2 Material und Methoden

2.1  Material

2.1.1  Geräte

↓22

Gerät

Hersteller, Sitz, Land

Agarosegelelektrophoresekammer

Biorad, München, D

Beta-Counter Handgerät LB122

Berthold, Berlin, D

Beta-Counter Wallac

Wallac, Freiburg, D

Bechergläser 50, 100, 200, 1000 ml

Schott, Mainz, D

Brutschrank Steri Cult 200

Lifescience, Frankfurt/M., D

Brutschrank für Bakterienkultur

Heraeus, Hanau, D

Durchflußzytometer FACS Calibur 750

Becton-Dickinson, USA

Durchlicht-Mikroskop LSM II

Zeiss, Göttingen, D

Einfrierboxen

Nalgene, USA

Fluoreszenzmikroskop LeicaTCS4D

Leica, Bensheim, D

Gelgießapparatur

Bio-Rad, München, D

Heizblock Digi Block

Laboratory Devices, Kehl, D

Kühlschrank 4 °C

Liebherr, CH

Light Cycler Instrument

Roche Diagnostics, Mannheim, D

Magnetrührer RCT Basic

Ika, Staufen, D

Meßzylinder 100, 250, 1000 ml

Schott, Mainz, D

MiniProtean II Western Blot Apparatur

Bio-Rad, München, D

Multikanalpipette

Eppendorf, Hamburg, D

Netzgerät Power Supply 200/2.0

Bio-Rad, München, D

PA-Gelelektrophoresekammer S4S

OWL, Portsmouth, USA

PCR-Gerät Trio Thermoblock

Biometra, Göttingen, D

pH-Meter 320

Mettler, Gießen, D

Photometer

Bio-Rad, München, D

Pipet Boy

IBS, CH

Pipetten 0,5-10 µl; 10-100 µl, 200-1000 µl

Eppendorf, Hamburg, D

Plattenlesegerät Bio Kinetics Reader

BioTek, USA

Scanner CanoScan D1250U2

Canon, Krefeld, D

Schüttelthermostat 3032

GFL, Burgwedel, D

Skalpell

Becton-Dickinson, USA

Sterile Werkbank Laminar Air HBB 2472

Heraeus, Hannover, D

Thermomixer 5436

Eppendorf, Hamburg, D

Tiefkühler -20 °C

Liebherr, CH

Tiefkühler -80 °C

Sanyo, J

UV-Transilluminator

MWG, Ebersberg, D

Wasserbad 1083

GFL, Burgwedel, D

Videodokumentationsanlage Digi Gel Print

Sony, Köln, D

Vortexer Vortex Genie2

Scientific Industries, USA

Zentrifuge Biofuge 13

Heraeus, Hannover, D

Zentrifuge Typ 5415 C

Eppendorf, Hamburg, D

Ultrazentrifuge Optima LE 80k

Beckmann, München,D

Zellzählkammer Fuchs-Rosenthal

HBG, Giessen-Lützellinden, D

2.1.2 Verbrauchsmaterial

Material

Hersteller, Sitz, Land

Druckerpapier (für Geldokumentation)

Sony, Köln, D

Einfrierröhrchen CellStar

Greinerbioone, Frickenhausen, D

FACS-Röhrchen

Nunc, Wiesbaden, D

Falconröhrchen (15, 50 ml)

Nunc, Wiesbaden, D

Filterpapier 3 mm

Whatman, Rotenburg/F., D

Haushaltsfolie Toppits

Melitta, Minden, D

Hyperfilm ECL (für Western Blot)

Amersham Biosciences, UK

Klonierungsringe

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Mikrotiterplatten

Nunc, Wiesbaden, D

Nylonmembran (für Western Blot)

Macherey-Nagel, Düren, D,

Paketklebeband Tesa

Beiersdorf, Hamburg, D

Parafilm

Roth, Karlsruhe, D

Petrischalen (Ø 10, 20 cm)

Nunc, Wiesbaden, D

Pipetten (steril) 2, 5, 10, 25 ml

BD, USA

Pipettenspitzen

Eppendorf, Hamburg, D

Reaktionsgefäße

Eppendorf, Hamburg, D

Röntgenfilm Biomax

Kodak, Stuttgard, D

Sterilfilter Rotilabo

Roth, Karlsruhe, D

6-well Platten

Nunc, Wiesbaden, D

24-well Platten

Nunc, Wiesbaden, D

96-well Platten

Nunc, Wiesbaden, D

Zellkulturgefäße (T25, T75 Flaschen)

Nunc, Wiesbaden, D

2.1.3 Chemikalien

Alle Chemikalien wurden mit dem Reinheitsgrad “pro analysi” erworben.

↓23

Chemikalie, Katalognummer

Hersteller, Sitz, Land

Aceton, 100014

Merck, Darmstadt, D

Acrylamid/Bisacrylamid, BIAC1902

Qbiogene, USA

Agar, 9002-18-0

ICN, USA

Agarose, 15510-027

Invitrogen, UK

Amidoschwarz, 1.01167

Merck, Darmstadt, D

Ammoniumazetat, 101116

Merck, Darmstadt, D

Ammoniumperoxydisulfat (APS), 101201

Merck, Darmstadt, D

Antibody Diluent, Background Reducing

DakoCytomation, DK

Aprotinin, 13718

Serva, Heidelberg, D

Blue/Orange-Gelauftragepuffer

Promega, Mannheim, D

Borsäure, 100165

Merck, Darmstadt, D

BSA, 6367901

Promega, USA

Carbenicillin, 15875

Serva, Heidelberg, D

Chloroform, 7386

J.T. Baker, Griesheim, D

Cisplatin, 15663-27-1

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Cocktailtablette Complete, 10481500

Roche Diagnostics, Mannheim, D

Color Markers High Range, C3312

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Coomassie-Blue,20279

Pierce, Rockfort, IL, USA

Daunorubicin, 1023

Farmitalia, Padua, I

Diethylpyrokarbonat (DEPC), 18835

Serva, Heidelberg, D

Dimethylsulfoxid (DMSO), 102391

Merck, Darmstadt, D

Dithiothreitol (DTT), 197777

Roche, Mannheim, D

100 bp-DNA-Längenstandard, 15628-050

GibcoBRL, Eggenstein, D

n-Dodecylhydrogensulfat-Natriumsalz (SDS), L-4390


Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Essigsäure, 6052

J.T. Baker, Griesheim, D

Ethanol, 8006

J.T. Baker, Griesheim, D

Ethidiumbromid, E-1510

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Ethylendiamin-N,N,N’,N’-Tetraessigsäure
Dinatriumsalz (EDTA), 324503


Calbiochem, Darmstadt, D

Dulbecco’s PBS, H15-001

PAA Laboratories, A

Fetuin, 21346

Serva, Heidelberg, D

Fötales Kälberserum (FKS), 011-06290M

Gibco, Eggenstein, D

Formaldehyd, 7040

J.T. Baker, Griesheim, D

Formamid, 12027

Merck, Darmstadt, D

Foto-Entwicklerlösung, 5224397

Kodak, Stuttgard, D

Foto-Fixierlösung, 5224381

Kodak, Stuttgard, D

Gel Loading Buffer II,

Ambion, Huntingdon, UK

Genetizin-Sulfat (G418), G-5013

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Glukose, G-8270

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Glutamin, 2503-024

GibcoBRL, Eggenstein, D

Glyzin, 23390

Serva, Heidelberg, D

Glykogen, 901393

Roche, Mannheim, D

Glyzerin, 23176

Serva, Heidelberg, D

Harnstoff, 108487

Merck, Darmstadt, D

Hefeextrakt, 0127-17

Difco, Heidelberg, D

N-(2-Hydroxyethyl)piperacin-N’-ethansulfon-
säure (HEPES), 1010110


Merck, Darmstadt, D

Insulin, 18135

GibcoBRL, Eggenstein, D

Kaliumchlorid, 4933

Merck, Darmstadt, D

Kaliumdihydrogenphosphat, 930185

Riedel-de-Haen AG, Seelze-Hannover, D

Kalziumchloriddihydrat, 102382

Merck, Darmstadt, D

Kanamycin, 60615-5G

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

L-15-Zellkulturmedium, BE12-700F

BioWhittaker, Taufkirchen, D

LSAB+, HRP

DakoCytomation, DK

2-Mercaptoethanol, 7569402

Promega, USA

Magermilchpulver, 232100

Becton-Dickinson, USA

Magnesiumchloridhexahydrat, M-9272

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Magnesiumsulfatheptahydrat, 105886

Merck, Darmstadt, D

Mayer’s Hematoxylin

DakoCytomation, Daenemark

Mitoxantron, M6545

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Natriumazid, 106404

Merck, Darmstadt, D

Natriumchlorid, 106404

Merck, Darmstadt, D

tri-Natriumcitratdihydrat, 106432

Merck, Darmstadt, D

Natriumhydrogencarbonat, 106392

Merck, Darmstadt, D

Natriumhydrogenphosphatdihydrat, 106580

Merck, Darmstadt, D

Natriumhydroxyd, 106498

Merck, Darmstadt, D

NovaRed

Vector Laboratories, UK

OPTIMEM-Zellkulturmedium

GibcoBRL, Eggenstein, D

Phenol, 100206

Merck, Darmstadt, D

Polyethylenglykol MG8000 (PEG), 109727

Merck, Darmstadt, D

Primary Mouse Negative Control

DakoCytomation, Daenemark

2-Propanol, 8067

J.T.Baker, Griesheim, D

Salzsäure, 100317

Merck, Darmstadt, D

Sulforhodamin B (SRB), S-1402

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

N,N,N’,N’-Tetramethylenethylen-Diamin (TEMED), T-8133


Sigma-Aldrich, Steinheim, D

t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100), X-100


Sigma-Aldrich, Steinheim, D

Transferrin, 36756

Serva, Heidelberg, D

Trichloressigsäure, 100807

Merck, Darmstadt, D

Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris/HCl), 108382


Merck, Darmstadt, D

Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris-Base), 108382


Merck, Darmstadt, D

Trypsin, L2153

Biochrom, Berlin, D

Trypton, 0123-17

Difco, Heidelberg, D

Tween20, 37470

Serva, Heidelberg, D

Xylencyanol, X-4126

Sigma-Aldrich, Steinheim, D

2.1.4 Radionukleotide

Radionukleotid, Katalognummer

Hersteller, Sitz, Land

[α-32P]-UTP, PB 20283

Amersham, Braunschweig, D

2.1.5 Enzyme

Enzym, Katalognummer

Hersteller, Sitz, Land

DNA-Polymerase AmpliTaq Gold, N808-0240

Perkin Elmer, Freiburg, D

SuperscriptII RNaseH- Reverse Transkriptase, 18064-022

Invitrogen, Karlsruhe, D

Shrimp Alkalische Phosphatase, M8201

Promega, Madison, WI, USA

T4 Polynukleotidkinase, M0201S

NEB, Ipswich, MA, USA

T4 DNA Ligase, M0202S

NEB, Ipswich, MA, USA

2.1.6  Kits

↓24

Kit, Katalognummer

Hersteller, Sitz, Land

LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit, 3003230

Roche Diagnostics, Mannheim, D

MAXIscript In vitro Transcriptions Kit, 1308-1326

Ambion, Huntingdon, UK

RNeasy Kit, 74104

Qiagen, Hilden, D

SuperFect Transfection Reagent, 301305

Qiagen, Hilden, D

SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR, 11904-018

Invitrogen, Karlsruhe, D

SuperSignal West Pico Chemilumininescent Substrate, 34080

Pierce, Rockford, USA

TOPO TA Cloning Kit, K4500-01

Invitrogen, Karlsruhe, D

T7-MEGAshortscript High Yield Transcription Kit, 1354

Ambion, Huntingdon, UK

Qiagen Plasmid Midi Kit, 12145

Qiagen, Hilden, D

Qiagen Plasmid Mini Kit, 12123

Qiagen, Hilden, D

QIAquick PCR Purification Kit, 28104

Qiagen, Hilden, D

QIAquick Gel Extraction Kit, 28704

Qiagen, Hilden, D

2.1.7 Synthetisierte DNA-Sequenzen

Alle Sequenzen sind in 5’→3’ Orientierung angegeben. Oligonukleotide wurden von der Firma MWG, Ebersberg, D synthetisiert Die Gensynthese für das Multitargetmultiribozym (MTMR) erfolgte bei der Firma Biospring, Frankfurt/M., D .

Bezeichnung

Sequenz

Ald-fw

ATC CTG GCT GCA GAT GAG TC

Ald-rev

GCC CTT GTC TAC CTT GAT GC

BCRP-fw

CTT ACA GTT CTC AGC AGC TCT TCG

BCRP-rev

CGA GGC TGA TGA ATG GAG AAG

BCRPsub-rev

 

MDR1-fw

CAG CTA TTC GAA GAG TGG GC

MDR1-rev

CCT GAC TCA CCA CAC CAA TG

MDR1sub-rev

 

MRP2-fw

GGA ACA ATT GTA GAG AAA GGA TC

MRP2-rev

CAC AAA CGC AAG GAT GAT GAA GAA

MRP2sub-rev

 

MTMR

TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG AAT TGC TGT GGC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACA TAG GCA AAA TGT TGT CTG GAC AAG CAC CTG GAA CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAC ATC TGG AGA AAA TGT TGT CTG GAC AAG CAC GTG CTT GTC CAC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACA ACA TTT TAA AAT GTT GTC TGG ACA AGC ACG TGC TTG TCC ACT GAT GAG TCC GTG AGG ACG AAA CAA CAT TTT GTG CTT GTC CAC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACA ACA TTT T

M13-fw

CAG GAA ACA GCT ATG AC

M13-rev

CAA AAG GGT CAG TGC TG

pIRES2-fw

TAA GCA GAG CTG GTT TAG TGA AC

pIRES2-rev

TTA TTC CAA GCG GCT TCG

T7-BCRPsub-fw

 

T7-MDR1sub-fw

TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT TCC AGG CTT GCT GTA AT

T7-MRP2sub-fw

TAA TAC GAC TCA CTA TAG CCT GTC GGC TCT GGG AAA TCC TC

2.1.8  Plasmide

↓25

Tabelle 2: Plasmide

Plasmid, Katalognummer

Resistenzen

Hersteller

pIRES2-EGFP, 6029-1

Kanamycin, Neomycin

BD, Heidelberg, D

pUC19/MTMR

Ampicillin

BiospringAG,Frankfurt/M., D

pCR2.1-TOPO, K4500-01

Ampicillin

Invitrogen, Karlsruhe, D

2.1.9 Lösungen und Puffer

Alle im folgenden beschriebenen Lösungen wurden, wenn nicht anders angegeben, in zweifach destilliertem Wasser angesetzt und bei Raumtemperatur gelagert. Angegebene pH-Werte beziehen sich auf eine Lösungstemperatur von 20 °C.

Bezeichnung

Bestandteile

Mengenangaben

Hinweise

Amidoschwarzlösung

Amidoschwarz

0,1 % in 45 % Methanol und 10 % Essigsäure

 

Blockpuffer

Magermilch

5 % (w/v)

Magermilchpulver in TBST lösen und Puffer bei
-20 °C lagern

10 x PBS

NaCl
Na2HPO4
KCl
KH2PO4, pH 6,8

8,0 % (w/v)

1,15 % (w/v)

0,2 % (w/v)

2 % (w/v)

Vor Gebrauch autoklavieren

Polyacrylamid-(PA)-Gel

Harnstoff
Acrylamid/Bisacrylamid
APS
TEMED

7,0 M

8,0 % (v/v)

0,01 % (v/v)

0,005 % (v/v)

Gel in 1 x TBE ansetzen APS und TEMED zuletzt zugeben

Protein-Destainpuffer

Methanol
Essigsäure

90 % (v/v)

2 % (v/v)

 

Protein-Elutionspuffer

Ethanol
EDTA, pH 8,0

NaOH

50 % (v/v)

0,05 mM

25 mM

 

5 x Protein-Running-Puffer

Tris-Base
Glycin
SDS

1,5 % (w/v)

7,2 % (w/v)

0,5 % (w/v)

 

Protein-Sammelgel

Tris-HCl, pH 6,8

Acrylamid

SDS

APS

TEMED

125 mM

4 % (w/v)

0,1 % (w/v)

0,01 % (w/v)

0,005 % (w/v)

APS und TEMED zuletzt zugeben.

Protein-Transferpuffer

Tris-Base
Glycin
Methanol

25 mM

150 mM

20% (v/v)

Puffer immer frisch ansetzen und kühlen.

Protein-Trenngel (7,5%)

Tris-HCl, pH 8,8

Acrylamid
SDS
APS
TEMED

375 mM

7,5 % (w/v)

0,1 % (w/v)

0,01 % (w/v)

0,005 % (v/v

APS und TEMED zuletzt zugeben.

RIPA-Puffer

Tris-Base
EGTA
NaCl
TritonX-100

Cocktailtablette

50 mM

5 mM

150 mM

1 % (v/v)

1 auf 20 ml

Lagerung bei 4 °C für 4 Wochen.

RNA-Elutionspuffer

Ammoniumazetat
EDTA
SDS

0,5 M

1 mM

0,2 % (w/v)

Puffer sterilfiltrieren.

RNA-Fällungspuffer

Ethanol
Ammoniumazetat
Glykogen

94,3 % (v/v)

0,2 M

0,5 % (v/v)

Puffer sterilfiltrieren.

RNA-Prozessierungspuffer

Tris/HCl, pH 7,5

MgCl2

40 mM

12 mM

Puffer sterilfiltrieren.

4 x Sample Puffer

Tris-Base

DTT

SDS

60 mM

100 mM

2 %

 

SRB-Lösung

Sulforhodamin B

Essigsäure

0,4 % (w/v)

0,1 % (v/v)

 

50 x TAE

Tris-Azetat, pH 8,0

Na2EDTA

2,0 M

50 mM

pH-Wert-Einstellung mit 1 M Essigsäure.

10 x TBE

Tris/HCl, pH 8,0

Borsäure
Na2EDTA

0,9 M

0,9 M

25 mM

pH-Wert-Einstellung mit 1 M HCl.

TBST-Puffer

Tween20

0,05 % in 1 x TBS

Lagerung bei 4 °C.

TE-Puffer

Tris/HCl, pH 8,0

Na2EDTA

10 mM

1,0 mM

pH-Wert-Einstellung mit 1 M HCl und autoklavieren.

2.1.10 Medien für die Bakterienkultur

↓26

Es wurden Bakterien der Art E. coli, Stamm DH5α (GibcoBRL, Eggenstein, D) verwendet. Die Kultur erfolgte in den nachstehend aufgeführten Medien, die unter sterilen Bedingungen angesetzt und bei 4 °C gelagert wurden.

Bezeichnung

Bestandteile

Mengenangaben

LB-Agar

Agar
Trypton
Hefeextrakt
NaCl, pH 7,0

1,5 % (w/v)
1,0 % (w/v)
0,5 % (w/v)
170 mM

LB-Medium

Trypton
Hefeextrakt
NaCl, pH 7,0

1,0 % (w/v)
0,5 % (w/v)
170 mM

SOC-Medium

Trypton
Hefeextrakt
Glukose
KCl
MgCl2
MgSO4
NaCl

20 g/l
5 g/l
20 mM
2,5 mM
10 mM
10 mM
10 mM

2.1.11 Medien für die Kultur eukaryotischer Zellen

Tab. 3 gibt Auskunft über die in der vorliegenden Arbeit eingesetzten eukaryotischen Zellen. Diese wurden in L-15 Komplettmedium kultiviert, das unter sterilen Bedingungen hergestellt und bei 4 °C gelagert wurde.

↓27

Tabelle 3: Eukaryotische Zellen

Bezeichnung

Ursprungsgewebe

Kulturmedium

Literaturverweis

EPG85-257 P

humanes Magenkarzinom

modifiziertes L-15-Medium

Dietel et al., 1990

EPG85-257 RNOV

humanes Magenkarzinom

modifiziertes L-15-Medium

Dietel et al., 1990

EPG85-257 RDB

humanes Magenkarzinom

modifiziertes L-15-Medium

Lage et al., 2000

A2780 P

humanes Ovarialkarzinom

modifiziertes L-15-Medium

Eva et al.,1982

A2780 RCIS

humanes Ovarialkarzinom

modifiziertes L-15-Medium

Materna et al.,2005

Das L-15 Medium wurde durch den Zusatz der folgenden Substanzen komplettiert:

Komplettmedium
FKS
NaHCO3
Glukose
Fetuin
Gentamycin
Transferrin
Glutamin
Insulin
Aprotinin


10 % (v/v)
0,112 % (w/v)
0,1 % (w/v)
0,0006 % (w/v)
0,0005 % (w/v)
0,00025 % (w/v)
4,0 mM
80 IE/l
10 MIE/l


Die Zusätze wurden unter sterilen Bedingungen in L-15-Zellkulturmedium gegeben.

↓28

Transfizierte Zellen wurden dauerhaft in Selektionsmedium gehalten, welches aus Komplettmedium mit 400 µg/ml G418 bestand. Bei der Transfektion von Zellen kam serumfreies OPTIMEM-Medium zur Anwendung.

2.1.12 Software

Internet-Explorer 4.5

Microsoft, Redmont, CA, USA

mfold 3.0

http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rnahttp://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna
Rensselaer Polytechnical Institute, Rensselaer, NY, USA

Sfold 2.0

http://sfold.wadsworth.org/index.plhttp://sfold.wadsworth.org/index.pl

Wadsworth Center, New York State Department of Health, Albany, NY, USA

MS Office 2001

Prism 3.0a

Microsoft, Redmont, CA, USA

GraphPadSoftware, San Diego, CA, USA

NIH Image 1.61

http://rsb.info.nih.gov/nih-image
National Institute of Health, Bethesda, MD, USA

 

http://edoc.hu-berlin.de

Humboldt Universität, Berlin, D

2.2 Methoden

2.2.1  Molekularbiologische Methoden

2.2.1.1  Präparation von Plasmid-DNA

Die Präparation von Plasmid-DNA erfolgte nach Birnboim und Doly (1979) unter Verwendung des Qiagen Plasmid Mini- bzw. Midi-Kits. Zu diesem Zweck wurden Flüssigkulturen von einzelnen Kolonien in 5 ml (Miniprep) bzw. 30 ml (Midiprep) angelegt und ü. N. auf dem Schüttler bei 37 °C inkubiert. Die Aufarbeitung der Kulturen geschah nach Herstellerangaben. Bei dem verwendeten System schloß sich an die alkalische Lyse der Zellen die Bindung des Plasmids an eine Anionenaustauschsäule an. Die Elution erfolgte mit 30 µl TE-Puffer. Qualität und Quantität der DNA wurden photometrisch bestimmt.

2.2.1.2 Bestimmung der Konzentration von Nukleinäure-Lösungen

↓29

Die Konzentration von Nukleinäure-Lösungen wurde mit Hilfe eines UV-Spektrometers bestimmt. Hierzu wurde die UV-Licht-Absorption der Nukleinsäurelösung bei einer Wellenlänge von 260 nm (OD260) gemessen. Dieser Absorptionswert läßt sich folgendermaßen in die Konzentration der entsprechenden Lösung umrechnen:

eine OD260 = 1 entspricht bei

 

dsDNA-Lösungen

50 µg/ml

RNA-Lösungen

40 µg/ml

Oligonukleotid-Lösungen

33 µg/ml

Zusätzlich wurde der Quotient der Absorptionen von Licht der Wellenlänge 260 nm (Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren) und 280 nm (Absorptionsmaximum von Proteinen) gemessen und zur Abschätzung der Qualität der jeweiligen Nukleinsäurelösung herangezogen. Für reine Nukleinsäure-Lösungen sollte das Verhältnis der beiden Absorptionswerte zwischen 1,8 und 2,0 bei DNA-Lösungen und 1,6 und 1,8 bei RNA-Lösungen liegen.

2.2.1.3 Elektrophoretische Auftrennung von DNA

↓30

Agarose (1,5 % (w/v)) wurde in 1 x TAE-Puffer bis zum vollständigen Lösen gekocht. Nach dem Abkühlen auf ca. 50-60 °C wurde der Lösung Ethidiumbromid zu einer Endkonzentration von 0,25 µg/ml zugesetzt, woraufhin das Gel gegossen wurde. Vor dem Beladen des Gels wurden die DNA-Proben mit 2 µl 6xDNA-Loading Dye versetzt und anschließend für 1-2 h bei 75 V elektrophoretisch aufgetrennt.

2.2.1.4 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die Elution von DNA-Fragmenten geschah durch Ausschneiden des entsprechenden Gelstücks und anschließender Behandlung mit dem Qiagen Gel Extraction Kit nach Angaben des Herstellers.

2.2.1.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion (PCR, Saiki et al., 1988) diente der gezielten in vitro-Amplifizierung ausgewählter DNA-Bereiche mit Hilfe synthetischer, die Zielsequenz flankierender Oligonukleotidprimer und der AmpliTaq Gold-DNA-Polymerase. Alle PCR-Ansätze sind in der Tab. 4 aufgelistet.

↓31

Tabelle 4: PCR-Ansätze

Art der PCR

Komponenten

Konzentration

RT-PCR






zusätzlich bei pIRES2-Primern:

AmpliTaq Gold10 x PCR-Puffer
dNTPs
5’-Oligonukleotidprimer
3’-Oligonukleotidprimer
Matrix cDNA
H2Odd
Betain
DMSO

0,2 U
2,5 µl
je 0,5 µM
5 pmol
5 pmol
50-100 ng
ad 25 µl

0,05 M
2,5 % (v/v)

PCR mit Plasmid-Matrize

AmpliTaq Gold
10 x PCR-Puffer
dNTPs
5’-Oligonukleotidprimer
3’-Oligonukleotidprimer
Plasmid-DNA
H2Odd

0,2 U
2,5 µl
je 0,5 µM
5 pmol
5 pmol
10 ng
ad 25 µl

Die Amplifikation erfolgte im Thermal Cycler nach folgendem Programm:

PCR-Schritt

Dauer, Temperatur

thermische Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase

10 min, 94 °C

DNA-Amplifikation in 36 Zyklen, bestehend aus:

1 min, 94 °C

1,5 min, Primer-spezifische Hybridisierungstemperatur (Ta)
1,5 min, 72 °C

Extension

10 min, 72 °C

Abkühlung

10 min bis ∞, 4 °C

↓32

Die spezifischen Hybridisierungstemperaturen (annealing temperature; Ta) der Primer, die Länge der PCR-Produkte und der Zweck der PCR sind in Tab. 5 wiedergegeben.

Tabelle 5: Detailangaben für verschiedene PCRs

5’- und 3’-Primer

Ta

PCR-Produkt-Länge

Zweck der PCR

Aldo-fw/rev

58 °C

443 bp

Positivkontrolle nach cDNA-Synthese

T7-BCRPsub-fw/rev

62 °C

361 bp

Herstellung des BCRP-Substrates für die in vitro-Transkription

T7-MRP2sub-fw/rev

62 °C

251 bp

Herstellung des MRP2-Substrates für die in vitro-Transkription

T7-MDR1sub-fw/rev

55 °C

259 bp

Herstellung des MDR1-Substrates für die in vitro-Transkription

pIRES2-fw/rev

50 °C

468 bp

Kontrolle der MTMR-Insertion; Expressionskontrolle des pIRES2-Plasmids nach Transfektion

M13-fw(-20)/rev

55 °C

800 bp

Herstellung der MTMR-DNA für die Klonierung

2.2.1.6 Sekundärstrukturanalyse von RNA

Sämtliche RNA-Sequenzen wurden mit den Programmen mfold 3.0 und Sfold 2.0 analysiert. Für darauffolgende experimentelle Anwendungen wurde diejenige RNA-Sekundärstruktur ausgewählt, die über die geringste freie Energie ΔG verfügt (Zarrinkar and Williamson, 1994). Mit Hilfe der Detaildarstellungsoptionen beider Programme konnte man die potentiellen Einzelnukleotide (ssNukleotide) in den ausgegebenen RNA-Strukturen lokalisieren. Darüber hinaus markierten entweder eine farbliche Zuordnung (mfold 3.0) oder ein Zahlenwert (Sfold 2.0) die Wahrscheinlichkeit für die Einzelsträngigkeit eines Nukleotides. Die Anzahl der potentiellen freien Nukleotide in den Hybridisierungsarmen von Ribozymen diente als Kriterium zur Auswahl der geeignetesten Sekundärstruktur.

2.2.1.7 Herstellung der Substrat-DNA-Matrices

↓33

Die Substrat-kodierenden DNA-Abschnitte, die die Ribozymschnittstellen sowie einen 5’-T7-Promotor enthalten, wurden mit Hilfe von PCR amplifiziert. Als Matrix in der PCR dienten die cDNAs der Zellinien, die die entsprechenden ABC-Transporter überexprimieren. Im Einzelnen verwendete man die cDNA der Zellinie EPG85-257RNOV als Matrix zur Amplifikation des Substrates BCRPsub, die cDNA der Zellinie EPG85-257RDB als Matrix zur Herstellung des Substrates MDR1sub und die cDNA der Zellinie A2780RCIS als Matrix für die PCR des Substrates MRP2sub. Der für die in vitro-Transkription erforderliche 5’-T7-Promotor konnte in der PCR durch die Verwendung von entsprechend konstruierten 5’-Vorwärtsprimern, die die T7-Promotorsequenz enthielten, amplifiziert werden. Nach Abschluß der Reaktion wurden die PCR-Produkte auf ein 1,5 %iges Agarose-Gel aufgetragen und mit Hilfe des Qiagen Gel Extraction Kits eluiert und aufgearbeitet (s. Kap. 2.2.1.4). Die aufgearbeiteten PCR-Produkte wurden als Matrices für die in vitro-Transkription eingesetzt (s.Kap. 2.2.1.9).

2.2.1.8 Herstellung der MTMR-DNA-Matrix

Die MTMR-DNA mitsamt vorgeschalteter T7-Promotor-Sequenz (s. Kap. 1.1.5) wurde chemisch synthetisiert und in den pUC19-Vektor kloniert. Die Herstellung des pUC19/MTMR-Vektors erfolgte von der Firma Biorad (Frankfurt/M., D). Zur Vorbereitung der in vitro-Transkription wurde der Vektor mit Hilfe des Restriktionsenzyms HindIII linearisiert und anschließend gefällt (siehe Abschnitt 2.2.1.15). Das luftgetrocknete DNA-Pellet wurde in RNAse-freiem Wasser solubisiert.

2.2.1.9  In vitro-Transkription

Aufgrund der integrierten T7-Promotorsequenzen konnten sämtliche doppelsträngige DNA-Matrices mit Hilfe einer T7-RNA-Polymerase in vitro transkribiert werden. Die Reaktion erfolgte unter Verwendung des MAXIscript In vitro Transcription Kits nach Herstellerangaben. Die folgende Auflistung beschreibt den Reaktionsansatz im Detail:

↓34

Komponente

Konzentration

Matrizen-DNA

1 µg

NTPs

je 10 mM

T7-Enzym-Mix

2 µl

10 x Transkriptionspuffer

2 µl

[α-32P]UTP (800 Ci/µl)

1 µl

H2Odd

ad 20 µl


Die Komponenten wurden auf Eis zusammenpipettiert und die Ansätze im Anschluß für 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde mit 10 µl Gel Loading Dye II abgestoppt und der gesamte Reaktionsansatz auf ein 8 %iges PA-Gel aufgetragen.

2.2.1.10 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) diente der Auftrennung radioaktiv markierter RNAs. Sie erfolgte in einem 8 %igen PA, 7 M Harnstoffgel in 1 x TBE, welches zwischen zwei Glasplatten, die vorher mit Paketklebeband abgedichtet wurden, gegossen wurde und für eine Stunde auspolymerisiert war. Vor Start der Gelelektrophorese wurde die Abdichtung gelöst und das zwischen den Glasplatten befindliche Gel in eine Halterung vertikal eingespannt. Die Auftrennung erfolgte zunächst für 30 min bei 20 W, anschließend für 4 h bei 40 in 1 x TBE-Laufpuffer.

2.2.1.11 Elution in vitro-transkribierter RNA

↓35

Nach Abschluß der PA-Gelelektrophorese wurde das Gel in den Glasplatten aus der Halterung genommen und vorsichtig die obere Glasplatte vom Gel gelöst. Das auf der unteren Glasplatte befindliche Gel wurde darufhin mit Klarsichtfolie luftblasenfrei umhüllt und in eine Filmkassette gelegt. In der Dunkelkammer wurde daraufhin ein Röntgenfilm aufgelegt und die Position des Filmes auf der Klarsichtfolie mit einem Folienschreiber genau markiert. Nach ca. 10 min wurde der Film entwickelt (siehe Kap. 2.2.1.24) und das Autoradiogramm diente nun zur Lokalisierung der radioaktiv markierten RNA-Banden auf dem Gel. Durch Auflage des Autoradiogramms konnten die Banden der in vitro-transkribierten RNAs im Gel lokalisiert, mit einem sterilen Skalpell herausgeschnitten und in ein steriles Reaktionsgefäß überführt werden. Im Reaktionsgefäß wurden die Gelstücke mechanisch zerkleinert. Nach Zugabe von 350 µl PA-RNA-Elutionspuffer wurden die Banden fünfmal abwechselnd in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei 37 °C aufgetaut, um die Gelstruktur zu zerstören und die nachfolgende Elution der RNA zu erleichern. Anschließend wurden die Ansätze ü.N. zur RNA-Elution bei 37 °C geschüttelt. Am darauffolgenden Tag wurde das Eluat durch Zentrifugation (30 min, 14000 rpm, 4 °C) von den Gelstücken getrennt und in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Durch Zugabe von 0,1 Vol 3 M Natriumazetat, 2,5 Vol Ethanol und 5 µg Glykogen für 3 h bei -70 °C wurde die RNA aus dem Eluat gefällt und anschließend für 1 h bei 14000 rpm und 4 °C durch Zentrigation pelletiert. Danach wurde das Pellet mit 70 %igem DEPC-Ethanol gewaschen und luftgetrocknet.

2.2.1.12 Quantifizierung radioaktiv markierter RNA

Die Stoffmenge radioaktiv markierter RNA wurde aus der von ihr emittierten und im ß-Counter Wallac 1409 (Wallac, Freiburg, D) detektierten radioaktiven Strahlung bestimmt. In die Berechnung ging zunächst die tatsächlich eingesetzte Menge Radioaktivität A ein. Diese ergibt sich aus der gemessenen Aktivität zum Zeitpunkt der Kalibrierung, Akal, und der Zeit der Kalibrierung, tkal, und der Halbwertzeit t1/2des verwendeten Isotops (32P mit t1/2=14,3 d). Es gilt dann:

↓36

 

eingesetzte Aktivität [counts]

Akal

eingesetzte Aktivitaet zum Zeitpunkt der Kalibrierung [counts]

tkal

Zeitpunkt der Kalibrierung [d]

t1/2

Halbwertzeit des eingesetzten Isotops [d]

In die Berechnung ging außerdem der Faktor W ein, der den Einbau von unmarkiertem UTP an einer beliebigen Position des Moleküls beschreibt. Dieser Faktor wird aus dem Quotienten der Stoffmenge eingesetzten unmarkierten UTPs, nUTP, und der Anzahl von UMPs je Transkriptionsmolekül, NUMP, berechnet:

↓37

 

Faktor für zufälligen Einbau von unmarkierten UTPs

nUTP

eingesetztes unmarkiertes UTP [nmol]

NUMP

Anzahl der UMPs im Transkriptionsmolekül

Die Stoffmenge des Transkripts nTranskript ist das Produkt aus der gemessenen Radioaktivität der Probe AMess und dem Quotienten W/A:

↓38

 

Transkriptstoffmenge [nmol]

AMess

gemessene Radioaktivität [counts]

W

Faktor für zufälligen Einbau unmarkierten UMPs

A

 

Nach der Berechnung der Stoffmenge des getrockneten RNA-Pellets wurde dieses in RNAse-freiem Wasser aufgelöst und eine Konzentration von 0,5 pmol/µl eingestellt.

2.2.1.13  In vitro-RNA-Prozessierung

Die ribozymatische Spaltung der RNA wurde in vitro in einem Gesamtvolumen von
10 µl unter RNA-Prozessierungsbedingen durchgeführt: 40 mM Tris/HCl (pH 7,5) und 12 mM MgCl2 bei 37 °C. Die Konzentrationen von Substrat und MTMR wie auch die Inkubationszeiten variierten je nach Versuchsziel und sind in Tab. 6 beschrieben. Bei Beendigung des Versuchs wurden die Ansätze mit 10 µl Gel Loading Dye II versetzt und im PA-Gel elektrophoretisch aufgetrennt.

↓39

Tabelle 6: Reaktionsbedingungen bei der RNA-Prozessierung in vitro

Untersuchungsziel

CMTMR (nM)

CSubstrat (nM)

t (min)

Autokatalyse MTMR

100

-

120

Identifikation MTMR-Fragmente

100

100

120

vini und kobs

125

25

0; 0,5; 1; 2; 3; 5; 10; 20; 30; 60; 120

kcat/kM und ∆S

0; 20; 40; 80; 120; 200; 300; 400

40

30

Nach Beendigung der PA-Gelelektrophorese wurde das Gel, wie in Kap. 2.2.1.11 beschrieben, aus der Halterung gelöst und nach Überführung in eine Filmkassette konnte in der Dunkelkammer ein Röntgenfilm aufgelegt werden. Abhängig von der Strahlungsintensität des Gels wurde der Film nach 6-48 h manuell entwickelt (siehe Kap. 2.2.1.24). Die derart erstellten Autoradiogramme wurden zur Bestimmung der kinetischen Konstanten eingescannt und mit Hilfe der NIH Image Software densitometrisch ausgewertet (s. Kap. 2.2.1.25).

2.2.1.14 Berechnung der Reaktionsparameter der ribozymatischen Substratspaltung

Aus den zeitabhängigen Reaktionskinetiken konnten durch densitometrische Vermessung der relativen Signalstärken von Substrat-RNA und Spaltprodukt-RNA Produkt-Zeit-Diagramme erstellt werden. Diese Daten bilden die Grundlage zur Berechnung der zeitabhängigen Reaktionsparameter, wie Initialgeschwindigkeit vini und beobachtete Reaktionsrate kobs.

2.2.1.14.1  Initialgeschindigkeit und beobachtete Spaltrate

↓40

Grundlage der experimentellen Bestimmung von Initialgeschwindigkeit, vini, und beobachteter Spaltrate, kobs, sind die gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.13 erstellten Autoradiogramme der zeitabhängigen Reaktionskinetiken. Durch densitometrische Vermessung der Banden von Substrat und Spaltprodukten konnte der prozentuale Anteil der Spaltprodukte (Pt) am eingesetzten Substrat ermittelt und in einem Produkt-Zeit-Diagramm dargestellt werden (Pt=f(t)-Diagramm).

Initialgeschwindigkeit

Die Initialgeschwindigkeit, vini, der ribozymatischen RNA-Spaltung bezeichnet die Umsetzung des RNA-Substrats S in die beiden Spaltprodukte P1 und P2 während der ersten Minuten der Reaktion. Sie wird aus dem Quotienten der Stoffmenge der gebildeten Produkte P1 und P2 zum Zeitpunkt t errechnet:

↓41

 

Initialgeschwindigkeit [mol/s]

nP1+P2

Stoffmenge der Spaltprodukte zum Zeitpunkt t [mol]

t

Reaktionszeit [s]

Die Initialgeschwindigkeit, vini,entspricht dem Anstieg im quasi linear verlaufenden Anfangsbereich des Graphen im Pt=f(t)-Diagramm.

↓42

Beobachtete Spaltrate k obs

Des weiteren wurde auf der Grundlage der zeitabhängigen Reaktionskinetiken die sogenannte beobachtete Reaktionsrate, kobs, gemäß den Formeln von Heidenreich et al., 1994 sowie Hendry et al., 1995 berechnet. Im Ergebnisteil erfolgt die Zuordnung der ermittelten Werte nach Heidenreich et al., 1994 bzw. Hendry et al., 1995 jeweils in den Fußnoten der Ergebnistabellen.

k obs nach Heidenreich ., 1994

↓43

Für die Berechnung des Reaktionsparameters nach Heidenreich et al., 1994 wurde zunächst der negative natürliche Logarithmus des relativen Anteils des ungeschnitten Substrates am Gesamtsubstrat (Su) ermittelt und gegen die Reaktionszeit aufgetragen.

 

beobachtete Spaltrate nach Heidenreich et al., 1994

-lnSu

negativer natürliche Logarithmus des relativen Anteils des ungeschnittenen Substrates am Gesamtsubstrat (0≤Su≤1)

t

Reaktionszeit [s]

↓44

Der Parameter kobs entspricht dem Anstieg der Regressionsgeraden im quasi linearen Anfangsbereich des Graphen im -lnSu-Zeit-Diagramm.

k obs nach Hendry ., 1995

Bei der Berechnung des Parameters kobs nach Hendry et al., 1995 wird im Gegensatz zur vorgenannten Methode lediglich der Anteil des ungespaltenen Substrates am maximal spaltbaren Substrat, Smax, verwendet.

↓45

 

beobachtete Spaltrate nach Heidenreich et al., 1994

-lnSmax

negativer natürliche Logarithmus des relativen Anteils des ungeschnittenen Substrates am maximal spaltbaren Substrat (0≤Smax≤1)

t

Reaktionszeit [s]

Diese Berechnung nach Hendry et al., 1995 bezieht die Tatsache ein, daß die ribozymatische Spaltreaktion nicht zum vollständigen Abbau des eingesetzten Substrats führt, sondern eine maximale Produktbildung erreicht wird. In diesem Fall entspricht kobs dem Anstieg der Regressionsgeraden aus dem Anfangsbereich des Graphen im
-lnSmax-Zeit-Diagramm.

2.2.1.14.2 Der Reaktionsparameter kcat/kM und ∆S

↓46

Basis für die Berechnung der Reaktionsparameter 2.Ordnung, die konzentrationsabhängig sind, wie kcat/kM und den molaren Stoffumsatz ∆S der Reaktion bilden die gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.13 erstellten Autoradiogramme der konzentrationsabhängigen Reaktionskinetiken. Durch densitometrische Vermessung der Banden von Substrat und Spaltprodukten konnte der prozentuale Anteil der Spaltprodukte (Pt) am eingesetzten Substrat in Abhängigkeit von der MTMR-Konzentration ermittelt und in einem Produkt-Konzentrations-Diagramm dargestellt werden (Pt=f(CMTMR)-Diagramm). Mit Hilfe mathematischer Transformationen wurden daraufhin die Parameter kcat/kM (nach Heidenreich und Eckstein, 1992 sowie Hendry et al., 1995) und ∆S bestimmt. Im Ergebnisteil erfolgt die Zuordnung der ermittelten Werte nach Heidenreich and Eckstein, 1992 bzw. Hendry et al., 1995 jeweils in den Fußnoten der Ergebnistabellen.

k cat /k M nach Heidenreich and Eckstein, 1992

Der Reaktionsparameter kcat/kM wurde von Heidenreich and Eckstein, 1992 folgendermaßen definiert:

↓47

SU

Anteil des zum Zeitpunkt t ungespaltenen Substrates am Gesamtsubstrat; 0≤Su≤1

Pt

Stoffmenge des gebildeten Produkts zum Zeitpunkt t [mol]

kcat/kM

Reaktionsparameter nach Heidenreich und Eckstein, 1992

t

Reaktionszeit [s]

cMTMR

MTMR-Konzentration [M]

Die Gültigkeit dieser Formel ist allerdings auf einen Bereich beschränkt, in dem bei steigender Ribozymkonzentration auch eine Zunahme der Spaltprodukte zu verzeichnen ist. Der Parameter kcat/kM kann nach Umstellung der Formel von Heidenreich and Eckstein wie folgt ermittelt werden:

↓48

-lnSU

negativer natürlicher Logarithmus des Anteils des zum Zeitpunkt t ungespaltenen Substrates am Gesamtsubstrat; 0≤Su≤1

kcat/kM

Reaktionsparameter nach Heidenreich und Eckstein, 1992

t

Reaktionszeit [s]

cMTMR

MTMR-Konzentration [M]

Der Parameter kcat/kM nach Heidenreich and Eckstein entspricht dem Anstieg im angenommenen linearen Teil des -lnSt/t-Konzentrations-Diagrammes.

↓49

k cat /k M nach Hendry ., 1995

Eine weitere Berechnungsmöglichkeit nach Hendry et al., 1995 berücksichtigt die Tatsache, daß die Reaktion nicht immer zum vollständigen Abbau des Substrates führt, sondern ein Maximalwert an gespaltenem Substrat (bzw. entstandener Produkte) erreicht wird. Es kann daher ein Anteil des zum Zeitpunkt t ungespaltenen Substrates an maximal spaltbaren Substrat, Smax, definiert werden (0≤Smax≤St):

↓50

Smax

Anteil des zum Zeitpunkt t ungespaltenen Substrats am maximal spaltbaren Substrat

Pmax

Stoffmenge des gebildeten Produktes zum Zeitpunkt t [mol]

Kcat/KM

Reaktionsparameter nach Hendry et al., 1995

t

Reaktionszeit [s]

cMTMR

MTMR-Konzentration [M]

Auch diese Formel ist nur in dem Bereich definiert, in dem bei steigender MTMR-Konzentration auch eine Zunahme der Spaltprodukte zu verzeichnen ist. Für den Parameter kcat/kM ergibt sich analog der vorangegangenene Formelumstellung folgende Gleichung:

↓51

-lnSmax

negativer natürlicher Logarithmus des Anteils des zum Zeitpunkt t ungespaltenen Substrats am maximal spaltbaren Substrat

kcat/kM

Reaktionsparameter nach Hendry et al., 1995

t

Reaktionszeit [s]

cMTMR

MTMR-Konzentration [M]

Der Parameter kcat/kM nach Hendry et al., 1995 entspricht dem Anstieg des angenommenen linearen Abschnittes des Graphen im –lnSmax/t-Konzentrations-Diagramm.

Molarer Stoffumsatz

↓52

Anhand der Daten aus den Produkt-Konzentrations-Diagrammen konnte untersucht werden, wie sich verschiedene molare Verhältnisse von MTMR-Fragmenten auf den molaren Stoffumsatz ∆S, d.h. die Bildung von Produktmolekülen pro MTMR-Fragment-Molekül, auswirken. Dabei entspricht der molare Stoffumsatz ∆S pro MTMR-Fragment dem Quotienten aus dem relativen Anteil des gebildeten Spaltproduktes (am eingesetzten Substrat) Pt (0≤Pt≤1) multipliziert mit der eingesetzten Stoffmenge des jeweiligen Substrates nSub und der eingesetzten Stoffmenge des dazugehörigen MTMR-Fragmentes nMTMR.

Pt

relativer Anteil der gebildeten Produkte am Gesamtsubstrat zum Zeitpunkt t; 0≤Pt≤1

nSub

Stoffmenge des eingestzten Substrates [mol]

nMTMR

Stoffmenge des eingesetzten MTMR-Fragmentes [mol]

2.2.1.15 Präzipitation von DNA

↓53

Eine DNA-enthaltende Lösung wurde mit 1/10 Vol 3 M Natriumazetat (pH 5) und 2,5 Vol Ethanol versehen. Die DNA wurde bei -20 °C für 20 min gefällt und 15 min bei 4 °C und 14000 rpm pelletiert. Das Pellet wurde mit 70 %igem Ethanol gewaschen und erneut für 5 min bei 14000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Im Anschluß wurde das DNA-Pellet luftgetrocknet und in 20 µl TE-Puffer oder H2Odd aufgenommen.

2.2.1.16 Klonierung des MTMR

Die im pUC19/MTMR-Vektor integrierte MTMR-Sequenz wurde zunächst mit Hilfe von M13-Primern amplifiziert (s.Kap. 2.2.1.5) und aufgereinigt (gemäß Kap. 2.2.1.3 und 2.2.1.4). Im Anschluß erfolgte eine Phosphorylierung des PCR-Produktes mit Hilfe der T4 Polynukleotidkinase. Der pIRES2/EGFP-Vektor wurde mit dem Enzym SmaI linearisiert und mit der Shrimp Alkalische Phosphatase dephosphoryliert. Anschließend wurden sowohl linearisierter Vektor als auch gereinigtes PCR-Produkt getrennt voneinander präzipitiert (siehe Kap. 1.1.1.15). Für die Ligation wurden linearisierter Vektor und PCR-Produkt im Verhältnis 1:5 zusammengegeben und mit Hilfe der T4 DNA Ligase über Nacht bei 16 °C inkubiert. Der Ligationsansatz wurde daraufhin wieder präzipitiert und in H2Odd aufgenommen.

2.2.1.17 Sequenzierung

Die Sequenzierung von DNA führte Dr. Martin Meixner am Institut für Genetik an der Humboldt-Universität Berlin durch.

2.2.1.18 RNA-Isolation

↓54

RNA wurde mit Hilfe des RNeasy Kits nach Herstellerangaben isoliert.

2.2.1.19 Reverse Transkription

Die aus den Zellen isolierte Gesamt-RNA (2 µg) wurde mit Hilfe der RNA-abhängigen-DNA-Polymerase Superscript II und Hexanukleotid-Zufallsprimern mit Hilfe des SuperScript First-Strand Synthesis System in cDNA umgeschrieben. Die cDNA-Proben wurden nach Beendigung der Synthese 1:10 mit H2Odd verdünnt und bei -20 °C gelagert.

2.2.1.20 Quantitative real-time RT-PCR

Die Expressionsstärke spezifischer mRNAs wurde mittels quantitativer real-time RT-PCR an einem Light Cycler-Gerät ermittelt. Dazu wurde der Light Cycler Fast Start DNA Master CYBR Green I Kit verwendet. Als Matrize diente die 1:10 verdünnte cDNA, die aus den Gesamt-RNAs der zu untersuchenden Zellinien gewonnen wurde. Der Reakionsmix enthielt des weiteren genspezifische Primer für die Zielgene BCRP/ABCG2 (Primer: BCRP-fw/rev), MDR1/ABCB1 (Primer: MDR1-fw/rev), MRP2/ABCC2 (Primer: MRP2-fw/rev) und ALDOLASE (Primer: Aldo-fw/rev), deren Sequenzen im Kapitel 2.1.7 zu finden sind. Zur Bestimmung der Molekülzahl pro Reaktionsansatz wurde ein im Vorfeld hergestelltes Standardplasmid verwendet, das das Primer-spezifische PCR-Produkt enthielt. Dieses Standardplasmid wurde vermessen und mit Hilfe seiner Nukleotidanzahl konnte die Molekülanzahl des Plasmids pro µl berechnet werden. Im Reaktionsmix wurde das Standardplasmid auf Konzentrationen von 1,2 x 107; 1,2 x 106; 1,2 x 105; 1,2 x 104; 1,2 x 103; 1,2 x 102; 1,2 x 101; 1,2 x 100 Moleküe pro Reaktionsansatz eingestellt. Diese Verdünnungsreihe des Standardplasmids wurde vor jeder Quantifizierung hergestellt. Aufgrund der bekannten Molekülkonzentrationen des Standardplasmids konnte die Quantität an Molekülen der Proben für das jeweilige Gen durch die LightCycler Software errechnet werden. Zur Ermittlung der relativen Genexpressionen der Gene BCRP, MDR1, und MRP2 in den jeweiligen Zellinien, wurde aus denselben cDNA-Proben die Expression des sogenannten “housekeeping”-Genes Aldolase (ALD) bestimmt. Alle Genexpressionsanalysen wurden in drei unabhängigen Versuchsreihen durchgeführt. Im Anschluß wurden die Quotienten aus jeder Versuchsreihe der ABC-Transporter-Quantifizierung und jeder Versuchsreihe der Aldolase-Quantifizierung (9 Quotienten) berechnet. Durch die Bestimmung von Mittelwert und Standardabweichung aller Quotienten konnten die relativen Expressionstärken der jeweiligen ABC-Transporter-Gene in den Zellinien ermittelt werden.

2.2.1.21 Protein-Isolation

↓55

Zur Isolation von Gesamtprotein wurden die entsprechenden Zellen in 10 cm Petrischalen ausgesät und bis zur 90 %igen Konfluenz wachsen gelassen. Zur Isolation wurde das Medium von den Schalen abgesaugt, zweimal mit PBS gewaschen und die Zellen wurden mit 250 µl RIPA-Puffer gleichmäßig bedeckt. Die Schalen wurden dann für 30 min auf Eis inkubiert. Im Anschluß wurden die Zellen mit einem Zellschaber von der Petrischale abgelöst und in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt. Durch Zentrifugation für 8 min bei 14000 rpm und 4 °C wurden Zelltrümmer pelletiert. Der Überstand wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und im Verhältnis 1:3 mit 4 x Sample Puffer versetzt. Daraufhin wurde die Proteinlösung für 10 min bei 95 °C denaturiert und sofort erneut für 8 min bei 14000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und bei -80 °C gelagert.

2.2.1.22 Quantifizierung von Proteinlösungen

Für die Bestimmung der Proteinkonzentration einer Lösung wurde zunächst 1 ml Protein-Elutionspuffer in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß pipettiert. Danach wurde dreimal jeweils 1 µl der zu quantifizierenden Proteinlösung auf eine Nylonmembran pipettiert und diese für
2 min mit Amidoschwarzlösung gefärbt. Die gefärbte Membran wurde daraufhin solange mit Protein-Destainlösung entfärbt, bis fast keine Hintergrundschwärzung mehr sichtbar war. Danach trennte man mit einem sterilen Skalpell gleichmäßig große Membranstücke, auf denen die angefärbten Proteinspots sichtbar waren, heraus. Zur Ermittlung der Hintergrundfärbung bzw. eines Referenzwertes schnitt man zudem ein ähnlich großes Stück ungefärbter Membran aus. Die Membranstücke wurden in die vorbereiteten 2 ml Eppendorf-Gefäße mit Elutionspuffer überführt und diese für 20 min bei RT geschüttelt. Die Extinktion der Proteinlösung wurde im Anschluß im Photometer bei einer Wellenlänge von 630 nm gemessen. Zur Quantifizierung diente eine Eichkurve mit Extinktionswerten bekannter Konzentrationen des Proteins BSA. Mit Hilfe der Eichkurve konnten die Proteinkonzentrationen der Proben von deren Extinktionswerten abgeleitet werden.

2.2.1.23 Western Blot

Für den Transfer von Proteinen auf eine Nylonmembran wurde zunächst eine Protein-Gelelektrophorese mit Hilfe der Mini Blot II-Anlage durchgeführt. Nach dem korrekten Zusammenbau der einzelnen Bestandteile wurde zuerst das Trenngel gegossen und auspolymerisieren gelassen. Im Anschluß wurde das Sammelgel gegossen. Nach dem Auspolymerisieren des Sammelgels wurde 5 x Running-Puffer in die Apparatur eingefüllt. Die Proteinlösungen wurden mit 4 x Sample Puffer versetzt, 10 min bei 95 °C erhitzt und danach auf das Gel appliziert. Die Elektrophorese konnte darufhin bei 70 V für 3-4 h durchgeführt werden. Danach wurde das Gel vorsichtig aus der Apparatur gelöst und in einer "semi-dry"-Blottingapparatur auf eine Nylonmembran luftblasenfrei geschichtet. Sowohl unter die Nylonmembran, als auch über dem Gel wurden jeweils drei Lagen Whatman-Papier im sogenannten "sandwich"-Prinzip angeordnet. Jede einzelne Lage des "sandwich"-Paketes wurde mit Transferpuffer durchtränkt und luftblasenfrei geschichtet. Danach wurde die Blottingapparatur vorsichtig geschlossen und der Proteintransfer für 1 h bei 20 V durchgeführt. Im Anschluß wurde die Blotappartur auseinandergebaut und die Membran vorsichtig aus dem "sandwich"-Paket gelöst. Zur Kontrolle des Proteintransfers wurde die Membran für 5 min mit Ponceau-Lösung gefärbt und danach mehrfach mit H2Odd solange entfärbt, bis klare Proteinbanden sichtbar wurden. Das Gel wurde in einer Coomassie-Blau-Lösung für 10 min gefärbt und ü.N. in einer 10 %igen Essigsäurelösung entfärbt. Sowohl von der angefärbten Membran, als auch vom Gel wurde ein Foto angefertigt. Nach der Kontrollfärbung der Membran wurde diese ü.N. bei 4 °C in Blockpuffer inkubiert. Danach wurden die Membran für 2 x 15 min mit TBST gewaschen und 2 h mit dem Primärantikörper, der zuvor in einer spezifischen Verdünnung in Blockpuffer gelöst wurde, inkubiert. Daraufhin erfolgten Waschschritte von 2 x 15 min und 2 x 5 min mit TBST und die Inkubation mit dem frisch in Blockpuffer verdünnten Sekundärantikörper für 1 h. Danach wurde die Membran für 2 x 30 min und 2 x 15 min mit TBST gewaschen. Zur Sichtbarmachung der Proteinbanden wurde das SuperSignal Western Blot Pico Chemoluminescent Substrate nach Herstellerangaben angewandt und im Anschluß ein Chemiluminizenz-sensitiver Film aufgelegt und entwickelt (siehe Kap. 2.2.1.24). Die verwendeten Antikörper und ihre spezifischen Verdünnungen sind in Tab. 7 aufgelistet.

↓56

Tabelle 7: Antikörper für Western Blots

Antikörper; Katalognummer

Verdünnung

Anwendung

Hersteller

mAb to P-Gp (C219); ALX-801-002

1:100 in Blockpuffer

1. AK zur Detektion von MDR1/ABCB1

Alexis, USA

anti BCRP mAb BXP-21, ALX-801-029

1:200 in Blockpuffer

1. AK zur Detektion von BCRP/ABCG2

Alexis, USA

mouse anti-GAPDH mAb; MAB374

1:1000 in Blockpuffer

1. AK zur Detektion von GAPDH

Chemicon, Temecula,CA, USA

mouse anti-actin mAb; MAB1501R

1:1000 in Blockpuffer

1. AK zur Detektion von Aktin

Chemicon, Temecula,CA, USA

goat anti-mouse IgG, Peroxidase conjugated; 31438

1:10000 in Blockpuffer

2. AK zur Detektion von Maus-IgG

Pierce, Rockford, IL, USA

2.2.1.24 Entwicklung von Filmen

Nach der versuchsabhängigen Expositionszeit eines Filmes wurde dieser in der Dunkelkammer aus der Filmkassette genommen und in der Entwicklerlösung solange geschwenkt, bis Signale sichtbar wurden. Danach wurde der Film in ein Wasserbad überführt und für einige Sekunden darin abgespült. Darauf folgte eine Inkubation in Fixierlösung für mindestens 1 min. Nach diesem Schritt erfolgte eine letzte Inkubation in Wasser für einige Sekunden. Mit Filmklammern wurde der entwickelte Film daraufhin aufgehängt und luftgetrocknet.

2.2.1.25 Dokumentation

Radiographie
Zur Sichtbarmachung von radioaktiv-markierten und PAGE aufgetrennten Nukleinsäuren wurde ein Röntgenfilm auf die mit Klarsichtfolie umhüllten Gele aufgelegt. Die Exposition des Filmes erfolgte bei -80 °C für folgende Expositionszeiten:

↓57

 

Expositionszeit

in vitro-Transkription

15 min

 

6-48 h

Im Anschluß wurden die Filme manuell entwickelt (siehe Kap. 2.2.1.24).


Densitometrische Auswertung

↓58

Aufgrund der Schwärzung des Röntgenfilmes konnten radioaktiv markierte Nukleinsäurenbanden detektiert und bei in vitro-Prozessierungsversuchen quantitativ vermessen werden. Für die quantitative Analyse wurden die entwickelten Röntgenfilme eingescannt. Die Auswertung des digitalen Bildes erfolgte am Computer unter Verwendung der NIH-Image Software.

Fotographie

Nukleinsäurebanden in ethidiumbromidhaltigen Agarosegelen wurden durch UV-Licht sichtbar gemacht und mit Hilfe der Videodokumentationsanlage Digi Gel Print fotografiert.

↓59

Angefärbte Proteinbanden in PA-Gelen bzw. auf Nylonmembranen wurden am Leuchttisch in ihrer Sichtbarkeit intensiviert und mit Hilfe der Videodokumentationsanlage Digi Gel Print fotografiert.

2.2.2 Mikrobiologische Methoden

2.2.2.1  Kultur von Bakterien

Die Kultur von Bakterien erfolgte in LB-Medium im Schüttelinkubator bzw. auf LB-Agarplatten im Brutschrank bei 37 °C. Während der Anzucht von transformierten Bakterien wurde das Antibiotikum, gegen welches das zu transformierende Plasmid ein Resistenzgen enthielt, ins LB-Medium bzw. in den LB-Agar gegeben. Die Konzentrationen des Antibiotikums wurden entsprechend der Versuchsprotokolle für die jeweiligen Vektoren, mit denen die Bakterien transformiert wurden, eingestellt. Zur langfristigen Lagerung wurden Bakterien in LB-Medium mit 30 % Glyzerin aufgenommen und bei -80 °C gelagert. Zur Aktivierung der Stammkulturen wurden 10 µl der Glyzerinkultur entnommen, in 30 ml LB-Medium gegeben und ü.N. auf dem Schüttelinkubator bei 37 °C herangezogen.

2.2.2.2 Transformation von Bakterien

Die Transformation von kompetenten E.coli-Bakterien erfolgte mit Hilfe des TOPO TA Cloning Kits. Je Transformationsansatz wurde ein Röhrchen chemokompetenter Bakterien mit 2 µl des Transformationsansatzes gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Danach erfolgte ein Hitzeschock für 30 s bei 42 °C und eine Inkubation für 5 min auf Eis. Im Anschluß wurden 250 µl raumtemperierten SOC-Mediums in das Röhrchen pipettiert und dieses wurde für 1 h bei 37 °C im Schüttelinkubator geschüttelt. Danach wurden LB-Agarplatten, die das entsprechende Selektionsantibiotikum enthielten, raumtemperiert und 20 µl der Bakteriensuspension pro Platte ausgestrichen. Die Platten inkubierten ü.N. bei 37 °C im Bakterienbrutschrank. Bei der Transformation der Plasmide pUC/MTMR bzw. pCR2.1-TOPO, die ein Ampicillinresistenzgen enthielten, wurde eine Carbinicillinkonzentration von 50 µg/ml im LB-Medium bzw. LB-Agar eingestellt. Bei der Transformation von pIRES2/EGFP wurde eine Kanamycinkonzentration von 25 µg/ml eingestellt. Am nächsten Tag wurden je Platte sechs Klone gepickt und die enthaltenen Plasmide aufpräpariert (s. Kap. 2.2.1.1).

2.2.3 Arbeit mit eukaryotischen Zellen

2.2.3.1  Kultivierung humaner Zellen

↓60

Sämtliche eukaryotische Zellen (s. Tab. 2) wurden im Brutschrank bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 in den angegebenen Medium kultiviert. Zur Aufrechterhaltung der spezifischen Resistenzen wurden der Zellinie EPG85-257RNOV Mitoxantron (200 ng/ml bzw. 0,39 µM), der Zellinie EPG85-257RDB Daunorubicin
(2,5 µg/ml bzw. 4,2 µM) und der Zellinie A2780RCIS Cisplatin (10 µg/ml bzw.
33,3 µM) zugesetzt. Zweimal wöchentlich wurden die Zellen mikroskopisch untersucht (Zelldichte, Infektionen, abgestorbene Zellen), einmal mit PBS gewaschen und das alte Medium durch frisches ersetzt. Sofern ein Kulturgefäß konfluent bewachsen war, wurden die Zellen darin trypsiniert (50 µl Trypsin/cm2 Gefäßboden, dann Inkubation bei 37 °C bis zum Ablösen der Zellen). Etwa ein Fünftel der trypsinierten Zellen wurde in ein neues Zellkulturgefäß mit frischem Medium überführt.

2.2.3.2 Einfrieren von Zellen

Die in T75-Flaschen kultivierten Zellen wurden bei Konfluenz trypsiniert, zentrifugiert (10 min, 800 rpm, RT), der Überstand abgesaugt und das Pellet in 95 % FKS und 5 % DMSO resuspendiert (ca. 2 x 106 Zellen pro ml). Diese Zellsuspension wurde in Aliquots von 1 ml in Einfrierröhrchen überführt und in mit 2-Propanol gefüllten Einfrierboxen bei -80 °C ü.N. gelagert. Am nächsten Tag wurden die Röhrchen aus den Einfrierboxen in normale Aufbewahrungsboxen überführt und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert. Zur Rekultivierung eingefrorener Zellkulturen wurden die Einfrierröhrchen vorsichtig im 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut und die Zellsuspension umgehend in ein Zellkulturgefäß mit Komplettmedium überführt. Am nächsten Tag wurden die aufgetauten Zellen mikroskopisch untersucht, einmal mit PBS gewaschen und neues Medium zugegeben.

2.2.3.3 Transfektion von Zellen

Alle Transfektionen wurden unter Verwendung des SuperFect Transfection Reagent durchgeführt. Am Tag vor der Transfektion wurden ca. 3 x 105 Zellen in 6-well-Platten ausgesät und in zytostatikafreiem Komplettmedium bis zu einer Konfluenz von 60-70 % anwachsen gelassen. Die Transfektion erfolgte gemäß dem folgenden Protokoll:

↓61

1.

2 µg Plasmid-DNA mit 10 mM sterilem Tris-HCl und 65 µl OPTIMEM zu einem Gesamtvolumen von 75 µl mischen;

2.

10 µl SuperFect dazugeben, 5 x auf- und abpipettieren;

3.

10 min bei RT inkubieren;

4.

Zellen 1 x mit PBS waschen;

5.

500 µl OPTIMEM zu DNA/SuperFect-Ansatz geben und gut mischen;

6.

DNA/SuperFect-Ansatz auf Zellen geben;

7.

2-3 h bei 37 °C im Brutschrank inkubieren;

8.

Medium entfernen, 2 x mit PBS waschen;

9.

Komplettmedium auf Zellen geben.

Als Negativkontrolle der Transfektion wurde das Protokoll in einem Parallelansatz ohne die Verwendung von Plasmid-DNA durchgeführt. Am darauffolgenden Tag wurden die transfizierten Zellen mikroskopisch untersucht und das Komplettmedium durch G148-haltiges Selektionsmedium (Komplettmedium mit 400 µg/ml G418) ersetzt. Die Zellen wurden nach weiteren 24 h trypsiniert und in eine 20 cm Petrischale überführt. Das Selektionsmedium wurde dreimal wöchentlich gewechselt. Sobald alle Zellen der Negativkontrolle im Selektionsmedium abgestorben waren und in den Transfektionsplatten einzelne Zellklone makroskopisch sichtbar waren, wurden das Medium entfernt, die Klone mit Klonierungsringen umschlossen und durch Zugabe von 30 µl Trypsin abgelöst. Die einzelnen, trypsinierten Zellklone wurden umgehend in
24-well Platten überführt und bis zur Konfluenz in Selektionsmedium gehalten. Danach wurden die Klone entweder in größere Zellkulturgefäße (T75-Flaschen) transferiert oder bis zur weiteren Verwendung eingefroren (siehe Kap.2.2.3.2).

2.2.3.4 Resistenzbestimmung

Die Resistenz aller Zellinien gegenüber verschiedenen Zytostatika wurde durch ein Zytotoxizitätsexperiment bestimmt (Skehan et al., 1990 bzw. Perez et al., 1993). Hierzu säte man die Zellen in 96-well Platten aus (dreimal 10 Vertiefungen je Versuch), so daß sie ü.N. in Komplettmedium anwachsen konnten. Anschließend wurden Zytostatika verschiedener Konzentrationsstufen (siehe Tab. 7) dazugegeben und für weitere fünf Tage im Brutschrank inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit fixierten die Zellen in 10 %iger Trichloressigsäure für 1 h bei 4 °C, wurden fünfmal mit Wasser gewaschen und die zellulären Proteine für 10 min mit 100 µl SulforhodaminB (SRB) in
1 %iger Essigsäure gefärbt. Überschüssige SRB-Lösung konnte durch 5 x Spülen der
96-well Platten mit 1 %iger Essigsäure entfernt werden. Im Anschluß wurden die Platten ü.N. luftgetrocknet. Am darauffolgenden Tag wurden die Protein-SRB-Komplexe in
300 µl 10 mM Tris (pH 8,0) gelöst und für 2 h auf dem Schüttler geschüttelt. Anschließend erfolgte die photometrische Vermessung der gelösten Protein-SRB-Komplexe im Plattenlesegerät (BioTek, USA) bei 562,5 nm. Als Referenzwert wurde eine Vertiefung mit 300 µl 10 mM Tris gefüllt, ebenfalls photometrisch vermessen und der Meßwert durch die Software von den übrigen Werten subtrahiert. Das relative Wachstum der Zellen unter den verschiedenen Zytostatikumskonzentrationen konnte derartig ermittelt werden, indem die Extinktionswerte der Zellen bei einer bestimmten Zytostatikumskonzentration mit denjenigen, die ohne Zytostatikum gewachsen waren (100 %), in Relation gesetzt wurden. Über die Konzentrationen der eingesetzten Zytostatika gibt Tab. 8 Auskunft.

↓62

Tabelle 8: Konzentrationen der im Proliferationsversuch eingesetzten Zytostatika

 

Mitoxantron [ng/ml]

Daunorubicin[ng/ml]

Cisplatin[µg/ml]

EPG85-257P

0; 0,63; 2; 3,16; 6,32; 20; 31,6; 63,2; 200; 632

0; 2,5; 5; 10; 25; 50; 100; 500; 1000; 2500

 

EPG85-257RNOV und abgeleitete Transfektanten

0; 6,32; 20; 63,2; 200; 632; 2000; 6320; 10000; 20000

  

EPG85-257RDB und abgeleitete Transfektanten

 

0; 5; 25; 50; 100; 500; 1000; 5000; 10000; 25000

 

A2780P

  

0; 0,0316; 0,1; 0,316; 0,56; 1; 1,78; 3,16; 10; 31,6

A2780RCIS
und abgeleitete Transfektanten

  

0; 0,1; 0,316; 1; 3,16; 5,6; 10; 17,8; 31,6; 100

2.2.3.5 Akkumulation von Zytostatika in Zellen

Die relative zelluläre Akkumulation des Zytostatikums Mitoxantron wurde für die Zellinien EPG85-257P, EPG85-257RNOV sowie deren abgeleitete Transfektanten und die Akkumulation des Zytostatikums Daunorubicin für die Zellinien EPG85-257P, EPG85-257RDB sowie deren abgeleitete Transfektanten im Durchflußzytometer bestimmt.

Dabei wurden jeweils 250000 Zellen in vier Vertiefungen einer 6-well Platte ausgesät und in Komplettmedium anwachsen gelassen. Am dritten Tag wurden die Zellen 1 x mit PBS gewaschen und in jeweils zwei Vertiefungen zytostatikahaltiges Komplettmedium, in die anderen beiden Vertiefungen Komplettmedium ohne Zytostatika gegeben. Das Zytostatikum Mitoxantron setzte man in einer Konzentration von 10 µg/ml bzw. 19,3 µM ein, die Konzentration von Daunorubicin war 580 ng/ml bzw. 1 µM. Die Platte wurde danach für 1 h im Brutschrank inkubiert. Im Anschluß wurden die Zellen 2 x mit PBS gewaschen, trypsiniert und in ein Falcon-Gefäß übertragen. Es erfolgten zwei Zentrifugationsschritte für jeweils 5 min bei 800 rpm und RT. Zwischen den Zentrifugationsschritten wurde der Überstand abgesaugt und das Pellet mit PBS gewaschen. Nach der zweiten Zentrifugation wurde das Pellet in 500 µl FACS-PBS aufgenommen und in spezielle FACS-Röhrchen überführt. Die Proben wurden in einem geschlossenen Behältnis bis zur Messung auf Eis gehalten. Die Messung der intrazellulären Fluoreszenz erfolgte direkt im Anschluß am Durchflußzytometer. Die Zellen wurden mit Licht einer Wellenlänge von 480 nm angeregt und die Emission wurde für Mitoxantron bei 630 nm, für Daunorubicin bei 580 nm gemessen. Es wurden pro Probe 2 x 10000 Zellen ausgewertet.

2.2.3.6 Immunzytochemische Lokalisation der ABC-Transporter

↓63

Zur Detektion der ABC-Transporter-Proteinexpression in den einzelnen Zellinien wurden die Zellen auf Objektträgern ausgesät und bis zum Erreichen von 70 %iger Konfluenz im Brutschrank inkubiert. Danach wurden die Objekträger 1 x mit PBS gewaschen, die darauf befindlichen Zellen mit einer Methanol-Azeton-Lösung (1:1) für 10 min bei
-20 °C fixiert und im Anschluß luftgetrocknet. Danach wurden die Objekträger für 5 min in einer 3 %igen Wasserstoffperoxidlösung inkubiert, um endogene Peroxidase zu blockieren. Die immunzytochemischen Reaktionen wurden im Anschluß für 18 h bei
5 °C mit den folgenden Antikörpern durchgeführt: mouse mAb MRP2clone4-2 für die Detektion von MRP2 (Verdünnung 1:100), mouse mAb C219 für die Detektion von MDR1/P-gp (Verdünnung 1:100) und mouse mAb BXP-21 für die Detektion von BCRP (Verdünnung 1:100). Die Antikörper wurden in Antibody Diluent Background Reducing-Lösung verdünnt. Parallel wurde zu jeder Reaktion eine Negativkontrolle angesetzt, die mit Primary Mouse Negative Control durchgeführt wurde. Die Antigene wurden mit Hilfe biotinylierter Antikörper (15 min bei RT), Streptavidin-Peroxidase-Komplex (15 min bei RT), LSAB+, HRP und NovaRed (10 min bei RT) sichtbar gemacht. Danach erfolgte eine Gegenfärbung und Dehydrierung der Präparate mit Mayer’s Hematoxylin die daraufhin im Fluoreszenzmikroskop ausgewertet werden konnten.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
23.08.2006