3 Ergebnisse

3.1  Entwicklung eines Multitargetmultiribozymes und Applikation im zellfreien System

↓63

In vorhergehenden Arbeiten wurden effektive anti-MDR1-, MRP2-, und BCRP-Hammerhead-Ribozyme in unserem Labor entwickelt und sowohl im zellfreien System, als auch in Zellkulturen erfolgreich eingesetzt (Holm et al., 1995; Kowalski et al., 2001, 2002, 2004; Materna et al., 2001, 2005). Da diese Gene jedoch in verschiedensten Tumorentitäten auch parallel resistenzassoziiert auftreten, sollte ein sogenanntes Ribozymkonstrukt entwickelt werden, welches die ABC-Transporter mRNA-Expressionen simultan inhibieren kann und somit vielseitig gentherapeutisch einsetzbar wäre. Um dieser Anforderung gerecht zu werden, wurden die drei genannten Hammerhead-Ribozyme und sogenannte SPACER-Abschnitte, die als Sequenzausschnitt der MDR1-mRNA gleichzeitig die Zielsequenz für das anti-MDR1-Ribozym darstellen, in einem Multitargetmultiribozym (MTMR) dergestalt miteinander kombiniert, daß sich eine tandemartige Anordnung von in cis- und in trans-spaltenden Ribozymen ergibt. Dabei sollten die MDR1-SPACER von in cis-aktiven anti-MDR1-Ribozymen gespalten werden, so daß es zur Freisetzung von MTMR-Fragmenten kommt, die anti-MDR1-, anti-BCRP- und anti-MRP2-Ribozyme enthalten. Diese sollten daraufhin ihre Ziel-mRNAs in trans katalysieren können. Die ribozymatische Spaltung in cis wird als Autokatalyse, die Spaltung in trans als Multitarget-Spaltung bezeichnet (s. Kap. 1.3.1.1). Auf die Konstruktion des Multitargetmultiribozymes wird in den folgenden Abschnitten näher eingegangen.

3.1.1  Auswahl der MTMR-Sequenz

Die funktionell unterschiedlichen Sequenzabschnitte des MTMR (3 x anti-MDR1-Ribozym, 3 x MDR1-SPACER, 1 x anti-BCRP-Ribozym und 1 x anti-MRP2-Ribozym) können auf unterschiedliche Art und Weise hintereinander angeordnet werden, so daß sich 21 Variationen eines potentiellen MTMRs ergeben. In Hinblick auf die Sekundärstrukturen der MTMR-Varianten wurden Untersuchungskriterien aufgestellt, die zur Identifizierung der besten Kombination führten:

↓64

1.

Ausbildung einer typischen Hammerhead-Ribozym-Struktur der integrierten Ribozymsequenzen

2.

Hoher prozentualer Anteil an Einzelnukleotiden in den Hybridisierungsarmen der integrierten Ribozyme.

3.

Keine sterischen Behinderungen der integrierten Ribozyme durch die Gesamt-MTMR-Sekundärstruktur.

Mit Hilfe der Programme mfold 3.0 und Sfold 2.0 konnten die Raumstrukturen aller 21 MTMR-Varianten erstellt und daraufhin die Untersuchungskriterien angewendet werden. Als Resultat dieser in silico-Analyse wurde diejenige MTMR-Sequenz identifiziert, die die beschriebenen Kriterien am besten erfüllt und somit die höchste Wahrscheinlichkeit einer Multitarget-Spaltung in sich birgt. In Tab. 9 werden die einzelnen Bestandteile dieser MTMR-Sequenz in der entsprechenden Reihenfolge beschrieben, in Abb. 8 ist das konstruierte MTMR schematisch dargestellt und in Abb. 9 ist die mit Hilfe von mfold 3.0 ermittelte dazugehörige Sekundärstruktur abgebildet.

Tabelle 9: Funktionelle Domänen des anti-ABC-Transporter-MTMR

Domänen

Funktion der Sequenz

5’- TAA TAC GAC TCA CTA TAG

T7-Promotorsequenz

GGG AAT

Verbindungssequenz

TGC TGT GGC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACA TAG GC

anti-MRP2-Ribozym

AAA ATG TTG TCT GGA CAA GCA C

MDR1-SPACER

CTG GAA CTG ATG AGT CCG TGA GGA CGA AAC ATC TGG AG

anti-BCRP-Ribozym

AAA ATG TTG TCT GGA CAA GCA C

MDR1-SPACER

GTG CTT GTC CAC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACA ACA TTT T

anti-MDR1-Ribozym

AAA ATG TTG TCT GGA CAA GCA C

MDR1-SPACER

GTG CTT GTC CAC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACA ACA TTT T

anti-MDR1-Ribozym

GTG CTT GTC CAC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA

ACA ACA TTT T -3’

anti-MDR1-Ribozym

↓65

Abbildung 8: Schematische Darstellung des MTMR

Die Abbildung illustriert den Aufbau des MTMR und seine Fähigkeit zur Autokatalyse sowie zur Multitarget-Spaltung (nach Kowalski et al., 2005).

Abbildung 9: Sekundärstruktur des MTMR

Mit Hilfe des Programmes mfold 3.0 wurde eine RNA-Sekundärstruktur des MTMR erstellt. Abgebildet ist diejenige RNA-Struktur, die die geringste freie Energie aufweist. Die Positionen der funktionell verschiedenen MTMR-Domänen werden durch die Pfeile angedeutet.

Bei der Auswertung der Sekundärstrukturen, die die Programme mfold 3.0 sowie Sfold 2.0 berechneten, wurde von den unterschiedlichen Faltungsmöglichkeiten einer Sequenz nur diejenige mit der geringsten freien Energie (∆G) in die Analyse einbezogen.

3.1.2 Autokatalyse des MTMR

↓66

Die ausgewählte MTMR-Sequenz und die Substratsequenzen MDR1sub, BCRPsub und MRP2sub wurden zunächst in vitro transkribiert. Die in vitro-Transkriptionsprodukte wurden auf ein PA-Gel aufgetragen und autoradiographisch sichtbar gemacht (s. Kap. 2.2.19 und Abb. 10).

Abbildung 10: In vitro Transkription der Substrat-RNAs und des MTMR

Repräsentatives Autoradiogramm der in vitro-Transkription des MTMR sowie der Substrate, die gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.9 durchgeführt wurde. 1: Radioaktiv-markierter RNA-Marker; 2: BCRPsub; 3: MRP2sub; 4: MDR1sub; 5: MTMR (nach Kowalski et al., 2005).

Aus Abb. 10 geht deutlich hervor, daß die in vitro-Transkription der MTMR-DNA-Matrize zu mehreren distinkten Transkriptionsprodukten führt. Es wurde daher analysiert, ob diese MTMR-Fragmente a-e aus einer unvollständigen, teilweise abgebrochenen in

↓67

vitro-Transkriptions-Reaktion resultieren oder aufgrund der prognostizierten Autokatalyse des MTMR zustande gekommen sind. Um aufzuklären, welche der alternativen Möglichkeiten eingetreten war, wurde die oberste RNA-Bande, die mit Hilfe des RNA-Markers als Gesamt-MTMR identifiziert werden konnte, aus dem PA-Gel eluiert und für 2 Stunden unter Autokatalysebedingungen inkubiert (s. Kap. 2.2.1.13). Auch hier erfolgte eine Auftrennung der Reaktionsprodukte im PA-Gel mit nachfolgender Autoradiographie (Abb. 11):

Abbildung 11: Autokatalyse des MTMR

Repräsentatives Autoradiogramm der Autokatalyse des MTMR, die gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.13 durchgeführt wurde (verändert nach Kowalski et al., 2005).

Abb. 11 zeigt, daß die MTMR-Banden, die im Eigenschnittversuch entstanden sind, denjenigen, die während der in vitro-Transkription des MTMR entstanden sind, gleichen. Es kann daraus geschlußfolgert werden, daß das MTMR zur Spaltung in cis in der Lage ist (Autokatalyse) und dabei distinkte Spaltfragmente (MTMR-Fragmente a-e) entstehen. Die Autokatalyse geschieht bereits während der in vitro-Transkription des MTMRs. Darüber hinaus wurde beobachtet, daß mit zunehmender in vitro-Transkriptionszeit der Anteil des in vitro-Transkriptes, welches das Gesamt-MTMR darstellt, zugunsten der Autokatalyseprodukte geringer wird und nach einer Reaktionzeit von 3 h nicht mehr zu detektieren ist.

3.1.3 Multitargetspaltung der Substrate MDR1sub, BCRPsub, MRP2sub

↓68

Die Autokatalyseprodukte des MTMRs (Bezeichnung MTMRa-MTMRe) wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeiten zur Katalyse in trans oder Multitargetspaltung untersucht. Aufgrund der drei GUC-Spalttripletts der MDR1-SPACER kann es durch die ribozymatische Spaltung in cis der anti-MDR1-Ribozyme zu unterschiedlich großen Spaltprodukten kommen. Es soll in den folgenden Versuchen jedes einzelne Spaltprodukt (a-e) in seiner Zusammensetzung identifiziert werden. Dazu wurden im Vorfeld die potentiellen Autokatalyseprodukte und deren Größe aufgelistet (s. Tab. 10). Mit Hilfe von gezielten Spaltversuchen wurde anschließend experimentell nachgewiesen, welches MTMR-Fragment den theoretischen Vorhersagen in seiner Zusammensetzung entspricht. Dazu wurde unter äquimolaren Verhältnissen jedes einzelne MTMR-Fragment mit jedem der drei Substrate für 2 h bei 37 °C unter RNA-Prozessierungsbedingungen inkubiert (siehe Kap. 2.2.1.13) und im PAGE aufgetrennt. Durch die Detektion von Substrat-spezifischen Spaltprodukten im Autoradiogramm konnte auf die Anwesenheit einer speziellen Ribozymsequenz in dem untersuchten MTMR-Fragment geschlossen werden. In den Abb. 12-14 werden repräsentative Autoradiogramme dieser Schnittversuche gezeigt.

Abbildung 12: Spezifische Spaltung des Substrates MDR1sub durch die MTMR-Fragmente MTMRa-e

Repräsentatives Autoradiogramm der Spaltanalysen von MTMRa-e mit MDR1sub, die gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.13 durchgeführt wurden. Die Pfeile kennzeichnen das Auftreten MRP2sub-spezifischer Spaltprodukte der Größe 152 bp und 89 bp. 1: RNA-Marker; 3: MDR1sub; 4: MTMRa; 5: MTMRa + MDR1sub; 6: MTMRb; 7: MTMRb+MDR1sub; 8: MTMRc; 9: MTMRc + MDR1sub; 10: MTMRd; 11: MTMRd + MDR1sub; 12: MTMRe; 13: MTMRe + MDR1sub (verändert nach Kowalski et al., 2005).

Abbildung 13: Spezifische Spaltung des Substrates BCRPsub durch die MTMR-Fragmente MTMRa-e

Repräsentatives Autoradiogramm der Spaltanalysen von MTMRa-e mit BCRPsub, die gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.13 durchgeführt wurden. Die Pfeile kennzeichnen das Auftreten BCRPsub-spezifischer Spaltprodukte der Größe 259 bp und 84 bp. 1: RNA-Marker; 3: BCRPsub; 4: MTMRa; 5: MTMRa + BCRPsub; 6: MTMRb; 7: MTMRb + BCRPsub; 8: MTMRc; 9: MTMRc + BCRPsub; 10: MTMRd; 11: MTMRd + BCRPsub; 12: MTMRe; 13: MTMRe + BCRPsub (nach Kowalski et al., 2005).

↓69

Abbildung 14: Spezifische Spaltung des Substrates MRP2sub durch die MTMR-Fragmente MTMRa-e

Repräsentatives Autoradiogramm der Spaltanalysen von MTMRa-e mit MRP2sub, die gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.13 durchgeführt wurden. Die Pfeile kennzeichnen das Auftreten MRP2sub-spezifischer Spaltprodukte der Größe 134 bp und 99 bp. 1: RNA-Marker; 3: MRP2sub; 4: MTMRa; 5: MTMRa + MRP2sub; 6: MTMRb; 7: MTMRb + MRP2sub; 8: MTMRc; 9: MTMRc + MRP2sub; 10: MTMRd; 11: MTMRd + MRP2sub; 12: MTMRe; 13: MTMRe + MRP2sub (nach Kowalski et al., 2005).

Aufgrund der Detektion spezifischer Spaltprodukte der Substrate MDR1sub, BCRPsub und MRP2sub konnten die MTMR-Fragmente in ihrer Zusammensetzung identifiziert werden. Tab. 10 faßt die Ergebnisse der spezifischen Spaltversuche der Substrate MDR1sub, BCRPsub und MRP2sub durch die Autokatalyseprodukte MTMRa-e zusammen:

Tabelle 10: Identifikation der Autokatalyseprodukte MTMRa-e (Kowalski et al., 2005).

MTMR-Fragment

Größe

Spaltung MDR1sub

Spaltung

BCRPsub

Spaltung
MRP2sub

Zusammensetzung

MTMRa

180 bp

-

+

+

anti-MRP2-Rz1); MDR1-SPACER; anti-BCRP-Rz; MDR1-SPACER; anti-MDR1-Rz; halbierter MDR1-SPACER

MTMRb

167 bp

+

-

-

halbierter MDR1-SPACER; anti-MDR1-Rz; MDR1-SPACER; anti-MDR1-Rz; anti-MDR1-Rz

MTMRc

115 bp

-

+

+

anti-MRP2-Rz; MDR1-SPACER; anti-BCRP-Rz; halbierter MDR1-SPACER

MTMRd

102 bp

+

-

-

halbierter MDR1-SPACER; anti-MDR1-Rz; anti-MDR1-Rz

MTMRe

60 bp
55 bp

-

+

+

55 bp-MTMR-Fragment: anti-MRP2-Rz ; halbierter MDR1-SPACER
60 bp-MTMR-Fragment: halbierter MDR1-SPACER; anti-BCRP-Rz; halbierter MDR1-SPACER

1)Rz:

Hammerhead-Ribozymsequenz

3.1.4 Abhängigkeit der MTMR-vermittelten Substratspaltung von der Zeit

↓70

Die kinetischen Eigenschaften des MTMR wurden im Folgenden ermittelt, um die Spalteffektivität des MTMRs im zellfreien System mit anderen katalytisch aktiven RNA-Molekülen vergleichen sowie Rückschlüsse auf eine Anwendbarkeit im zellulären Kontext ziehen zu können. Vorerst wurde die Abhängigkeit der ribozymatischen Katalyse in trans von der Reaktionszeit analysiert. Dazu wurden Substrat-RNA und MTMR-Fragment-RNA im Verhältnis 1:5 unter RNA-Prozessierungsbedingungen inkubiert (siehe Kap. 2.2.1.13). Die Katalyse des BCRP-Substrates BCRPsub und des MRP2-Substrates MRP2sub erfolgte mit dem MTMR-Fragment MTMRe; das MDR1-Substrat MDR1sub wurde durch das MTMR-Fragment MTMRd gespalten. Diese MTMR-Fragmente wurden ausgewählt, da sie die kleinstmöglichen Autokatalyseeinheiten und daher Endprodukte der MTMR-Selbstspaltung darstellen. Die Intensität der Banden der verbleibenden Substrat-RNA sowie der Spaltprodukte wurde durch densitometrische Vermessung quantifiziert. Dadurch war es möglich, die Verhältnisse von entstandenen Spaltprodukten zum verbleibenden Substrat zu ermitteln und in Produkt-Zeit-Diagrammen darzustellen. Aus diesen Diagrammen geht hervor, daß das eingesetzte Substrat nicht vollständig umgesetzt wurde, sondern ein Maximalwert der Substrat-RNA-Spaltung erreicht wird. Während der ersten Minuten der Reaktion ist das Verhältnis von Produktmenge und Zeit dergestalt, daß ein linearer Zusammenhang angenommen werden kann. Danach verringert sich die Menge des Produktes pro Zeiteinheit bis der Maximalwert der Produktbildung erreicht ist. In Abb. 15 (S. 72-73) werden repräsentative Autoradiogramme sowie die dazugehörigen Produkt-Zeit-Diagramme von zeitabhängigen Reaktionskinetiken von MTMR-Fragmenten und der dazugehörigen ABC-Transporter-Substrate gezeigt.

Abbildung 15: MTMR vermittelte Spaltung von der Substrat-RNAs in Abhängigkeit von der Reaktionszeit

Repräsentative Autoradiogramme der Substrat-RNA-Spaltung durch das MTMR und die dazugehörigen Produkt-Zeit-Diagramme, die gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.13 und 2.2.1.14 erstellt wurden. Alle graphisch dargestellen Werte sind Mittelwerte und die Fehlerbalken die Standardabweichung aus drei Einzelexperimenten.

A:

Autoradiogramm einer Reaktionskinetik des MTMRd mit MDR1sub. 1: RNA-Marker; 3: MDR1sub; 4: MTMRd; 5: 0 min; 6: 0,5 min; 7: 1 min; 8: 2 min; 9: 3 min; 10: 5 min; 11: 10 min; 12: 20 min; 13: 30 min; 14: 60 min; 15: 120 min.

B:

Produkt-Zeit-Diagramm der MDR1sub-Spaltung durch MTMRd.

C:

Autoradiogramm einer Reaktionskinetik von MTMRe mit BCRPsub. 1: RNA-Marker; 3: BCRPsub; 4: MTMRe; 5: 0 min; 6: 1 min; 7: 2 min; 8: 3 min; 9: 5 min; 10: 10 min; 11: 20 min; 12: 30 min; 13: 60 min; 14: 120 min.

D:

Produkt-Zeit-Diagramm der BCRPsub-Spaltung durch MTMRe.

E:

Autoradiogramm einer Reaktionskinetik von MTMRe mit MRP2sub. 1: RNA-Marker; 3: MRP2sub; 4: MTMRe; 5: 0 min; 6: 1 min; 7: 2 min; 8: 3 min; 9: 5 min; 10: 10 min; 11: 20 min; 12: 30 min; 13: 60 min; 14: 120 min.

F:

Produkt-Zeit-Diagramm der MRP2sub-Spaltung durch MTMRe.

3.1.4.1  Initialgeschwindigkeit (vini) und beobachtete Spaltrate (kobs) der Reaktion

↓71

Die Initialgeschwindigkeit der MTMR-vermittelten Substratspaltung entspricht dem Anstieg des Graphen im quasi linearen Anfangsbereich der Produkt-Zeit-Diagramme (s. Abb. 15 B, D, F), d.h. in dem Bereich, in dem die Produktbildung kontinuierlich erfolgt. In den zeitabhängigen Reaktionskinetiken ist dieses bei allen drei Substraten in den ersten Minuten der Reaktion der Fall. Für diesen Bereich wurde eine lineare Regression durchgeführt und gemäß den Angaben in Kap. 2.2.1.14.1 konnte die Initialgeschwindigkeit für die MTMR-vermittelte Spaltung aller RNA-Substrate berechnet werden.

Um alternative Vergleichsmöglichkeiten mit Daten aus der Literatur zu haben, wurde darüber hinaus die beobachtete Spaltrate, kobs, sowohl nach Heidenreich et al., 1994 als auch nach Hendry et al., 1995 ermittelt. Hierzu wurde der negative natürliche Logarithmus des verbleibenden Substrates vom Gesamtsubstrat (Su; Heidenreich et al., 1994) bzw. vom maximal spaltbaren Substrat (Smax; Hendry et al., 1995) gegen die Reaktionszeit aufgetragen und gemäß den Angaben in Kap. 2.2.1.14.1 konnte kobs berechnet werden. Die experimentelle Ermittlung von kobs ist in Abb. 16 dargestellt. Die Werte für vini und kobs sind in Tab. 11 aufgelistet, die Zuordnung zur Methode von Heidenreich et al., 1994 bzw. Hendry et al., 1995 ist in den Fußnoten der Tabelle ersichtlich.

Abbildung 16: Der Reaktionsparameter kobs für die Katalyse der Substrat-RNAs

Aufgrund der densitometrischen Auswertungen der Autoradiogramme der zeitabhängigen Reaktionskinetiken der Substrat-RNAs (s. Abb. 16) wurde gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.14.1 kobs ermittelt.

↓72

A:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kobs für die MTMR-vermittelte Spaltung von MDR1sub nach Heidenreich et al., 1994.

B:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kobs für die MTMR-vermittelte Spaltung von MDR1sub nach Hendry et al., 1995.

C:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kobs für die MTMR-vermittelte Spaltung von BCRPsub nach Heidenreich et al., 1994.

D:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kobs für die MTMR-vermittelte Spaltung von BCRPsub nach Hendry et al., 1995.

E:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kobs für die MTMR-vermittelte Spaltung von MRP2sub nach Heidenreich et al., 1994.

F:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kobs für die MTMR-vermittelte Spaltung von MRP2sub nach Hendry et al., 1995.

3.1.5 Abhängigkeit der MTMR-vermittelten Substratspaltung von der MTMR-Konzentration

In einer weiteren kinetischen Charakterisierung wurde die Abhängigkeit der MTMR-vermittelten Katalyse in trans von der MTMR-Konzentration analysiert (konzentrationsabhängige Kinetik). Dazu wurden die Substrat-RNAs mit verschiedenen Konzentrationen von MTMR-Fragment-RNAs gemäß den Angaben in Kap. 2.2.1.13 inkubiert. Aufgrund der unterschiedlichen Verhältnisse von MTMR-Fragment zu Substrat konnte die Produktbildung bei multiple turnover- (MTMR-Fragment-Unterschuß) und single turnover-Bedingungen (MTMR-Fragment-Überschuß) sowie bei äquimolaren Verhältnissen von MTMR-Fragment und Substrat ermittelt werden. In
Abb. 17 (S. 76-77) sind repräsentative Autoradiogramme der konzentrationsabhängigen Kinetiken für alle Substrat-RNAs sowie die dazugehörigen Produkt-Konzentrations-Diagramme dargestellt.

Abbildung 17: Konzentrationsabhängige Reaktionskinetiken der Katalyse der Substrat-RNAs

Repräsentative Autoradiogramme der Substrat-Spaltung durch das MTMR und die dazugehörigen Produkt-Konzentrations-Diagramme, die gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.13 und 2.2.1.14.2 erstellt wurden. Alle Werte sind Mittelwerte und die Fehlerbalken die Standardabweichung aus drei Einzelexperimenten.

↓73

A:

Autoradiogramm einer Reaktionskinetik des MTMRd mit MDR1sub. 1: RNA-Marker; 2: 40 nM MDR1sub-RNA; 3: 120 nM MTMRd-RNA; 4: 40 nM MTMRd + 40 nM MDR1sub, sofort gestoppt; 5: 20 nM MTMRd + 40 nM MDR1sub; 6: 40 nM MTMRd + 40 nM MDR1sub; 7: 80 nM MTMRd + 40 nM MDR1sub; 8: 120 nM MTMRd + 40 nM MDR1sub; 9: 200 nM MTMRd + 40 nM MDR1sub; 10: 300 nM MTMRd + 40 nM MDR1sub.

B:

Produkt-Konzentrations-Diagramm der Katalyse des MDR1sub durch MTMRd.

C:

Autoradiogramm einer Reaktionskinetik des MTMRe mit BCRPsub. 1: RNA-Marker; 2: 40 nM BCRPsub-RNA; 3: 120 nM MTMRe-RNA; 4: 20 nM MTMRe + 40nM BCRPsub; 5: 40 nM MTMRe + 40 nM BCRPsub; 6: 80 nM MTMRe + 40 nM BCRPsub; 7: 120 nM MTMRe + 40 nM BCRPsub; 8: 200 nM MTMRe + 40 nM BCRPsub; 9: 300 nM MTMRe + 40 nM BCRPsub; 10: 400 nM MTMRe + 40 nM BCRPsub.

D:

Produkt-Konzentrations-Diagramm der Katalyse des BCRPsub durch MTMRe.

E:

Autoradiogramm einer Reaktionskinetik des MTMRe mit MRP2sub. 1: RNA-Marker; 2: 40 nM MRP2sub-RNA; 3: 120 nM MTMRe-RNA; 4: 40 nM MTMRe + 40 nM MRP2sub, sofort gestoppt; 5: 20 nM MTMRe + 40 nM MRP2sub; 6: 40 nM MTMRe + 40 nM MRP2sub; 7: 80 nM MTMRe + 40 nM MRP2sub; 8: 120 nM MTMRe + 40 nM MRP2sub; 9: 200 nM MTMRe + 40 nM MRP2sub; 10: 300 nM MTMRe + 40 nM MRP2sub; 11: 400 nM MTMRe + 40 nM MRP2sub.

F:

Produkt-Konzentrations-Diagramm der Katalyse des MRP2ub durch MTMRe.

Aus den Produkt-Konzentrations-Diagrammen (Abb. 17 B, D, F) geht hervor, daß bei geringen Konzentrationen des MTMR-Fragments (bis etwa 120 nM) die Produktmenge quasi linear zunimmt. Weitere Erhöhungen der MTMR-Fragment-Konzentrationen haben nicht mehr diesen Einfluß auf die Produktbildung, d.h. die Spaltreaktion nähert sich, analog der zeitabhängigen Reaktionskinetiken, einem Maximalwert der Produktbildung. Das bedeutet, daß unabhängig von der MTMR-Konzentration unter den gewählten Bedingungen vom MDR1-Substrat MDR1sub höchstens 55 % und vom BCRP-Substrat BCRPsub sowie vom MRP2-Substrat MRP2sub maximal 75 % umgesetzt werden können.

Anhand der Daten aus den Produkt-Konzentrations-Diagrammen konnte darüber hinaus untersucht werden, wie sich verschiedene molare Verhältnisse von MTMR-Fragment und Substrat die Bildung von Produktmolekülen pro MTMR-Fragment-Molekül, kurz molarer Stoffumsatz ∆S, auswirken. Gemäß den Angaben in Kap. 2.2.1.14.2 wurde ∆S ermittelt und in Abb. 18 dargestellt.

↓74

Abbildung 18: Molarer Stoffumsatz der MTMR-vermittelten Substratspaltung

Der molare Stoffumsatz für die Spaltung der RNA-Substrate unter multiple und single turnover Bedingungen wurde, wie in Kap. 2.2.1.14.2 ausgeführt ist, berechnet. Die angegebenen Werte stellen Mittelwerte und die Fehlerbalken die Standardabweichung aus drei Einzelexperimenten dar.

Je geringer der Quotient aus nMTMR/nSubstrat ist, um so größer wird der molare Stoffumsatz ∆S. Das heißt, daß multiple turnover Bedingungen (MTMR-Fragment-Unterschuß) zu einer relativen Steigerung der Spalteffizienz des MTMRs führen.

Legt man die molaren Verhältnisse von Substrat und MTMR-Fragment der zeitabhängigen Reaktionskinetiken zugrunde (Verhältnis jeweils 1:5), entspricht der molare Stoffumsatz einem Wert von 0,84 für die Spaltung von MDR1sub, 0,123 für die Katalyse von BCRPsub und 0,119 für die Umsetzung des MRP2sub. Das bedeutet, daß je Mol eingesetzten MTMR-Fragments 0,084 Mol MDR1sub, 0,123 Mol BCRPsub und 0,119 Mol MRP2sub umgesetzt wurden. Umgekehrt waren also für die Spaltung von
1 Mol MDR1sub 12 Mol MTMRd, für BCRPsub und MRP2sub jeweils 9 Mol MTMRe erforderlich. Für den maximal erreichten Umsatz von 77 % (19,25 nM) bei MDR1sub und von 75 % (18,75 nM) bei BCRPsub bzw. bei MRP2sub waren bei MDR1sub 231 nM MTMRd, bei BCRPsub 173,25 nM und bei MRP2sub 168,75 nM MTMR-Fragment-RNA erforderlich.

3.1.6 Der Reaktionsparameter kcat/kM

↓75

Auf Grundlage der densitometrischen Auswertung der konzentrationsabhängigen Reaktionskinetiken wurde der Reaktionsparameter kcat/kM entsprechend der von Heidenreich and Eckstein (1992) und Hendry et al., 1995 aufgestellten Zusammenhänge experimentell ermittelt (s. Kap. 2.2.1.14.2) und in Abb. 19 (S.79-80) graphisch dargestellt. Die Werte für kcat/kM finden sich in Tab. 11.

Abbildung 19: Der Reaktionsparameter kcat/kM für die Katalyse der Substrat-RNAs

Auf Grundlage der densitometrsichen Auswertungen der Autoradiogramme der konzentrationsabhängigen Reaktionskinetik der Substrat-RNAs (s. Abb. 17) wurde gemäß der Angaben in Kap. 2.2.1.14.2 kcat/kM ermittelt.

A:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kcat/kM für die MTMR-vermittelte Spaltung von MDR1sub nach Heidenreich und Eckstein, 1992.

B:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kcat/kM für die MTMR-vermittelte Spaltung von MDR1sub nach Hendry et al., 1995.

C:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kcat/kM für die MTMR-vermittelte Spaltung von BCRPsub nach Heidenreich und Eckstein, 1992.

D:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kcat/kM für die MTMR-vermittelte Spaltung von BCRPsub nach Hendry et al., 1995.

E:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kcat/kM für die MTMR-vermittelte Spaltung von MRP2sub nach Heidenreich und Eckstein, 1992.

F:

Experimentelle Ermittlung des Reaktionsparameters kcat/kM für die MTMR-vermittelte Spaltung von MRP2sub nach Hendry et al., 1995.

↓76

Die nachfolgende Tab. 11 faßt die ermittelten kinetischen Reaktionsparameter des MTMRs zusammen. Darüber hinaus sind die publizierten kinetischen Daten der im MTMR integrierten Monoribozyme (anti-MDR1-, anti-BCRP-, anti-MRP2-Ribozym) sowie Reaktionskonstanten von ausgewählten Ribozymen, die auf der Grundlage dergleichen Methodik ermittelt wurden, aufgeführt.

Tabelle 11: Kinetische Parameter von MTMR-Fragmenten und Monoribozymen (nach Kowalski et al., 2005)

Ribozym

Substrat-länge (bp)

vini
(fmol s-1)

kcat/kM
(M-1 s-1)

kobs (s-1)

Referenz

MTMR-BCRP

343

0,11

9744a
9143b

4,1 x 10-2 a

3,2 x 10-2 c

Kowalski et al., 2005

BCRP

343

2,21

55000a
24180

2,68 x 10-2 a

1,17 x 10-2 c

Kowalski et al., 2001

MTMR-MRP2

233

0,11

5149a
3299b

5,3 x 10-2 a

2,9 x 10-2 c

Kowalski et al., 2005

MRP2

233

0,127

9307a
7719b

8,73 x 10-4a

7,66 x 10-4c

Materna et al., 2001

MTMR-MDR1

241

0,13

5135a
2046b

7,7 x 10-2 a

4,6 x 10-2 c

Kowalski et al., 2005

MDR1

259

n.a.

47500b,d

n.a.

Holm et al., 1995

Rz967

234

0,15

10625a
4673b

n.a.

Wichert et al., 1999

 

985

n.a.

22-500b

n.a.

Heidenreich et al., 1992

n.a.:

nicht analysiert

a

Reaktionsparameter kcat/kM und kobs nach Hendry et al., 1995

b

Reaktionsparameter kcat/kM nach Heidenreich and Eckstein, 1992

c

Reaktionsparameter kobs nach Heidenreich et al., 1994

d

durchgeführt bei 42 °C

Ein Vergleich der in Tab. 11 aufgeführten Werte zeigt, daß die katalytische Aktivität des MTMR-Fragmentes, welches die anti-MRP2-Ribozymsequenz enthält (MTMR-MRP2), in dergleichen Größenordnung liegt, wie die des anti-MRP2-Monoribozymes. Für das MTMR-Fragment, welches die anti-BCRP-Ribozymsequenz (MTMR-BCRP) enthält, sind die Werte für vini und kcat/kM im Vergleich zum anti-BCRP-Monoribozym etwa um das Zehnfache geringer; wohingegen die Werte des MTMR-BCRP für die beobachteten Spaltrate kobs im Vergleich zum Monoribozym etwas größer sind. Der direkte Vergleich der kinetischen Parameter zwischen MTMR-MDR1 und anti-MDR1-Monoribozym ist unzulässig, da die Monoribozymdaten bei 42 °C ermittelt wurden.

3.2  Anwendung des MTMR in verschiedenen Zellsystemen

3.2.1  Klonierung des MTMR

↓77

Die von der Firma Biospring (Frankfurt/M., D) synthetisierte MTMR-Sequenz wurde entsprechend den Angaben in Kapitel 2.2.1.16 “blunt-end” in die SmaI-Schnittstelle des eukaryotischen Expressionsvektors pIRES2/EGFP kloniert. Die korrekte Insertion der MTMR-Sequenz im Expressionsvektor wurde durch Sequenzierung überprüft. Als Kontrollvektor für die darauf folgenden Transfektionsanalysen wurde der nicht modifizierte pIRES2/EGFP-Vektor verwendet (kurz pIRES2/Kontrolle). In Abb. 20 ist die Vektorkarte von pIRES2/EGFP mit der klonierten MTMR-Sequenz dargestellt.

Abbildung 20: Vektorkarte von pIRES2/MTMR (Vekorkarte online unter: www.bd.com)

3.2.2 Expression des MTMR in stabilen Transfektanten

Der MTMR-exprimierende eukaryotische Expressionsvektor pIRES2/MTMR und der Kontrollvektor pIRES2/Kontrolle wurden, wie im Kapitel 2.2.3.3 beschrieben, jeweils in die Zellinien EPG85-257RDB, EPG85-257RNOV und A2780RCIS stabil transfiziert. Es wurden jeweils 48 MTMR-exprimierenden Transfektanten und
12 Kontrolltransfektanten pro Zellinie etabliert. Im Folgenden wurde die RNA aller stabilen Klone extrahiert und in cDNA umgeschrieben (siehe Kap. 2.2.1.18, 2.2.1.19). Zur Kontrolle der reversen Transkription wurde eine RT-PCR mit ALD-Primern durchgeführt, welche spezifisch mit einem Sequenzabschnitt des konstitutiv exprimierten “housekeeping" Gens ALD hybridisieren und ein PCR-Produkt von 249 bp amplifizieren. Die Kontrolle de r MTMR- bzw. pIRES2/Kontrolle-Expression in den transfizierten Zellinien wurde mit Hilfe einer RT-PCR unter Verwendung vektorspezifischer pIRES2-Primer durchgeführt. Hierbei konnte ein PCR-Produkt von 468 bp in den mit pIRES2/MTMR und ein PCR-Produkt von 161 bp in den mit pIRES2/Kontrolle transfizierten Zellinien detektiert werden. Aus den untransfizierten resistenten Ausgangszellinien und ihren chemosensiblen Partnerzellinien wurde wie erwartet kein PCR-Produkt amplifiziert. In Abb. 21 sind die Ergebnisse der RT-PCRs mit Hilfe der Aldolase-Primer sowie der pIRES2-Primer abgebildet. Dabei wurden von transfizierten Zellen jeweils eine Kontroll- und eine MTMR-exprimierende Transfektante pro untersuchter Ausgangszellinie (257RDB, 257RNOV, A2780RCIS ) dargestellt, die auch in den anschließenden Analysen untersucht wurden.

↓78

Abbildung 21: Aldolase- und Vektor-spezifische RT-PCRs

Die RT-PCRs wurden gemäß den Angaben in Kapitel 2.2.1.5 durchgeführt. Der obere Teil der Abb. zeigt die Vektor-spezifischen RT-PCRs (468 bp PCR-Produkt bei MTMR-Transfektanten, 161 bp bei Kontroll-Transfektanten, kein PCR-Produkt bei Ausgangszellinien). Der untere Teil der Abb. zeigt die ALD-spezifischen RT-PCRs (249 bp PCR-Produkt in allen Zellinien). 1: jeweils DNA-Längenmarker; 2: 257P; 3: 257RNOV; 4: 257RNOV/Kontrolle; 5: 257RNOV/MTMR; 6: 257P; 7: 257RDB; 8: 257RDB/Kontrolle; 9: 257RDB/MTMR; 10: A2780P; 11: A2780RCIS; 12: A2780RCIS/Kontrolle, 13: A2780RCIS/MTMR (nach Kowalski et al., 2005).

3.2.3 Zelluläre Effekte der MTMR-Expression

In weiteren Analysen wurde untersucht, wie sich die MTMR-Expression einerseits auf die spezifische Expression der ABC-Transporter MDR1, BCRP und MRP2 und andererseits auf den Multidrug-Resistenz-Phänotyp der transfizierten Zellen auswirkt.

3.2.3.1  Expression der ABC-Transporter

In den drei multidrug-resistenten Zellinien 257RDB, 257RNOV und A2780RCIS konnte das MTMR mit Hilfe des eukaryotischen Vektors pIRES2/MTMR exprimiert werden (siehe Kap. 3.2.2). Anschließend wurde experimentell geprüft, ob dadurch die ABC-Transporter-spezifischen Genexpressionen für MDR1 (257RDB/MTMR-Transfektanten), BCRP (257RNOV/MTMR-Transfektanten) und MRP2 (A2780RCIS/MTMR-Transfektanten) vermindert wurden.

3.2.3.1.1  Quantitative Analyse der ABC-Transporter mRNA-Expression

↓79

Die Effizienz der MTMR-vermittelten Inhibition der ABC-Transporter mRNAs wurde mit Hilfe der quantitativen real-time RT-PCR ermittelt (s. Kap. 2.2.1.20). Hinsichtlich der MDR1-Expression wurden 39 257RDB/MTMR- und sechs 257RDB/Kontroll-Transfektanten untersucht. In Bezug auf die BCRP-Expression wurden 30 257RNOV/MTMR- und sieben 257RNOV/Kontroll-Transfektanten analysiert. Für die Bestimmung der MRP2-Expression wurden 35 A2780RCIS/MTMR- und 12 A2780RCIS/Kontroll-Zellinien quantifiziert. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, daß die Kontrolltransfektanten eine ähnlich hohe ABC-Transporterexpression aufwiesen, wie die Ausgangszellinien. In den transfizierten Magenkarzinomzellinien 257RDB und 257RNOV konnte bei über 50 % der MTMR-exprimierenden Transfektanten eine starke Inhibition der ABC-Transporter-mRNA detektiert werden. In den Ovarialkarzinomzellinien A2780RCIS/MTMR wurde bei 37 % der Klone eine sehr deutliche Herunterregulation der MRP2-mRNA auf unter 50 % des Ausgangsniveaus gemessen. Die Ergebnisse der quantitativen real-time PCR sind im Einzelnen in Tab. 12 zusammengefaßt und in Abb. 22 graphisch dargestellt.

Tabelle 12: ABC-Transporterexpression in MTMR-exprimierenden Zellinien

Transfektanten

starke Inhibition*

moderate Inhibition**

geringe/keine Effekte***

257RDB/MTMR

 

14 Klone (36 %)

5 Klone (13 %)

257RNOV/MTMR

 

11 Klone (37 %)

3 Klone (10 %)

A2780RCIS/MTMR

13 Klone (37 %)

8 Klone (23 %)

14 Klone (40 %)

*

Herunterregulation zwischen 50-100 %

**

Herunterregulation zwischen 10-49 %

***

Herunterregulation zwischen 0-9 %

Abbildung 22: Quantifizierung der ABC-Transporter mRNAs

↓80

A:

Relative mRNA-Expression des ABC-Transporters MDR1. 1: 257P; 2: 257RDB; 3: 257RDB/MTMR; 4: 257RDB/Kontrolle

B:

Relative mRNA-Expression des ABC-Transporters BCRP. 1: 257P; 2: 257RNOV; 3: 257RNOV/MTMR; 4: 257RNOV/Kontrolle

C:

Relative mRNA-Expression des ABC-Transporters MRP2. 1: A2780P; 2: A2780RCIS; 3: A2780RCIS/MTMR; 4: A2780RCIS/Kontrolle (nach Kowalski et al., 2005).

Die klassische multidrug-resistente Magenkarzinomzellinie 257RDB weist verglichen mit der sensitiven, parentalen Zellinie 257P eine 6126-fache Überexpression der MDR1-kodierenden mRNA auf. Durch die Expression des MTMR konnte diese Überexpression auf 3 % des Ausgangswertes gesenkt werden, d.h. daß 97 % der Genexpression inhibiert werden konnten (Abb. 22 A).

Die atypisch multidrug-resistente Zellinie 257RNOV weist eine 18,8-fache Überexpression der spezifischen BCRP-mRNA verglichen mit der sensitiven, parentalen Zellinie 257P auf. Durch die Expression des MTMR konnte in den MTMR-exprimierenden Transfektanten die BCRP-Expression um bis zu 80 % inhibiert werden (Abb. 22 B).

↓81

Der Vergleich der atypisch multidrug-resistenten Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS und der parentalen, nicht-resistenten Variante A2780P ergibt, daß die MRP2-kodierende mRNA in den multidrug-resistenten Zellen 126-fach überexprimiert ist. In dieser Zellinie bewirkte die Expression des MTMRs eine Verringerung des MRP2-mRNA-Level auf bis zu 4 % des Ausgangswertes, also eine Inhibition von 96 % (Abb. 22 C).

3.2.3.1.2 Effekt des MTMR auf die ABC-Transporter Proteinexpression

Mit Hilfe zweier unabhängiger Methoden konnte der zelluläre Proteingehalt der ABC-Transporter in den MTMR-exprimierenden Zellen bestimmt werden. Zum einen wurde mit Western Blot-Analysen die Expression des MDR1/P-Gp-Proteines in den Zellinien 257P, 257RDB und abgeleiteten Klonen sowie der des Proteins BCRP in den Zellinien 257P, 257RNOV und abgeleiteten Klonen ermittelt (siehe Kap. 2.2.1.23). Zum anderen wurden von allen untersuchten Zellinien immunzytochemische Analysen durchgeführt (s. Kap. 2.2.3.6).

In Übereinstimmung mit den Daten aus der quantitativen real-time RT-PCR geht aus den Western Blot-Analysen hervor, daß durch die Expression des MTMRs der Proteingehalt von MDR1/P-gp in den klassischen, multidrug-resistenten Zellen und der des BCRP in den atypisch, multidrug-resistenten Zellen derart reduziert war, daß er das Niveau der korrespondierenden sensitiven Zellinie 257P erreichte (s. Abb. 23).

↓82

Abbildung 23: Bestimmung des ABC-Transporter-Proteingehaltes durch Western Blots

A:

Bestimmung des Proteingehaltes von MDR1/P-Gp (170 kDa, obere Banden) mit Hilfe des mAb C219 und zur Ladungskontrolle von GAPDH (37 kDa, untere Banden,) mit dem mAb anti-GAPDH. 1: 257P; 2: 257RDB; 3: 257RDB/MTMR; 4: 257RDB/Kontrolle.

B:

Bestimmung des Proteingehaltes von BCRP (72 kDa, obere Banden) mit Hilfe des mAb BXP-21 und zur Ladungskontrolle von X-Aktin (42 kDa; untere Banden) mit dem mAb anti-X-Aktin. 1: 257P; 2: 257RNOV; 3: 257RNOV/MTMR; 4: 257RNOV/Kontrolle (nach Kowalski et al., 2005).

Die Proteinlevel MDR1/P-Gp, BCRP und MRP2 wurden darüber hinaus mit Hilfe von monoklonalen AK in den Ausgangszellinien sowie deren Transfektanten immunzytochemisch bestimmt (s. Abb. 24). Diese Methode bestätigte die Western Blot-Ergebnisse für MDR1/P-Gp sowie BCRP und diente zur Detektion des MRP2-Proteingehaltes in den Ovarialkarzinomzellinien, der trotz umfangreicher experimenteller Variationen mittels Western Blot nicht zu bestimmen war.

↓83

Abbildung 24: Immunzytochemische Detektion der ABC-Transporter

Die Expression der Proteine MDR1/P-Gp, BCRP und MRP2 wurde von Dr. Pawel Surowiak immunzytochemisch mit Hilfe von mAb detektiert (s. Kap. 2.2.3.6) (nach Kowalski et al., 2005).

A:

Immunzytochemische Bestimmung von MDR1/P-Gp mit Hilfe des anti-MDR1-mAb C219 (Alexis, USA). 1: 257RDB; 2: 257P; 3: 257RDB/MTMR; 5: 257RDB/Kontrolle.

B:

Immunzytometrische Detektion von BCRP mit Hilfe des anti-BCRP-mAb BXP-21 (Alexis, USA). 1: 257RNOV; 2: 257P; 3: 257RNOV/MTMR; 4: 257RNOV/Kontrolle.

C:

Immunzytometrische Detektion von MRP2 mit Hilfe des anti-MRP2-mAb MRP2clone4-2 (Monosan, USA). 1: A2780RCIS; 2: A2780P; 3: A2780RCIS/MTMR; 4: A2780RCIS/Kontrolle.

Durch die immunzytometrische Detektion der ABC-Transporter konnte gezeigt werden, daß in den multidrug-resistenten Zellinien 257RDB, 257RNOV und A2780RCIS der jeweilige ABC-Transporter (MDR1, BCRP, MRP2) im Vergleich zu den korrespondierenden parentalen, sensitiven Zellinien 257P bzw. A2780P überexprimiert ist. Gleiches trifft für die von den resistenten Zellinien abgeleiteten Kontrolltransfektanten zu, die den unmodifizierten Vektor pIRES2/EGFP exprimieren. Im Gegensatz dazu zeigten alle MTMR-exprimierenden Transfektanten (257RDB/MTMR; 257RNOV/MTMR, A2780RCIS/MTMR) entweder gar keine oder nur sehr schwache ABC-Transporter Expression, die mit denen der jeweiligen parentalen, sensitiven Zellinien 257P bzw. A2780P vergleichbar war. Damit konnten die Ergebnisse der quantitativen real-time RT-PCR und der Western Blot-Analysen (im Fall von MDR1/P-Gp und BCRP) mit einer weiteren unabhängigen Methode bestätigt werden. Die MTMR-Expression bewirkte demzufolge in allen multidrug-resistenten Zellinien einen annähernd komplette Ausschaltung der ABC-Transporter Expressionen.

3.2.4 Zytotoxizität der Ausgangszellinien und Transfektanten gegenüber verschiedenen Zytostatika

↓84

Im Folgenden wurde untersucht, inwiefern sich die Inhibition der ABC-Transporter durch die Expression des anti-ABC-Transporter-MTMRs auf die Multidrug-Resistenz der transfizierten Zellinien auswirkt. Dazu wurden in Zytotoxizitätsexperimenten die IC50-Werte der einzelnen Zellinien gegenüber demjenigen Zytostatikum bestimmt, welches ein Substrat des jeweiligen ABC-Transporters darstellt. In den Zellinien 257P sowie 257RDB und abgeleiteten Transfektanten wurde die Zytotoxizität gegenüber Daunorubicin (DNR) getestet, in den Zellinien 257P sowie 257RNOV und abgeleiteten Transfektanten wurden die IC50-Werte der Zellen gegenüber Mitoxantron (MX) und in den Ovarialkarzinomzellinien A2780P sowie A2780RCIS und abgeleiteten Transfektanten wurde die Zytotoxizität gegenüber Cisplatin (CisPt) bestimmt (s. Kap. 2.2.3.4).

In der MTMR-exprimierenden Transfektante 257RDB/MTMR wurde im Vergleich zur klassisch multidrug-resistenten Ausgangszellinie 257RDB eine komplette Aufhebung der Daunorubicinresistenz erreicht (100 % Reversion der DNR-Resistenz, p < 0,01). In den 257RNOV/MTMR-Zellen konnte eine drastischen Reduktion der Mitoxantronresistenz im Vergleich zur atypisch multidrug-resistenten Ausgangszellinie 257RNOV detektiert werden. Die IC50-Werte ergeben eine MX-Reversion um 94 % (p < 0,001). Die Cisplatinresistenz der MTMR-exprimierenden Transfektante A2780RCIS/MTMR war im Vergleich zu ihrer multidrug-resistenten Ausgangslinie A2780RCIS um 63 % (p < 0,01) verringert.

Abbildung 25: Zytotoxitität der untersuchten Zellinien

Die Resistenzen aller Zellinien gegenüber verschiedener Zytostatika wurden im Proliferations-Assay (s. Kap. 2.2.3.4) bestimmt. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte mit Standardabweichung aus mindestens drei unabhängigen Versuchen.

↓85

A:

Resistenzbestimmung der parentalen, sensitiven 257P Zellinie, der klassisch multidrug-resistenten Zellinie 257RDB und ihrer abgeleiteten Transfektanten gegenüber Daunorubicin.

B:

Resistenzbestimmung der parentalen, sensitiven 257P Zellinie, der atypisch multidrug-resistenten Zellinie 257RNOV und abgeleiteter Transfektanten gegenüber Mitoxantron.

C:

Resistenzbestimmung der parentalen, sensitiven A2780P Zellinie, der atypisch multidrug-resistenten Zellinie A2780RCIS und abgeleiteter Transfektanten gegenüber Cisplatin.

Tab. 13 gibt Auskunft über die ermittelten IC50-Werte mit den dazugehörigen p-Werten und den Resistenzfaktoren für alle untersuchten Zellinien.

Tabelle 13: IC50-Werte und Resistenzfaktoren der untersuchten Zellinien

Zellinie

Zytostatikums-

resistenz

IC50 (µg/ml)1

Resistenz-
faktor (x-fach)2

p-Wert3

257P

DNR

0,03±0,02

1

 

257RDB

DNR

3,5±1,17

97

0,0254

257RDB/MTMR

DNR

0,015±0,001

0,5

0,0725

257RDB/

Kontrolle

DNR

2,5±0,5

83

0,925

257P

MX

0,018±0,003

1

 

257RNOV

MX

1,25±0,007

69

< 0,00014

257RNOV/

MTMR

MX

0,081±0,002

4,5

< 0,00016

257RNOV/

Kontrolle

MX

0,94±0,002

52

0,346

A2780P

CisPt

1,98±0,76

1

 

A2780RCIS

CisPt

15,98±4,9

8

0,00037

A2780RCIS/

MTMR

CisPt

9,68±2,4

4,8

0,0318

A2780RCIS/

Kontrolle

CisPt

10,5±0,9

5

0,218

1

DieIC50-Werte stellen Mittelwerte mit Standardabweichungen aus mindestens drei unabhängigen Dreifachmessungen dar.

2

Die Resistenzfaktoren beziehen sich jeweils auf die parentale Zellinie.

3

Die p-Werte wurden von mindestens drei unabhängig bestimmten IC50-Werten mit Hilfe des ungepaarten, zweiseitigen t-Testes der Prism3.1a-Software ermittelt.

4

Bezüglich 257P

5

Bezüglich 257RDB

6

Bezüglich 257RNOV

7

Bezüglich A2780P

8

Bezüglich A2780RCIS

3.2.5 Akkumulation verschiedenener Zytostatika in Ausgangszellinien und Transfektanten

↓86

In der parentalen sensitiven Zellinie 257P, der klassischen multidrug-resistenten Zellinie 257RDB sowie in den von ihr abgeleiteten Tranfektanten wurde die Akkumulation von Daunorubicin und in der Zellinie 257P, der atypisch multidrug-resistenten Zellinie 257RNOV sowie in den von ihr abgeleiteten Transfektanten die Akkumulation von Mitoxantron mit Hilfe der Durchflußzytometrie (siehe Kap. 2.2.3.5) bestimmt.

Abbildung 26: Akkumulation von Daunorubicin und Mitoxantron

Wie in Kapitel 2.2.3.5 beschrieben wurde die Akkumulation von DNR in den Magenkarzinomzellinien 257P, 257RDB sowie in deren Transfektanten und die Akkumulation von MX in 257P, 257RNOV sowie in deren Transfektanten mittels Durchflußzytometrie gemessen. Die Werte stellen Mittelwerte mit Standardabweichung aus jeweils drei unabhängigen Experimenten dar (nach Kowalski et al., 2005).

A:

Relative Akkumulation von Daunorubicin der Zellinie 257P, der klassisch multidrug-resistenten Zellinie 257RDB und ihrer abgeleiteten Transfektanten.

B:

Relative Akkumulation der Zellinie 257P, der atypisch multidrug-resistenten Zellinie 257RNOV und ihrer abgeleiteter Transfektanten.

↓87

In der klassisch multidrug-resistenten Zellinie beträgt die relative Akkumulationsrate von Daunorubicin 0,1 % der parentalen Zellinie 257P. Durch die Expression des MTMRs in den 257RDB/MTMR-Zellen konnte die Akkumulationsrate gegenüber Daunorubicin drastisch gesteigert werden, auf 67 % des Wertes der parentalen 257P Zellinie.

Die Akkumulation von Mitoxantron in der atypisch multidrug-resistenten Zellinie 257RNOV entspricht etwa 5 % des Wertes der parentalen 257P Zellinie. Hier konnte die MTMR-Expression die Akkumulation in den 257RNOV/MTMR-Transfektanten um
100 % auf das Niveau der parentalen 257P Zellinie anheben.

Sowohl bezüglich der Daunorubicin- als auch der Mitoxantronakkumulation wurden in den Kontroll-Transfektanten 257RDB/Kontrolle und 257RNOV/Kontrolle, die den unmodifizierten Vektor pIRES2/EGFP exprimieren, im Vergleich zu den MTMR-Transfektanten geringere, aber dennoch signifikante Effekte in der Zytostatikaakkumulation gemessen.

↓88

Aufgrund der fehlenden Fluoreszenzeigenschaften von Cisplatin konnten in den Zellinien A2780P und A2780RCIS sowie in deren abgeleiteten Transfektanten keine Akkumulationsmessungen mit Hilfe der Durchflußzytometrie durchgeführt werden.


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23.08.2006