Prof. Dr. Christoph Markschies
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

• 1 Einleitung

  • 1.1  Chemotherapeutische Behandlung maligner Tumoren

    • 1.1.1  Daunorubicin und Mitoxantron

    • 1.1.2 Cisplatin

  • 1.2 Chemoresistenzen von Tumorzellen

    • 1.2.1  Bedeutung von ABC-Transportern

    • 1.2.2 Die ABC-Transporter MDR1/P-Gp, BCRP und MRP2

      • 1.2.2.1  MDR1/P-Gp/ABCB1

      • 1.2.2.2 BCRP/ABCG2

      • 1.2.2.3 MRP2/ABCC2

    • 1.2.3 Tumorzellinien als Untersuchungsmodelle für Resistenzmechanismen

  • 1.3 RNA-Technologien zur Genregulation

    • 1.3.1  Antisense-Oligodesnukleotide (AS-ODN)

    • 1.3.2 RNA-Interferenz

    • 1.3.3 Ribozyme

      • 1.3.3.1  Hammerhead-Ribozyme

        • 1.3.3.1.1  Hammerhead-Ribozym-Spaltung in cis und in trans

      • 1.3.3.2 Kinetische Charakterisierung von Ribozymen

  • 1.4 Zielstellung der Arbeit

• 2 Material und Methoden

  • 2.1  Material

    • 2.1.1  Geräte

    • 2.1.2 Verbrauchsmaterial

    • 2.1.3 Chemikalien

    • 2.1.4 Radionukleotide

    • 2.1.5 Enzyme

    • 2.1.6  Kits

    • 2.1.7 Synthetisierte DNA-Sequenzen

    • 2.1.8  Plasmide

    • 2.1.9 Lösungen und Puffer

    • 2.1.10 Medien für die Bakterienkultur

    • 2.1.11 Medien für die Kultur eukaryotischer Zellen

    • 2.1.12 Software

  • 2.2 Methoden

    • 2.2.1  Molekularbiologische Methoden

      • 2.2.1.1  Präparation von Plasmid-DNA

      • 2.2.1.2 Bestimmung der Konzentration von Nukleinäure-Lösungen

      • 2.2.1.3 Elektrophoretische Auftrennung von DNA

      • 2.2.1.4 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

      • 2.2.1.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)

      • 2.2.1.6 Sekundärstrukturanalyse von RNA

      • 2.2.1.7 Herstellung der Substrat-DNA-Matrices

      • 2.2.1.8 Herstellung der MTMR-DNA-Matrix

      • 2.2.1.9  In vitro-Transkription

      • 2.2.1.10 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

      • 2.2.1.11 Elution in vitro-transkribierter RNA

      • 2.2.1.12 Quantifizierung radioaktiv markierter RNA

      • 2.2.1.13  In vitro-RNA-Prozessierung

      • 2.2.1.14 Berechnung der Reaktionsparameter der ribozymatischen Substratspaltung

        • 2.2.1.14.1  Initialgeschindigkeit und beobachtete Spaltrate

        • 2.2.1.14.2 Der Reaktionsparameter k_cat/k_M und ∆S

      • 2.2.1.15 Präzipitation von DNA

      • 2.2.1.16 Klonierung des MTMR

      • 2.2.1.17 Sequenzierung

      • 2.2.1.18 RNA-Isolation

      • 2.2.1.19 Reverse Transkription

      • 2.2.1.20 Quantitative real-time RT-PCR

      • 2.2.1.21 Protein-Isolation

      • 2.2.1.22 Quantifizierung von Proteinlösungen

      • 2.2.1.23 Western Blot

      • 2.2.1.24 Entwicklung von Filmen

      • 2.2.1.25 Dokumentation

    • 2.2.2 Mikrobiologische Methoden

      • 2.2.2.1  Kultur von Bakterien

      • 2.2.2.2 Transformation von Bakterien

    • 2.2.3 Arbeit mit eukaryotischen Zellen

      • 2.2.3.1  Kultivierung humaner Zellen

      • 2.2.3.2 Einfrieren von Zellen

      • 2.2.3.3 Transfektion von Zellen

      • 2.2.3.4 Resistenzbestimmung

      • 2.2.3.5 Akkumulation von Zytostatika in Zellen

      • 2.2.3.6 Immunzytochemische Lokalisation der ABC-Transporter

• 3 Ergebnisse

  • 3.1  Entwicklung eines Multitargetmultiribozymes und Applikation im zellfreien System

    • 3.1.1  Auswahl der MTMR-Sequenz

    • 3.1.2 Autokatalyse des MTMR

    • 3.1.3 Multitargetspaltung der Substrate MDR1sub, BCRPsub, MRP2sub

    • 3.1.4 Abhängigkeit der MTMR-vermittelten Substratspaltung von der Zeit

      • 3.1.4.1  Initialgeschwindigkeit (v_ini) und beobachtete Spaltrate (k_obs) der Reaktion

    • 3.1.5 Abhängigkeit der MTMR-vermittelten Substratspaltung von der MTMR-Konzentration

    • 3.1.6 Der Reaktionsparameter k_cat/k_M

  • 3.2  Anwendung des MTMR in verschiedenen Zellsystemen

    • 3.2.1  Klonierung des MTMR

    • 3.2.2 Expression des MTMR in stabilen Transfektanten

    • 3.2.3 Zelluläre Effekte der MTMR-Expression

      • 3.2.3.1  Expression der ABC-Transporter

        • 3.2.3.1.1  Quantitative Analyse der ABC-Transporter mRNA-Expression

        • 3.2.3.1.2 Effekt des MTMR auf die ABC-Transporter Proteinexpression

    • 3.2.4 Zytotoxizität der Ausgangszellinien und Transfektanten gegenüber verschiedenen Zytostatika

    • 3.2.5 Akkumulation verschiedenener Zytostatika in Ausgangszellinien und Transfektanten

• 4 Diskussion 

  • 4.1  Idee und Hintergrund der Multitarget-Spaltung

    • 4.1.1  Das Multitargetmultiribozym-Reaktionssystem

    • 4.1.2 Konstruktion des MTMRs

    • 4.1.3 Auswahl der Ziel-RNA-Sequenzen

  • 4.2 Aktivität des in vitro-transkribierten MTMR

    • 4.2.1  Bewertung des in vitro-transkribierten MTMRs im zellfreien System

  • 4.3  Anwendung des MTMRs in verschiedenen Zellsystemen

    • 4.3.1  Etablierung stabiler MTMR- und Kontroll-Transfektanten der Zellinien 257RNOV, 257RDB und A2780RCIS

      • 4.3.1.1  Auswahl des Vektorsystemes und Klonierung der MTMR-Sequenz

      • 4.3.1.2 Generierung stabiler Transfektanten

    • 4.3.2 Funktionelle Untersuchungen der Transfektanten

      • 4.3.2.1  Resistenzverhalten der Transfektanten

      • 4.3.2.2 Akkumulationsverhalten der Transfektanten

    • 4.3.3 ABC-Transporter-„Restaktivität“ und alternative MDR-Mechanismen

  • 4.4 Ribozyme versus Antisense-Technologie und RNAi

  • 4.5 Ausblick

• Literaturverzeichnis

• Abkürzungen und Kurzdefinitionen

• Danksagung

• Lebenslauf

• Publikationen

• Selbständigkeitserklärung

• Tabelle 1: Chemotherapeutika-transportierende ABC-Transporter

• Tabelle 2: Plasmide

• Tabelle 3: Eukaryotische Zellen

• Tabelle 4: PCR-Ansätze

• Tabelle 5: Detailangaben für verschiedene PCRs

• Tabelle 6: Reaktionsbedingungen bei der RNA-Prozessierung in vitro

• Tabelle 7: Antikörper für Western Blots

• Tabelle 8: Konzentrationen der im Proliferationsversuch eingesetzten Zytostatika

• Tabelle 9: Funktionelle Domänen des anti-ABC-Transporter-MTMR

• Tabelle 10: Identifikation der Autokatalyseprodukte MTMRa-e (Kowalski et al., 2005).

• Tabelle 11: Kinetische Parameter von MTMR-Fragmenten und Monoribozymen (nach Kowalski et al., 2005)

• Tabelle 12: ABC-Transporterexpression in MTMR-exprimierenden Zellinien

• Tabelle 13: IC₅₀-Werte und Resistenzfaktoren der untersuchten Zellinien

• Tabelle 14: Relative Stärken und Schwächen verschiedener RNA-Technologien

• Abbildung 1: Strukturformeln von Daunorubicin (A) und Mitoxantron (B)

• Abbildung 2: Strukturformel von Cisplatin

• Abbildung 3: Mechanismen der Chemoresistenz (verändert nach Gottesman, 2002)

• Abbildung 4: RNA-Technologien zur Geninhibition (verändert nach: Kurreck, 2003)

• Abbildung 5: Struktur eines Hammerhead-Ribozymes

• Abbildung 6: Ribozymatische Spaltung in cis und in trans

• Abbildung 7: Wege der Ribozymreaktion (nach Stage-Zimmermann and Uhlenbeck, 1998)

• Abbildung 8: Schematische Darstellung des MTMR

• Abbildung 9: Sekundärstruktur des MTMR

• Abbildung 10: In vitro Transkription der Substrat-RNAs und des MTMR

• Abbildung 11: Autokatalyse des MTMR

• Abbildung 12: Spezifische Spaltung des Substrates MDR1sub durch die MTMR-Fragmente MTMRa-e

• Abbildung 13: Spezifische Spaltung des Substrates BCRPsub durch die MTMR-Fragmente MTMRa-e

• Abbildung 14: Spezifische Spaltung des Substrates MRP2sub durch die MTMR-Fragmente MTMRa-e

• Abbildung 15: MTMR vermittelte Spaltung von der Substrat-RNAs in Abhängigkeit von der Reaktionszeit

• Abbildung 16: Der Reaktionsparameter k_obs für die Katalyse der Substrat-RNAs

• Abbildung 17: Konzentrationsabhängige Reaktionskinetiken der Katalyse der Substrat-RNAs

• Abbildung 18: Molarer Stoffumsatz der MTMR-vermittelten Substratspaltung

• Abbildung 19: Der Reaktionsparameter k_cat/k_M für die Katalyse der Substrat-RNAs

• Abbildung 20: Vektorkarte von pIRES2/MTMR (Vekorkarte online unter: www.bd.com)

• Abbildung 21: Aldolase- und Vektor-spezifische RT-PCRs

• Abbildung 22: Quantifizierung der ABC-Transporter mRNAs

• Abbildung 23: Bestimmung des ABC-Transporter-Proteingehaltes durch Western Blots

• Abbildung 24: Immunzytochemische Detektion der ABC-Transporter

• Abbildung 25: Zytotoxitität der untersuchten Zellinien

• Abbildung 26: Akkumulation von Daunorubicin und Mitoxantron