Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Functional genome analysis of the plant-growth promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42; characterizing its production and regulation of nonribosomal peptide synthetases

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Dipl. Chem. Alexandra Koumoutsi

Dekan: Prof. Dr. Christian Limberg

Gutachter:
1. Professor Dr. Rainer Borriss
2. PD Dr. habil. Joachim Vater

eingereicht: 11.10.2006

Datum der Promotion: 04.12.2006

Summary

Bacillus amyloliquefaciens is a Gram-positive bacterium that is widely distributed in the soil. It colonizes the plant roots and several of its natural isolates, such as the FZB42 strain, are used as bio-fertilizers, since they can promote plant growth and suppress plant pathogenic organisms. The features and mechanisms governing the biocontrol-related function of the strain have not yet been fully characterized. The domesticated strain of B. subtilis 168, a model organism for studies on Gram-positive bacteria, is closely related to B. amyloliquefaciens FZB42, but does not promote plant growth.

As a first approach to detect gene differentiation between B. amyloliquefaciens FZB42 and B. subtilis 168, and since only the genome sequence of the latter was known at that point, Suppression Subtractive Hybridization (SSH) was employed. Thereby, several unique genes of B. amyloliquefaciens FZB42 could be identified. Among others, it was established that the genome of B. amyloliquefaciens FZB42 harbours genes with high similarity to nonribosomal peptide synthetases and polyketide synthases of various Bacillus species, yet different from the ones present in the genome of B. subtilis 168.

Meanwhile, our laboratory became engaged in a project aiming to define the complete genome sequence of B. amyloliquefaciens FZB42, in collaboration with the GenoMik Network in Göttingen. The major part of the work and the co-ordination of the whole process were performed by Xiao-Hua Chen and myself. Shotgun and fosmid library approaches, primer walking and multiplex PCR were used in order to decipher the complete sequence of B. amyloliquefaciens FZB42. Sequencing of the whole genome has since been completed and the second round of annotation is currently in process (performed by Xiao-Hua Chen).

Strain FZB42 is the first member of the B. amyloliquefaciens species to have its genome sequenced. The genome of strain FZB42 consists of a single circular chromosome of 3916 kb, and thus is smaller than that of B. subtilis 168 (4214 kb). It contains 3931 genes, 80% of which show more than 50% amino acid similarity to genes of B. subtilis 168. Comparative genome analysis revealed several characteristics of the bacterium that might be associated with its biocontrol activity. Striking is the presence of eight gene clusters that control the non-conventional synthesis of secondary metabolites, some of which with reported antifungal and antibacterial activities.

B. amyloliquefaciens FZB42 possesses the srf, fen, pks1 (bae), bac and dhb operons, which are responsible for the synthesis of surfactin, fengycin, bacillaene, bacilysin and bacillibactin, respectively, and are also shared by B. subtilis 168. In addition, and as initially detected by the SSH experiments, the genome of B. amyloliquefaciens FZB42 contains the bmy, dif, pks2 gene clusters, which control the synthesis of bacillomycin D, difficidin/oxydifficidin and macrolactin respectively. The functionality of all eight gene-clusters was verified by a series of mass spectrometry analysis (MALDI-TOF MS and HPLC-ESI MS), in collaboration with Xiao-Hua Chen and Dr J. Vater. It is conceivable that the profound genetic capacity of B. amyloliquefaciens FZB42 to produce antagonistically acting secondary metabolites enables the strain to cope successfully with competitors within its natural environment and to promote plant growth. Therefore, the biological activity of those compounds was further examined. Bacillomycin D and fengycin were the only antibiotics produced by the strain, which could exhibit a general inhibitory effect on fungal growth, acting in a synergistic manner.

A further issue pursued in this work was to identify the regulatory pathways that govern the expression of bacillomycin D. Global regulators, such as DegU, DegQ and ComA, the alternative sigma factors, σB and σH, and a novel Rap protein were found to affect the transcriptional activation of the main promoter of the bmy operon identified in this work. In particular, DegU was shown to mediate its effects, after binding directly to two distinct A/T-rich sites at the bmy promoter region. The other regulatory players were associated with more indirect effects, which were mostly exerted via DegQ, a protein that seems to optimise the activity of DegU, or via DegU itself.

DegU was shown to play an additional role on bacillomycin D production, presumably a post-transcriptional one, apart from activating the main promoter of the bmy operon. Therefore, its presence was critical for the production of bacillomycin D. Similarly, YczE, a membrane protein of unknown function, encoded adjacently to sfp (a 4'-phosphopantetheinyl transferase that post-translationally modifies nonribosomal peptide synthetases and makes them functionally active), proved to be essential for bacillomycin D production, but dispensable for the production of the rest peptide antibiotics produced by B. amyloliquefaciens FZB42. The effect was mediated at a post-transcriptional level (prior to the peptide’s export) and was independent of DegU.

To conclude, this work provides information concerning the genetic identity of B. amyloliquefaciens FZB42, its lifestyle and its production of secondary metabolites by it. In addition, it defines the complex regulatory network that controls the expression of the most abundant lipopeptide of the organism, bacillomycin D. It is the first time that the gene expression of a member of the iturin-group antibiotics has been monitored.

Zusammenfassung

Bacillus amyloliquefaciens ist ein im Boden weit verbreitetes Gram-positives Bakterium. Es kolonisiert Pflanzenwurzeln und mehrere natürliche Isolate, wie zum Beispiel der Stamm FZB42 werden als Biodünger verwendet, da sie in der Lage sind, Pflanzenwachstum zu fördern und Pflanzenpathogene zu unterdrücken. Die Eigenschaften und Mechanismen, welche dieseBiokontrollfunktionen steuern wurden bislang noch nicht vollständig charakterisiert. Der domestizierte Stamm B. subtilis 168, ein Modellorganismus für Studien an Gram-positiven Bakterien, ist eng verwand mit B. amyloliquefaciens FZB42, fördert jedoch kein Pflanzenwachstum.

Als ein erster Ansatz zur Ermittlung von Gendifferenzen zwischen B. amyloliquefaciens FZB42 und B. subtilis 168 - wobei zum damaligen Zeitpunkt nur die Genomsequenz letzteren Organismus bekannt war - wurde die “Supression Subtractive Hybridisation”(SSH) angewandt. Hierdurch wurden mehrere einzigartige Gene in B. amyloliquefaziens identifiziert. Unter anderem wurde gezeigt, dass das Genom von B. amyloliquefaziens FZB42 Gene mit starker Ähnlichkeit zu nichtribosomalen Peptid-Synthetasen und Polyketid-Synthasen verschiedener Bacillus-Arten beinhaltet, die sich jedoch von den im B. subtilis 168-Genom enthaltenen Genen unterscheiden.

Unterdessen beteiligte sich unser Labor in Kollaboration mit dem GenoMik Network in Göttingen an einem Projekt, dessen Ziel die komplette Sequenzierung des Genoms von B. amyloliquefaciens war. Der Hauptanteil der Arbeit, sowie die Koordination des gesamten Projekts wurden von Xiao-Hua Chen und mir selbst durchgeführt. Zur Entschlüsslung der vollständigen Genomsequenz von B. amyloliquefaciens wurden Shotgun und Fosmid-Library Ansätze, Primer walking und Multiplex-PCR angewandt. Die Sequenzierung des gesamten Genoms wurde mittlerweile abgeschlossen und derzeitige Arbeiten sind bis zur zweiten Annotationsrundevorangeschritten (durchgeführt von Xiao-Hua Chen).

Der Stamm FZB42 ist das erste Mitglied der B. amyloliquefaziens-Art, dessen Genom sequenziert wurde. Das Genome von Stamm FZB42 besitzt ein einziges kreisförmiges und 3916 kb großes Chromosom, das damit kleiner ist als das Chromosom von B. subtilis 168 (4214 kb). Es enthält 3931 Gene, von denen 80% mehr als 50%ige Aminosäuren-Ähnlichkeit mit Genen von B. subtilis zeigen. Vergleichende Genomanalysen offenbarten mehrere Charakteristika des Bakteriums, welche mit seiner Biokontrollaktivität assoziiert sein könnten. Auffällig ist die Präsenz von acht Genclustern, die die unkonventionelle Synthese von sekundären Metaboliten kontrollieren, von denen einige bereits beschriebene antifungale und antibakterielle Aktivitäten besitzen.

B. amyloliquefaciens FZB42 besitzt die srf, fen, pks1 (bae), bac und dhb Operons, welche für die Synthese von Surfactin, Fengycin, Bacillaene, Bacilysin und Bacillibactin verantwortlich sind und die ebenfalls im Genom von B. subtilis 168 enthalten sind.Wie bereits durch die anfänglichen SSH-Experimente gezeigt worden war, beinhaltet das Genom von B. amyloliquefaciens FZB42 die bmy-, dif-, pks2-Gencluster, die die Synthese von Bacillomycin D, Difficidin/Oxydifficidin und Macrolactin kontrollieren.Die Funktionalität dieser acht Gencluster wurde in Zusammenarbeit mit Xiao-Hua Chen und Dr. J. Vater durch eine Serie von Massenspektrometrie-Analysen (MALDI-TOF MS and HPLC-ESI MS) nachgewiesen. Es ist vorstellbar, dass die umfangreiche genetische Kapazität, antagonistisch wirkende sekundäre Metabolite zu produzieren, es B. amyloliquefaciens FZB42 ermöglicht, erfolgreich gegen Konkurrenten in seiner natürlichen Umgebung vorzugehen und das Pflanzenwachstum zu fördern.Daher wurde die biologische Aktivität dieser Komponenten weiter untersucht. Bacillomycin D und Fengycin waren die einzigen von diesem Stamm produzierten Antibiotika, welche einen generellen inhibitorischen Effekt auf das Wachstum von Pilzen zeigten, wobei sie in synergistischer Weise wirkten.

Ein weiteres in dieser Arbeit verfolgtes Ziel war die Identifizierung der regulatorischen Wege, die die Expression von Bacillomycin D steuern. Es wurde gezeigt, dass globale Regulatoren, wie beispielsweise DegU, DegQ und ComA, die alternativen Sigmafaktoren σB und σH und ein neuartiges Rap-Protein die transkriptionale Aktivität des in dieser Arbeit identifizierten Hauptpromotors des bmy-Operons beeinflussen. Insbesondere wurde gezeigt, dass DegU seine Effekte nach direkter Bindung an zwei unterschiedliche A/T-reiche Regionen im bmy-Promotor ausübt. Die anderen Regulatoren wurden mit eher indirekten Effekten assoziiert, welche meist über DegU oder DegQ ausgeübt wurden. Letzteres Protein scheint die Aktivität von DegU auf unbekannte Weise zu optimieren.

Es wurde außerdem gezeigt, dass DegU abgesehen von der Aktivierung des Hauptpromoters des bmy-Operons eine zusätzliche, vermutlich post-transkriptionale Rolle bei der Bacillomycin D-Produktion spielt. Daher war die Präsenz von DegH essentiell für die Produktion von Bacillomycin D. Auf ähnliche Weise erwies sich YczE, ein Membranprotein unbekannter Funktion, das neben sfp (eine 4´-Phosphopantetheinyl-Transferase, die nichtribosomale Peptide post-translational modifiziert und sie aktiviert) kodiert liegt, als essentiell für die Bacillomycin D-Produktion, jedoch als entbehrlich für die Produktion der restlichen von B. amyloliquefaciens FZB42 produzierten Peptid-Antibiotika. Der Effekt wurde auf einem post-transkriptionalen Level ausgeübt (vor dem Peptid-Export) und war unabhängig von DegU.

Abschließend kann gesagt werden, dass diese Arbeit Informationen über die genetische Identität von B. amyloliquefaciens FZB42, seine Lebensweise und die Produktion sekundärer Metabolite durch das Bakterium liefert. Außerdem definiert sie das komplexe regulatorische Netzwerk, das die Expression des meistvorhandenen Lipopeptides des Organismus, Bacillomycin D, kontrolliert. Es ist die erste Untersuchung der Genexpression eines Mitglieds Gruppe der Antibiotika von Iturin.

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23.01.2007