Modulation unterschiedlicher Formen der Multidrug-Resistenz mittels eines Multitargetmultiribozymes

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Diplom-Biologin Petra Kowalski

geboren am 29.12.1974 in Berlin

Prof. Dr. Christoph Markschies
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Dekan: Prof. Thomas Buckhout, PhD
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Gutachter:
1. Prof. Dr. rer. nat. Andreas Herrmann
2. PD Dr. rer. nat. Hermann Lage
3. PD Dr. med. Carsten Denkert

Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.06

Zusammenfassung

Die Chemotherapie mit Zytostatika ist eine wichtige Therapieform bei der Behandlung von Krebserkrankungen. Allerdings entwickeln Tumorzellen häufig Resistenzen, meist gegen verschiedene strukturell und funktionell unabhängige Zytostatika; ein Phänomen, das als Multidrug-Resistenz (MDR) bezeichnet wird und die Hauptursache für das Scheitern einer Chemotherapie ist. Mit Hilfe von in vitro-Untersuchungen wurden erhöhte Genexpressionen der ABC-Transporter MDR1, MRP2 und BCRP in verschiedenen MDR-Tumorzellinien als maßgebliche Resistenzfaktoren identifiziert, wie z.B. in den Magenkarzinomzellinien EPG85-257RDB (MDR1) und EPG85-257RNOV (BCRP) sowie in der Ovarialkarzinomzellinie A2780RCIS (MRP2).

Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines auf Ribozym-Technologie basierenden Therapieansatzes, welcher die Expressionen der oben genannten ABC-Transporter simultan inhibiert und dessen Anwendung zur Reversion der zellulären MDR führt.

Dazu wurde ein Multitargetmultiribozym (MTMR) entwickelt, das aus in trans-aktiven Ribozymen besteht, die gegen die ABC-Transporter mRNAs gerichtet sind sowie aus in cis-spaltenden Ribozymen und aus Spacer-RNA-Sequenzen. Es gelang der Nachweis der autokatalytischen Spaltung des MTMRs, welche zur Freisetzung von in trans-aktiven Ribozymen führte. Die Analyse der kinetischen Parameter des MTMRs ergab, daß die autokatalytisch entstandenen MTMR-Fragmente ihre Substrat-RNAs im Vergleich zu den korrespondierenden Monoribozymen ohne Einbuße an Effizienz spalten können. Darüber hinaus wurde die MTMR-Sequenz stabil in den drei eingangs genannten MDR-Zellinien exprimiert, was in einer signifikanten Reduktion der jeweiligen Ziel-mRNAs (Reduktion der MDR1-mRNA um 97 %, der BCRP-mRNA um 80 %, der MRP2-mRNA um 96 %) und der entsprechenden Proteine resultierte. Die Multidrug-Resistenz konnte aufgrund der MTMR-Expression um 70% (A2780RCIS), 95% (257RNOV) und 100% (257RDB) aufgehoben werden. Analog dazu zeigte sich in den 257RNOV-Zellen eine komplette und in den 257RDB-Zellen eine 90%ige Reversion der jeweiligen Zytostatikumsakkumulation.

Das MTMR stellt erstmalig ein RNA-Konstrukt dar, welches in der Lage ist, simultan mehrere unabhängige Gene funktionell auszuschalten. Es besitzt daher ein großes Potential sowohl für grundlagenorientierte Forschung als auch zukünftige gentherapeutische Ansätze.

Eigene Schlagworte: RNA Technologie, Ribozyme, ABC Transporter, MDR, ABCG2, ABCC2, ABCB1

Abstract

Cancer cells are often insensible against structurally and functionally unrelated drugs that is known as multiple drug resistance (MDR) and the main cause for treatment failure. Overexpression of the ABC-transporters P-gp (ABCB1), MRP2 (ABCC2), and BCRP (ABCG2) is associated with MDR in several cancer cell lines, e.g. in the stomach carcinoma cell lines EPG85-257RDB (P-gp), EPG85-257RNOV (BCRP), and in the ovarian carcinoma cell line A2780RCIS (MRP2).

We aimed the development of a novel hammerhead ribozyme-based therapeutic approach capable of simultaneous silencing of the prementioned ABC-transporters, and consequently of reversing MDR phenotypes.

We designed a so-called multitarget multiribozyme (MTMR) consisting of trans-acting hammerhead ribozymes directed against the MDR1, MRP2, and BCRP transcripts, of MDR1 homologous spacer sequences, and of cis-acting ribozymes against the spacer sequences. Autocatalytic cleavage in cis excised the full-length MTMR, and released trans-acting hammerhead ribozymes. We also evaluated the catalytic features of the MTMR using large RNA target molecules. Comparison of the kinetic values of the autocatalytically derived MTMR fragments with those of corresponding mono-ribozymes demonstrated an MTMR-mediated substrate cleavage without distinct loss in catalytic efficiency. Moreover, the MTMR was stably expressed in the prementioned multidrug-resistant cancer cell lines, and decreased the targeted transcripts about 97% (MDR1), 80% (MRP2), and 96% (BCRP) as well as the corresponding protein levels, respectively. Cellular MDR could be reverted about 70% (A2780RCIS), 95% (257RNOV), and 100% (257RDB). Additionally, the MTMR reversed mitoxantrone accumulation entirely, and daunorubicin accumulation about 90% in stomach carcinoma cells, respectively. Taken together, the MTMRs capability of simultaneous silencing of multiple genes provides an effective instrument to knockdown genes of interest.

Keywords: RNA technology, Ribozymes, ABC transporter, MDR, ABCG2, ABCC2, ABCB1

Freudig war, vor vielen Jahren,
Eifrig so der Geist bestrebt,
Zu erforschen, zu erfahren,
Wie Natur im Schaffen lebt.
Und es ist das ewig Eine,
Das sich vielfach offenbart:
Klein das Große, groß das Kleine,
Alles nach der eignen Art,
Immer wechselnd, fest sich haltend,
Nah und fern und fern und nah,
so gestaltend, umgestaltend -
Zum Erstaunen bin ich da.

J. W. Goethe

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23.08.2006