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1  Einleitung

1.1 Allgemeine Einleitung

Kardiovaskuläre Erkrankungen zählen zu den häufigsten Ursachen für die Morbidität und Mortalität in unserer Gesellschaft.1 2

Einen großen Anteil stellen neben Erkrankungen der Herzkranzgefäße und des Herzmuskels die Veränderungen der Herzklappen dar.3 Die Therapie der Wahl besteht heutzutage im operativen Ersatz dieser erkrankten oder abnormen Herzklappen, durch mechanische, biologische Prothesen oder durch sogenannte Homografts.

Im Jahre 1952 wurde die erste erfolgreiche Herzklappenimplantation zuerst in die Aorta descendens durch Hufnagel et al.4 und 1960/62 durch Harken5 und Starr6 in Aorten- und Mitralposition durchgeführt. In den darauf folgenden Jahrzehnten erfolgte eine stetige Verbesserung der Klappenprothesen im Hinblick auf ihre Haltbarkeit und Funktionalität.7

Die mechanischen Klappenprothesen (Abb.1) zeichnen sich durch ihre gute Hämodynamik und insbesondere durch ihre lange Haltbarkeit aus.8 Nach Implantation entsteht jedoch das Problem der Thrombogenität und der daraus lebenslang notwendigen Antikoagulation des Patienten. Daraus ergibt sich ein erhöhtes Risiko in bezug auf eine verstärkte Blutungsneigung und den damit verbundenen Problemen.9 Ein weiterer limitierender Faktor eines mechanischen Klappenersatzes ist die infektiöse Endokarditis und dem damit verbundenen Klappenversagen.10 11

Abb. 1 :
Beispiel für eine mechanische Klappe (St. Jude Medical)


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Neben den mechanischen werden auch biologische Prothesen zum Klappenersatz verwendet. Diese Klappen werden aus tierischem (Xenograft) oder aus menschlichem Gewebe hergestellt (Homograft).12

Xenografts (Abb.2) bestehen typischerweise aus schweineaortalem Gewebe oder aus Rinderperikard.13 Sie sind häufig zusätzlich chemisch mit Gluteraldehyd behandelt, um ihre Haltbarkeit zu erhöhen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Klappen besteht in dem Verzicht auf einer lebenslangen Antikoagulation, da Bioprothesen ein geringeres thrombogenes Potential besitzen. Ein wichtiger Nachteil ist ihre geringe durchschnittliche Haltbarkeit von 10-15 Jahren.14

Abb. 2
A.
Abbildung einer biologischen Herzklappe B. Klappe mit degenerativen Klappensegeln

Kryokonservierte Homografts oder funktionsfähige Klappen z.B. Spenderherzen, die nicht für die Transplantation verwendet werden, finden ebenfalls Anwendung als Klappenersatz. Wie bei den Xenografts ist auch bei den Homografts keine Antikoagulation notwendig.15

Ein wichtiger Nachteil dieser Art des Klappenersatzes besteht in ihrer begrenzten Verfügbarkeit.16 Einige Studien berichten über das Versagen von Homograftklappen bei Kindern,17und Yankah et al. beschreibt immunologische Reaktionen bei diesen Verfahren.18


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All den verwendeten Herzklappenprothesen oder Homografts ist gemeinsam, dass sie aus fremden, nicht autologem Gewebe bestehen und somit auch kein Wachstums- bzw. Regenerationspotential aufweisen.19 Eine besondere Gruppe stellen pädiatrische Patienten dar. Sie haben ihr Größenwachstum noch nicht abgeschlossen und benötigen deshalb häufig Korrekturoperationen, um die Größe der Klappen ihrem Wachstum anpassen zu können.20

So existiert bis zum jetzigem Zeitpunkt keine ideale Herzklappenprothese, die nicht antikoaguliert, resistent gegenüber Infektionen ist, sich in das umgebende Gewebe gut integriert, mitwächst und letztendlich eine gute hämodynamische Funktion hat.21


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1.2  Tissue Engineering (TE)

Allgemeiner Teil

Ein möglicher Ansatz zur Überwindung der genannten Limitationen in der Behandlung von Gefäß- und Herzklappenerkrankungen stellt das Tissue Engineering von kardiovaskulärem Gewebe dar.

Das Prinzip des Tissue Engineerings besteht darin, aus körpereigenen Zellen einen funktionalen und vitalen Gewebe- und Organersatz herzustellen, um erkrankte oder zerstörte Organe und Gewebe zu ersetzen.22

Dabei werden Zellen, in unserem Modell vom Patienten selbst (autolog) isoliert, kultiviert, auf ein resorbierbares Gerüst besiedelt und in-vitro zu einem funktionellen Zell-Gerüst-Konstrukt konditioniert.

Abb.3
Das Prinzip des Tissue Engineerings:
1. Isolierung der autologen Zellen 2. Kultivierung 3. Besiedlung auf ein geeignetes Polymer
4. Konditionierung und evtl. 5. Reimplantation


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Aktuell beschäftigen sich weltweit mehrere Forschungsgruppen mit diesem Konzept. Ihre Arbeiten unterscheiden sich in der Wahl der Gerüstmaterialien und der Zellquellen.23

Das funktionale und physiologische Design und die Auswahl des geeigneten Polymergerüstes als Stützgerüst für die Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die Entwicklung von „tissue engineerten“ Konstrukten wie z.B. der Herzklappe.

Bei der Verwendung von dezellularisierter, xenogener Matrix,24 welche mit Spenderzellen besiedelt wird, besteht einerseits der Vorteil, dass man ein nahezu perfektes Klappendesign übernimmt und mit guten hämodynamischen Bedingungen rechnen kann. Andererseits scheint es, als ob die aufgebrachten vaskulären Zellen nicht in das Innere der Matrix hineinwachsen können. Erste vielversprechende Ergebnisse werden von Bader et al.25 sowie Steinhoff et al.26 demonstriert. Das diese Matrix im unbesiedelten Zustand nicht unproblematisch ist, hat die Arbeit von Simon et al. gezeigt. Hier wurden unbesiedelte, dezellularisierte, xenogene Herzklappengerüste mit fatalen Folgen implantiert.27 Diese Versuche zeigen die Wichtigkeit der Zellbesiedlung und der in-vitro Konditionierung vor der eigentlichen Implantation, um eine genügende Gewebeentwicklung schon vorab zu erreichen.

Abb.4
(Steinhoff et al.)
Besiedelte dezellularisierte xenogene Herzklappe 12 Wochen nach Implantation


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Ein weiterer Ansatz stellt die Verwendung biologischer Matrix dar. Einer der möglichen Anwendungen wurde z.B. in der Arbeit von Ye et al. beschrieben. Hier wurde der Gebrauch von Fibringel für das Tissue Engineering demonstriert. Dieses Fibringel ist ein biologisch abbaubares Polymer, welches aus Blut des Patienten selbst hergestellt werden kann. Ye et al. beschrieb die Herstellung eines Zell-Fibringel-Konstruktes aus einer Suspension humaner aortaler Myofibroblasten und einer Fibrinogen-, Thrombin- und Calciumcloridlösung, welche dann polymerisiert wurde.28 Schließlich wurde daraus eine dreisegelige Herzklappe hergestellt.29

Bei einer weiteren Methode des Tissue Engineerings werden resorbierbare Polymere verwendet. Dabei werden Zellen isoliert, mittels Zellkultur vermehrt (expandiert) und auf resorbierbare Polymergerüste besiedelt. Diese Gerüste geben den aufgebrachten Zellen eine dreidimensionale Struktur vor. Während die Zellen eine extrazelluläre Matrix synthetisieren, sollte das Polymergerüst im Idealfall im gleichen Maße resorbiert werden. Bisher konnte dieses Konzept bei Geweben wie Knorpel, Gefäßen, Herzklappensegeln, Darm, Leber und zahlreichen anderen Geweben experimentell erfolgreich angewendet werden. 30 31 32 33

Die entstehenden Konstrukte würden aus körpereigenem Gewebe bestehen und normalen biologischen Mechanismen unterliegen, wie dem des Umbaus, des Wachstums und des Regenerierens. Da es sich um autologen Gewebeersatz handelt, hätten sie theoretisch auch das Potential, sich in das umgebende Gewebe zu integrieren und eine funktionale und lebendige Gewebestruktur zu bilden, dessen Haltbarkeit verlängert wäre. Dieses Konstrukt hätte theoretisch die gleichen funktionellen Eigenschaften wie natürliches Gewebe.

Bei diesen verwendeten Polymeren muss eine gewisse mechanische Stabilität vorhanden sein, ebenso wie eine poröse Oberfläche, in deren Zwischenräume die Zellen einwachsen und sich die extrazelluläre Matrix bilden kann. In einem der ersten Experimente von Shinoka et al. wurde versucht, aus solchem Material ein tissue engineertes Herzklappensegel herzustellen. Ein resorbierbares Polymer wurde mit Zellen des gleichen Schafes besiedelt, in dem das besiedelte Segelkonstrukt in posteriorer Position der Pulmonalisklappe implantiert wurde.34 Nach 6 Wochen in vivo hatte sich dieses Polymer komplett resorbiert und an derselben Stelle hatte sich ein vitales Gewebe gebildet.35 Als Segelgerüst diente ein kombiniertes Polymer-Gerüst aus PLA (polylactic acid), welches von beiden Seiten mit einem PGA-Gerüst [polyglycolic acid (92% glycolic und 8% lactic acid)] ummantelt war. Das Problem bestand darin, dass sich dieses verwendete Polymer verdickte und zu steif wurde. Somit war es nicht möglich, eine nicht stenotische dreiseglige Klappe aus diesem Gerüstmaterial herzustellen. [Seite 9↓]Basierend auf diesen Erfahrungen wurden verschiedene Polymergemische ausprobiert,36 37 die ausreichende mechanische Eigenschaften aufweisen und sich im gleichen Masse resorbieren können. Ebenso konnte sich eine suffiziente extrazelluläre Matrix bilden.

In einem weiteren Schritt entwickelte die Arbeitsgruppe in Boston ganze dreisegelige Klappenprothesen aus verschiedenen resorbierbaren Polymergerüsten38 und implantierte diese nach der Zell-Besiedlung in ein Tiermodell.39 Durch die Wahl eines neuartigen Polymers und die Verbesserung der Polymereigenschaften wurde versucht, den autologen Zellen ein mechanisches Gerüst zur Verfügung zu stellen, auf denen sie adhärieren und die extrazelluläre Matrix bilden können. Voraussetzung ist hier eine gewisse Oberflächenbeschaffenheit, so dass die Zellen auch während des Blutflusses adhärent bleiben.

Zuerst wurden diese Klappen vorwiegend statisch konditioniert. Anschließend wurde versucht, diese Klappen unter Druck und Flussbedingungen in sogenannten Bioreaktoren zu konditionieren.40 Mit Hilfe dieser dynamischen Kultivierung sollte vor der eigentlichen Implantation durch pulsatilen Druck und Fluss eine bessere Adhärenz der Zellen mit Einwanderung ins Innere des Polymers und Bildung der extrazellulären Matrix erreicht werden. Auf diese Art und Weise konnten in-vitro vitale Klappen hergestellt werden, bei denen eine Gewebeentwicklung und eine Polymerresorption im Laufe der Zeit nachgewiesen werden konnten. Diese so hergestellten Konstrukte entsprachen histochemisch als auch biomechanisch einem natürlichen Klappengewebe.38

Zur weiteren Verbesserung der hämodynamischen Eigenschaften wurde versucht, ein naturgetreues Klappendesign nachzuahmen. Um die Form einer dreiseglige Herzklappe zu erhalten, wurde zunächst eine in der Klinik verwendete Polyurethanklappe als Vorlage für die Herstellung einer zweiteiligen Aluminiumform benutzt. Mit Hilfe dieser Form konnte das resorbierbare Polymer gelegt und zu einer Klappe geformt werden.41 Zur weiteren Optimierung des Klappendesigns wurde eine menschliche Homograft- Herzklappe mittels der Computertomographie erfasst. Aus den daraus ermittelten Daten wurde mit Hilfe eines speziell dafür entwickelten Computerprogramms eine dreidimensionale Rekonstruktion dieser Herzklappe erstellt. Anschließend wurde mit Hilfe der 3-D-Rekonstruktion ein so genanntes Stereolithographiemodell erstellt, woraus schließlich eine naturgetreue Kopie als Negativform gefertigt wurde.42

Mittels dieser hergestellten Form konnte die naturgetreue dreisegelige Herzklappennachbildung konstruiert werden.43


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Mit diesem Verfahren war es möglich, eine menschliche Herzklappe nachzubilden und statt eines zylindrischen Konduits, Herzklappengerüste zu verwenden, die der anatomischen Struktur von humanen Herzklappen nachempfunden sind.

Zellquelle

Eine Möglichkeit der Gewebeentnahme stellt die Biopsie dar. Hierbei kann man kleine Gewebeproben der jeweiligen autologen Zellen entnehmen und sie in-vitro kultivieren. Bei einigen Organen und Geweben erweist sich die Entnahme in Form einer Biopsie als extrem schwierig, z.B. bei der Herzklappe. So behilft man sich mit der Verwendung anderer vaskulärer Zellen, insbesondere Fibroblasten und glatter Muskelzellen. Diese sind für die Bildung der extrazellulären Matrix notwendig, welche für die mechanische Beanspruchung der tissue engineerten Herzklappe unabdingbar ist.44

Zur Verfügung stehende vaskulären Zellquellen für das Tissue Engineering sind z.B. arterielle Myofibroblasten aus der Aorta.45 Auch venöse Myofibroblasten stellen eine Zellquellalternative dar.46 Diese werden z.B. aus einem Teil der Vena saphena magna entnommen, so dass nur ein kleiner chirurgischer Eingriff nötig ist.

Eine weitere mögliche alternative Zellquelle Zellen stellen humane mesenchymale Progenitorzellen dar.47 Bei den aus dem Knochenmark stammenden Zellen wurde demonstriert, dass sie in der Lage sind, sich in verschiedene Zelllinien mesenchymaler Art wie Knochen, Knorpel und Muskel zu entwickeln.48 In Tierversuchen konnten Knochenmarksstammzellen von Schafen, durch Knochenmarkspunktion gewonnen, auf ein Gerüst aufgebracht und in vitro untersucht werden.49 Die Arbeitsgruppe Hoerstrup et al. hat in ersten Versuchen Knochenmarkzellen für das Tissue Engineering von dreisegligen Herzklappen verwendet. Dabei wurde eine Differenzierung dieser Zellen zu Myofibroblasten beobachtet. Diese Versuche wurden jedoch noch nicht an Patienten untersucht, sondern in vitro getestet. 50

Eine weitere Zellquelle wurde in meiner Doktorarbeit evaluiert und stellt die Gewinnung von Zellen aus Nabelschnurgefäßen dar, welche im nachfolgenden Teil ausführlicher erläutert wird.


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1.3  Fragestellung

Auf der Suche nach einer geeigneten Zellquelle für das „Tissue Engineering“ von kardiovaskulären Geweben stellen vaskuläre Zellen aus Nabelschnurgefäßen eine potentielle Alternative zu den bisher genutzten Zellquellen dar.

Im ersten Teil meiner Arbeit beschäftigte ich mich mit der Evaluierung der neuartigen Zellquelle. Von besonderer Bedeutung war hierbei die Entwicklung einer Methode zur Kryokonservierung der vaskulären Nabelschnurzellen bzw. der Nabelschnur selbst und die Charakterisierung der gewonnenen unterschiedlichen Zelltypen. Dieser Ansatz hätte den Vorteil, dass man bei einem Kind, dessen Herzklappenfehler pränatal in der Echokardiographie diagnostiziert wurde, die Zellen aus der Nabelschnur nach der Geburt isolieren, kryokonservieren und schließlich zum idealen OP- Zeitpunkt rekultivieren könnte, um ein geeignetes „tissue engineertes“ Konstrukt herstellen zu können.

In einem zweiten Schritt sollte dieses Herzklappengerüst mit den rekultivierten Zellen besiedelt und zu einem funktionsfähigen Gewebekonstrukt sowohl statisch als auch dynamisch in einem Bioreaktor unter kontrollierten Druck- und Flussbedingungen konditioniert werden. Im Anschluss sollten die so hergestellten Klappenkonstrukte histologisch, immunhistologisch, elektronenmikroskopisch und funktionell untersucht werden.

Abb.5
Das Prinzip des Tissue Engineerings von humanen Nabelschnurzellen
1. Zellgewinnung 2. Kultivierung 3. Kryokonservierung 4. Besiedlung auf ein Herzklappenpolymer


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Dabei wurden drei möglichen Ansätze der Kryokonservierung untersucht.

1. Die Zellen werden aus der frischen Nabelschnur isoliert und kultiviert (Gruppe A) (Kontrollgruppe) (Abb.6).

Abb.6
Isolierung der Zellen aus der frischen Nabelschnur

2. Die Nabelschnur wird als Ganzes kryokonserviert. Die Zellen werden nach dem Auftauen isoliert und kultiviert (Gruppe B). (Abb.7)

Abb.7
Kryokonservierung der gesamten Nabelschnur und nach dem Auftauprozess Isolierung der Zellen


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3. Die Zellen werden gleich aus der Nabelschnur isoliert und dann kryokonserviert.

Abb.8
Zellen werden aus der Nabelschnur isoliert und die Zellkultur wird eingefroren

Die Untersuchungen wurden von der Ethikkommission der medizinischen Fakultät Charité genehmigt. Der Ethikantrag liegt der Arbeit bei.


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27.05.2005