Ergebnisse

Methodische Aspekte - Konzeption und Optimierung einer nicht- radioaktiven Southern Blot Hybridisierungsanalyse zum Nachweis von TEL- Genrekombinationen Konzeption und Optimierung der Hybridisierung Aufreinigung der Template- DNA

Bei der Herstellung der Digoxigenin- Sonde haben bei dem Versuch eine möglichst reine Template- DNA zu verwenden, spezifische Aufreinigungsversuche des herausgeschnittenen das TEL- Gen enthaltenden Fragmentes nach dem Schneiden mit dem Restriktionsenzym EcoRI, nicht zu besseren Hybridisierungsergebnissen geführt.

Southern Transfer, Hybridisierung und Chemolumineszenz

Vom Southern Transfer über die Hybridisierung bis zur Chemolumineszenz- Darstellung wurden alle Schritte im Hinblick auf die Sensitivitätsbeeinflussung und Bildhintergrundbildung überprüft. Die Methode des Southern Transfers, auch als Capillary Transfer bezeichnet, ist die sensitivste aller für den Transfer von Nukleinsäuren von Agarosegel auf Membranen zur Verfügung stehenden verschiedenen Methoden. Die Depurinierung der DNA im Agarosegel nach der Elektrophorese und vor dem Southern Transfer spielt in diesem Zusammenhang für die Sensitivität eine entscheidende Rolle. (Hierbei kommt es zu einer Fragmentierung hochmolekularer DNA, was zu einer guten Vorbereitung für einen optimalen Transfer beiträgt.) Besonders differieren kann der Zeitfaktor. Die besten Ergebnisse wurden mit einer Depurinierungsdauer von etwa 30 Minuten erzielt. Der Transfer vom Gel auf die Membran erfolgte abhängig von der Größe der DNA entweder mit 10 x SSC oder mit 20 x SSC konzentrierter Pufferlösung, wobei sich im vorliegenden Fall die Verwendung von 20 x SSC für den Transfer am günstigsten erwies. Die Membran wurde direkt an den Transfer anschließend von beiden Seiten im Stratolinker gecrosslinked,um mögliche Hintergrundprobleme bei der Darstellung auf Röntgenfilmen durch die Rückseite der Membran zu verhindern. Ein sich anschließendes sofortiges Waschen der Membran in 2 x SSC stellte sich als Hintergrund reduzierend heraus, da hiermit Verunreinigungen durch Salzprezipitate vermindert werden konnten. Der Zusatz von Salmon sperm- DNA in die Hybridisierungslösung erwies sich ferner in diesem Zusammenhang als effizienzfördernd. Die Verwendung der Blocking Reagent Stock Solution von Boehringer Mannheim beim Blocken von durch die Sonde verursachten unspezifischen Bindungen, stellte sich im Vergleich zu anderen am effektivsten für die Hintergrundreduzierung heraus. Beste Ergebnisse im Hinblick auf Schnelligkeit und Sensitivität der Darstellung der Chemolumineszenz- Reaktion wurden im Vergleich zu beispielsweise DOP fab fragments und NEN mit CDP- Star™ und Anti- Digoxigenin- AP erreicht.

Zur Optimierung der Auswertbarkeit wurden Vorversuche mit positiv geladenen Membranen mit für TEL- AML1 positiven (REH- Zellinie) und negativen (Buffy Coat) Kontrollproben durchgeführt. Eine recht lange Elektrophoreselaufzeit (circa 24 Stunden) und damit eine weite Auftrennung der größten DNA Fragmente erwies sich dabei als optimal.

Die neu hergestellten Hybridisierungsfilter mit PatientInnen- DNA konnten nach dem oben beschriebenen optimierten Versuchsaufbau ausgewertet werden. Bei der Rehybridisierung alter Filter stellte sich allerdings die damalige standardisierte kurze Laufzeit als problematisch bei der Beurteilung der längeren DNA- Fragmente heraus. Wenn von auf rehybridisierten Filtern befindlichen PatientInnenproben noch kryokonservierte DNA Proben vorrätig und verwendbar waren, wurde eine Auftragung auf neue, positiv geladene Hybridisierungsmembranen angestrebt.
Auswertungskriterien/ Optionen der Beurteilung und Vergleich der DNA- Hybridisierungsergebnisse mit Ergebnissen einer RNA- basierten nested- PCR
Im folgenden soll auf einige Interpretationsmöglichkeiten der Hybridisierungsanalyse von TEL- Genrearrangements eingegangen werden.

Um die Vielfältigkeit der Rekombinationsmuster für das TEL- Gen bei monoklonalen Zellpopulationen einschätzen zu können, wurden von in der Laborroutine mittels PCR bereits auf das Vorliegen der TEL- AML1- Fusion getesteten PatientInnenproben neue Hybridisierungsfilter hergestellt und eine erneute PCR zur TEL- AML1- Detektion durchgeführt. Die Auswahl der über die Laborroutine befundeten PCR- PatientInnenproben erfolgte nach einem bewusst etwa gleichmäßig gehaltenen Verhältnis von für TEL- AML1 positiven und negativen PatientInnen. Durch eine Laborassistentin wurden 30 TEL- AML1 positive und negative Proben zur Untersuchung ausgewählt. Sowohl die Auswertung der Southern Blot Ergebnisse als auch die Auswertung der PCR erfolgte jeweils unabhängig ohne die Kenntnis des TEL- Status. Die Beurteilung der vergleichenden Southern Blot Analyse erfolgte ohne Kenntnis der PCR- Befunde für die jeweilige PatientInnennummer durch zwei unabhängige Personen, welche Erfahrung mit Southern Blot Verfahren hatten. Von den im Southern Blot untersuchten Proben war in 25 Fällen eine Übereinstimmung mit den PCR- Ergebnissen festzustellen. In einem Fall fand sich in der Hybridisierung eine germline Konfiguration im Gegensatz zum in der PCR dargestellten Rearrangement. 4 Fälle waren im Southern Blot aufgrund degenerierter DNA nicht auswertbar. Die PCR- Ergebnisse stimmten mit den jeweiligen Auswahlkriterien der Laborassistentin überein. Es war 10 mal eine Translokation im TEL- Genlokus durch die Hybridisierung nachweisbar und in 12 Fällen in der PCR. Eine germline- Konfiguration fand sich im Southern Blot in 15 und in der PCR in 18 Fällen.

TEL- Rearrangement Southern Blot

+

-

nicht auswertbar

TEL- AML1 PCR

+

10

1

1

-

/

15

3

nicht auswertbar

/

/

/

Tabelle 10: Vergleich der TEL- Rearrangement Southern Blot Analyse Ergebnisse mit den TEL- AML1 RNA basierten PCR- Ergebnissen.

Die Abbildung Nr. 10 veranschaulicht schematisch verschiedene Varianten des rearrangierten TEL- Genlokus in der Southern Blot Hybridisierungsanalyse mit der Digoxigenin markierten Sonde TEL487. Auf die Ergebnisse der PCR wird im Abschnitt 4.1.3 näher eingegangen.

Abbildung 10: Schematisch dargestellte Ergebnisse der Southern Blot Hybridisierungsanalyse für Rearrangements des TEL- Gens. Da für jedes Gen zwei Allele vorhanden sein sollten, ergeben sich unterschiedliche Kombinationen der Konfiguration des TEL- Genlokus (G/G; G/R; R/R; R/D).(G = germline, R = Rearrangement, D = Deletion)

Bei der Untersuchung des TEL- Genlokus zeigten die DNA- Proben mit einer Keimbahnkonfiguration (G, germline Konfiguration) für TEL nach der Hybridisierung mit der 585 Basenpaare langen TEL487 Digoxigenin markierten Sonde eine Bande bei etwa 20kb. Liegt eine lymphoblastische Zellpopulation mit einem rearrangierten TEL- Genlokus vor, so müssten theoretisch bei reziproker Translokation zwei Fragmente von TEL sichtbar werden, da der Bruchpunkt zwischen Exon 5 und 6 liegt. Dem entspräche beispielsweise die sechste der schematischen Darstellungen in Abbildung 10. Häufig war ein Teil deletiert, so dass in der Großzahl der Fälle nur eine zusätzliche Bande bei etwa 9kb zur Darstellung kam. Im Falle einer 100%igen Blastenpopulation war neben der Bande im Bereich von 9kb anstelle des Keimbahnfragments eine höher oder tiefer liegende Bande nachweisbar. Es gab überdies Fälle, in denen sich zwei rekombinierte TEL BamHI Fragmente neben dem germline Fragment fanden. Bei der Deletion eines Allels und einer Rekombination des zweiten Allels fehlte das Keimbahnfragment, wenn der Anteil der malignen Zellen ebenfalls 100% betrug. Das Keimbahnfragment war ferner nicht nachweisbar, wenn beide Allele deletiert waren. Wenn nicht alle Zellen von der Deletion betroffen waren, blieb ein Keimbahnfragment mit geringerer Intensität nachweisbar. Die unterschiedliche Lokalisation der Banden hängt ebenfalls von den an der Rekombination beteiligten Genabschnitten von TEL bzw. AML1 (zwischen TEL Exon 5 und 6 bzw. zwischen AML1 Exon 2 und 4 – je nach Bruchpunkt im Intron) und der dadurch veränderten Lage der Schnittstellen für das Restriktionsenzym BamHI ab, wonach die rekombinierten DNA- Fragmente kürzer oder länger als das Keimbahnfragment sein können und in einem anderen Kilobasenbereich erscheinen. So kann es aus verschiedenen Gründen zu Schwierigkeiten bei der Beurteilung kommen. Die Banden im Kilobasenbereich um 20kb können zudem beispielsweise „komigrieren“ und somit die Differenzierung zwischen einer Deletion des einen translozierten Anteils des rearrangierten TEL- Allels und einem nicht translozierten TEL- Allel z.T. erschweren. Besonders schwierig zeigte sich diese Differenzierung bei den alten rehybridisierten Filtern, die eine kürzere Laufzeit hatten und bei denen die Auftrennung in den höheren Kilobasenbereichen folglich gering war. Abbildung Nr. 11 veranschaulicht ein Beispiel eines PatientInnenfilters. Es wurde ein DNA- Längenstandard zur Bestimmung der Fragmentlänge und zwei Buffy Coat Proben als Negativkontrolle (Keimbahnstandard) mitgeführt.

Abbildung 11: Southern Blot Hybridisierungsanalyse zum Nachweis eines TEL- Genrearrangements in genomischer DNA. Die DNA wurde mit BamHI verdaut und die Hybridisierung erfolgte mit der Digoxigenin markierten Sonde TEL487. In Slot Nr.1 befindet sich ein Längenstandard (1 Kb Marker), der nur auf dem UV- Transiluminator sichtbar ist. Slot Nr.2 und 20 stellen die germline (G) Konfiguration von TEL Buffy coat DNA dar; Slot Nr.7 und Nr.14 zeigen Rekombinationen im TEL- Genlokus.
Auswertung der PatientInnenfilter
Zum Nachweis von TEL- Genrekombinationen wurde mindestens eine Southern Blot Analyse des Diagnosematerials pro PatientIn durchgeführt. Die überwiegende Anzahl der Proben wies eine Keimbahnkonfiguration für das TEL- Gen auf. Bei den Proben mit einem TEL- Rearrangement fanden sich meist zwei veränderte TEL BamHI Fragmente als reziproke Produkte der Translokation. Eine Deletion des nicht rearrangierten TEL- Fragmentes, wie sie bei der Zellinie REH zu beobachten ist, konnte nur in einem Fall festgestellt werden.
Ergebnissen einer RNA- basierten nested- PCR
Von archivierten PatientInnenproben wurde parallel der Nachweis einer TEL- Genrekombination durch die Southern Blot Analyse und der Nachweis eines TEL- AML1- Fusionsgens mittels RNA basierter PCR durchgeführt. Es wurde von archivierter RNA cDNA in einer RT- PCR amplifiziert und diese in einer nested- PCR mit den Primern TELint. und AMLint. auf das Vorhandensein der Translokation TEL- AML1 überprüft. Mittels der internen PCR wurden zwei verschiedene TEL- AML1- Amplifikationsprodukte dargestellt. Das längere Amplifikationsprodukt umfasste 269 bp und ging auf die Fusion des Exon 5 von TEL mit dem Exon 2 von AML1 zurück. Das kürzere PCR- Produkt hatte eine Länge von 230 bp und entsprach dem Fusionsprodukt aus TEL Exon 5 und AML1 Exon 3. In der vorliegenden Vergleichsreihe wies jedoch keine Probe allein das kürzere Transkript für die Fusion von TEL und AML1 auf.

Abbildung Nr. 12 zeigt über Gelelektrophorese aufgetrennte PCR- Fragmente.

Abbildung 12: Elektrophoretische Auftrennung der RNA basierten TEL- AML1 PCR-. Ergebnisse Nummer 2, 5 und 6 sind TEL- AML1 positiv und Nummer 12 stellt die als Positivkontrolle verwendete Zellinie REH dar, Slot 1, 3, 4 und 7 bis 10 sind TEL- AML1 negativ. Probe 11 ist nicht zu verwerten. Probe 13 und 14 stellen Mastermix 1 und 2 dar, also das Pipettiergemisch ohne RNA. Die bei 1 bis 10 und REH vorhandene untere Bande stellt die RNA- Materialkontrolle von dem Gen ABL dar.

Ermittlung der Häufigkeit der TEL - Rekombination
Insgesamt wurden 228 DNA Proben auf das Vorliegen einer das TEL- Gen betreffenden Rekombination untersucht. Es wurden einerseits alte Filter rehybridisiert, andererseits gezielt archivierte DNA von ALL- REZ BFM 83 - 95 protokollgerecht behandelten ALL- ErstrezidivpatientInnen auf neu hergestellten Filtern hybridisiert. Da auf den alten Nylonmembranen die unterschiedlichsten Erkrankungen, Therapiekontrolle sowie Diagnosematerialien ohne Selektion aufgetragen wurden, ergab sich nach den Auswahlkriterien: ALL, bekannter Immunphänotyp und Diagnosematerial ein Probenumfang von 122 Kindern, welche in die Auswertung eingeschlossen wurden, davon 29 PatientInnen mit initialer ALL. Von den Kindern, die an einem ALL- Rezidiv erkrankten und nach den ALL- REZ BFM 83 - 95 Protokollen behandelt wurden, konnten insgesamt 93 Proben untersucht werden. Der größte Anteil der untersuchten PatientInnen zeigte den Immunphänotyp einer B- Vorläufer- Zell ALL (BVZ- ALL oder B- Cell Precursor ALL, BCP- ALL). Dementsprechend konnten 24 Proben einer ALL Ersterkrankung und 87 Proben eines ALL Rezidivs dem BVZ- ALL Typ zugerechnet werden. Die Rezidiverkrankungen einer BVZ- ALL verteilten sich mit 71 PatientInnen auf ein erstes Rezidiv und mit 16 PatientInnen auf Folgerezidive. Die verbleibenden PatientInnenproben verteilten sich auf den T- Zell- Immunphänotyp mit insgesamt 11 PatientInnen. ALL- Proben des reifen B- Zellstadiums waren im untersuchten PatientInnenkollektiv nicht vertreten. PatientInnenproben ohne bekannten Immunphänotyp wurden aus der Auswertung ausgeschlossen.

ALL- Erkrankungsstadium

Immunphänotyp

Ersterkrankung

Rezidiv

gesamt

BVZ- ALL

24

87

111

T-/ prä- T- ALL

5

6

11

gesamt

29

93

122

Tabelle 11: Zusammensetzung des untersuchten PatientInnenkollektivs, eingeteilt nach Erkrankungsstadium und Immunphänotyp. („gesamt“ entspricht n = PatientInnenzahl)

Bei erstmalig erkrankten Kindern lag das ermittelte Vorkommen eines rearrangierten TEL- Genlokus bei 6,9% (2/ 29) und bei Kindern mit rezidivierter ALL bei 9,7% (9/ 93). Ein TEL- Rearrangement zeigte sich mit unterschiedlicher Häufigkeit in den verschiedenen Subtypen der ALL. Bei dem am häufigsten vorliegenden Immunphänotyp einer BVZ- ALL war ein TEL- Rearrangement bei 11 von 111 untersuchten PatientInnen festzustellen. (Es wird hier keine detailliertere Unterteilung der B- Zell- Vorläufer- Subtypen in prä- prä- B- ALL, common- ALL, prä- B- ALL und My+ALL vorgenommen.) Innerhalb der 24 Proben von PatientInnen, die an einer initialen B- Vorläuferzell ALL erkrankt waren, konnte in zwei Fällen (7,7%) eine Rekombination im TEL- Genlokus identifiziert werden. Bei den 71 PatientInnenproben eines ALL Erstrezidivs konnte ein TEL- Rearrangement in einer Ratio von 9,9% (7/ 71) gefunden werden. Bei den 11 PatientInnen des Immunphänotyps einer prä- T- ALL oder T- ALL, war der TEL- Genlokus nur in seiner Keimbahnkonfiguration nachzuweisen. Eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse spiegelt Tabelle Nr. 12 mit einer Darstellung der Häufigkeitsverteilung der nachgewiesenen TEL- Genrekombinationen eingeteilt nach der Verteilung des Immunphänotyps (BVZ-, T- und prä- T- ALL) und dem Stadium der Erkrankung (Ersterkrankung und Folgerezidive) wider.

1. Erkrankung

1. Rezidiv

2. Rezidiv

3. Rezidiv

gesamt

n

TEL- Rearrangement

+

-

+

-

+

-

+

-

+

-

BVZ- ALL

111

2

(7,7%)

22

(92,3%)

7

(9,9%)

64

(90,1%)

1

(33%)

2

(67%)

1

(7,7%)

12

(92,3%)

11

(9,9%)

100

(90,1%)

T-/ prä- T-ALL

11

-

5

-

4

-

-

-

2

-

11

gesamt

122

2

27

7

68

1

2

1

14

11

111

Tabelle 12: Ergebnisse mittels Southern Blot Analyse nachgewiesener TEL- Genrearrangements der untersuchten 122 PatientInnen. (BVZ- ALL schließt ein: prä- prä- B- ALL, common- ALL, prä- B- ALL und My+ ALL ) („gesamt“ entspricht n = PatientInnenzahl)

Klinische Verläufe
Um dem Vorhaben einer späteren statistischen Auswertung der prognostischen Bedeutung einer TEL- Genrekombination bei ALL- Rezidiven Folge zu leisten, wurde die untersuchte PatientInnengruppe im weiteren auf PatientInnen mit dem ersten Rezidiv einer B- Vorläufer- Zell- ALL, die protokollgerecht nach ALL- REZ BFM behandelt wurden, beschränkt. Damit wurde der neben einem frühen Zeitpunkt und einer ungünstigen Lokalisation des 1. Rezidivs für eine schlechte Prognose als unabhängiger Faktor geltende T- Zell- Immunphänotyp aus dem PatientInnenkollektiv ausgeschlossen. Folglich wurde die Zahl der in die Auswertung einfließenden Proben auf 65 PatientInnen eingegrenzt. Von diesen 65 PatientInnen war der TEL- Genlokus bei 5 PatientInnen (7,7%) rearrangiert. Eine Kontrollgruppe von 313 PatientInnen wurde zusätzlich nach den oben beschriebenen Auswahlkriterien erstellt und rekrutierte sich aus den nicht getesteten PatientInnen, die in der ALL- REZ BFM Studie bis zum erwähnten Nachweisbeginn durch die Routine- PCR- Untersuchung erfasst sind.
Charakterisierung klinischer Merkmale der PatientInnen
In der Therapiestudie ALL- REZ BFM ist eine Vielzahl klinischer Daten von RezidivpatientInnen erfasst, auf die im folgenden für das beschriebene PatientInnenkollektiv zurückgegriffen wird.

Anhand verschiedener klinischer Merkmale, wie Alter bei initialer Diagnose, Dauer der Remission usw., wurde eine Charakterisierung des PatientInnenkollektivs zum Rezidivzeitpunkt vorgenommen. So zeigte sich bei einem Vergleich der PatientInnenproben mit einem positiven oder einem negativen Hybridisierungsergebnis für ein TEL- Genrearrangement bei einem ersten Rezidiv einer ALL- Erkrankung für die Proben, deren Zellen im TEL- Gen rekombiniert waren, eine längere Dauer der ersten Remission zwischen Initial- und Erstrezidivdiagnose. Der Median der Dauer der ersten Remission lag mit 35 Monaten (2,9 Jahren) bei den für das TEL- Genrearrangement positiv getesteten PatientInnen tendenziell über den negativ getesteten PatientInnen, bei welchen ein Median von 28 Monaten (2,3 Jahren) zu ermitteln war. Wie weiterhin aus der Tabelle Nr. 13 hervorgeht, lag das Alter bei Erstdiagnose der akuten lymphoblastischen Leukämie von TEL- Rearrangement positiven PatientInnen mit 88 Monaten (7,3 Jahren) im Vergleich über dem für ein TEL- Genrearrangement negativ getesteten PatientInnen mit 58 Monaten (4,8 Jahren). Der Median des Alters bei Rezidivdiagnose lag mit 123 Monaten (10,25 Jahren) bei den positiv getesteten PatientInnen etwas über den Ergebnissen der negativ getesteten mit 105 Monaten (8,75 Jahren). Die geringe Probenzahl erlaubt keine statistisch signifikanten Aussagen über die Unterschiede zwischen beiden Gruppen zu treffen. Eine Tendenz lässt sich jedoch erkennen: ALL- PatientInnen, deren leukämische Zellen im TEL- Genlokus rearrangiert sind, haben eine über dem Durchschnitt liegende Dauer der ersten Remission und erleiden so zu einem relativ späten Zeitpunkt ein Rezidiv.

TEL- Rearrangement

nicht getestet

+

-

n =

313

5

60

Alter bei Initialdiagnose
(in Monaten)

Median

63

88

58

Minimum

1

77

9

Maximum

197

151

190

Alter bei Rezidivdiagnose
(in Monaten)

Median

110

123

105

Minimum

12

111

23

Maximum

212

208

203

Dauer der Remission
(in Monaten)

Median

29

35

28

Minimum

3

23

6

Maximum

125

57

123

Leukozytenzahl 1000/µl

Median

6

6

7

Minimum

0,6

2,5

1

Maximum

301

9

97

periphere Blasten 1000/µl

Median

0,3

1

1

Minimum

0

0

0

Maximum

295

4

80,5

Tabelle 13: Median und Interquartilsabstand der Variablen bei dem auf TEL- Rekombinationen getesteten und nicht getesteten RezidivpatientInnenkollektiv („gesamt“ entspricht n= PatientInnenzahl; die PatientInnenzahl beträgt insgesamt 378).

Die anderen unabhängigen klinischen und morphologischen prognostischen Variablen (wie: initiale Leukozytenwerte und Anzahl der peripheren Blasten) unterschieden sich bei positiven und negativen PatientInnen im Median nicht wesentlich voneinander. Im Maximum lagen jedoch bei den TEL- Rearrangement positiven PatientInnen die initialen Leukozytenwerte bei 9000/µl und bei den negativen bei 97000/µl. Bei der Anzahl der peripheren Blasten ist ein ähnliches Verhältnis der Maxima zwischen TEL- Rearrangement positiv bzw. negativ getesteten PatientInnen zu erkennen (positiv = 4000/µl vs. negativ = 80500/µl).

TEL- Rearrangement

nicht getestet

+

-

gesamt getestet

n =

313

5

60

65

Rezidivzeitpunkt

sehr früh

67
(21,4%)

-

11
(16,9%)

11
(16,9%)

früh

94
(30,0%)

2
(3,1%)

18
(27,7%)

20
(30,8%)

spät

152
(48,6%)

3
(4,6%)

31
(47,7%)

34
(52,3%)

Rezidivlokalisation

KM isoliert

207
(66,1%)

4
(6,2%)

40
(61,5%)

44
(67,7%)

KM kombiniert

76
(24,3%)

-

15
(23,1%)

15
(23,1%)

extramedullär ohne KM- Befall

30
(9,6%)

1
(1,5%)

5
(7,7%)

6
(9,2%)

Tabelle 14: Angaben zu Geschlecht, Rezidivzeitpunkt- und lokalisation von Kindern mit einem Rezidiv einer B- Vorläuferzell- ALL der Therapiestudien ALL-REZ BFM 83-95.

Ein erstes Rezidivereignis konnte bei PatientInnen mit rearrangierten TEL- Genfragmenten nicht vor 18 Monaten nach Erstdiagnose und einem therapiefreien Intervall unter sechs Monaten („sehr frühes Rezidiv“) beobachtet werden. Zwei TEL- Rearrangement positive PatientInnen erkrankten an einem frühen und drei an einem späten Rezidiv. Bei TEL- Rearrangement negativen PatientInnen ist dagegen eine Verteilung auf „sehr frühe Rezidive“ (18,3% oder 11/ 60), „frühe Rezidive“ (30% oder 18/ 60) und „späte Rezidive“ (51,7% oder 31/ 60) zu verzeichnen. Entsprechend dieser Charakteristika ergab sich die Einteilung in die ALL- REZ BFM Therapiestrategiegruppen S1 bis S4. Sowohl die Gruppe S2 als auch die Gruppe S3 ist mit je zwei TEL- Rearrangement positiven PatientInnen besetzt. In der für eine TEL- Genrekombination positiv getesteten Gruppe wurde keinE PatientIn, die/ der nach den Richtlinien der Strategiegruppe S4 behandelt wurde gefunden. Es lässt sich also bei den TEL- Genrekombination positiven PatientInnen eine annähernd gleichmäßige Verteilung auf die ersten drei Therapiegruppen feststellen. Kontrastierend dazu zeigen neun PatientInnen der TEL- Rearrangement negativen PatientInnen eine Zuordnung zur Strategiegruppe S4.

TEL- Rearrangement

nicht getestet

+

-

gesamt
getestet

n =

313

5

65

60

Strategie-gruppen:

S1

5
(1,6%)

1
(1,5%)

2
(3,1%)

3
(4,6%)

S2

200
(63,9%)

2
(3,1%)

37
(56,9%)

39
(60,0%)

S3

45
(14,4%)

2
(3,1%)

12
(18,5%)

14
(21,6%)

S4

63
(20,1%)

-

9
(13,8%)

9
(13,8%)

KMT

keine

239
(76,3%)

4
(6,2%)

49
(75,4%)

53
(81,6%)

allogen

53
(17,3%)

1
(1,5%)

8
(12,3%)

9
(13,8%)

autolog

20
(6,4%)

-

3
(4,6%)

3
(4,6%)

Tabelle 15: Angaben zur Therapie von Kindern mit einem Rezidiv einer B- Vorläuferzell- ALL der Therapiestudien ALL-REZ BFM 83-95.

Es ließ sich feststellen, dass von den PatientInnen mit einem Rearrangement im TEL- Genlokus nur eine/ einer eine allogene Knochenmarktransplantation erhielt. Bei den PatientInnen mit einer germline- Konfiguration im TEL- Genlokus lag dagegen das Verhältnis der transplantierten mit 18,3% (11 von 60 PatientInnen) jedoch etwas unter dem der nicht getesteten mit 23,3% (73 von 313 PatientInnen).

Die Ergebnisse des Therapieansprechens (siehe Tabelle Nr. 16) zeigen, dass vier von fünf (80%) TEL- Rearrangement positiven PatientInnen eine zweite komplette Remission (2. CR; second complete remission) erreichten. Bei den TEL- Rearrangement negativen PatientInnen waren es 43 von 60 PatientInnen (71,7%). Eine/ einer der positiv getesteten PatientInnen, die eine 2. CR erreichten, entwickelte später ein Zweitmalignom und eine/ einer rezidivierte erneut. Bei den positiv getesteten PatientInnen verstarb keine/ keiner in der 2. CR, dagegen waren bei den negativ getesteten fünf tödliche Ereignisse zu verzeichnen. Es fand sich des weiteren in der positiv getesteten Gruppe kein Therapie- Non- Responder, im Vergleich zu acht PatientInnen in der negativ getesteten Gruppe, die nicht auf die Therapie ansprachen. Eine/ einer der TEL- Rearrangement positiven PatientInnen verstarb in der Induktionsphase der Therapie, während sich lediglich zwei weiterhin in zweiter kompletter Remission befinden. 15 von 60 (25%) der im TEL- Genlokus germline- konfigurierten PatientInnen befinden sich weiterhin in zweiter kompletter Remission.

TEL- Rearrangement

nicht getestet

+

-

gesamt

getestet

n =

313

5

60

65

Response

Remission

236
(75,4%)

4
(6,2%)

43
(66,1%)

47
(72,3%)

non- response

23
(7,3%)

-

8
(12,3%)

8
(12,3%)

Induktionstod

20
(6,4%)

1
(1,5%)

2
(3,1%)

3
(4,6%)

Angabe fehlt

34
(10,9%)

-

7
(10,8%)

7
(10,8%)

Folgeereignis

in CCR

109
(34,8%)

2
(3,1%)

15
(23,1%)

17
(26,2%)

verstorben in CR (Therapietod)

20
(6,4%)

-

5
(7,7%)

5
(7,7%)

Zweitmalignom

2
(0,64%)

1
(1,5%)

-

1
(1,5%)

erneut rezidiviert

138
(44,1%)

1
(1,5%)

29
(44,7%)

30
(46,2%)

non- responder/ progressiv disease

24
(7,7%)

-

9
(13,8%)

9
(13,8%)

verstorben ohne CR (Induktionstod)

20
(6,4%)

1
(1,5%)

2
(3,1%)

3
(4,6%)

Tabelle 16: Klinischer Verlauf von Kindern mit einem Rezidiv einer B- Vorläuferzell- ALL der Therapiestudien ALL-REZ BFM 83-95. (CR = complete remission; CCR = continuous complete remission)

Korrelation der Ergebnisse bezüglich der prognostischen Aussage
- Charakterisierung des Behandlungserfolgs der PatientInnen mit einem Genrearrangement im TEL- Lokus
- ereignisfreie Überlebenswahrscheinlichkeiten
Aus der im vorigen Abschnitt dargestellten Charakterisierung des Rezidivverlaufes ergab sich bei den PatientInnen mit einer für den TEL- Genlokus positiv getesteten Rekombination eine mediane Beobachtungszeit von 77 Monaten (6,4 Jahren). Diese Gruppe weist damit eine wesentlich längere mediane Beobachtungszeit auf als die der TEL- Rearrangement negativen PatientInnen mit 20 Monaten (1,7 Jahren) und die der nicht getestet Vergleichsgruppe mit 26 Monaten (2,2 Jahren).

Anschließend soll hinzugefügt werden, dass die zwei sich bis heute in kompletter Remission befindenden positiven PatientInnen über acht Jahre beobachtet wurden.

TEL- Rearrangement

nicht

getestet

+

-

n =

313

5

60

Beobachtungszeitraum

(in Monaten)

Median

26

77

20

Minimum

0,2

0,9

0,85

Maximum

153

98

138

Tabelle 17: Median und Interquartilsabstand der Variablen bei dem auf TEL- Rekombinationen getesteten und nicht getesteten RezidivpatientInnenkollektiv („gesamt“ entspricht n= PatientInnenzahl; die PatientInnenzahl beträgt insgesamt 378).

Wie die Abbildung Nr. 13 veranschaulicht, zeigt die Analyse der Wahrscheinlichkeit des ereignisfreien Überlebens nach Kaplan Meier (EFS, event free survival time) (Life- Table- Analyse) nach dem ersten Rezidiv einer BVZ- ALL eine höhere Wahrscheinlichkeit des ereignisfreien Überlebens in der Gruppe der PatientInnen mit einer Rekombination im TEL- Genlokus zu dem Zeitpunkt, zu dem etwa die Hälfte der nicht getesteten PatientInnen ein Folgeereignis erlitt. Die Gruppe der TEL- Rearrangement negativen PatientInnen zeigt insgesamt eine niedrigere Wahrscheinlichkeit eines ereignisfreien Überlebens.

Abbildung 13: Life- Table- Untersuchung nach Kaplan Meier. Überlebenswahrscheinlichkeit von Kindern mit 1. Rezidiv von B- Vorläuferzell- ALL der Therapiestudien ALL-REZ BFM 83-95 (Chemotherapie) in Abhängigkeit vom TEL- AML1 Status.