Deutsches Herzzentrum Berlin
Stiftung des Bürgerlichen Rechts

DISSERTATION

Isolierung und Kryokonservierung von vaskulären Zellen aus menschlichen Nabelschnurgefäßen für das
Tissue Engineering von kardiovaskulären Geweben (Herzklappen)

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von

Liv Krämer

Berlin

Gutachter:
1. Priv.-Doz. Dr. med. Jürgen Ennker
2. Prof. Dr. med. Dr. h.c. mult. Roland Hetzer
3. Prof. Dr. med. Theodor Fischlein

Datum der Promotion: 15. April 2005

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Allgemeine Einleitung
  • 1.2  Tissue Engineering (TE)
    • Allgemeiner Teil
    • Zellquelle
  • 1.3  Fragestellung
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Zellkultur
    • Zellgewinnung
    • Gewinnung von Endothelzellen
    • Gewinnung von Myofibroblasten
  • 2.2  Kryokonservierung
    • Kryokonservierung der Zellkultur
    • Kryokonservierung der gesamten Nabelschnur
  • 2.3 Auftauprozess
    • Auftauen der Zellkulturen
    • Auftauen der Nabelschnüre
  • 2.4 Methoden der Zellidentifikation
    • Identifikation mittels Zellmorphologie
    • Identifikation mittels Immunfluoreszenz
    • Wachstumsverhalten der Zellkulturen
  • 2.5  Herstellung der Polymerkonstrukte
    • Gerüstmaterial
    • Klappenherstellung
    • Zellbesiedlung
    • Versuchsaufbau
  • 2.6  Evaluation der Konstrukte
    • Histologie
    • Immunhistochemie
    • Elektronenmikroskopie
    • Quantifizierung des Kollagen-Gehaltes
    • Strukturelle und funktionelle Untersuchungen von kryokonservierten Zellen und dem besiedelten Herzklappenkonstrukten
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Zellkultur
    • Zellgewinnung
    • Morphologie der gewonnen Zellen
    • Identifikation mittels indirekter Immunfluoreszenz
    • Wachstumsverhalten der Zellkulturen
  • 3.2  Herstellung der Polymerkonstrukte
    • Gerüstmaterial
    • Klappenherstellung
    • Klappenbesiedlung
    • Bioreaktor und dynamische Zellkonditionierung
  • 3.3  Evaluierung der Konstrukte
    • Histologie und Immunhistochemie
    • Elektronenmikroskopie
    • Untersuchungen auf Kollagen-Gehalt
    • Strukturelle und funktionelle Untersuchungen von kryokonservierten Zellen und dem besiedelten Herzklappenkonstrukten
• 4  Diskussion
• 5  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Erklärung an Eides Statt

Bilder

• Abb. 1 :
  Beispiel für eine mechanische Klappe (St. Jude Medical)
• Abb. 2
  A. Abbildung einer biologischen Herzklappe B. Klappe mit degenerativen Klappensegeln
• Abb.3
  Das Prinzip des Tissue Engineerings: 1. Isolierung der autologen Zellen 2. Kultivierung 3. Besiedlung auf ein geeignetes Polymer  4. Konditionierung und evtl. 5. Reimplantation
• Abb.4
  (Steinhoff et al.)  Besiedelte dezellularisierte xenogene Herzklappe 12 Wochen nach Implantation
• Abb.5
  Das Prinzip des Tissue Engineerings von humanen Nabelschnurzellen 1. Zellgewinnung 2. Kultivierung 3. Kryokonservierung 4. Besiedlung auf ein Herzklappenpolymer
• Abb.6
  Isolierung der Zellen aus der frischen Nabelschnur
• Abb.7
  Kryokonservierung der gesamten Nabelschnur und nach dem Auftauprozess Isolierung der Zellen
• Abb.8
  Zellen werden aus der Nabelschnur isoliert und die Zellkultur wird eingefroren
• Abb.9
  „Mincing technique“ der mesenchymalen Zellen aus der Nabelschnurarterie
• Abb.10
  Querschnitt durch das Polymer (P4HB) Erkennbar ist eine poröse Struktur, in das die Zellen hineinwachsen können.
• Abb.11
  A) Negativform der Herzklappe von der Ventrikelseite betrachtet B) Seitliches Bild der Negativform mit den „Sinus of Valsalva“
• Abb.12
  Herstellung der Klappenform aus dem Polymermaterial 1. Zugeschnittene Polymere werden um das Stereolithographiemodell gelegt und durch punktuelle Wärme mittels Lötstab an den Rändern adaptiert 2-3. Mittels der Abdrucktechnik wird die Klappe geformt
• Abb.12
  Fertiges Herzklappenkonstrukt mit aufgenähtem Silikonadapter  1. “Sinus of Valsalva” 2. Konduit 3. Silikonadapter
• Abb.13
  Besiedelte Klappe zur Inkubation im Polyethylenbehälter
• Abb.14 Skizze des Bioreaktors (1) mit Überlaufbehälter (2), Pumpe (3) und Inkubator (4) (rosa: Medium; schwarz: Luft)
• Abb.15
  Versuchsanordnung des Klappenbioreaktors;  1.Bioreaktor 2. Reservoir 3. Schlauchsystem zur Pumpe 4. Inkubator
• Abb.16
  Adhärierte Endothelzellen 24h nach Isolation
• Abb.17
  Konfluente Endothelzellmonolayer mit dem typischen pflastersteinartigen Muster
• Abb.18   Auswachsen der Zellen aus dem Gewebe
• Abb.19
  Konfluente Myofibroblasten mit typischem „fischschwarm“ ähnlichem Muster
• Abb.20
  Von-Willebrandt-Faktor in der indirekten Immunfluoreszenz Frische und kryokonservierte Endothelzellmonolayer (H UVEC, human umbilical vein endothelial cells) wurden in der 3. Passage mit monoclonalem Anti-von-Willebrandt-Faktor-Antikörpern (grüne Fluoreszenz) markiert und mit DAPI als Kontrolle (blaue Fluoreszenz) dargestellt. In frischen und eingefrorenen HUVECs: Darstellung der zytoplasmatischen Lokalisation des von-Willebrandt-Faktors und des Zellkerns. (bar 100µm)
• Abb.21
  Konfluente frische und kryokonservative Endothelzellen der 3.Passage, markiert mit dem CD 31 Marker (grüne Fluoreszenz) und der DAPI Anfärbung als Kontrolle; starke Signalintensität beider Gruppen. In frischen und eingefrorenen HUVECs Darstellung von CD 31 und des Zellkerns. (bar 100µm)
• Abb.22
  Darstellung von endogenem α-Aktin  Konfluente Myofibroblasten der dritten Passage wurden mit monoklonalem Anti-α-Aktin Antikörpern markiert (grüne Fluoreszenz). Als Kontrolle diente das Phasenkontrastbild derselben Zellen. In frischen und eingefrorenen Myofibroblasten Darstellung der fibrillären Lokalisation des α-Aktin. (bar 100µm)
• Abb.23
  Darstellung von Kollagen IV. Konfluente Myofibroblasten der dritten Passage wurden mit monoklonalem Anti-Kollagen-IV Antikörpern markiert (grüne Fluoreszenz). Als Kontrolle diente das Phasenkontrastbild.(bar200µm)
• Abb.24 Darstellung von Fibronektin als dünne Fasern. Konfluente Myofibroblasten der dritten Passage wurden mit monoklonalem Anti-Elastin Antikörpern markiert (grüne Fluoreszenz). Als Kontrolle diente das Phasenkontrastbild.
• Abb.25
  Wachstumskinetik der Endothelzellen aus humanen Nabelschnüren Die dritte Passage der Endothelzellen isoliert aus frischen (Gruppe A, n=14), kryokonservierten Nabelschnüren (Gruppe B, n=3) und aus kryokonservierten Zellkulturen (Gruppe C, n=8). Die Zellen wurden auf 6 Plattenvertiefungen in einer Konzentration von 1,0x10⁵ Zellen ausgesät und über 6 Tage kultiviert. Jeden Tag wurden die Zellen mit Trypanblau angefärbt und in der Neubauer-Zählkammer gezählt.
• Abb.26
  Wachstumskinetik der Myofibroblasten aus humanen Nabelschnüren  Dargestellt ist die dritte Passage der Zellen isoliert aus frischen (Gruppe A, n=7) und aus kryokonservierten Zellkulturen (Gruppe C, n=5). Gruppe B wurde in der Graphik nicht berücksichtigt, weil keine Zellen aus dem Explantatstück auswuchsen. Die Daten wurden als „standard of the mean“ dargestellt. P<0,051 am 6.Tag ergab keinen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe.
• Abb.27
  Eine makroskopische Aufsicht des P4HB Polymers (Ausschnitt)
• Abb.28
  Hergestelltes Klappenkonstrukt aus porösem P4HB  -A. Seitliche Ansicht B. Aortale Ansicht mit Blick auf die Segel
• Abb.29
  Besiedelte Klappe mit gelblich schimmernder Oberfläche. Pinzettenspitze zeigt auf die Segel.
• Abb.30
  Im Bioreaktor eingebrachtes Klappengerüst (mit Pfeil gekennzeichnet)
• Abb.31
  A. HE-Färbung der dynamisch im Bioreaktor konditionierten Klappen (Vergrößerung 4x ). Es sind mehrschichtige Zelllagen auf den Oberflächen des Polymers und ins Innere einwachsende Zellen erkennbar.(Pfeil)   B. HE-Färbung der statisch geführten Klappen (Vergrößerung 10x). Nur vereinzelte ein- bis zweischichtige Zelllagen und kaum ein Wachstum ins Innere des Polymers ist sichtbar.
• Abb.32
  Positiver Kollagen I Nachweis der dynamisch geführten Klappen in der immunhistochemischen Färbung  (grau: Polymer; lila: Kollagen I)
• Abb.33
  Positiver Kollagen IV Nachweis der dynamisch geführten Klappen in der immunhistochemischen Färbung  (grau: Polymer; lila/ blau: Kollagen IV)
• Abb.34
  Positiver Fibronectin Nachweis der dynamisch geführten Klappen in der immunhistochemischen Färbung. Das Polymer ist teilweise bereits resorbiert. (10 fache Vergrößerung) (grau: Polymer; lila: Fibronectin)
• Abb.35
  Positiver α-Aktin Nachweis der dynamisch geführten Klappen in der immunhistochemischen Färbung  (grau: Polymer; rosa: α-Aktin) (20 fache Vergrößerung)
• Abb.36
  Nur schwach positiver Nachweis von Kollagen I bei der immunhistochemischen  Untersuchung der statischen Klappen (grau:Polymer; blau:Kollagen I Nachweis)
• Abb.37
  Schwach positiver Nachweis von Fibronektin bei der immunhistochemischen  Untersuchung der statisch belassenen Klappe. Beginnende Resorbtion des Polymers ist sichtbar  (10 fache Vergrößerung)
• Abb.38
  A. Elektronenmikroskopische Aufnahme der dynamisch geführten Klappe mit mehrschichtigen Zellverbänden Ein Einwachsen der Zellen ins Polymerinnere ist erkennbar (Pfeil zeigt auf Zellen)  B. Elektronenmikroskopische Aufnahme der statisch geführten Klappe mit nur einschichtiger Zelllage auf der Oberfläche des Polymers (Pfeil zeigt auf Zellen)
• Abb.39
  Kollagengehalt der statischen und dynamischen Klappe im Vergleich
• Abb.40
  Ca-Antwort auf 10 µM Histamin in kultivierten Endothelzellen und Myofibroblasten aus der frischen und eingefrorenen Nabelschnur. Bei beiden wurde kein Unterschied in ihrer Antwort auf Histaminstimulierung festgestellt
• Abb.41
  Ca-Antwort auf 10 µM Histamin in unbesiedelten und mit Fibroblasten besiedelten Klappenpolymeren. In den nicht besiedelten Klappen sind die Einzelfasern des Polymergerüsts sichtbar (weiße Pfeile). In den besiedelten Klappen lagerten sich die Zellen an den Fasern des Gerüstes an (weißer Pfeil). Auf Stimulation mit Histamin zeigten sie eine vergleichbare [Ca²⁺]_i-Antwort wie die kultivierten Zellen.
• Abb.42
  Die weitgehend glatte Oberfläche des verwendeten Polymers P4HB
• Abb.43
  Die Zellen sind auf der Oberfläche des Polymers sichtbar, allerdings mit nur losem Kontakt.  Die Zellschichten lösen sich von der Oberfläche ab  (Doppelpfeil zeigt die Ablösung der Zellen vom Polymer „peel-off“ Phänomen)   Ein Einwachsen in das Polymerinnere wird kaum beobachtet
• Abb.44
  Hämotoxilin-Eosin Färbung der im Bioreaktor konditionierten Klappe. Der Pfeil deutet auf die mehrschichtigen Zelllagen hin. Ein Einwachsen der Zellen ins Polymerinnere ist zu erkennen (Pfeilspitze)