4 Diskussion

4.1  Idee und Hintergrund der Multitarget-Spaltung

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Die Chemotherapie mit zytotoxischen Substanzen ist eine wichtige Therapieform bei der Behandlung von Krebserkrankungen. Allerdings entwickeln Tumorzellen häufig gegen die eingesetzten Therapeutika Multidrug-Resistenzen (MDR), die die Hauptursache für das Scheitern einer Chemotherapie sind. Aufgrund dieser Problematik ist es von grundlegender Bedeutung, MDR-verursachende Gene in Tumorzellen zu identifizieren und möglicherweise therapiebegleitend auszuschalten. Der Einsatz von pharmakologisch aktiven Sustanzen, die den zellulären resistenzverursachenden Alterationen entgegenwirken, sogenannten MDR-Modulatoren, hat in der Vergangenheit sowohl in Zellkulturen als auch in der therapeutischen Praxis immer wieder das Phänomen der tertiären Resistenz mit sich gebracht. Das bedeutet, daß die Tumorzellen neben ihrer intrinsischen/primären und erworbenen/sekundären MDR auch gegen die MDR-Modulatoren Resistenzmechanismen ausbilden können und damit die Wirksamkeit dieser Substanzen aufgehoben ist. Dieses Phänomen ist bislang für RNA-basierte Agenzien noch nicht beschrieben worden. Daher gilt die Entwicklung von RNA-Strategien als vielversprechende Alternative, um MDR-assoziierte Gene in ihrer Expression auszuschalten und damit zur Überwindung von Chemoresistenzen beizutragen. Die Transkripte von MDR-assoziierten ABC-Transportern stehen dabei besonders im Fokus der Forschung. Mit Hilfe des gesamten Methodenspektrums an RNA-Strategien (s. Kap. 1.3) konnte beispielsweise die MDR1-mRNA inhibiert werden: angefangen von der Applikation von Antisense-Oligonukleotiden (Liu et al., 1996; Stuart et al., 2000, Rittierodt et al., 2004), über die Anwendung von Hammerhead-Ribozymen (Holm et al., 1994; Kobayashi et al., 1994), small interfering RNAs (Nieth et al., 2003; Wu et al., 2003, Xu et al., 2005) bis hin zu short hairpin RNAs (Stege et al., 2004; Yagüe et al., 2004, Xu et al., 2004). Darüber hinaus sind siRNAs (Ee et al., 2004) und Hammerhead-Ribozyme gegen die mRNA des ABC-Transporters BCRP (Kowalski et al., 2001; Kowalski et al., 2002; Kowalski et al., 2004) sowie MRP1 (Osada et al., 2003) und MRP2 (Materna et al., 2001; Materna et al., 2005) beschrieben worden.

Das Phänomen der Multidrug-Resistenz ist im zellulären Kontext jedoch meist nicht auf die Veränderung eines Genes zurückzuführen, sondern stellt sich als ein Multikomponentensystem dar, welches durch Kaskaden oder unabhängige Expressionen verschiedener Gene verursacht wird.

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Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig ein Multitargetmultiribozym (MTMR), welches durch die Kombination von in cis- und in trans-aktiven Hammerhead-Ribozymen sowie SPACER-Sequenzen befähigt ist, die Transkripte dreier unabhängiger Gene, die für die ABC-Transporter MDR1/P-gp, MRP2 und BCRP kodieren, simultan funktionell auszuschalten.

Sogenannte Multitarget-Ribozyme (MTR) wurden in anderen Zusammenhängen bereits beschrieben. Dieser Begriff bezieht sich allerdings auf die tandemartige Anordnung mehrerer Ribozyme, die gegen verschiedene Sequenzabschnitte eines RNA-Moleküles gerichtet sind. Zum einen konnten durch die Kombination zweier Monoribozyme zwei konservierte Positionen des Retrovirus S1-Gensegmentes, das das virale Zelladhäsionsprotein σ1 kodiert, gespalten werden (Shahi et al., 2002). Zum anderen erzielten Chen et al. (1992) durch die Expression verschiedener Mono-, Di-, Tetra-, Penta- und Nona-Ribozyme die Spaltung der HIV-env-RNA an bis zu neun verschiedenen Positionen. Die genannten antiviralen MTR-Konstrukte können als gentherapeutische Agenzien gegen ein einzelnes Transkript angewendet werden; doch aufgrund von fehlenden SPACER-Sequenzen und in cis-aktiven Ribozymen verfügen sie nicht über das Potential zur Spaltung mehrerer unabhängiger RNA-Moleküle.

4.1.1  Das Multitargetmultiribozym-Reaktionssystem

Um die Transkripte der ABC-Transporter MDR1, MRP2 und BCRP simultan zu inhibieren, wurden Hammerhead-Ribozyme, die diese Transkripte angreifen, und sogenannte SPACER-RNA-Sequenzen in einem Multitarget-Multiribozym (MTMR) dergestalt miteinander kombiniert, daß die SPACER-Sequenzen von den in cis-aktiven Ribozymen gespalten werden können, wodurch es zur Autokatalyse des MTMRs und zur Freisetzung der in trans-spaltenden Ribozyme kommt, die daraufhin ihre Ziel-RNAs katalysieren können. Die Idee von autokatalytisch aktiven, selbst-prozessierenden Ribozymen wurde bereits von Taira et al. (1990, 1991) entwickelt. Dabei konnte ein in trans-agierendes Ribozym, welches gegen die mRNA des Hefe-spezifischen SFL1-Genes gerichtet war, durch ein in cis-spaltendes Ribozym freigesetzt werden, dessen Sequenz am 3'-Ende des Konstruktes lokalisiert war (Taira et al.,1990; Taira et al., 1991). Im Fokus dieser Arbeiten steht allerdings die Expression von "maßgeschneiderten" Ribozymsequenzen mit definierten 5'- und 3'-Enden, die vergleichsweise effektiver sind als nicht-prozessierte Kontroll-Ribozyme, die aufgrund der Beschaffenheit herkömmlicher Expressionsvektoren meist Bestandteil eines langen Transkriptes sind.

4.1.2 Konstruktion des MTMRs

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Das Multitargetmultiribozym setzt sich aus folgenden Einzelsequenzen zusammen: anti-MRP2-Ribozym, anti-BCRP-Ribozym, 3 x anti-MDR1-Ribozym, 3 x MDR1-SPACER. Es gibt 21 verschiedene Möglichkeiten, diese Bestandteile miteinander zu kombinieren. Um diejenige Sequenz zu detektieren, die die funktionellen Anforderungen des Multitargetmultiribozymes am besten erfüllt, wurde im Vorfeld von experimentellen Untersuchungen eine in silico-Analyse aller MTMR-Varianten durchgeführt. Dabei wurden die von speziellen Computerprogrammen berechneten MTMR-RNA-Sekundärstrukturen herangezogen und bezüglich der im Ergebnisteil dargestellten Auswahlkriterien untersucht.

RNA-Sekundärstrukturen können in silico mit Hilfe der Programme mfold 3.0 und Sfold 2.0 erzeugt werden. Bei der Bewertung der MTMR-Varianten mit Hilfe von mfold 3.0 wurde von den angebotenenen Strukturen gemäß der Benutzerhinweise jeweils diejenige mit der geringsten freien Energie herangezogen (Zuker and Stiegler, 1981; Zuker, 1989). Das Sfold 2.0-Programm hingegen bietet eine RNA-Sekundärstrukturanalyse, die nicht nur die optimale, energieärmste RNA-Struktur, sondern auch alternative Faltungen einbezieht. Auf dieser Grundlage wird ein Wahrscheinlichkeitsprofil bezüglich der Anordnung und Einzelsträngigkeit für jedes Nukleotid in der eingegebenen Sequenz erstellt (Ding and Lawrence, 2001). Durch die Bewertung der verschiedenen MTMR-Sekundärstrukturen mit Hilfe zweier Programme, die auf unterschiedlichen Algorithmen basieren, steigt die Wahrscheinlichkeit, daß übereinstimmende Strukturen unter den angegebenen Bedingungen tatsächlich vorliegen. Trotzdem sind die im Folgenden dargestellten möglichen Fehlerquellen bei der Auswertung von in silico erzeugten Sekundärstrukturen zu beachten:

1.

Die Berechnung von RNA-Sekundärstrukturen mit computergestützten Modellierungsprogrammen stellt lediglich eine wahrscheinliche Annäherung an die tatsächliche Sekundärstruktur dar. Hundertprozentige Voraussagen sind mit Hilfe der verfügbaren Programme nicht möglich.

2.

Der Zusammenhang zwischen RNA-Sequenz und Tertiärstruktur ist noch nicht vollständig aufgeklärt und kann im zellulären Umfeld, z.B. durch RNA-bindende Proteine, dergestalt beeinflußt werden, daß die für die computergestützte Simulation verwendeten Parameter nicht mehr zutreffen bzw. irrelevant geworden sind (Lee et al., 1997).

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Die Bindung des Ribozymes an sein Substrat ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der ribozymatischen Spaltreaktion (Hendry und McCall, 1995). Da die im MTMR integrierten Hammerhead-Ribozymsequenzen einen jeweils identischen katalytischen Kern besitzen, kann die Reaktionsrate nur durch die Sekundärstruktur der Hybridisierungssequenzen beeinflusst werden. Intramolekulare Schleifenstrukturen oder Aggregate können zur sterischen Hinderung bei der Ausbildung des Ribozym-Substrat-Komplexes führen bzw. die Reaktionsrate erniedrigen, da die Nukleotide der Hybridisierungsarme bereits im Molekül gebunden sind (Stage-Zimmermann and Uhlenbeck, 1998). Einige Studien befürworten die Hypothese, daß ein hoher Anteil an freien Nukleotiden in den Bindungsarmen von Ribozymen die Reaktionsrate der ribozymatischen Spaltung erhöht. Allerdings ist diese Aussage hypothetischer Natur und konnte noch nicht abschließend belegt werden. Einer Studie von Amarzguioui et al. (2000) zufolge ist die Erreichbarkeit einer RNA-Zielsequenz nicht nur vom Vorhandensein von Einzelstrangbereichen, sondern auch von alternativen Parametern abhängig, die jedoch noch nicht determiniert werden konnten. Aufgrund der in mehreren Studien übereinstimmenden Meinung, daß ein hoher Anteil freier Nukleotide in den Hybridisierungsarmen von Ribozymen sowie in der Zielregion der dazugehörigen mRNA die Ausbildung des Ribozym-Substrat-Komplexes erleichtert (Ding and Lawrence, 2001, Ding and Lawrence, 2003, Ding et al., 2004), wurde die Anzahl der freien Nukleotide in den Hybridisierungsarmen der im MTMR integrierten Ribozymsequenzen sowie die Ausbildung der typischen Hammerhead-Struktur und die sterische Zugänglichkeit der Hybridisierungsarme als Bewertungskriterien für die in silico-Analyse zugrunde gelegt.

4.1.3 Auswahl der Ziel-RNA-Sequenzen

Als Substrat-RNAs wurden Abschnitte aus den jeweiligen mRNAs der Zielgene MDR1, MRP2 und BCRP ausgewählt, die lang genug sind, um Rückschlüsse auf die vollständige mRNA zuzulassen. Die Substrat-RNAs wurden in vorangehenden Analysen bereits mit Hilfe von Einzel-Ribozymen in vitro mit einer hohen Effizienz hydrolisiert. In den nachfolgenden Anwendungen der Mono-Ribozyme in verschiedenen Zellkultursystemen konnte ebenfalls eine starke Erniedrigung der Ziel-mRNA nachgewiesen werden. Diese Analysen zeigen, daß die ausgewählten Substrat-RNAs für die in vitro-Bewertung von Ribozymsequenzen geeignet sind und eine positive Korrelation zwischen hoher Effizienz im zellfreien System und in zellulärer Umgebung besteht.

4.2 Aktivität des in vitro-transkribierten MTMR

Der Mechanismus der ribozymatischen Spaltung wurde als sequenzspezifische alkalische Hydrolyse unter Beteiligung von Mg2+ beschrieben (Dahm et al., 1991). Es ergibt sich daraus eine Abhängigkeit der Reaktion vom pH-Wert, der Mg2+-Konzentration und der Temperatur. Durch das biologische System, in dem die ribozymatische Spaltung Anwendung finden soll, sind diese Parameter vorgegeben (in diesem Fall humane Zellen). Deshalb richtete sich die Optimierung der Katalysereaktion auf die MTMR- bzw. die Ziel-RNA-Sequenzen und nicht auf die Reaktionsbedingungen. Diese wurden so gewählt, daß sie sich den physiologischen Verhältnissen in der Zelle weitestgehend annähern (pH 7,5, Mg2+-Konzentration 12 mM, Reaktionstemperatur 37 °C). Eine Studie bewertet den intrazellulären Gehalt von Mg2+-Ionen zwar deutlich niedriger (0,1-1 mM) als die hier im zellfreien System angewandten 12 mM (London, 1991), jedoch wird eine Mg2+-Konzentration zwischen 10-50 mM übereinstimmend für kinetische Analysen von Hammerhead-Ribozymen empfohlen (Uhlenbeck, 2003, Kato et al., 2001). Darüber hinaus gibt es Indizien, daß Komponenten mit geringem Molekulargewicht (low molecular weight components) in Zellen die fehlenden Mg2+-Ionen kompensieren (Nedbal and Sczakiel, 1997).

4.2.1  Bewertung des in vitro-transkribierten MTMRs im zellfreien System

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Das Multitargetmultiribozym wurde hinsichtlich seiner Reaktionsparameter genauer analysiert und die erhaltenen kinetischen Daten mit den publizierten Reaktionsparametern der im MTMR integrierten Monoribozyme sowie ausgewählter Ribozyme, die unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen ermittelt wurden, verglichen (s. Tab. 11 im Ergebnisteil). Sowohl im Vergleich mit den Mono-Ribozymen gegen die Substrate MDR1sub, BCRPsub und MRP2sub, als auch zu den Daten von Ribozymen, die gegen vollkommen andere Substrat-RNAs gerichtet sind, zeigt sich, daß die Spaltaktivität der durch Autokatalyse freigesetzten MTMR-Fragmente nicht als vermindert, sondern vielmehr als hoch einzuschätzen ist.

Da die a priori-Bewertung ribozymatischer Aktivität im zellfreien System ein geeignetes Hilfmittel ist, um die Eignung der gegebenen Konstrukte für Zellkulturanwendungen einzuschätzen (Sigurdsson and Eckstein, 1995), ist analog zu den Ergebnissen der Monoribozyme anti-MDR1, anti-BCRP und anti-MRP2 (Holm et al., 1995; Kowalski et al., 2001 und 2002; Materna et al., 2001 und 2005) eine hohe Effizienz des MTMR im zellulären Kontext zu erwarten.

4.3  Anwendung des MTMRs in verschiedenen Zellsystemen

Durch stabile Expression des MTMRs mit Hilfe eines eukaryotischen Expressionsvektors sollte determiniert werden, ob die im zellfreien System beobachtete Substratspaltung auch in verschiedenen Zellsystemen erfolgt und daraus eine Inhibition der Ziel-mRNA sowie physiologische Effekte abzuleiten sind.

4.3.1  Etablierung stabiler MTMR- und Kontroll-Transfektanten der Zellinien 257RNOV, 257RDB und A2780RCIS

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Aus den drei genannten chemoresistenten Zellinien wurden stabile Transfektanten etabliert, die entweder den unmodifizierten Expressionsvektor pIRES2/EGFP (Kontrolltransfektanten) oder den Expressionsvektor pIRES2/MTMR mit integrierter MTMR-Sequenz (MTMR-Transfektanten) exprimieren. Die Auswahl der drei chemoresistenten Zellinien für die Anwendung des MTMR begründete sich zum einen aus der Tatsache, daß jeweils eine der Ziel-mRNAs für die im MTMR integrierten Ribozyme im Vergleich zu ihrer parentalen chemosensitiven Variante überexprimiert ist, und zum anderen dadurch, daß die gleichen Ziel-mRNAs in diesen Zellinien bereits durch Monoribozyme sowie siRNAs und z.T. durch shRNAs reguliert wurden, was einen Vergleich der Effizienzen der unterschiedlichen Antisense-Techniken ermöglicht (Holm et al., 1994; Kowalski et al., 2002; Nieth et al., 2003; Stege et al., 2004, Materna et al., 2005; Priebsch et al., 2006, eingereicht).

4.3.1.1  Auswahl des Vektorsystemes und Klonierung der MTMR-Sequenz

Trotz einer effizienten Spaltung von Ziel-RNA durch Hammerhead-Ribozyme im zellfreien System ist eine erfolgreiche Applikation der gleichen Ribozyme in zellulärer Umgebung (in vitro und/oder in vivo) nicht automatisch gewährleistet. Mögliche Gründe für diese unzureichende Übertragbarkeit sind:

1.

Die Substrat-mRNA liegt als gefaltete Raumstruktur vor, die sich aufgrund der spezifischen Verhältnisse in der jeweiligen Zelle höchstwahrscheinlich anders gestaltet als im zellfreien System. Zudem kann die Ribozymschnittstelle in der
Ziel-mRNA durch an sie gebundene Proteine abgeschirmt sein.

2.

Es ist in der Regel ein Überschuß an Ribozym erforderlich, um die Ziel-mRNA signifikant zu inhibieren. Bei der Expression der Ribozymsequenz durch ein Vektorsystem kann dieses möglicherweise nicht gewährleistet sein (z.B. durch sogenanntes "silencing" des vektoriellen Promotors durch benachbarte schwach exprimierende genomische Bereiche).

3.

Verschiedene zelluläre RNasen können die Ribozyme degradieren und damit ihrer Funktionalität entgegenwirken.

4.

Die gespleißte mRNA wird schnell vom Nukleus ins Zytoplasma transportiert. Daher müssen aktive Ribozyme auch ins Zytoplasma transportiert werden, um Kolokalisation mit ihrer Ziel-RNA zu gewährleisten (Hormes et al., 1997).

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Aus den genannten Gründen erfordert ein Ribozym- bzw. MTMR-Expressionssystem eine hohe Produktionsrate an stabiler katalytisch aktiver RNA, die zytoplasmatisch lokalisiert ist. Der eukaryotische Expressionsvektor pIRES2/EGFP erfüllt diese Kriterien bezüglich der MTMR-Expression in den entsprechenden Zielzellinien. Das MTMR konnte stabil im Genom integriert und permanent exprimiert werden. Der im Vektor integrierte CMV-Promotor sorgt generell für eine hohe Transkriptionsrate in allen getesteten Zellsystemen. Darüber hinaus rekrutiert dieser Promotor die Polymerase II, die sich bei Ribozymanwendungen als vorteilhaft erwiesen hat. Es zeigte sich hierbei, daß Ribozyme, die die für die Polymerase II typische 3’-Polyadenylatschwanzstruktur aufwiesen, stabiler und aktiver waren, als solche, die von einer anderen Polymerase transkribiert wurden (Bertrand et al., 1997).

4.3.1.2 Generierung stabiler Transfektanten

Durch Transfektion sind stabile MTMR- und Kontroll-Transfektanten aus den resistenten Zellinien 257RNOV, 257RDB und A2780RCIS etabliert worden. Alle Transfektanten wurden hinsichtlich der Expression der inserierten Gensequenz mit Hilfe der RT-PCR kontrolliert. Da keine "falsch-positiven" Klone detektiert wurden, kann auf eine sehr hohe Transfektionseffizienz geschlossen werden. Allerdings stellt der Nachweis der MTMR-Expression mittels RT-PCR noch keine Garantie für die beabsichtigte katalytische Wirkung in der Zelle dar. Aufgrund der zufälligen Integration des Vektors in das Genom der Zielzelle ist durch sog. Silencing nicht auszuschließen, daß die MTMR-Expressionseinheit etwa unter die Kontrolle eines schwachen oder nur zeitweise abgelesenen Promotors gelangte und damit die MTMR-Expression beeinträchtigt wurde. Da die PCR eine hochsensitive Methode darstellt, die auch schwach exprimierte Sequenzen nachweisen kann, ist die katalytische Aktivität des MTMRs in funktionellen Untersuchungen zu analysieren.

4.3.2 Funktionelle Untersuchungen der Transfektanten

4.3.2.1  Resistenzverhalten der Transfektanten

Die Transfektion der MTMR-Sequenz in die eingangs genannten resistenten Krebszellinien sollte zur Inaktivierung der Ziel-mRNAs der Gene BCRP, MRP2 und MDR1 und damit zur Verringerung des jeweiligen Proteines führen, für das die spezifischen mRNAs kodieren. Es konnte bereits eindeutig gezeigt werden, daß die ABC-Transportproteine durch den aktiven Export spezifischer Zytostatika einen maßgeblichen Anteil am MDR-Phänotyp der Zellen haben (Kowalski et al., 2002; Stege et al., 2004). Umgekehrt müßte eine Verringerung des ABC-Transportergehaltes als Resultat der MTMR-Expression zur Resensitivierung der Zellen gegenüber dem spezifischen Zytostatikum führen.

↓95

Alle Transfektanten wurden deshalb hinsichtlich ihrer Resistenzeigenschaften gegen die vom jeweiligen ABC-Transporter transportierte Substanz gestestet. Als Maßstab für die Bewertung der Resistenz diente die halbmaximale wachstumsinhibitorische Konzentration (IC50) des jeweiligen Zytostatikums im Medium, wobei es sich um ein Maß handelt, das bei diesbezüglichen Untersuchungen in der Fachliteratur fast immer angegeben wird (Fricker and Buckley, 1996; Voigt,2005). Es konnte gezeigt werden, daß die Zellinie 257RNOV eine 69-fach höhere Resistenz gegen Mitoxantron und die Zellinie 257RDB eine 97-fach höhere Resistenz gegen Daunorubicin im Vergleich zu ihrer parentalen Zellinie 257P aufweisen. Dieses Resistenzverhalten ist seit Etablierung dieser Zellinien unverändert geblieben, was ein Vergleich mit in der Vergangenheit publizierten Daten über die beiden Zellinien zeigt (Kellner et al., 1997; Stege et al.,2004). Die Kontrolltransfektanten, die den unmodifizierten Expressionsvektor transkribieren, wiesen ein ähnliches Resistenzverhalten auf wie die jeweiligen resistenten Ausgangszellinien. Bei der Transfektion der resistenten Zellinie A2780RCIS konnten analoge Ergebnisse erzielt werden. Zum einen ist die spezifische Cisplatinresistenz der Ausgangszellinie A2780RCIS gegenüber der parentalen Zellinie A2780P um das Achtfache erhöht und im Vergleich zu vorher publizierten Daten unverändert (Materna et al., 2005). Anderenfalls zeigten die Kontrolltransfektanten einen stabilen MDR-Phänotyp. Die Ergebnisse der MTMR-exprimierenden Transfektanten waren nicht ganz einheitlich. In allen drei Zellinien konnten bei den MTMR-exprimierenden Klonen etwa bei einem Drittel schwache, bei einem weiteren Drittel moderate und bei einem letzten Drittel starke zelluläre Effekte nachgewiesen werden. Diese Inhomogenität könnte aufgrund von Positionseffekten der Transfektion eingetreten sein, d.h. daß durch die zufällige Integration des Vektors in das Genom der Ausgangszellen die Transkription eines bestimmten Genes derart beeinflußt würde, daß sich die zelluläre Resistenz veränderte. Aufgrund der folgenden Argumente ist jedoch ein solcher Effekt auszuschließen:

1.

Das Ergebnis sollte mit gleicher Wahrscheinlichkeit in den MTMR-exprimierenden und Kontrolltransfektanten auftreten. Da keine der Kontrolltransfektanten eine Verringerung des spezifischen Resistenzfaktors aufweist, ist der Sensitivierungseffekt auf die MTMR-Expression zurückzuführen.

2.

Die Resensitivierung der MTMR-exprimierenden Transfektanten erfolgte in drei unabhängigen Tranfektionsanalysen und ist auch für die jeweilige Zellinie spezifisch, d.h. im Falle von A2780RCIS/MTMR gegen Cisplatin, 257RNOV/MTMR gegen Mitoxantron und 257RDB/MTMR gegen Daunorubicin. Diese Spezifität spricht ebenfalls gegen einen Positionseffekt.

3.

Diejenigen Transfektanten, die einen Sensitivierungseffekt zeigen, sollten keine Korrelation mit dem RNA bzw. Proteinniveau des jeweiligen ABC-Transporters aufweisen. Die Analyse aller Transfektantenzellinien machte jedoch deutlich, daß die zelluläre Sensibilisierung stark mit der Inhibition der ABC-Transporter korreliert.

Aus den genannten Gründen ist bei allen Transfektionsexperimenten ein zellulärer Effekt auf die Expression der MTMR-Sequenz zurückzuführen. Die unterschiedliche Stärke des Sensibilisierungseffektes könnte aufgrund unterschiedlicher MTMR-Expressionsstärken in den Transfektanten entstanden sein, da wie bereits in vorhergehenden Abschnitten erwähnt wurde, die Integration des Expressionsvektor zufällig erfolgt und dieser von benachbarten genomischen Strukturen in seiner Expressionsstärke sowohl positiv als auch negativ beeinflußt werden kann. Die Ergebnisse widerspiegeln einen typischen Verlauf derartig durchgeführter Transfektionsanalysen. Eine durchschnittliche Drittelung der Transfektanten in solche mit schwachen, moderaten und starken Effekten hat sich zum einen hier in drei unabhängigen Zellinien und damit auch drei unabhängigen Transfektionsversuchen und zum anderen auch in anderen Studien gezeigt (Kowalski et al., 2004; persönliche Kommunikation mit Mitarbeitern der AG Lage am Institut für Pathologie, Charité Berlin).

4.3.2.2 Akkumulationsverhalten der Transfektanten

↓96

Die Akkumulation der Zytostatika Mitoxantron und Daunorubicin konnte mit Hilfe der Durchflußzytometrie in den abgeleiteten Transfektanten der Zellinien 257RNOV und 257RDB ermittelt werden. Im Ergebnis der Untersuchungen zeigte sich, daß die MTMR-Transfektanten eine ähnlich hohe Akkumulation des jeweiligen Zytostatikums aufwiesen, wie die parentale nicht-resistente Zellinie 257P. Bei den MTMR-Transfektanten der Zellinie 257RNOV wurde teilweise sogar eine höhere Substratakkumulation nachgewiesen, als in den parentalen Zellen. Die resistenten Ausgangszellinien 257RNOV bzw. 257RDB zeigten eine vergleichsweise niedrige Substratakkumulation. Die Kontrolltransfektanten beider Zellinien konnten die Zytostatika gering, jedoch im Vergleich zur Ausgangszellinie signifikant erhöht akkumulieren. Dieser Effekt resultiert aus einem unterschiedlichen Expressionsniveau der ABC-Proteine in Ausgangszellinien und Kontrolltransfektanten, welches eine Folge verschiedenartiger Kultivierungsbedingungen ist. Die Ausgangszellinien wurden unter permantentem Zytostatikumsdruck gehalten, was im Gegensatz dazu bei sämtlichen Transfektanten nicht der Fall war. Der Zytostatikumsdruck bewirkt in den Zellen eine permantente Induktion der entsprechenden ABC-Transporter, woraus ihr im Vergleich zu Kontrollinien erhöhter Expressionslevel resultiert (Nieth and Lage, 2005). Umgekehrt wurde bereits an den beiden Ausgangszellinien gezeigt, daß eine Kultivierung ohne Zytostatika zur Abnahme der ABC-Transporter-Expressionen bis auf ein distinktes Niveau führt, welches dann allerdings stabil erhalten bleibt (Stege et al., 2004; persönliche Kommunikation mit Dipl.-Biol. A. Stege und Dipl.-Ing. A. Priebsch).

Die Ergebnisse deuten auf eine direkte Korrelation zwischen Inhibition der Ziel-mRNA und dem Akkumulationsverhalten der Zellen in den MTMR-exprimierenden Transfektanten hin. Durch die katalytische Aktivität des MTMR konnten die Ziel-mRNAs von BCRP bzw. MDR1 gespalten und damit die Translation des jeweiligen ABC-Transporters verhindert werden, woraus eine deutlich verringerte Exportkapazität der Substrate von BCRP bzw. MDR1 resultiert. Die Effekte der MTMR-Expression treten durch die Messung der Akkumulation vergleichsweise deutlicher hervor als bei der Resistenzbestimmung. Das erklärt sich daraus, daß die ABC-Transporter MDR1 bzw. BCRP in diesen Zellinien direkt die Zytostatika Daunorubicin bzw. Mitoxantron exportieren und somit ihre verringerte Expression im Akkumulationsverhalten meßbar ist. An der Resistenz der Zellen gegenüber dem entsprechenden Zytostatikum sind die ABC-Transporter maßgeblich beteiligt. Dennoch können in den untersuchten Zellsystemen alternative MDR-Mechanismen existieren, beispielsweise auch solche, bei denen Zytostatika im Zellinneren durch Kompartimentierung inaktiviert werden oder ihre zytotoxische Wirkung durch die Ausbildung anderer Faktoren eingeschränkt wird (s. Kap. 4.3.3).

4.3.3 ABC-Transporter-„Restaktivität“ und alternative MDR-Mechanismen

Die Ergebnisse der quantitativen real time RT-PCR zeigten, daß die mRNAs der für die ABC-Transporter MDR1, BCRP und MRP2 kodierenden Gene nicht vollständig vom MTMR gespalten wurden, so daß sich eine Expression dieser Gene in allen MTMR-Transfektanten auf einem niedrigeren Niveau einstellte. Wenngleich in geringerem Maße, können die in den MTMR-Transfektanten vorhandenen ABC-Transporter die Ausbildung eines MDR-Phänotypes verursachen. Mit Hilfe von IC50-Werten wurden die Resistenzfaktoren aller Zellinien gegenüber den zu untersuchenden Zytostatika ermittelt und damit der Grad der Multidrug-Resistenz in den Transfektanten versus Ausgangszellinien bestimmt. Dabei stellte sich heraus, daß die Multidrug-Resistenz aller untersuchter MTMR-Transfektanten im Vergleich zur jeweiligen Ausgangszellinie um mindestens 50 % vermindert, allerdings nur in Einzelfällen komplett aufgehoben wurde, was auf die “Restaktivität” der gering exprimierten ABC-Transporter in diesen Transfektanten zurückgeführt werden kann.

↓97

Darüber hinaus sind in den drei verwendeten MDR-Zelllinien im Vergleich zu ihren parentalen, chemosensiblen Partnern alternative Mechanismen ausgeprägt, die die spezifische MDR mitverursachen und natürlich nicht mit Hilfe des ABC-Transporter-MTMRs ausgeschaltet wurden.

In der resistenten Magenkarzinomzellinie 257RNOV wurde beispielsweise eine erhöhte Expression der mRNA für das Heparansulfat-Proteoglycan-3 (GPC-3) im Zusammenhang mit der Mitoxantronresistenz der Zellen gefunden. Eine spezifische Inhibition dieser mRNA mit Hilfe eines Hammerhead-Ribozymes konnte die Mitoxantronresistenz der Zellen erniedrigen, allerdings nicht aufheben (Wichert et al., 2004). In den MTMR-exprimierenden Transfektanten der Zellinie 257RNOV ist dieser Mechanismus nicht aufgehoben und ist eventuell für die noch meßbare Mitoxantronresistenz in den MTMR-exprimierenden Transfektanten verantwortlich.

Die gleiche resistente Zellinie exprimiert auch verstärkt zwei weitere Proteine der ABC-Transporter-Superfamilie, TAP1 und TAP2 (Lage et al., 2001), die als Heterodimer an der Antigenpräsentation der Zelle beteiligt und darüber hinaus in verschiedenen MDR-Zellinien im direkten Zusammenhang mit Mitoxantronresistenz beschrieben worden ist (Neefjes et al., 1993; Izquierdo et al.,1996; Moriyama et al., 2003). Die Überexpression des TAP1/2-Heterodimeres kann, wie GPC-3, für einen MDR-Phänotyp in den 257RNOV/MTMR-Transfektanten verantwortlich sein, obwohl das BCRP-Protein weitestgehend inhibiert ist.

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Ein weiterer Chemoresistenzmechanismus, der besonders in der Zellinie 257RNOV, aber auch in den 257RDB-Zellen ausgeprägt ist, ist die Verringerung des nukleären Gehaltes an DNA-Topoisomerasen II. Diese Enzyme sind in der Lage, durch gezielte Spalt- und Ligationsreaktionen über einen sogenannten “spaltbaren Komplex” die DNA-Doppelhelix in ihrer Topologie zu verändern und damit zu deren Entwindung beizutragen (Osheroff et al., 1994). Inhibitoren des Enzymes stabilisieren den “spaltbaren Komplex”, so daß der Reaktionsverlauf gestört wird. Es wird angenommen, daß der zytotoxische Effekt von Topoisomerase II-Hemmstoffen auf dieser Stabilisierung beruht (Nelson et al., 1984). Umgekehrt können Resistenzen gegen Topoisomerase II-Inhibitoren von allen Prozessen herrühren, die zu einer veränderten Bindungsaffinität des Enzymes zu Therapeutika oder DNA und damit zu einer verringerten Ausbildung des "spaltbaren Komplexes" führen (Harker et al., 1999; Lage and Dietel, 2002). In humanen Zellen existieren zwei Isoformen der Topoisomerase II, Topo IIα und TopoIIβ, die homodimerisieren (Jenkins et al., 1992). Im Vergleich zur parentalen Zellinie 257P konnten in der Zellinie 257RNOV erniedrigte Expressionswerte für beide Isoformen der Topoisomerase II und in der Zellinie 257RDB für die Isoform Topo IIβ ermittelt werden (Lage et al., 2006, in press). Die Zytostatika Daunorubicin und Mitoxantron interkalieren in der DNA und greifen somit auch die Topisomerase II an. Eine verminderte Expression von Topoisomerasen II stellt einen zellulären Schutzmechanimus dar, um die zytotoxische Wirkung der genannten Substanzen zu verringern, woraus eine ABC-Transporter-unabhängige Resistenz in den beschriebenen Zellinien resultiert.

Ein weiterer zellulärer Mechanismus, der zur Überwindung der zytotoxischen Wirkung von Zytostatika führt, ist die Störung von Signalkaskadewegen, die zum programmierten Zelltod, der Apoptose, führen. Dieses kann beispielsweise durch ein mutiertes p53-Gen realisiert werden (Lowe et al., 1993). Die parentale Ovarialkarzinomzellinie A2780P exprimiert Wildtyp p53, wohingegen ihre cisplatinresistente Variante A2780RCIS zwei funktionelle Punktmutationen im p53-Gen aufweist, welche zu einer veränderten Aminosäuresequenz führen. Diese Veränderungen im p53-Status der resistenten Zellinie können zu Störungen der Apoptosesignalwege führen und stellen möglicherweise einen alternativen Resistenzmechanismus gegenüber dem Apoptose-induzierenden Agenz Cisplatin dar (unpublizierte Daten Dr. V. Materna).

Es ist anzunehmen, daß die genannten Zellinien noch weitere Strategien entwickelt haben, die zur Ausbildung von Chemoresistenzen gegen die verwendeten Zytostatika führen, jedoch noch nicht experimentell detektiert oder funktionell analysiert worden sind. Beispielsweise wurden die mRNA-Expressionsprofile der Zellinien 257RNOV, 257RDB und 257P mit Hilfe von Microarray-Chips in unterschiedlichen Studien untersucht (Ludwig et al., 2002; Heim et al., 2005). Dabei konnten mehr als hundert auf- bzw. herabregulierte Gene in den einzelnen resistenten Zellinien versus parentaler Zellinien gefunden werden. Die Funktionen dieser Gene und ihre Bedeutung für die Chemoresistenz von Zellen erfordern jedoch noch weitere Studien.

↓99

Die genannten Möglichkeiten der Ausbildung von Multidrug-Resistenzen machen deutlich, daß durch die Inhibition eines Genes bzw. die Blockade eines Resistenzweges eine hundertprozentige Remission der Zellen zum parentalen Phänotyp kaum erfolgen kann. Umso wichtiger ist es, möglichst Mechanismen außer Kraft zu setzen, die an oberster Stelle eines kaskadeartigen Systems von Signalen stehen, die die Zelle vor zytotoxischen Substanzen schützen. Die Inhibition der genannten ABC-Transporter ist eine solche Herangehensweise und die komplette Aufhebung der Daunorubicinresistenz in einigen MTMR-Transfektanten der Zellinie 257RDB zeigt, daß trotz möglicher alternativer Resistenzmechanismen die Inhibition von P-Glykoprotein in diesem Zellsystem die wichtigste Strategie zur Resensitivierung ist.

4.4 Ribozyme versus Antisense-Technologie und RNAi

Für die Therapie von Krebserkrankungen ist oftmals die gezielte Ausschaltung bestimmter Gene bzw. Genprodukte erforderlich, um eine Tumorzelle derart zu schädigen, daß sie abstirbt. Um dieses Ziel zu erreichen, bietet die Anwendung von RNA-Techniken Vorteile im Vergleich zu konventionellen Therapeutika. Durch die Sequenzspezifität von RNA-Techniken kann sichergestellt werden, daß nur die Expression der Zielgene inhibiert wird. Darüber hinaus sind weder Resistenzmechanismen noch starke gesundheitsgefährliche Nebenwirkungen gegen Antisense-Oligonukleotide, Ribozyme oder siRNAs durch klinische Studien bekannt geworden (bislang sind jedoch erst sehr wenige klinischen Studien mit siRNAs publiziert, viele Untersuchungen wurden aber 2005 begonnen) (Wong-Staal et al., 1998; Usman and Blatt, 2000). Doch nicht nur in der Krebsforschung bzw. -therapie, sondern auch im Zusammenhang mit anderen molekularbiologischen Fragestellungen ist die Inhibition spezifischer Gensequenzen notwendig. Von den vielfältigen Möglichkeiten der RNA-Techniken werden nicht katalytische Antisense-Oligonukleotide, Ribozymtechniken oder Methoden, die auf RNA-Interferenz (RNAi) basieren, am häufigsten angewendet. Vor- und Nachteile der einzelnene Techniken sind in der Tab. 14 dargestellt (Übersicht in: Scherer and Rossi, 2003; Jarad et al., 2003).

Tabelle 14: Relative Stärken und Schwächen verschiedener RNA-Technologien

Technik

Vorteile

Nachteile

AS-ODN

  • leichte Herstellung
  • können modifiziert werden, um Selektivität und Effizienz zu verbessern
  • können gegen Introns gerichtet werden
  • einfache Herstellung
  • jahrelange Erfahrung

  • können in vivo Interferon induzieren (wenn lang und mit CpG-Inseln)
  • können Proteine binden (Aptamer Aktivität)
  • nur exogene Applikation (synthetisch)
  • Berichte von off-target Effekten
  • keine katalytische Aktivität

Ribozyme

  • katalysieren Zielsequenz
  • Einzelbasenpolymorphismen sind unterscheidbar
  • Hybridisierungssequenzen können verändert werden, um Spezifität anzupassen
  • einfache katalytische Domäne
  • können Intronen oder subzelluläre Kompartimente angreifen
  • exogene und systemische Applikation möglich
  • seit den 80er Jahren bekannt

  • erfordern Spalttriplet (am besten GUC) in Zielsequenz
  • können Proteine binden (Aptamer Aktivität)

RNAi

  • effizient bei geringen Konzentrationen
  • exogene (siRNA) und systemische (shRNA) Applikation
  • Einfache Herstellung

  • häufig off-target Effekte
  • oft Interferon Induktion und unspezifischer mRNA-Abbau in vivo
  • nukleäre RNA oder Introns können nicht erreicht werden
  • systemische Anwendung erfordert spezielle Promotoren und Vektorsysteme
  • erst seit etwa 5 Jahren in vitro und in vivo Applikationen

↓100

Durch Evaluierung aller in Frage kommender Antisense-Methoden wurde in Hinblick auf die Zielsetzung dieser Arbeit aus folgenden Gründen für eine Hammerhead-Ribozym-basierte Technologie entschieden:

1.

Die alternativen Techniken sind nicht zu einer Spaltung der Sequenzen in cis geeignet und damit auch nicht zur Autokatalyse. Die Freisetzung der in trans-aktiven Ribozyme ist jedoch nur mit Hilfe der Selbstspaltung des MTMR möglich. Durch diese ribozym-spezifischen Katalyseeigenschaften erhält das entwickelte MTMR das Potential, mehrere Zielsequenzen zu katalysieren, was durch keine der alternativen Techniken erreicht werden kann.

2.

Durch die Befähigung zur Ziel-RNA-Spaltung können die katalytischen Eigenschaften von Ribozymen a priori im zellfreien System charakterisiert und daraus Vorhersagen für die Anwendbarkeit des jeweiligen Konstruktes im zellulären Kontext gemacht werden. Alternative Techniken können nur in Zellkulturen getestet werden, was zeit- und kostenintensiver ist, da evt. unwirksame Antisense-Moleküle nicht im Vorfeld ausgeschlossen werden können.

3.

Im Vergleich zur RNAi sind ribozymatische Methoden bereits langjährig in vitro und in vivo angewandt worden, so daß eine Vielfalt an publizierten Daten und Erfahrungswerten verfügbar sind.

4.

Der Einsatz von AS-ODN bzw. siRNAs ist insofern ineffektiv, als das diese nur exogen appliziert werden können und Langzeiteffekte in Zellkulturen nicht meßbar sind.

5.

Im Gegensatz zu Ribozymtechniken wurden sowohl bei AS-ODN als auch bei RNAi-Anwendungen sogenannte "off-target" Effekte sowie die Induktion von Interferonen beschrieben.

6.

Unter den verschiedenen Ribozymklassen sind die Hammerhead-Ribozyme am besten charakterisiert. Darüber hinaus sind sie durch ihre einfache Struktur und kurze Sequenz auch vergleichsweise einfach und kostengünstig, beispielsweise als Multiribozymkonstrukt, zu synthetisieren.

In zwei Studien, die die Inhibition der MDR1-mRNA in den klassisch multidrug-resistenten 257RDB-Zellen mit Hilfe von siRNAs und shRNAs beschreiben, hat sich herausgestellt, daß die funktionellen Effekte der MDR1-Modulation auf einem ähnlichen Niveau waren, wie sie durch die MTMR-Expression erzielt werden konnten (Nieth et al., 2002; Stege et al., 2004). Im direkten Vergleich hat sich die neuere RNAi-Technologie demzufolge nicht als vorteilhafter herausgestellt.

4.5 Ausblick

↓101

Bei der Betrachtung der Chemoresistenz handelt es sich bei den meisten Tumoren, aber auch in den hier untersuchten Zellkulturmodellen, um ein Multikomponentensystem, welches von unterschiedlichen Parametern beeinflußt wird. Die Resistenz einer jeweiligen Zelle ist daher immer ein Resultat additiver Effekte verschiedener Mechanismen. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, daß die ABC-Transporter BCRP, MRP2 und MDR1 Hauptverursacher der jeweiligen Resistenzphänotypen in den gewählten Zellmodellen sind und deren spezifische Inhibition eine vergleichsweise dramatische Wirkung auf die chemoresistente Zelle haben. Nichtsdestotrotz könnte durch die spezifische Inhibition weiterer bekannter Resistenzfaktoren die Chemoresistenz aller dreier Zellinien vermutlich in allen Transfektantenlinien komplett aufgehoben werden. Ein entsprechendes Multitargetmultiribozym gegen unterschiedliche Resistenzfaktoren, die in einem Zellsystem erhöht exprimiert werden, hätte das Potential der Inhibition verschiedener Gene in einem System, woraus sich möglicherweise synergistische Effekte in Bezug auf die Resensitivierung der Zellen ergeben.

Hinsichtlich seiner Praxisrelevanz stellt das hier entwickelte MTMR allerdings ein "universelles Medikament" dar. Zum einen sind die drei ABC-Transporter in vielen Tumorentitäten resistenzassoziiert gefunden worden, zum anderen ist es vorstellbar, daß die ABC-Proteine in einem heterogenen Tumor parallel ausgebildet werden, und damit beispielsweise der Behandlung mit einer Vielzahl an Therapeutika entgegenwirken. Das ABC-Transporter-MTMR könnte hierbei im Vorfeld Chemoresistenzen verhindern und damit die Heilungschancen erhöhen.

In der Zellkultur konnte ein solcher Synergismus noch nicht überprüft werden, da die gleichzeitige Expression der ABC-Transporter MDR1/P-Gp, BCRP und MRP2 in Tumorzellen zum Beginn der Arbeit noch nicht beschrieben worden war. In einer umfangreichen Arbeit haben Szakács et al. (2004) die Expression aller 48 humanen ABC-Transporter-Gene in 60 verschiedenen Tumorzellinien untersucht. Durch die Auswertung dieser publizierten Daten konnte eine Zellinie identifiziert werden, die alle drei ABC-Transporter auf sehr geringem Niveau exprimiert. Es handelt sich hierbei um die Lungenkarzinomzellinie NCI-H460. In dieser Zellinie könnte durch den Einsatz des konstruierten MTMRs die simultane Inhibition der drei ABC-Transporter-mRNAs im zellulären Kontext gezeigt werden. Dieser Versuchsansatz ist eine wichtige neue Zielstellung für die Weiterentwicklung des MTMRs (derzeitige Arbeit d. Verf.). Darüber hinaus wird der Einsatz von siRNAs in zahlreichen Studien propagiert und teilweise den Hammerhead-Ribozymen vorgezogen. Obwohl in eigenen Untersuchungen der direkte Vergleich beider Techniken keinen Vorteil der RNAi-basierten Methodik erbrachte, ist diese Fragestellung noch nicht abschließend geklärt. Besonders die Eigenschaft der Multitargetspaltung offeriert ein großes Anwendungsspektrum und viele Vorteile im Vergleich zu anderen RNA-Strategien. Durch Kombination von Ribozym- und siRNA-Technik wäre jedoch die Entwicklung eines sogenannten "Multitarget-siRNA-Konstrukts" denkbar. Hierbei würden spezifische Hammerhead-Ribozyme durch Spaltung in cis jeweils sense- und antisense-Stränge von siRNA-Molekülen freisetzen, die daraufhin hybridisieren und ihre Ziel-RNA inhibieren könnten. Solch ein Konstrukt wurde jüngst am Institut für Pathologie entwickelt. Erste Ergebnisse der in vitro-Transkription des Multitarget-siRNA-Konstruktes deuten auf eine erfolgreiche Autokatalyse und auf eine damit verbundene Freisetzung der einzelnen siRNA-Stränge hin. Allerdings ist noch vollkommen unklar, ob die sense- und antisense-siRNA-Stränge tatsächlich hybridisieren und die gebildeten Moleküle auch inhibitorische Wirkung im zellulären Kontext entfalten (derzeitige Arbeiten d. Verf.).


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23.08.2006