1 Einleitung

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In der vom Robert-Koch-Institut publizierten Dachdokumentation Krebs wurden für das Jahr 2004 395.000 Krebsneuerkrankungen in Deutschland registriert (www.rki.dehttp://www.rki.de; “Krebs in Deutschland”). Tumorerkrankungen sind die zweithäufigste Todesursache und werden laut prognostischen Schätzungen in den kommenden Jahren den ersten Platz einnehmen. Nicht nur aufgrund dieser Statistiken sind die Bemühungen um eine verbesserte Krebstherapie enorm; das Spektrum reicht von chirurgischer Entfernung des neoplastischen Gewebes über Strahlentherapie bis hin zur Chemotherapie. Die Suche nach neuen antineoplastisch wirksamen Substanzen stellt eine permanente Aufgabenstellung der Pharmakologie und Krebsforschung dar. Häufig verursachen jedoch die eingesetzten Therapeutika ungewollte, die Gesundheit des Patienten stark beeinträchtigende Nebenwirkungen, wobei noch hinzukommt, daß Resistenzen der Krebszellen gegen die eingesetzten Medikamente eine effiziente Therapie verhindern.

Die Ursachen einer Krebserkrankung liegen in genetischen und epigenetischen Veränderungen der Tumorzellen im Vergleich zu nicht entarteten Zellen. Für die Entwicklung neuer wirksamer Medikamente ist es daher erstens maßgeblich, Gene, die speziell in Tumorzellen ausgebildet werden und im Zusammenhang mit der Erkrankung stehen, zu identifizieren und zweitens, neue Wege zu erschließen, solche
Krebs-assoziierten Gene gegebenenfalls spezifisch, effizient und nebenwirkungsfrei auszuschalten, um damit die Heilungschancen von Patienten zu erhöhen. Um dieser Zielsetzung gerecht zu werden, ist die Entwicklung neuer Behandlungsformen, beispielsweise der Gentherapie, unumgänglich. Der Begriff Gentherapie umfaßt das Einbringen von Konstrukten in die Zielzellen, die der Erkrankung von Patienten durch die Veränderung von Genexpressionen auf molekularer Ebene entgegenwirken sollen. Die gentherapeutisch eingebrachten Konstrukte können vielgestaltig sein. Eine Möglichkeit, Gene mit Hilfe von künstlich in die Zielzellen eingebrachten Molekülen auszuschalten bieten RNA-Technologien. Dabei können Transkripte von spezifischen Genen durch Bindung von einer komplementären RNA verändert und infolgedessen in den Zielzellen abgebaut werden. Die Expression des Zielgens kann somit verhindert werden.

Die nachfolgenden Kapitel gehen auf die Chemotherapie von Tumoren und die Wirkweise einiger in der Arbeit verwendeter Therapeutika sowie die Mechanismen von Chemoresistenz ein. Desweiteren werden die grundlegenden Eigenschaften von Ribozymen sowie ihre Verwendung als neue Medikamente in der Gentherapie von Krebserkrankungen diskutiert.

1.1  Chemotherapeutische Behandlung maligner Tumoren

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Tumorerkrankungen können im wesentlichen durch chirurgische Entfernung des entarteten Gewebes, durch Bestrahlung und durch den Einsatz von chemotherapeutisch wirksamen Substanzen behandelt werden. Insbesondere für lokal nicht begrenzte Tumoren, wie Leukämien, oder viele durch Absiedlung von Zellen aus dem Primärtumor entstehende Metastasen stellt die Entwicklung systemisch wirksamer Arzneimittel eine wesentliche Erweiterung der Möglichkeiten in der Krebstherapie dar und hat zur Verbesserung der Behandlungsergebnisse beigetragen. Häufig werden in der adjuvanten Tumortherapie sogenannte Zytostatika eingesetzt. Dieser Begriff umfaßt eine chemisch heterogene Gruppe von zytotoxischen Substanzen, die die Teilung funktionell aktiver Zellen verhindern oder verzögern. Entsprechend ihres Eingriffs in den Zellzyklus wird zwischen phasenspezifischen (blockieren eine spezielle Phase des Zellzyklus) und phasenunspezifischen Zytostatika unterschieden. Funktionell können Zytostatika auf vielerlei Weise wirksam werden: etwa indem sie durch Alkylierung von Nukleinsäuren zu Veränderungen der DNA führen (DNA-Quervernetzung, Basen-Fehlpaarungen etc.), durch Inhibition der Topoisomerasen oder Hemmung der Polymerasen I, III, Primasen, Ligasen, Telomerasen bis hin zu Zellschädigung durch Radikale sowie Interkalation. Dabei ist es möglich, daß die gleiche Substanz über verschiedende Mechanismen den Zellzyklus blockiert.

Das Spektrum an Chemotherapeutika ist heutzutage immens. Allerdings sind die an sie gestellten großen Erwartungen bisher nicht erfüllt worden. Nur wenige Tumore, wie z.B. Wilms-Tumor, akute Leukämien oder testikuläres Karzinom, sind durch Chemotherapie vollständig heilbar. In der Gesamtheit der Krebserkrankungen machen sie nur einen sehr geringen Anteil aus (Neumann, 1992). Bei anderen Tumoren kann die Chemotherapie lebensverlängernd wirken, etwa beim Ovarialkarzinom, Brustkrebs oder Prostatakarzinom. Bei zahlreichen anderen Krebserkrankungen, darunter den am häufigsten vorkommenden Entitäten, wie dem metastasierenden Bronchial- oder Mammakarzinom, ist eine Lebensverlängerung bisher nicht möglich (Neumann, 1992; Zeller und zur Hausen, 1995).

Nichtsdestoweniger werden auf dem Gebiet der Chemotherapie weiter Fortschritte erzielt. Dazu zählen neue Erkenntnisse über die Proliferationskinetik von Tumoren und den Wirkmechanismus der meist empirisch gefundenen zytostatischen Stoffe sowie die Resistenzmechanismen der Krebszellen. Durch Kombination von Wirkstoffen, wie sie in der Polychemotherapie von Tumoren angewandt werden, lassen sich die Therapieergebnisse deutlich verbessern (Neumann, 1992; Licht, 1998). Aus der Vielzahl von zytostatisch wirksamen Substanzen sollen in den folgenden Kapiteln drei Vertreter, die in der Arbeit Verwendung fanden, kurz vorgestellt werden.

1.1.1  Daunorubicin und Mitoxantron

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Daunorubicin zählt strukturell zu den Anthrazyklinen und besteht aus einer tetrazyklischen Ringverbindung, die Quinon-Hydroquinon-Gruppen enthält. Ein Zuckermolekül, das Daunosamin, ist zudem an die Ringverbindung glykosidisch gebunden (s. Abb. 1). Die Aufnahme des Anthrazyklins in die Zelle erfolgt über Diffusion.

Abbildung 1: Strukturformeln von Daunorubicin (A) und Mitoxantron (B)

Daunorubicin wird vorwiegend in akuten lymphoblastischen und myoblastischen Leukämien angewendet. Trotz der verschiedenen Einsatzmöglichkeiten wird eine erfolgreiche Anwendung des Anthrazyklins durch die Ausbildung von Resistenzmechanismen in Tumorzellen sowie durch seine hohe toxische Wirkung auf gesundes Gewebe, welches sich in erster Linie in chronischer Kardiomyopathie und kongestivem Herzversagen äußert, stark beeinträchtigt.

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Mitoxantron ist ein synthetisches Anthracendion. Es besteht aus einem planaren Anthrachinonringsystem, an das zwei identische Aminoalkylseitenketten gebunden sind (s. Abb. 1). Die Aufnahme von Mitoxantron in die Zelle erfolgt über Diffusion. In diesem Zusammenhang wurde eine Veränderung der Lipidzusammensetzung der Plasmamembran nach Mitoxantronakkumulation beobachtet, die sich positiv auf die Zytostatikumsaufnahme auswirkt. Die veränderte Membranpermeabilität begünstigt wahrscheinlich die Assoziation von Mitoxantron und Plasmamembran und führt zur Diffusion der Substanz in die Zelle (Burns et al., 1988).

Mitoxantron wird beispielsweise bei Brustkrebs, Leukämien und androgen-unabhängigen Prostatakarzinomen eingesetzt. Frühe Berichte über Mitoxantron nährten die Hoffnung, daß dieses Anthracendion weniger kardiotoxisch ist als beispielsweise Daunorubicin. Allerdings haben aktuellere Untersuchungen diese Vermutung nicht bestätigt.

Aufgrund der planaren Ringsysteme interkalieren beide Substanzen in Nukleinsäuren und hemmen die RNA- und DNA-Synthese. Außerdem werden die Topoisomerasen I und II inhibiert und die DNA der Zelle permanent geschädigt. Solche DNA-Schäden sind Strangbrüche, Quervernetzungen, Aggregation und Kondensation von DNA und Chromosomenabberationen. Ein Resultat dieser zahlreichen DNA-Schäden ist die Blockierung des Zellzyklus, vor allem in der späten S-Phase. Darüber hinaus werden Makromoleküle alkyliert und Helikasen gehemmt (Neumann, 1992) sowie freie Radikale freigesetzt, die zur Schädigung der DNA und Lipid-Peroxidation führen. Aus den zahlreichen Zellschädigungen resultiert die Induktion von Apoptose (Übersichten: Gewirtz, 1999, Minotti et al., 2004).

1.1.2 Cisplatin

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Cisplatin besteht aus einem neutralen, anorganischen, planaren Komplex, bei dem ein zentrales Platinum mit jeweils zwei Chlorid- und Amin-Ionen verbunden ist (s. Abb. 2). Dieser Komplex ist in der Lage, mit der zellulären DNA zu interagieren. Dabei wird das neutrale Cisplatin durch mehrfache spontane Hydratisierungsreaktionen aktiviert, welche in erster Linie die cis-gebundenen Chlorid-Ionen durch Wassermoleküle ersetzen (Kelland, 2000).

Abbildung 2: Strukturformel von Cisplatin

In der Krebstherapie spielt Cisplatin eine bedeutende Rolle, besonders für die Behandlung von Tumoren des Ovars, der Testis oder Kopf- und Hals-Tumoren (Prestayko et al., 1979).

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Die Zytotoxizität von Cisplatin ist primär durch seine Interaktion mit den nukleophilen N7-Atomen in Purinbasen gekennzeichnet. Dadurch entstehen DNA-Protein und DNA-DNA-Interstrang bzw. Intrastrang-Querverbindungen (Eastman, 1987), wobei die Cisplatin-induzierten DNA-Intrastrang-Addukte, die zu großen Läsionen innerhalb eines DNA-Moleküls führen, für die Zytotoxizität von Cisplatin hauptverantwortlich sind (Pinto and Lippard, 1985). Durch die DNA-Intrastrang-Addukte werden zahlreiche Protein-Kaskaden aktiviert, die an derart geschädigte DNA binden (Bellon et al., 1991). Dazu gehören beispielsweise Proteine des zellulären "Mismatch-Repair-Komplexes" (Chaney and Vaisman, 1999). Cisplatin kann daher zum zellulären Arrest in der S- oder G2/M-Phase des Zellzyklus führen. Ebenfalls aktivieren die Cisplatin-induzierten DNA-Schäden apoptotische Signalwege der Zelle, vorrangig über p53, p73 und MAPK (Übersicht: Siddik, 2003).

1.2 Chemoresistenzen von Tumorzellen

Chemotherapeutika sind die effektivste Methode der Behandlung metastasierender Tumoren. Allerdings sind Krebszellen oftmals in der Lage, Chemotherapeutikaresistenzen (kurz: Chemoresistenzen) zu entwickeln, die die Hauptursache für das Scheitern einer Chemotherapie sind und damit die erfolgreiche Behandlung einer Tumorerkrankung verhindern. Unter Chemoresistenz versteht man die im Vergleich zu einer anderen Zelle verminderte Empfindlichkeit einer Zelle gegenüber einem Zytostatikum. Die Unempfindlichkeit von Tumoren gegenüber Zytostatika ist auf unterschiedliche Ursachen zurückzuführen: Die applizierten Therapeutika sind für den speziellen Tumor ungeeigent, die Medikamentenkonzentrationen am Wirkort sind zu gering oder es wird mit einer Kombination von Substanzen behandelt, die sich in ihrer Wirkung gegenseitig abschwächen (Pluen et al., 2001; Jain, 2001). Neben diesen Gründen sind fast immer molekulare Mechanismen in den entsprechenden Zytostatika-unempfindlichen Tumorzellen mit dem Auftreten von Chemoresistenz verbunden; diesbezügliche Beispiele sind in der folgenden Auflistung zusammengefaßt und in Abb. 3 schematisch dargestellt (Übersicht: Gottesman, 2002):

1.

Aktiver Auswärtstransport durch Ausbildung von Effluxpumpen (d.h. Proteine, die Stoffe aus der Zelle heraustransportieren können)

2.

Erniedrigte Zytostatikumsaufnahme

3.

erhöhtes Zielmolekül (auf das der Angriff der Zytostatika erfolgt) erhält Zellstoffwechsel aufrecht

4.

verändertes Zielmolekül verhindert Zytostatikabindung

5.

verstärkte DNA-Reparatur

6.

Zytostatikum wird metabolisiert und dadurch unwirksam

7.

Verhinderung der Apoptose durch Beeinflussung der Zellzyklus-Kontrolle und Apoptosewege

8.

räumliche Trennung des Zytostatikums zum Wirkort (Kompartimetierung)

9.

Veränderung der Membranlipidzusammensetzung

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Abbildung 3: Mechanismen der Chemoresistenz (verändert nach Gottesman, 2002)

Z: Zytostatikum

Neben den Chemoresistenzfaktoren, die die Medikamente spezifisch in ihrer Wirkung beeinträchtigen, spielen auch unspezifische Faktoren eine Rolle: Hypoxie, Hitzeschock oder langsames Tumorwachstum (Gottesman, 2002).

Durch Chemoresistenzen können entweder einzelne Klassen von Medikamenten wirkungslos werden oder es tritt eine simultane Resistenz gegen Chemotherapeutika mit unterschiedlicher Struktur und Wirkmechanismen auf (Licht, 1998). Dieses Phänomen wird Vielfachresistenz oder Multidrug-Resistenz, kurz MDR, genannt (Pastan and Gottesman, 1987). Dabei wird zwischen intrinsischer/primärer und erworbener/sekundärer MDR unterschieden (Chin et al., 1993). Intrinsische bzw. primäre MDR liegt dann vor, wenn ein Tumor schon a priori eine Vielfachresistenz aufweist. Dies ist häufig bei Tumoren des Gastrointestinaltraktes, der Leber und der Niere zu beobachten. Erworbene oder sekundäre MDR tritt erst nach oder während der Chemotherapie auf. Auslöser hierfür sind in der Regel die eingesetzten Zytostatika selbst, die eine Selektionierung resistenter Tumorzellen hervorrufen. Experimentell und klinisch wurde bestätigt, daß die Expressionen bestimmter Gene auf zellulärer Ebene für die MDR von Tumorzellen verantwortlich sind. Mehrere MDR-verursachende Gene und die Wirkmechanismen ihrer Genprodukte konnten bereits identifiziert werden.

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Das zuerst identifizierte MDR-assoziierte Gen wurde nach dem Phänomen der Multidrug-Resistenz als MDR1 benannt. Vielfachresistenz, die im Zusammenhang mit der Überexpression von MDR1 steht, wird auch als klassische MDR bezeichnet. Das Genprodukt ist ein integrales Glykoprotein der Plasmamembran (auch Permeabilitätsglykoprotein; P-Gp), das in seiner Funktion als Effluxpumpe in der Lage ist, verschiedenste Chemotherapeutika aus der Zelle herauszutransportieren und daher zelluläre Resistenzen gegenüber diesen Substanzen zu verursachen (s. Kap. 1.2.2.1).

Tumorzellen können jedoch auch andere Mechanismen der Vielfachresistenz aufweisen, die nicht mit der Expression von P-Gp im Zusammenhang stehen und daher als atypische oder P-Gp-unabhängige MDR bezeichnet werden (Moscow and Cowan, 1988; Lage, 1999).

1.2.1  Bedeutung von ABC-Transportern

Bei der in vitro-Selektion von Krebszellen mit zytotoxischen Krebsmedikamenten, beispielsweise mit den in der Arbeit verwendeten Substanzen Daunorubicin, Mitoxantron und Cisplatin, wird oftmals ein verstärkter ATP-abhängiger Efflux (Auswärtstransport) der zytotoxischen Substanzen festgestellt, welcher mit der Herausbildung eines MDR-Phänotypes einhergeht. Genauere Untersuchungen in solchen multidrug-resistenten Zellen haben ergeben, daß ABC-Transporter an der Ausbildung der MDR beteiligt sind.

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Die Superfamilie der ABC-Transporter ist eine der größten Proteinfamilien und in allen Organismenbereichen vertreten (Archaea, Bacteria und Eukarya). Die Bezeichnung ABC-Transporter basiert auf dem Vorhandensein der hochkonservierten ATP-Bindungskassette (TP- inding assette) (Higgins, 1992). Die Kassetten (oder funktionelle Domänen) sind die Grundlage für einen energiegekoppelten Substrattransport (Schneider and Hunke, 1998) entgegen einem Konzentrationsgradienten. In der Primärstruktur der zytoplasmatischen ATP-bindenden Kassetten befinden sich zwei hochkonservierte Sequenzmotive, die als "Walker Boxen A und B" bezeichnet werden und eine Nukleotidbindetasche bilden (Walker et al., 1982).

Im humanen Genom wurden bisher 48 ABC-Transportergene identifiziert (Dean et al., 2001). Aufgrund von Aminosäuresequenzanalysen ihrer ATP-bindenden Domänen wurden sie in sieben Unterfamilien eingeteilt, die mit ABCA-ABCG bezeichnet werden. Die Gene einer Unterfamilie weisen neben Homologien der ATP-Bindedomäne auch meist Übereinstimmungen in den Transmembrandomänen auf.

Die humanen ABC-Transporter fungieren als zelluläre Effluxpumpen zur Kontrolle intrazellulärer Konzentrationen potentiell schädlicher Substanzen. Sie haben dabei insgesamt ein breites Spektrum an Stoffklassen, die von ihnen durch Membranen transportiert werden können: Ionen, Phospholipide, Polysaccharide, Steroide, Aminosäuren, Gallensalze und Peptide für die Antigenpräsentation. Aufgrund ihrer Substratspezifität kommt dabei einigen ABC-Transportern neben ihrer physiologischen Funktion eine bedeutende Rolle beim Transport von Medikamenten und deren Metaboliten zugute, was zur Ausbildung von Mehrfachresistenzen führen kann. Bislang konnte für 13 humane ABC-Transporter ein Transport von Chemotherapeutika nachgewiesen werden, von denen jedoch nicht alle zwangsläufig Vielfachresistenzen in Tumorzellen verursachen.

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In der nachstehende Tabelle werden die 13 ABC-Transporter genannt, deren Substratspektrum Chemotherapeutika einschließt. Dabei werden sowohl die Subfamilienzuordnungen aufgeführt als auch die Trivial- oder Kurzbezeichnungen, welche in zahlreichen Publikationen zu finden sind.

Tabelle 1: Chemotherapeutika-transportierende ABC-Transporter

ABC-Transporter Subfamilie

Kurzbezeichnung

Name und Referenz

ABCB1

MDR1/P-Gp

ulti rug esistance Protein 1 / - lyco rotein (Juliano and Ling, 1976)

ABCB2-3

TAP1-2

ransporter associated with ntigen rocessing 1-2 (Lage et al., 2001)

ABCB11

SPGP

ister of - (Childs et al., 1998)

ABCC1-6; ABCC10-12

MRP1-6;

MRP7-9

D associated rotein 1-9 (Übersicht zu MRP1-6 in: Leonard et al., 2003; MRP7-8: Augustine et al., 2005; MRP9: Yasui et al., 2004)

ABCG2

BCRP/MXR/ABCP

reast ancer esistance rotein / ito antrone esistance / TP- inding assette lacenta (Doyle et al., 1998)

Von den in Tab. 1 aufgeführten ABC-Transportern sind nur einige für die Entstehung von Vielfachresistenzen in Tumorzellen beteiligt, u.a. MDR1/P-Gp, MRP2 und BCRP, auf die die folgenden Kapitel genauer eingehen.

1.2.2 Die ABC-Transporter MDR1/P-Gp, BCRP und MRP2

1.2.2.1  MDR1/P-Gp/ABCB1

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Oftmals wird in kultivierten und mit einem bestimmten Therapeutikum selektionierten Tumorzellen Multidrug-Resistenz aufgrund der Expression eines membranständigen ABC-Transporters, dem P-Glykoprotein (P-Gp), beobachtet. P-Gp wurde 1976 von Juliano und Ling als Genprodukt des MDR1-Genes beschrieben (Juliano and Ling, 1976). Dieser Transporter gehört als ABCB1 zur B-Unterfamilie der ABC-Proteine. Das MDR1-kodierende Gen befindet sich auf Chromosom 7q21.1. MDR1/P-Gp ist in unterschiedlichen normalen humanen Geweben, meist exkretorischer Art wie Niere, Leber und Darm ausgebildet und nimmt eine bedeutende Rolle bei der zellulären Sekretion von Steroiden und potentiell gefährlichen Metaboliten ein. In Mäusen existieren zum humanen MDR1 homologe Gene, die als Abcb1a und Abcb1b bezeichnet werden. In sogenannten knock-out Experimenten, bei denen diese Gene in den entsprechenden Mäusen homozygot ausgeschaltet wurden, zeigte sich ein vorerst normaler Phänotyp, der jedoch extrem anfällig gegenüber neurotoxischen Substanzen ist (Schinkel et al., 1994 und 1997). Durch diese Studien wurde deutlich, daß MDR1/P-Gp ein bedeutender Transporter an der Blut-Hirn-Schranke ist. Darüber hinaus wurde das Gen in Stammzellen exprimiert gefunden, wo es ebenfalls eine Schutzfunktion gegen toxische Substanzen einnimmt. Neben dieser natürlichen Funktion des MDR1/P-Gp kann seine Expression in der Chemotherapie bei Krebspatienten zu Resistenzen führen und damit eine erfolgreiche Behandlung unterbinden (Schellens et al., 2000). Die Expression des MDR1/P-gp ist vielfach in humanen Tumoren nachgewiesen worden, u.a. in Tumoren des Gastrointestinaltraktes (Leber, Pankreas), Tumoren des hämatopoetischen Systems (Myelom, Lymphom, Leukämien), Tumoren des Urogenitalsystems (Niere, Ovar, Testis) und bei Krebserkrankungen von Kindern (Neuroblastom, Fibrosarkom) (Goldstein et al., 1989). Aus Studien an unterschiedlichen Patientenkollektiven geht hervor, daß die Expression des MDR1-Genes mit der Entwicklung von Multidrug-Resistenz stark korreliert und demzufolge eine Inhibition des Genproduktes eine positive Wirkung auf den Erfolg einer Chemotherapie hat (Tidefelt et al., 2000; Surowiak et al., 2005).

1.2.2.2 BCRP/ABCG2

In verschiedenen multidrug-resistenten Zellinien, die nicht MDR1/P-Gp oder einen MRP-Transporter exprimieren, konnte ein ATP-abhängiger Efflux bestimmter Zytostatika festgestellt werden. Diese Beobachtung führte zur Identifizierung eines neuen Mitgliedes der G-Unterfamilie der ABC-Transporter, dem ABCG2. Aufgrund seiner Erstbeschreibung in der humanen Brustkrebszellinie MCF-7/AdrVp wurde der Transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) genannt (Doyle et al., 1998). Parallel wurde derselbe Transporter auch von anderen Gruppen entdeckt, so daß auch die Abkürzungen MXR für Mitoxantrone Resistance-Protein (Miyake et al., 1999) und ABCP für ABC-Transporter in Plazenta-Gewebe (Allikmets et al., 1998) Verwendung fanden. Das humane BCRP-Gen ist auf Chromosom 4q22 lokalisiert (Knutsen et al., 2000). In Tumorzellen kann die alleinige Ausbildung von BCRP zu einem MDR-Phänotyp führen (Doyle et al., 1998, Ross et al., 1999). Das BCRP hat ein Molekulargewicht von 72 kDa und ist in der zellulären Plasmamembran lokalisiert (Litman et al., 2000; Rocchi et al., 2000). Wie alle Mitglieder der G-Unterfamilie ist BCRP ein Halbtransporter. Um funktionelle Wirksamkeit zu erlangen, muß BCRP als Dimer vorliegen. Unterschiedliche Gruppen konnten für BCRP Homodimere nachweisen, was bislang einmalig für einen Vertreter der ABC-Transporter G-Subgruppe ist (Ozvegy et al., 2001 und 2002; Kage et al., 2002; Litman et al., 2002). In Mäusen existiert ein zum humanen BCRP homologes Gen, welches als bcrp1 bzw. abcg2 bezeichnet wird (Allen et al., 1999). Mit Hilfe von bcrp1 knock-out-Mäusen konnte nachgewiesen werden, das BCRP in vivo einerseits eine protektive Rolle vor Umwelt- und Nahrungsmittel-Xenotoxinen ausübt, andererseits aufgrund seiner Expression im Brustdrüsengewebe die Sekretion von toxischen Stoffen in die Muttermilch verursacht (Breedveld et al., 2005; Jonker et al., 2005; van Herwaarden et al., 2006). Die biologische Bedeutung dieser paradox erscheinenden Wirkweise ist noch nicht abschließend geklärt. Bei Krebspatienten mit akuter myeloider Leukämie korrelierte die Expression von BCRP mit dem Auftreten von Multidrug-Resistenz signifikant (Ross et al., 2000; Sargent et al., 2001; Steinbach et al., 2002). BCRP-Inhibitoren bewirken in Zellkulturen (Kowalski et al., 2002, 2004, 2005) sowie in Patienten eine Reversion des MDR-Phänotypes und stellen demzufolge eine Verbesserung der Effektivität der Chemotherapie dar (Lee 2004; Übersichtsartikel zu BCRP: Sarkadi et al., 2004; Lepper et al., 2005; Staud and Pavek, 2005).

1.2.2.3 MRP2/ABCC2

Das MD -associated Protein 2, MRP2, ist in den kanalikulären Hepatozyten beim Menschen exprimiert (Kool et al., 1997). Es fungiert als ein Haupttransporter für organische Anionen von der Leber in die Galle, was die alternative Bezeichnung canalicular multiple organic anion transporter (cMOAT) widerspiegelt (Sparreboom et al., 2003). Als ABCC2 ist es der C-Unterfamilie der humanen ABC-Transporter zugehörig. Das humane MRP2-Gen ist auf Chromosom 10q24 lokalisiert. In Patienten mit dem Dubin-Johnson-Syndrom (Dubin and Johnson, 1954) ist das MRP2-Gen mutiert, was zu einer Störung des Transportes von organischen Ionen führt (Wada et al., 1998). In geringem Maße wurde MRP2-Expression in Nierenkanälen, Darmenterozyten, Plazentagewebe und Hirnkapillaren festgestellt, was auf eine ähnliche Schutzfunktion wie beim P-Gp bzw. BCRP hindeutet (Kruh and Belinsky, 2003). Neben der natürlichen Funktion von MRP2 wurde eine Überexpression dieses ABC-Transporters in Tumorzellen im Zusammenhang mit dem Heraustransport von verschiedenen Chemotherapeutika beobachtet (Borst et al., 2000). Besonders der Transport des Zytostatikums Cisplatin, welches in der Tumortherapie vielfältig zum Einsatz kommt, unterscheidet MRP2 von allen anderen Mitgliedern der MRP-Familie (Taniguchi et al., 1996). In verschiedenen Cisplatin-resistenten Zellinien zeigte sich eine Überexpression des Transporters (Taniguchi et al., 1996; Materna et al., 2005). MRP2 wurde auch in unterschiedlichen humanen Tumorentitäten, wie kolorektales Karzinom, Brustkrebs und Leukämien, Ovarialkarzinom identifiziert (Kruh and Belinsky, 2003). In einer Studie mit Krebspatienten mit akuter myeloider Leukämie korrelierte die Expression von MRP2 signifikant mit dem Auftreten von Chemoresistenz (Steinbach et al., 2003). Im Einklang mit diesen Befunden wurde in einer MRP2-überexprimierenden Ovarialkarzinomzellinie mit Hilfe von Hammerhead-Ribozymen die spezifische Cisplatinresistenz revertiert (Materna et al., 2005).

1.2.3 Tumorzellinien als Untersuchungsmodelle für Resistenzmechanismen

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Zur experimentellen Identifikation von Resistenzmechanismen benutzt man häufig Tumorzellinien, bei denen eine parentale Zellinie schrittweise steigenden Konzentrationen eines Zytostatikums ausgesetzt ist und somit eine resistente Variante dieser Ausgangszellinie etabliert wird. Ein wesentliches Merkmal der selektionierten Zellinie ist, das die erworbene Resistenz auch bei Kultivierung ohne Zytostatikum stabil erhalten bleibt. Zur Bestimmung der Resistenz einer Zellinie dienen Proliferations- und Klonogenitätsassays. Unter den Proliferationsassays sind der Sulforhodamin B- und der MTT-Test etabliert (SRB- bzw. MTT-Assay; Skehan et al., 1990; Mosmann, 1983), wobei der auf einer Proteinfärbung basierende SRB-Assay am deutlichsten mit der Zellzahl korreliert und daher bevorzugt Anwendung findet (Perez et al., 1993; Fricker and Buckley, 1996). Diese Methode ermöglicht die Ermittlung des IC50-Wertes (Inhibitory Concentration 50), mit dem diejenige Zytostatikumskonzentration gemeint ist, bei der verglichen mit der unbehandelten Kontrolle die Hälfte der kultivierten Zellen wachstumsinhibiert oder abgestorben sind. Der multiplikative Unterschied zwischen den IC50-Werten von parentaler und resistenter Zellinie wird als Resistenzfaktor bezeichnet.

In der vorliegenden Arbeit wurden drei unterschiedliche Zellinienmodelle verwendet. Davon entstammen zwei Zellinien-Paare der gleichen chemosensiblen, parentalen Magenkarzinomzellinie EPG85-257P (kurz: 257P), die im Jahre 1985 im Hamburger Universitätsklinikum Eppendorf von einem Patienten mit einem Adenokarzinom des Magens etabliert wurde. Durch Selektion mit Daunorubicin sind aus ihr die klassische multidrug-resistente Zellinie EPG85-257RDB (kurz: 257RDB) und durch Mitoxantronselektion die atypisch multidrug-resistente Zellinie EPG85-257RNOV (kurz: 257RNOV) etabliert worden (Dietel et al., 1990; Lage et al., 2000). In der klassisch multidrug-resistenten Zellinie 257RDB ist der ABC-Transporter MDR1/P-Gp und in der atypisch multidrug-resistenten Zellinie 257RNOV ist BCRP im Vergleich zur parentalen Zellinie 257P überexprimiert. Beim dritten Zellkulturmodell handelt es sich um die parentale, chemosensible Ovarialkarzinomzellinie A2780P, die im Jahre 1982 aus einer Patientin mit Ovarialkarzinom etabliert wurde (Eva et al.,1982). Durch Selektion mit dem Zytostatikum Cisplatin konnte aus ihr die atypisch multidrug-resistente Variante A2780RCIS etabliert werden, die den ABC-Transporter MRP2 im Vergleich zur parentalen Zellinie verstärkt ausbildet (Materna et al., 2005).

1.3 RNA-Technologien zur Genregulation

1978 stellten Stephenson und Zamecnik eine neue Klasse von Wirkstoffen vor, bei denen Oligonukleotide durch komplementäre Bindung einer viralen Ziel-RNA (Rous-Sarcoma-Virus) anti-virale Aktivität entwickeln konnten (Stephenson and Zamecnik, 1978). Es dauerte einige Jahre bis die Bedeutung dieser auf die alleinige Wirkung von RNA basierenden Entdeckung zur Geltung kam, da vor allem die hohen Kosten und geringen Ausbeuten bei der Produktion von Nukleinsäuremolekülen zu starken Limitationen führten. Nichtsdestoweniger wurde 1999 das erste medikamentös wirksame Antisense-Oligonukleotid, Fomivirsen (ISIS Pharmaceuticals, CA, USA), auf dem US-Markt zugelassen. Mit Hilfe der Grundlagenforschung haben sich das Spektrum und die Anwendungsbereiche von RNA-Technologien stark erweitert: angefangen von Antisense-DNA-Oligonukleotiden, Ribozymen, Triplex-formierende Oligonukleotiden bis hin zu DNAzymen, Aptameren, Decoys, small interfering RNAs (siRNAs) und CpG-Oligonukleotiden. Allen genannten RNA-Technologien ist gemeinsam, daß die zur Anwendung gebrachten Moleküle Sequenzen enthalten, die zu Teilen einer mRNA oder anderen Ziel-RNA komplementär sind (Übersichten in: Giles, 2000; Dias and Stein, 2002). Daher können sie als wertvolle Agenzien zur spezifischen Geninhibition, beispielsweise in der funktionellen Genomanalyse, zur Bewertung von bestimmten Genen und für therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Unter den RNA-Technologien sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in pharmakologischen oder biotechnologischen Anwendungen Antisense-DNA-Oligonukleotide, katalytisch aktive RNA-Oligonukleotide, sogenannte Ribozyme, und Moleküle, die mittels RNA-Interferenz wirksam sind, mittlerweile am häufigsten vertreten. Abb. 5 geht auf die Wirkweise dieser RNA-Technologien ein.

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Abbildung 4: RNA-Technologien zur Geninhibition (verändert nach: Kurreck, 2003)

Dargestellt sind verschiedene RNA-Technologien zur Inhibition spezifischer Genexpressionen. Während die meisten Therapeutika direkt an ein Protein binden, wirken alle RNA-Techniken über die komplementäre Basenpaarung mit der Ziel-RNA. Antisense-Oligodesnukleotide (AS-ODN) blockieren die Translation der mRNA oder induzieren ihre Degradation mit Hilfe der RNaseH. Ribozyme degradieren die Ziel-RNA durch Bindung und Spaltung. RNA-Interferenz wirkt über kleine small interfering RNA-Moleküle (siRNAs), die mit Hilfe eines sogenannten RISC-Proteinkomplexes komplementär an die Ziel-RNA binden, wodurch diese degradiert wird.

1.3.1  Antisense-Oligodesnukleotide (AS-ODN)

Antisense-Oligodesnukleotide (AS-ODN) bestehen in der Regel aus 15-20 DNA-Nukleotiden, die komplementär zur Ziel-RNA sind. Sie wirken über zwei verschiedene Mechanismen. Zum einen können spezielle AS-ODN die zelleigene RNase H rekrutieren, die den RNA-Anteil von zellulären DNA-RNA-Heteroduplexen schneidet, welches zur Degradation der Ziel-RNA führt. Modifizierte AS-ODN prozessieren ihre Ziel-RNA (meist tRNA) mit Hilfe der RNasen L oder P. Zum anderen können AS-ODN, die nicht über einen RNase-vermittelten Mechanismus wirken, durch sterische Hinderung des Ribosomes die Translation der mRNA blockieren (Übersichten in: Kurreck, 2003; Scherer and Rossi, 2003; Goodchild, 2004).

1.3.2 RNA-Interferenz

Die RNA-Interferenz (RNAi) wird von den RNA-Technologien derzeit am intensivsten untersucht. Es handelt sich dabei um einen natürlich vorkommenden Mechanismus für sequenzspezifische posttranskriptionelle Geninhibition, der zuerst an dem Nematodenwurm Caenorhabditis elegans beschrieben wurde (Fire et al., 1998). RNAi wird durch lange doppelsträngige RNA-Moleküle ausgelöst, die mit Hilfe eines sogenannten Dicer-Enymes zu kleinen Doppelstrang-RNAs von 21-25 Nukleotiden Länge prozessiert werden. Das Dicer-Enzym ist ein RNase III-Protein, welches beide RNA-Stränge spaltet und dabei jeweils 2 Nukleotide am 3'-RNA-Strang als Überhang läßt. Diese kleinen doppelsträngigen RNAs werden als short interfering RNAs (siRNAs) bezeichnet. Sie integrieren in einen als RNA-induced silencing complex (RISC) bezeichneten Protein-RNA-Komplex, der in der Lage ist, die Ziel-RNA komplementär zum Antisense-Strang der siRNA zu spalten. Dieser konservierte biochemische Mechanismus konnte vorerst nicht in humanen Zellen zur Anwendung kommen, da die langen doppelsträngigen RNAs eine starke Induktion von Interferonen auslösten. Einen Durchbruch brachten die Wissenschaftler um Tuschl, indem sie zeigten, daß
21-Nukleotid RNA-Duplexe mit 3'-Überhängen zur spezifischen Geninhibition in humanen Zellen verwendet werden können (Elbashir et al., 2001). Mittlerweile gibt es Möglichkeiten, den Mechanismus der RNAi permanent in Zellen einzusetzen, z.B. mit Hilfe von short hairpin RNAs (shRNAs) (Übersichten in: McManus and Sharp, 2002; Tuschl 2002).

1.3.3 Ribozyme

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Spezielle RNA-Moleküle sind in der Lage, die Ziel-RNA ohne die Assistenz von zelleigenen RNasen zu spalten. Diese Eigenschaft basiert auf natürlich vorkommenden RNA-Enzymen, hauptsächlich vom sogenannten Hammerhead-Typ, die Cech et al. in den frühen 1980er Jahren entdeckten und mit dem Terminus “Ribozym” beschrieben (Cech et al.,1981). In den darauffolgenden Jahren fand man weitere natürlich vorkommende katalytische RNAs, beispeilsweise Hairpin-, Hepatitis Delta Virus- Ribozyme und Varkud Satellite-RNA, GroupI- und GroupII-Introns, die RNA-Untereinheit der RNaseP (Guerrier-Takada et al., 1983), Anteile der ribosomalen RNA sowie RNA-Komponenten des Spliceosomes (Übersichten in: James and Gibson; 1998; Sun et al., 2000; Doudna and Cech, 2002).

Die Katalysereaktion kann in drei Schritte eingeteilt werden:

  1. 1. Assoziation von Ribozym- und Ziel-RNA über komplementäre Basenpaarung.
  2. 2. Spaltung der Ziel-RNA.
  3. 3. Dissoziation des Ribozym-Substrat-Komplexes.

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Die Substratspaltung ermöglicht ein sogenanntes „katalytisches Zentrum“, welches sich innerhalb des Ribozymmoleküles befindet (unabhängig von der Ribozymklasse). Liegen Spaltprodukte und Ribozym dissoziiert vor, kann das Ribozym ein weiteres Substratmolekül katalysieren.

Die vorliegende Arbeit stellt die Entwicklung eines Hammerhead-Ribozymsystems zur Geninhibition verschiedener Zielgene vor, so daß die nachfolgenden Kapitel speziell auf Hammerhead-Ribozyme eingehen sowie Anwendungen der Ribozymtechnologie vorstellen.

1.3.3.1  Hammerhead-Ribozyme

Die Hammerhead-Ribozyme sind erstmals als selbst-spaltende Sequenzen innerhalb von pflanzen-infizierenden Viroid-RNAs beschrieben worden (Hutchins et al., 1986; Buzayan et al., 1986). Analysen der Nukleotidsequenz in diesen Viroid-RNAs zeigten, daß die Nukleotide um die Schnittstelle zum einen hochkonserviert sind und zum anderen mit der Ziel-RNA eine typische Struktur ausbilden, die in zweidimensionaler Abbildung an einen Hammerkopf-Hai erinnert und daher die Bezeichnung "hammerhead" erhielt. Die Hammerhead-Struktur enthält einen hochkonservierten katalytischen Kern, in dem eine Helix (Helix II, Abb. 5) und einzelsträngige Verbindungsnukleotide angeordnet sind. Darüber hinaus sind für die Ziel-RNA-Bindung zwei flankierende Sequenzen erforderlich, die über komplementäre Basenpaarungen mit der Ziel-RNA zwei weitere Helices ausbilden (Helices I und III, Abb. 5).

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Abbildung 5: Struktur eines Hammerhead-Ribozymes

Aufbau eines Hammerhead-Ribozymes mit der Nummerierung nach Hertel et al., 1992.

Mit der Information über die konservierten Nukleotide im katalytischen Zentrum des Hammerhead-Ribozymes und über die Anforderungen an das Schnittmotiv in der Ziel-RNA synthetisierte Uhlenbeck das erste künstliche Hammerhead-Ribozym (Uhlenbeck, 1987). Die Substrat-RNA sollte ein sogenanntes NUX-Triplett enthalten, welches vom Hammerhead-Ribozym als katalytisches Motiv erkannt und am 3'-Ende gespalten wird. Hierbei entspricht N jedem beliebigen Nukleotid (A, U, C, G) und X den Nukleotiden A, U oder C. Nicht immer ist die Spaltreaktion nach einem NUX-Motiv gewährleistet, doch in vielen Analysen konnte nach einem GUC-Triplett eine ribozymatische Katalyse beobachtet werden (Perriman et al.,1992; Shimayama et al., 1995; Zoumadakis and Tabler, 1995). Die 5'-NU- und 3'- benachbarten Sequenzen des Spalttriplets hybridisieren über komplementäre Basenpaarung mit den Armen des jeweiligen Hammerhead-Ribozymes. Die Länge dieser Hybridisierungssequenz ist abhängig von den Anforderungen an das Ribozym. Zum einen sorgt allein diese Sequenz für die Spezifität der ribozymatischen Spaltreaktion und sollte daher nicht zu kurz gewählt sein, um unspezifische Bindungen und Katalysen zu verhindern. Andererseits wird die Reaktionsrate vermindert, je länger die Hybridisierungsarme eines Ribozymes sind, da dadurch die Dissoziation des Ribozymes vom Substrat erschwert wird. Die optimalen Bedingungen müssen für jedes Hammerhead-Ribozym im einzelnen empirisch getestet werden, jedoch erreicht man im Allgemeinen den besten Kompromiß zwischen Spezifität und Reaktionsrate bei einer Gesamtlänge der Hybridisierungssequenz von 12-20 bp (Fedor and Uhlenbeck, 1992; Goodchild and Kohli, 1991; Heidenreich and Eckstein, 1992).

Hammerhead-Ribozyme können die Spaltung von RNA bis um das Achtfache gegenüber der spontanen Hydrolyse erhöhen (Fedor and Uhlenbeck, 1992). Die Reaktion erfordert kein ATP und ist irreversibel. Unter geeigneten Konditionen können Hammerhead-Ribozyme wie richtige Katalysatoren auftreten, indem sie mehr als ein Substratmolekül spalten. Die katalytische Aktivität von Hammerhead-Ribozymen ist in der Regel abhängig vom Vorhandensein bivalenter Metall-Ionen, von denen Mg2+ in den meisten Versuchen in zellfreien Systemen in Konzentrationen zwischen 10 und 20 mM eingesetzt wird. Mn2+ oder Ca2+ können das Mg2+ substituieren. Die Ionen sind für die korrekte Ausbildung der Ribozym-Sekundärstruktur verantwortlich und partizipieren direkt in der Katalysereaktion (Dahm and Uhlenbeck, 1991; Hertel et al.,1994, Bassi et al., 1996; Bassi et al., 1997). Dennoch können Spaltreaktionen beim Vorhandensein extrem hoher Ionenstärken auch ohne divalente Kationen stattfinden (Murray et al., 1998).

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Obwohl das Hammerhead-Ribozym das am besten untersuchte Ribozym ist, ist der Katalysemechanismus noch nicht vollständig aufgeklärt. Nichtsdestoweniger wurden Hammerhead-Ribozyme bereits vielfältig in vitro und in vivo angewendet. Es hat sich in den experimentellen Analysen herausgestellt, daß die Erreichbarkeit des Spalttripletts in der Substrat-RNA für das Ribozym der geschwindigkeitsbestimmende Schritt und daher auch der entscheidende Faktor für die erfolgreiche Anwendbarkeit eines Hammerhead-Ribozymes ist. Aus diesem Grund sind diejenigen Spalttripletts in der Substrat-RNA bei der ribozymatischen Katalyse bevorzugt, die in sogenannten Schleifen-Strukturen angesiedelt und daher räumlich gut erreichbar sind (Übersichten in: James and Gibson, 1998). Heutzutage können computergestützte RNA-Sekundärstruktur-Algorithmen a priori Wahrscheinlichkeitsprofile für die räumliche Lage einzelner Nukleotide in einer RNA-Sequenz erstellen. Diese Programme sind als Grundlage für die experimentelle Planung geeignet, können jedoch Versuche im zellfreien System und/oder in vitro nicht ersetzen (Ding et al., 2004; Mathews et al., 2004).

1.3.3.1.1  Hammerhead-Ribozym-Spaltung in cis und in trans

Hammerhead-Ribozyme sind in der Lage, an eine gegenüberliegende Substrat-RNA zu hybridisieren und diese am 3'-Ende des erforderlichen Spalttriplets zu katalysieren. Sind Substrat- und Ribozym-RNA Bestandteil eines identischen RNA-Moleküls, handelt es sich um eine Spaltung in cis. Diese Eigenschaft der Selbstspaltung ist den meisten natürlich vorkommenden Ribozymen gemeinsam. Im Gegensatz dazu bezeichnet man die ribozymatische Spaltung von Substrat-RNA, die ein vom Ribozym unabhängiges Molekül darstellt, als Spaltung in trans. Die Katalyse in trans geschieht fast immer bei der technologischen Anwendung von Ribozymen, da in der Regel die Inhibition unabhängiger Substrat-RNAs beabsichtigt wird. Dennoch kamen in cis- und in trans-spaltende Hammerhead-Ribozyme kombiniert derartig zum Einsatz, das durch Spaltung in cis ein benachbartes in trans-aktives Hammerhead-Ribozym mit definiertem 3'-Ende aus einem RNA-Molekül entstand. Aufgrund dieser Verbindung von Spaltung in cis und in trans können Hammerhead-Ribozyme mit definierten 3'- und 5'-Endsequenzen in vitro transkribiert werden, wodurch der Einbau von spezifischen Terminationssignalen in artifiziellen Vektorsystemen verzichtbar ist (Taira et al., 1990). Die folgende Abbildung illustriert die Hammerhead-ribozymatische Spaltung in cis und in trans.

Abbildung 6: Ribozymatische Spaltung in cis und in trans

Dargestellt sind schematisch die Möglichkeiten der Hammerhead-Ribozym-katalysierten Spaltreaktionen. Die Pfeile indizieren die Katalyse.

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A:

Ribozymatische Spaltung in cis. Ribozym- und Substrat-RNA sind auf einem Molekül lokalisiert.

B:

Ribozymatische Spaltung in trans. Ribozym- und Substrat-RNA sind auf separaten Molekülen lokalisiert.

1.3.3.2 Kinetische Charakterisierung von Ribozymen

Zur Untersuchung der Effizienz eines einzelnen Ribozymes dienen Reaktionskinetiken. Kcat und kM sind Reaktionskonstanten für alle katalysierten Prozesse, die zum einen die Reaktionsrate (kcat) und zum anderen die Affinität von Enzym/Ribozym zum Substrat (kM) beschreiben. Häufig verwendet man den Quotienten kcat/kM, um die katalytische Effizienz des zu untersuchenden Ribozymes auszudrücken. Darüber hinaus stellen auch die beobachteten Spaltrate, kobs, sowie der Initialgeschwindigkeit, vini, kinetische Eigenschaften des zu untersuchenden Ribozymes dar.

Kinetische Parameter lassen sich entweder unter Substratüberschuß relativ zum Ribozym (multiple turnover) oder unter Ribozymüberschuß relativ zum Substrat (single turnover) bestimmen. Bei single turnover-Bedingungen wird angenommen, daß das gesamte Substrat am Anfang der Reaktion gebunden wird und demzufolge die beobachtete Reaktionsrate (kobs) nicht von der Assoziation bzw. Dissoziation von Ribozym und Substrat abhängt. Diese Bedingungen erlauben die Bestimmung der beobachteten Spaltrate (kobs), welches der Konstante k2 in Abb. 7 entspricht.

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Bei multiple turnover-Bedingungen sind mehrere Runden von Assoziation und Dissoziation in die Spaltreaktion involviert, so daß die Reaktionsrate sehr stark von der Stabilität der Helices im Ribozym-Substratkomplex (R•S) und in den Ribozym-Produktkomplexen (P1•R•P2) abhängig ist. Es kann beispielsweise dazu kommen, daß bei schwacher Substratbindung die Dissoziationsrate größer ist als die Spaltrate, wobei dann k-1>k2 (Abb. 7), so daß kobs geringer ist als die Spaltrate und keine Produkte gebildet würden.

Im Gegensatz dazu werden bei starker Substratbindung die ersten Substratmoleküle schnell katalysiert, weitere Spaltreaktionen durch die geringe Dissoziationsrate jedoch stark beeinträchtigt. Die beobachtete Spaltrate hängt in diesem Fall am stärksten von den Konstanten k3 und k6 (Abb. 7) ab (Übersichten in: Stage-Zimmermann and Uhlenbeck, 1998; Goodchild, 2000).

Abbildung 7: Wege der Ribozymreaktion (nach Stage-Zimmermann and Uhlenbeck, 1998)

Dargestellt sind schematisch die möglichen Wege der ribozymatischen Spaltreaktion. R steht für Ribozym, S für Substrat, P1 und P2 sollen die Spaltprodukte der Reaktion symbolisieren. Jede Reaktion und Rückreaktion hat eine spezifische kinetische Konstante (k), die für die Hinreaktionen durchgängig nummeriert wurden (k1 - k6) und für die Rückreaktionen wurden die Nummerierungen mit einem negativen Vorzeichen besetzt (k-1 - k-6). Experimentell lassen sich mit Hilfe spezifischer Reaktionsbedingungen einige der Reaktionskonstanten bestimmen.

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Durch die Charakterisierung eines Hammerhead-Ribozymes im zellfreien System unter multiple turnover- sowie single turnover-Bedingungen können die Reaktionskonstanten genau bestimmt und daraufhin die kinetischen Eigenschaften eines Ribozymes ermittelt werden.



Obwohl keine direkte Proportionalität zwischen der Effizienz eines Ribozymes im zellfreien System und in Zellkulturen oder in vivo besteht, haben sich in der Praxis Hammerhead-Ribozyme mit hohen kinetischen Parametern auch oftmals als effektiv bei zellulären Anwendungen erwiesen (Kowalski et al., 2002; Materna et al., 2005).

1.4 Zielstellung der Arbeit

Die ABC-Transporter MDR1, BCRP und MRP2 wurden in unterschiedlichen multidrug-resistenten Zellinien sowie in Gewebeproben resistenter Tumorzellen als maßgebliche Faktoren für die Ausbildung von Vielfachresistenzen beschrieben. Darüber hinaus sind Hammerhead-Ribozyme angewendet worden, die die mRNA-Expression der genannten ABC-Transporter herabregulieren und somit spezifischen zellulären Zytostatikaresistenzen entgegenwirken können. Allerdings stellen die bislang publizierten Arbeiten, die die Modulation der ABC-Transporterexpressionen mit Hilfe von RNA-Technologien zum Ziel hatten, lediglich die Expressionsinhibition eines ABC-Transporters dar. Sowohl Zellkulturdaten als auch klinischen Studien machen jedoch deutlich, daß oftmals die gleichzeitige Expression mehrerer Gene mit dem Auftreten von Multidrug-Resistenz im Zusammenhang steht. Daraus ergibt sich die Problematik, ob es möglich ist, mit Hilfe von RNA-Technologie ein Konstrukt herzustellen, welches zur gleichzeitigen Inhibition mehrerer unabhängiger Gene befähigt ist.

Aufgrund dieser Fragestellung ist es das Ziel dieser Arbeit, ein auf Ribozym-Technologie basierendes Modul zu entwickeln, welches die Expressionen der drei vorgestellten ABC-Transporter simultan unterdrückt und dadurch befähigt ist, spezifischen Zytostatikaresistenzen in multidrug-resistenten Zellinien entgegenzuwirken.

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Um diese Problematik lösungsorientiert zu bearbeiten, wurden folgende Teilfragen gestellt:

1.

Ist es möglich, durch die Anwendung computergestützter RNA-Sekundärstrukturanalyseverfahren ein Hammerhead-Ribozym-Konstrukt zu entwickeln, welches gegen die mRNAs der ABC-Transporter MDR1, BCRP und MRP2 gerichtet ist?

2.

Ist das entwickelte Konstrukt in der Lage, die genannten Ziel-RNAs im zellfreien System zu spalten?

3.

Wie hoch sind die Spaltaktivität und die katalytischen Parameter kcat, kM, kobs und vini des Konstruktes im Vergleich zu publizierten Daten?

4.

Ist es möglich das Konstrukt in den multidrug-resistenten Zellinien 257RDB, 257RNOV und A2780RCIS zur Expression zu bringen?

5.

Kann durch die Expression des Konstruktes der mRNA-Level sowie der Proteingehalt der genannten ABC-Transporter signifikant reduziert werden?

6.

Wie verändert sich das Resistenznivieau der genannten Zellinien gegenüber den Zytostatika Daunorubicin, Mitoxantron und Cisplatin durch die Expression des Konstruktes?

7.

Kann eine Veränderung der spezifischen Zytostatika-Akkumulation von Daunorubicin und Mitoxantron durch die Einbringung des Konstruktes ermittelt werden?

Der Ergebnisteil enthält die Beantwortung der oben genannten Punkte.


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23.08.2006