslösung wird dekantiert und die unspezifisch gebundene Sonde durch folgende Waschvorgänge entfernt:
3 x mit „2 x Washing Solution“ (2 x SSC/ 0,1% SDS) für je 5 min bei RT

3 x mit „0,5 x Washing Solution“ (0,5 x SSC/ 0,5% SDS) für je 15 min bei 65°C

Für die nicht- radioaktive Darstellung durch Chemolumineszenz erfolgen anschließend weitere Wasch- und Blockschritte für die spezifische Antikörperbindung nach einer verifizierten Methode der Non- Radioactiv Digoxigenin Chemiluminescent Detection von Roche Diagnostics/ Boehringer Mannheim, auf die im folgenden näher eingegangen wird.
Die Abbildung Nr. 9 stellt schematisch das Prinzip der Chemiluminescent Detection (Chemolumineszenz Reaktion) mit Digoxigenin (DIG), der anti- Digoxigenin Alkalischen Phosphatase (anti- DIG- AP) als gebundenes anti- DIG- Antikörperkonjugat und CDP- Star ™ dar.

	Abbildung 9: Prinzip der 11- UTP- Digoxigenin Chemolumineszenz Markierung.

Der Filter wird nach den sich direkt an die Hybridisierung anschließenden Waschschritten für eine Minute in Washing Buffer equilibriert. Anschließend wird der Filter für circa eine Stunde mit einer Blocking Solution bei Raumtemperatur behandelt, um unspezifische Bindungen des Antikörpers an die Membran zu verhindern. Danach wird die Membran in einer 1:10000 Blocking Solution enthaltenden Verdünnung des Anti- Digoxigenins, Fab- fragments, welches mit Alkalischer Phosphatase konjugiert ist, für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung mit dem Antikörper wird verworfen und es folgen zwei Waschschritte für jeweils 15 Minuten mit dem Washing Buffer bevor der Filter für drei Minuten in einem Detection Buffer equilibriert wird. Bis das Chemolumineszenzsubstrat hinzugegeben wird, muss der Filter feucht bleiben und wird deshalb zwischen zwei Klarsichtfolien gelegt. Solange der Filter feucht bleibt, kann das Chemolumineszenzsubstrat CDP- Star™ in einer Konzentration von 1µl:1000µl Detection Buffer appliziert werden. Die Darstellung erfolgt durch die Belichtung von Röntgenfilmen in Röntgenkassetten. Je nachdem, ob es sich um eine Rehybridisierung alter Filter handelte oder um eine erstmalige Hybridisierung, betrug die Dauer der Exposition zwischen zehn Minuten bis maximal sechs Stunden. Zur Entfernung der hybridisierten TEL- Sonde wurden die Nylonfilter mit kochender 0,1 x SSC Lösung inkubiert und bis zur Abkühlung auf Raumtemperatur gewaschen. Dies ermöglicht konsekutive Hybridisierungen der Nylonmembran.

Um die durch die Southern Blot Analyse erhaltenen Ergebnisse mit einer weiteren Methode zu überprüfen, wurden mit der bereits für den Routinenachweis der [Seite 34↓]Translokation t(12;21) im molekulargenetischen Labor der pädiatrischen Hämatologie/ Onkologie der Charité Campus Virchow Klinikum zur Verfügung stehenden nested- PCR 30 RNA PatientInnenproben untersucht.

Das Prinzip entspricht methodisch dem in Abschnitt 3.2.4. zur TEL- Sondenherstellung bereits dargestellten. Im ersten (externen) PCR- Ansatz wurden die Primer TELext. und AMLext. verwendet und als Primer für die ABL- Kontrolle up ABL und ABLext.. Im zweiten (internen) PCR- Ansatz wurden die Primer TELint. und AMLint.verwendet und als Primer für die ABL- Kontrolle up ABLint. und ABLint.

Tabelle 8: Externe PCR – Reagenzien. Interne PCR – Reagenzien.

Tabelle 9: Amplifikationsbedingungen für externe und interne PCR.

Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm SPSS Version 7,5.

Methoden: Life- Table- Analyse nach Kaplan Meier; Exakttest nach Fischer; Rangsummentest nach Wilcoxon; univariante Analyse

Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden:

• Dextran Sulfat
  Biometra, Göttingen:
• Hybridisierungsnetze
  Fluka Biochemika, Buchs:
• Skim Milk Powder
  FMC, BioProducts, Rockland, USA:
• NuSieve GTG Agarose
• SeaKem GTG Agarose
  Herbeta- Arzneimittel, Berlin:
• Ethanol 100%
  Merck, Darmstadt:
• Formamid (HCONH₂)
• Natriumhydroxid (NaOH)
• Natriumthiosulfat
• 2- Propanol
  NEN Life Science Products, Zaventem:
• Renaissance enhanced luminol Western Blot Chemiluminiscence Reagent
  Nucleon Scotlab:
• Sodium Perchlorat
  Oncor Appligene, Heidelberg:
• Positive- HCD TM Nylon- Membran
  Pall, Portsmouth, England:
• Biodyne a transfer Membran
  Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden:
• Dimethyldichlorsilane Solution
  Roche Diagnostics GmbH, Mannheim:
• Anti- Digoxigenin- AP und DOP fab frabments
• CDP- Star™
• DIG DNA Labeling Mixture
• DNA Labeling and Detection kit
  Serva, Feinbiochemika, Heidelberg
• Ethidiumbromid, reinst.
  Sigma- Aldrich Chemie, Steinheim:
• BSA
• SDS[Seite 36↓]
• Tris Base (TRIZMA®)
• Maleic Acid
  Schleicher & Schüll Inc., Keene, USA:
• Sheets

Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA:

• Precision Molecular Mass Standard
  Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim:
• Desoxynucleoside Triphosphate Set
• DNA- Längenstandard
• λ-DNA/ HindIII Fragmente (kB: 23.1, 9.4, 6.7, 4.4, 2.3, 2.0, 0.6)
• λ-DNA/ SmaI Fragmente (kB: 19.3, 12.2, 8.6, 8.2)
  BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, USA:
• 1 Kb DNA Ladder
  TIB Molbiol, Berlin:
• Oligonukleotide (Primer)

Amersham International, Buckinghamshire, England:

• EcoRV, SacI
  Boehringer GmbH, Mannheim
• BamHI
  Gibco BRL Life Technologies, Paisley, Schottland:
• Super Script Reverse Transcriptase
  New England Biolabs, Schwalbach:
• Eco RI
• Hind III
  Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA, USA:
• AmpliTaq® DNA- Polymerase
• Ampli Taq Gold

Invitrogen, Renfrewshire, Scotland, GB:

• TOPO™ TA Cloning® Kits
  Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA:
• QIAprep Spin Miniprep Kit

Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA:

• QIAquick Gel Extraction Kit (50)[Seite 37↓]
• QIAquick PCR Purification Kit (50)

Biochrom KG, Berlin:

• RPMI 1640 Medium: Seromed®

Gentra Systems, Minneapolis, USA:

• Puregene® DNA Isolation Kit.
  Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA:
• QIAquick, DNA Puirification System
  Phenolchlorophormmethode:
• TEN- Puffer
• Proteinase K
• 20% SDS
• Phenol
• Chloroform/Isoamylalkohol
• Ethanol
• Natriumacetat
• Tris- Puffer

Du Pont de Nemours & Co. (Inc.), Wimington, Delaware, USA:

• Cronex medical x- ray film
  Polaroid Co., Cambridge, Mass. USA:
• Land Pack Filme Typ 667 (36DIN)

Elektrophorese- Puffer:

• 1x TAE, pH 8,0

• Aqua dest. ad 5000ml
• 1x Gelladepuffer (Orange G):

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• Ethidiumbromid: = 0,5 µg/ml EtBr in Aqua dest.

Depurinierungslösung.: HCl 0,2M

Denaturierungslösung.: NaOH 0,5M + NaCl 1,5M

Neutralisierungslösung.: Trisamoniummethan (C4H11NO3) 0,5M + NaCl 3M pH 7,5

20 x SSC Stock Solution: 3M NaCl + 0,3 M NaCitrat (tri- Natriumcitrat- Dihydrat) pH 7,0

10% SDS pH 7,2

2 x SSC Washing Solution: 2 x SSC + 0,1% SDS

0,5 x SSC Washing Solution: 2 x SSC + 0,5% SDS

Hybridisierungslösung:

• 10 x Denhardts
• 10g Dextransulfat
• 0,1% SDS (10ml 10% SDS)
• 3x SSC
• 50 µg/µl Salmon-DNA
• 100 x Denhardts:2% Ficoll Typ 400
• 2% BSA
• 2% Polyvinylpyrrolidon Typ 360

Maleinsäure Puffer: 0,1M Maleinsäure und 0,15M NaCl und pH 7,5

Blocking Reagent Stock Solution

Washing Buffer: Maleinsäure Puffer + Tween20

Detection Buffer: 100mM TrisHCl und 100mM NaCl

Quiagen GmbH, Hilden:

• Rnaeasy Kit™

Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA:

• Wide Mini Sub Cell (Agarosegelelektrophoresekammer)
  DNA Engine™ PTC- 200 (MJ Research, Inc.) Watertown, MA, USA
  Eppendorf GmbH, Hamburg:
• Centrifuge 5415 C
  Polaroid Co., Cambridge, Mass. USA:
• CU- 5 Nahaufnahme- Kamera
  Biochrom KG, Berlin:[Seite 39↓]
• Seromed®
  Stratagene, La Jolla, CA, USA:
• Stratalinker 1800

Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA:

• Molecular Analyst

SPSS Version 7,5 (Windows)