Molekularbiologische Arbeitstechniken DNA- Isolierung

Die DNA- Isolierung der frisch aufgearbeiteten positiven und negativen Kontrollproben erfolgte nach der Methode der Firma Gentra Systems mit dem Puregene® DNA Isolation Kit. DNA- Proben ab 1993 wurden über „Qiagensäulen“ der Firma QIAgen gewonnen und die davor datierten DNA- Proben mittels der „Phenolchloroformmethode“, die hier beispielhaft für die Technik der DNA- Isolierung ausführlicher beschrieben werden soll.

Um die Erythrozyten selektiv zu lysieren wird Knochenmark mit dem 3- fachen Volumen Erythrozytenlysepuffer vermischt. Die Leukozyten werden nach der vollständigen Erythrozytenlyse 30 Minuten bei g= 265 (1200rpm) zentrifugiert. Das sedimentierte Leukozytenpellet wird in TEN- Puffer resuspendiert. Anschließend wird die Probe mit Proteinase K und 1/10 Vol 20% SDS versetzt und unter Bewegung bei 37°C für ca. 12 Stunden inkubiert. Die so durch die Auflösung der Kern- und Zellmembranen der Leukozyten freigesetzte DNA wird danach von den Zellproteinen durch Extraktion mit ½ Vol Phenol und ½ Vol Chloroform/ Isoamylalkohol für zehn Minuten gereinigt. Der durch die darauffolgende Zentrifugation (15 Minuten bei 5000rpm) sich bildende Überstand wird in ein neues Gefäß dekantiert und dieser Vorgang mehrmals wiederholt bis die Interphase keine Proteine mehr enthält. In der Probe verbleibende Reste von Phenol werden durch Extraktion mit ½ Vol Chloroform/Isoamylalkohol entfernt. Die Präzipitation der DNA erfolgt durch die Zugabe von 3 Vol absolutem Ethanol und 1/10 Vol 2M Natriumacetat. Anschließend folgt ein Waschgang mit 70%igem Ethanol. Mit unterschiedlicher Menge an Tris- Puffer wird die gewonnene DNA abschließend, je nach gewünschter Konzentration der Probe, gelöst. Die letztendliche Konzentration der DNA wird mittels UV- Spektrophotometer bestimmt indem eine Verdünnung der jeweiligen DNA- Lösung in Aqua dest. hergestellt und die Absorption bei 260 nm (A₂₆₀) und 280°nm (A₂₈₀) gemessen wird.

Gewinnung der Plasmid- DNA von TEL Beschreibung des Prinzips der Einklonierung von Genabschnitten

Plasmide sind extrachromosomal vorkommende, ringförmige DNA- Moleküle. Das Einklonieren eines PCR- Produktes in einen vorgegebenen Klonierungsvektor (Insertion) – im vorliegenden Fall pCR 2,1- TA Cloning Vector - und das anschließende Einbringen dieses Plasmids in das Zytoplasma kompetenter E.coli- Stämme (Transfektion) ermöglicht die Vermehrung der Zielsequenz. Es erfolgt eine zweifache Selektion der Bakterienkolonien. Der Klonierungsvektor enthält die Gensequenz für Antibiotikaresistenz gegen Ampicillin und Kanamycin. Die Agarmedien für die Bakterienkolonien enthalten eines dieser beiden Antibiotika. Somit können sich nur diejenigen E.coli- Stämme, die das Plasmid enthalten und damit antibiotikaresistent sind, vermehren. Um Bakterienkolonien zu unterscheiden,die einen leeren Vektor oder einen mit dem zu klonierenden DNA- Produkt enthalten, enthält der Vektor die genetische Information der ersten 146 Aminosäuren des β- Galaktosidasgens. In dieser Sequenz liegt die Insertionsstelle für das zu klonierende DNA- Produkt (multiple cloning site). Solche Vektoren werden für Wirtszellen benutzt, welche für das carboxy- terminale Ende der β- Galaktosidase kodieren. In einem Prozess, der als α- Komplementierung bezeichnet wird, ergeben die Proteinfragmente des β- Galaktosidasegens sowie die der Wirtszelle ein enzymatisch aktives Enzym, welches in Anwesenheit von 5- bromo- 4- chloro- 3- indolyl- β- D- Galaktosidase zur Blaufärbung der Bakterienkolonien führt. Kommt es zu einer Insertion des zu klonierenden DNA- Produktes, so verhindert diese die α- Komplimentierung und die Bakterienkolonien erscheinen weiß.

Durchführung der Klonierung
Mit Hilfe des TOPO™ TA Cloning® Kits können cDNA- Fragmente innerhalb weniger Minuten in den Klonierungsvektor inseriert werden. Die Ligation zwischen dem Vektor und dem Insert wird durch die Transferase- Aktivität der Taq- Polymerase vermittelt. Sie fügt an das 3’- Ende des synthetisierten PCR- Produkts ein einzelnes Desoxyadenosin (A) an, welches dann kovalent mit dem am 3’- Ende des linearisierten Vektors befindlichen Desoxythymidin (T)- Restes bindet. Der verwendete pCR 2,1- TA Cloning Vector besitzt eine ColE1 origin zur Replikation von E. coli, einen versatilen Polylinker, Gene für die Ampicillin- und Kanamycin- Resistenz und ein lacZ- alpha- Komplement zur blau- weiß- Selektion der Transformanten. Die bakterielle Expression des lacZ- alpha- Fragmentes zur alpha- Komplementierung wird durch den lac- Promotor reguliert. Nachdem die Ligation des PCR- Produktes in den Vector in einem ersten Schritt durch die Integration in seinen versatilen Polylinker erfolgt, findet die Transformation von E. coli und die Selektion der transformierten Zellen auf LB- Agaroseplatten, die zuvor mit Ampicillin versetzt wurden, statt. Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Danach pickt man 10 weiße Kolonien und kultiviert wiederum über Nacht. Um zu überprüfen, ob es zur Transfektion gekommen ist, schließt sich eine Kontroll- PCR an.

Abbildung 7: Vektorskizze.
Aufreinigung der Plasmid- DNA
Die Plasmid- DNA wird aus dem Zytoplasma, der in der Kontroll- PCR positiven Bakterienstämme, gewonnen. Dies geschieht mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit Protokolls.
Ausschneiden der klonierten TEL - Sequenz/ Aufreinigung der Template- DNA
Um die Spezifität des Verfahrens zu erhöhen, muss für die Digoxigenin- Markierung bei der Inkorporierung von Digoxigenin- 11- dUTP während der PCR eine möglichst reine Template- DNA eingesetzt werden, da verbleibende Vektorsequenzen (Plasmid) in der Ausgangs- DNA für die Sondenherstellung zu unspezifischen Hybridisierungssignalen führen können. Dafür wird das zuvor einklonierte TEL- Gen (Nukleotide 21387) aus dem Plasmid möglichst nah an den Primerbindungssequenzen mit dem Restriktionsenzym EcoRI, welches seine Schnittstellen direkt beiderseits der Topo- Cloning Region aufweist und auch keine Schnittstelle innerhalb des TEL- Gens hat, ausgeschnitten.

EcoRI (Escherichia coli RY 13):

5’- G↓AATTC- 3’

3’- CTTAA↑G- 5’

Tabelle 3: Herkunft und Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease EcoRI.

Nach dem Verdau wird die Probe über ein Agarosegel aufgetrennt, die sichtbare Bande ausgeschnitten und über den QIAquick Gel Extraction Kit aufgereinigt.
Beschreibung der Digoxigenin- markierten TEL- Sonde
Die TEL- Sonde entspricht der TEL- cDNA von Nukleotid 487 bis 1072 (Exon 5 und 6). Sie hat eine Länge von 585bp. In diesem Abschnitt liegt keine Schnittstelle von BamHI. Es ist eine doppelsträngige DNA- Sonde, die mit 11- dUTP- Digoxigeninmarkiert ist. Das Nachweisprinzip wird im Zusammenhang mit der Southern Blot Untersuchung beschrieben.
Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifizierung der nicht- radioaktiv- markierten TEL- Sonde Beschreibung des Verfahrens der Polymerasekettenreaktion (PCR)
Mittels der PCR - einer in vitro Nukleinsäuresynthese, die im Prinzip eine Nachahmung der in vivo DNA- Replikation darstellt - kann spezifisch der Abschnitt des TEL- Gens der cDNA auf ein Vielfaches amplifiziert und gleichzeitig nicht- radioaktiv markiert werden. Folgende Komponenten sind für die Amplifikation von DNA in der Polymerasekettenreaktion nötig: DNA, DNA- Polymerase, Primer (Oligonukleotide mit 15-30 Basen, die komplementär zu den Enden der definierten DNA- Sequenz sind, die amplifiziert werden soll) und ein Gemisch von dNTPs (Desoxyribonucleotidtriphosphate als Bausteine der zu synthetisierenden DNA), in dem 11- dUTP- Digoxigenin im Austausch zu TTP enthalten ist. Das Prinzip der Polymerasekettenreaktion ist eine vielfache Hintereinanderreihung dreier Reaktionen, die sich nur in ihrer Inkubationstemperatur unterscheiden. Im ersten Schritt wird die DNA denaturiert, so dass Einzelstränge vorliegen. Beim zweiten Schritt - auch Annealing genannt - lagern sich zugegebene Oligonukleotide (Primer) an die komplementären DNA- Sequenzen. Der dritte und letzte Schritt im Zyklus der PCR ist die Synthese eines komplementären DNA- Stranges durch die DNA- Polymerase. Das Enzym synthetisiert vom 3’-Ende der angelagerten Primer ausgehend einen zur Ursprungs- DNA komplementären DNA- Strang. In jedem weiteren Zyklus dienen die an der Ursprungs- DNA synthetisierten DNA- Stränge wiederum als Matrize zur weiteren Amplifikation von DNA durch die Polymerase. So kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung des zwischen den Primern gelegenen DNA- Abschnittes. Durch die Verwendung der hitzestabilen Polymerase aus dem Bakterium Thermophilus aquaticus ist die Automatisierung der Temperaturzyklen möglich, da nicht bei jeder Hitzedenaturierung der DNA das Enzym zerstört wird und anschließend neu hinzugefügt werden muss.
Bedingungen für die Durchführung der externen und internen PCR
Um ein möglichst reines Ausgangsprodukt für die Hybridisierungssonde und damit eine erhöhte Spezifität und Effektivität zu erlangen, wird eine PCR in zwei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt (sogenannte nested- PCR). Im ersten PCR- Ansatz (externe PCR) wird das durch die Plasmidaufreinigung erhaltene Produkt – TEL Nukleotid 2 bis 1374 - in einer Verdünnung mit Aqua dest. von 1:2000 für die Sondenherstellung eingesetzt. Um die unspezifische Hybridisierung durch verschiedene PCR- Nebenprodukte ferner zu vermeiden, wird das Produkt der externen PCR wiederum erst nach einer 1:10000 Verdünnung in den zweiten Ansatz (interne PCR) eingesetzt, welche nur für Exon 5 und 6 des TEL- Gens von den Nukleotiden 487 bis 1072 amplifiziert. Dabei erfolgt die Digoxigenin- Markierung. In dem Schritt der internen PCR wird Digoxigenin- 11- dUTP im Austausch zu TTP in einem Verhältnis von 1:19 inkorporiert. Ein detection assay wird direkt an die PCR angeschlossen, um die labeling- Effizienz in der PCR zu überprüfen und damit die spätere Hybridisierungssensitivität abschätzen zu können. Die aufgeführte Tabelle Nr. 4 stellt einen Reaktionsansatz von 50µl der externen PCR dar und listet die einzelnen Reaktionsschritte mit Temperatur und Dauer auf.

Menge

Reagenzien

Temperatur in °C

Zeit in min

1,3µl

Upstream- Primer TEL 2

initiale Denaturierung

94

10,00

1,3µl

Downstream- Primer TEL 1374

annealing

58

0,45

5µl

dNTP- Mix (2mM)

elongation

72

1,30

5µl

PCR- Puffer

Denaturierung

94

0,30

0,2µl

AmpliTaq Gold® DNA- Polymerase (5U/µl)

Wiederholung 35 Zyklen

1µl

Plasmid- cDNA (1:2000 verdünnt)

annealing

58

0,45

37µl

H20 dest.

elongation

72

1,30

Denaturierung

94

0,30

anschließend

annealing

58

0,30

final elongation

72

7,00

14

'for ever'

Tabelle 4: Externe PCR – Reagenzien auf 50µl und Amplifikationsbedingungen.

Die aufgeführte Tabelle Nr. 5 stellt einen Reaktionsansatz von 50µl der internen PCR dar und listet die einzelnen Reaktionsschritte mit Temperatur und Dauer auf.

Menge

Reagenzien

Temperatur in °C

Zeit in min

1,3µl

Upstream- Primer TEL 487

initiale Denaturierung

94

10,00

1,3µl

Downstream- Primer TEL 1072

annealing

63

0,45

2,5µl

dNTP- Mix (2mM)

elongation

72

1,30

2,5µl

DIG-DNA-Labeling-Mix (mit Dig-11-dUTP)

Denaturierung

94

0,30

5µl

PCR- Puffer

Wiederholung 35 Zyklen

0,2µl

AmpliTaq Gold® DNA- Polymerase (5U/µl)

annealing

63

0,45

1µl

Reaktionsprodukt externe PCR (1:10000)

(1:100000 verdünnt)???

elongation

72

1,30

37µl

H20 dest.

Denaturierung

94

0,30

anschließend

annealing

58

0,30

final elongation

72

7,00

14

'for ever'

Tabelle 5: Interne PCR – Reagenzien auf 50µl und Amplifikationsbedingungen.

RT - Reverse Transkription
Um zur RNA komplementäre DNA (cDNA) zu gewinnen, die dann in die PCR eingesetzt werden kann, wurde die RNA dem im folgenden angeführten Reaktionsansatz der reversen Transkription unterzogen.

Menge

Reagenzien

2µl

Hexanukleotide (50M)

1µl

DTT (100mM)

5µl

dNTP- Mix (2mM)

4µl

First Strand Buffer (5x conc.)

1µl

RNA

2µl

SuperScript IITM H- Reverse- Transkriptase (200U/µl)

20µl

H20 dest.

Reaktionsbedingungen

45 min 37°C

5 min 94°C

Tabelle 6: RT- PCR – Reagenzien eines Reaktionsansatzes von 20µl und Amplifikationsbedingungen.

Agarosegelelektrophorese zur Darstellung der PCR- Produkte
Die Produkte aus der Sonden- PCR wurden mit 1/3 Volumen eines Gelladepuffers (Orange G) versetzt und in die Slots eines Agarosegels einpipettiert. Parallel dazu wurde ein DNA- Längenstandard aufgetragen (BIO- RAD, Precision Molecular Mass Standard), der die Größenzuordnung der im Gel aufgetrennten DNA- Fragmente erlaubte. Anschließend erfolgte die Konzentrationsbestimmung mittels des Molecular Analyst® (BIO- RAD). Bei der Agarosegelelektrophorese wandern DNA- Moleküle entsprechend ihrer Größe und Ladung in einem konstanten elektrischen Feld. Die Auftrennung erfolgt in einem 3%igen mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel bei 120 Volt über einen Zeitraum von ca. 30 Minuten. Durch den Zusatz von Ethidiumbromid werden die im Agarosegel aufgetrennten DNA- Fragmente auf dem UV- Transilluminator anschließend sichtbar. Die Dokumentation der Ergebnisse erfolgt mit einer Polaroidkamera.
Dot Blot Analyse
Um die Sensitivität der hergestellten Sonde festzustellen, wurde eine Hybridisierungsanalyse der in der PCR hergestellten DIG- 11- dUTP markierten doppelsträngige cDNA- Sonde mittels einer Dot Blot Reaktion durchgeführt. Die Sonde hybridisiert zum sense und antisense Zielgen- Strang. Der erste Schritt bestand in der Prähybridisierung einer Verdünnungsreihe von TEL 487-1250 haltiger cDNA (10pg bis 0,01pg) auf einer Nylonmembran für 2 Stunden. Danach wurde mit der Zugabe der markierten DNA bei 65°C über Nacht hybridisiert. Anschließend wurde in zwei Waschgängen die unspezifisch gebundene DIG- 11- dUTP markierte DNA- Sonde beseitigt.

Waschschritte:

2 x mit „2 x Washing Solution“ (2 x SSC/ 0,1% SDS) für je 5 min bei Raumtemperatur

2 x mit „0,5 x Washing Solution“ (0,5 x SSC/ 0,1% SDS) für je 15 min bei 65°C

Es folgte die Detektion durch Chemolumineszenz wie sie im Abschnitt der Southern Blot Darstellung ausführlich beschrieben ist.
Positiv- Kontrolle: Zellinie REH
Um eine TEL- Genrekombination in der Southern Blot Analyse richtig beurteilen zu können, ist es nötig jeweils einen negativen und einen positiven Standard mit zu hybridisieren. Als negatives Kontrollmaterial wurde DNA aus Leukozyten gesunder SpenderInnen eingesetzt, und als TEL- AML1 positives Kontrollmaterial wurde DNA der Zellinie REH der humanen prä- B- Zell- ALL, deren nicht transloziertes TEL- Allel deletiert ist, zur Hybridisierung verwendet.
Kultivierung der Zellinie
Bei einer Temperatur von 37°C und einem CO2 Gehalt von 5% wurden die Zellen der REH- Zellinie im RPMI 1640 Medium mit folgenden Zusätzen kultiviert:

10% FCS

20 mM Hepes

2 mM Glutamin

100 U/ml Penicillin

100 µg/ml Streptomycin
DNA- Restriktion
Zur Southern Blot Analyse wird die DNA als erstes durch eine Restriktionsendonuklease in handhabbare Fragmente geschnitten. Um Genveränderungen beurteilen zu können, dürfen keine Schnittpunkte im gewünschten Genabschnitt sein. Durch Verdau und Auftrennung der Fragmente über ein Agarosegel entsteht ein Schmier von Fragmenten (Restriction Smear).

Die DNA wurde dementsprechend mit der Restriktionsendonuklease BamHI geschnitten. 10µg DNA wurden mit bis zu 120 Units/µl des Restriktionsenzyms in geeigneten Restriktionspuffern inkubiert.

BamHI (Bacillus amyloliquifaciens H)

5’- G↓GATCC- 3’

3’-CCTAG↑G- 5’

Tabelle 7: Herkunft und Erkennungssequenz der Restriktionsendonuklease BamHI.

Zur Überprüfung des Verdaues wurde die geschnittene PatientInnen DNA mit einem Gelladepuffer versetzt und in ein 0,6%iges mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel pipettiert. Die Auftrennung erfolgte über 2,5 Stunden bei 70 Volt. Bei unvollständigem Verdau wurde unter Zusatz von BamHI für weitere ca. 6 Stunden inkubiert.
Gelelektrophorese der geschnittenen DNA
Nach dem vollständigen Verdau wurde die geschnittene PatientInnen DNA mit ½ Volumen eines Gelladepuffers versetzt und in ein 0,6%iges mit Ethidiumbromid versetztes Agarosegel pipettiert. Zur Bestimmung der germline- DNA- Konfiguration wurde parallel eine verdaute Buffy Coat- Probe aufgetragen und als Positivkontrolle, Zellen der REH- Zellinie. Zusätzlich wurde ein DNA- Längenstandard (λ- DNA/ HindIII) aufgetragen, der die Größenzuordnung der aufgetrennten DNA- Fragmente erlaubte. Die Auftrennung erfolgte über Nacht bei 4°C und 40 Volt. Die Dokumentation der DNA Restriktionsmuster erfolgte auf dem UV- Transilluminator bei 254nm mittels einer Polaroidkamera.
Southern Blot Beschreibung des Versuchsaufbaus
Entsprechend der 1975 von Southern beschriebenen Methode ist es möglich über eine spezifische Sonde, im vorliegenden Fall die Digoxigenin- markierte TEL- Sonde, eine korrespondierende Gen- Sequenz zu finden.[137] Die Darstellung der Fragmente ist aber nicht direkt auf dem Agarosegel möglich. Es ist vielmehr ein Medium nötig, auf dem die Hybridisierungsreaktion stattfinden kann. Deshalb wird die doppelsträngige DNA, nachdem sie über das Gel aufgetrennt worden ist, anschließend für 30 Minuten in 0,25 M HCl bei Raumtemperatur depuriniert, 30 Minuten in einer 0,5M NaOH- Lösung denaturiert und anschließend für wiederum 30 Minuten in einer 1,5 M NaCl- Lösung neutralisiert, um die dadurch vorliegenden einzelsträngigen Fragmente vom Gel auf eine Nylonmembran transferieren zu können. Das Gel wird auf ein Filterpapier (Whatmann 3MM Papier), das durch hochkonzentrierte Salzlösung (20 x SSC) getränkt wird, gelegt. Auf das Gel wird anschließend die Nylonmembran (bei den neu hergestellten Membranen handelte es sich um positiv geladene Nylonmembranen) und darüber saugfähiges trockenes Papier gelegt und das Ganze mit etwas Druck beschwert. Die Salzlösung wird durch das trockene Papier angezogen. Dabei gelangt sie erst durch das Gel und dann an die Nylonmembran. Die DNA steigt mit der Salzlösung auf, wird aber durch die Nylonmembran aufgehalten und bleibt so in der gleichen Konfiguration wie sie im Gel bestand an der Membran haften. Die Bindung der DNA durch die Nylonmembran hängt u.a. vom quantitativen Salzgehalt der Transportlösung ab. Der Transfer der DNA auf die Nylonmembran wurde entsprechend dem Aufbau von Southern durchgeführt (siehe Abbildung Nr. 8). Nach einer Transferzeit von maximal 24 Stunden wurde die DNA durch 15- minütiges Trocknen bei 80°C und anschließendem Auto- Crosslinken (Stratolinker von Stratagene) von beiden Seiten kovalent an die Membran gebunden und danach kurz in 2 x SSC gewaschen. Die so an der Nylonmembran fixierte und immobilisierte DNA kann nun mit einer spezifischen, im vorliegenden Fall mit einer nicht- radioaktiven, Sonde hybridisiert werden. Nur die Fragmente, die komplementär zu einer genauen Sonde sind, werden mit ihr hybridisieren. In der vorliegenden Arbeit wurde die Sonde über Antikörperbindung und Chemolumineszenz sichtbar gemacht. Jede komplementäre Sequenz erscheint mit einer markierten Bande an der bestimmten Position der Größe des jeweiligen DNA- Fragmentes. Die Trennmuster der DNA- Fragmente im Gel bleiben erhalten, so dass der Filter eine exakte Replik des ursprünglichen Gels darstellt.

Abbildung 8: Veranschaulichung der Southern Blot Analyse.
Hybridisierung mit der Digoxigenin- markierten Sonde
Der wie beschrieben vorbereitete Filter wird anschließend bei 38°C für 4 Stunden mit der DNA- Seite nach innen zeigend in einem Hybridisierungsgefäß prähybridisiert, wobei der hohe Salzgehalt aus der Membran gewaschen wird, der von dem Southern Blot Prozess noch übrig ist und die unspezifischen Bindungen werden mittels Salmon sperm- DNA abgesättigt. Anschließend erfolgt eine Hybridisierung mit der bei 95°C denaturierten markierten Sonde für mindestens acht Stunden bei 41°C. Die formamidhaltige Hybridisierungslösung wird dekantiert und die unspezifisch gebundene Sonde durch folgende Waschvorgänge entfernt:
3 x mit „2 x Washing Solution“ (2 x SSC/ 0,1% SDS) für je 5 min bei RT

3 x mit „0,5 x Washing Solution“ (0,5 x SSC/ 0,5% SDS) für je 15 min bei 65°C

Für die nicht- radioaktive Darstellung durch Chemolumineszenz erfolgen anschließend weitere Wasch- und Blockschritte für die spezifische Antikörperbindung nach einer verifizierten Methode der Non- Radioactiv Digoxigenin Chemiluminescent Detection von Roche Diagnostics/ Boehringer Mannheim, auf die im folgenden näher eingegangen wird.
Die Abbildung Nr. 9 stellt schematisch das Prinzip der Chemiluminescent Detection (Chemolumineszenz Reaktion) mit Digoxigenin (DIG), der anti- Digoxigenin Alkalischen Phosphatase (anti- DIG- AP) als gebundenes anti- DIG- Antikörperkonjugat und CDP- Star ™ dar.

Abbildung 9: Prinzip der 11- UTP- Digoxigenin Chemolumineszenz Markierung.

Der Filter wird nach den sich direkt an die Hybridisierung anschließenden Waschschritten für eine Minute in Washing Buffer equilibriert. Anschließend wird der Filter für circa eine Stunde mit einer Blocking Solution bei Raumtemperatur behandelt, um unspezifische Bindungen des Antikörpers an die Membran zu verhindern. Danach wird die Membran in einer 1:10000 Blocking Solution enthaltenden Verdünnung des Anti- Digoxigenins, Fab- fragments, welches mit Alkalischer Phosphatase konjugiert ist, für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung mit dem Antikörper wird verworfen und es folgen zwei Waschschritte für jeweils 15 Minuten mit dem Washing Buffer bevor der Filter für drei Minuten in einem Detection Buffer equilibriert wird. Bis das Chemolumineszenzsubstrat hinzugegeben wird, muss der Filter feucht bleiben und wird deshalb zwischen zwei Klarsichtfolien gelegt. Solange der Filter feucht bleibt, kann das Chemolumineszenzsubstrat CDP- Star™ in einer Konzentration von 1µl:1000µl Detection Buffer appliziert werden. Die Darstellung erfolgt durch die Belichtung von Röntgenfilmen in Röntgenkassetten. Je nachdem, ob es sich um eine Rehybridisierung alter Filter handelte oder um eine erstmalige Hybridisierung, betrug die Dauer der Exposition zwischen zehn Minuten bis maximal sechs Stunden. Zur Entfernung der hybridisierten TEL- Sonde wurden die Nylonfilter mit kochender 0,1 x SSC Lösung inkubiert und bis zur Abkühlung auf Raumtemperatur gewaschen. Dies ermöglicht konsekutive Hybridisierungen der Nylonmembran.
Überprüfung der Southern Blot Ergebnisse mittels der PCR
Um die durch die Southern Blot Analyse erhaltenen Ergebnisse mit einer weiteren Methode zu überprüfen, wurden mit der bereits für den Routinenachweis der Translokation t(12;21) im molekulargenetischen Labor der pädiatrischen Hämatologie/ Onkologie der Charité Campus Virchow Klinikum zur Verfügung stehenden nested- PCR 30 RNA PatientInnenproben untersucht.
nested- PCR
Das Prinzip entspricht methodisch dem in Abschnitt 3.2.4. zur TEL- Sondenherstellung bereits dargestellten. Im ersten (externen) PCR- Ansatz wurden die Primer TELext. und AMLext. verwendet und als Primer für die ABL- Kontrolle up ABL und ABLext.. Im zweiten (internen) PCR- Ansatz wurden die Primer TELint. und AMLint.verwendet und als Primer für die ABL- Kontrolle up ABLint. und ABLint.

Menge

Reagenzien

Menge

Reagenzien

xµl

Primer TELext. und AMLext. (je 5pmol)

xµl

Primer TELint. und AMLint (je 10pmol)

xµl

Primer up ABL und ABLext. (je 2,5pmol)

xµl

Primer up ABLint. und ABLint. (je 2,5pmol)

3µl

dNTP Mix (2mM)

3µl

dNTP Mix (2 mM)

3µl

PCR- Puffer

3µl

PCR- Puffer

0,1µl

AmpliTaq® DNA- Polymerase (5U/µl)

0,1µl

AmpliTaq® DNA- Polymerase (5U/µl)

30µl

H2O dest.

30µl

H2O dest.

0,1µl

cDNA

0,1µl

PCR- Produkt (1:100 verdünnt)

Tabelle 8: Externe PCR – Reagenzien. Interne PCR – Reagenzien.

Schritte

Temperatur in °C

Zeit in Minuten

initiale Denaturierung

94

6,00

annealing

61

0,30

elongation

72

0,45

Denaturierung

94

1,00

Wiederholung Zyklus 1-5

annealing

61

0,45

elongation

72

0,45

Denaturierung

94

1,00

annealing

61

0,45

Wiederholung Zyklus 6-29

final elongation

72

10,00

Tabelle 9: Amplifikationsbedingungen für externe und interne PCR.