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2  Material und Methoden

2.1 Zellkultur

Alle Arbeiten mit der Nabelschnur, den Zellkulturen und der in-vitro Konditionierung wurden unter sterilen Bedingungen unter der Sicherheitswerkbank (Kendro-Heraeus Typ HS12) bzw. in den Inkubatoren (Forma Scientific Forma®Typ 3110) durchgeführt. Im Inkubator herrschte eine Temperatur von 37°C mit zusätzlicher 5% CO²-Begasung und einer Luftfeuchtigkeit von 100%.

Zellgewinnung

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Endothelzellen und gemischte Zellkulturen aus glatten Muskelzellen und Fibroblasten -die vereinfacht im weiteren Text als Myofibroblasten bezeichnet werden- aus humanen Nabelschnurgefäßen isoliert.

Für die Kultivierung der Endothelzellen wurde Medium 199 [Gibco Life Technologies, USA] verwendet, dem vor Gebrauch der Wachstumsfaktor bFGF (bovine fetal growth factor [Sigma, USA]), 10% FCS [Sigma, USA] und 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin [Gibco Life Technologies, USA] zugegeben wurde.

Für die Kultivierung von der gemischten Zellkultur aus glatten Muskelzellen und Fibroblasten wurde Dublecco´s modified Eagle medium (DMEM) [Gibco Life Technologies, USA], 10% FCS [Sigma, USA,] und 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin [Gibco Life Technologies, USA] benutzt.

Unmittelbar nach der Geburt wurde die Nabelschnur in kühlem PBS-Puffer (Gibco) aufbewahrt und innerhalb von 6 Stunden präpariert. Gemäß dem vorliegenden Ethikbericht wurde eine Einverständniserklärung der Mutter eingeholt.

Zur Isolierung der Endothelzellen aus der Nabelschnurvene wurde eine modifizierte Methode nach Jaffé et al. verwendet.51 Die Nabelschnur wurde mehrfach mit PBS gespült, um etwaige Kontaminationen mit z.B. Blut zu vermeiden. Anschließend wurde sie auf jegliche Anzeichen von Druckstellen oder Verletzungen an der Oberfläche untersucht. Derartige Stellen wurden entfernt, da diese oft zu Schäden an den inneren Oberflächen führen können. Dies würde zu einer Verunreinigung der Zelllinie mit glatten Muskelzellen oder Fibroblasten führen.


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Die Nabelschnur wird mit einem Skalpell in Stücke mit 8-10 cm Länge geschnitten, die Vene mit einer Knopfkanüle katherisiert und anschließend mit PBS gespült.

Für den weiteren Ablauf gab es zwei Ansätze, wie sie im Kapitel „Fragestellung“ beschrieben wurden.

  1. Sofortige Kryokonservierung eines Teils der Nabelschnur und Präparation der Zellen aus dem anderen Teil.
  2. Sofortige Präparation der Zellen aus der gesamten Nabelschnur und anschließende Aufteilung der Zellen in Kryokonservierung bzw. Kultivierung.

Gewinnung von Endothelzellen

Nach Spülung mit PBS wurde das Gefäßlumen mit 0,2% Dispase (Boehringer, Nr.: 295825) aufgefüllt. Das andere Ende der Nabelschnur wurde zuvor mit einer zweiten sterilen Klemme verschlossen. Zur Ablösung der Zellen wurde das Enzym für 30 Minuten bei 37°C im Lumen belassen, bevor es mit dem Medium 199 neutralisiert wurde.

Die Zellsuspension wurde in einem 50 ml Falcon Röhrchen aufgefangen und bei 1200 rpm und 10°C für 10min zentrifugiert (Eppendorf). Der Überstand wurde mit Hilfe einer sterilen Pasteurpipette (Merck) abgesaugt, das Zellpellet mit 4 ml Medium resuspendiert und auf 4-5 Kulturflaschen (25cm², Falcon) verteilt. Im Anschluss wurden die Flaschen auf je 5ml Medium 199 aufgefüllt und bei 37°C unter den oben aufgeführten Standardbedingungen im Inkubator kultiviert. Dem Zellkulturmedium wurde der Wachstumsfaktor bFGF [basic fetal growth factor, Endkonzentration 10ng/ml, Sigma] zugesetzt. Nach 24 Stunden erfolgte ein Medienwechsel.


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Gewinnung von Myofibroblasten

Die Myofibroblasten wurden über die freipräparierten Arterien aus der restlichen Nabelschnur gewonnen. Das präparierte Gefäß wurde in einer Petrischale (10cm² Durchmesser, Sarstedt) longitudinal aufgeschnitten, in 1mm x 1mm große Stücke geschnitten (mincing technique) und auf weitere Petrischalen verteilt. (Abb. 9)

Abb.9
„Mincing technique“ der mesenchymalen Zellen aus der Nabelschnurarterie

Im letzten Schritt wurden die Gewebestücke mit 10-15ml Zellkulturmedium (DMEM, Gibco) (siehe „Zellkultur“) bedeckt und in einen Inkubator gebracht.

Sobald ein Auswachsen der Zellen aus dem explantierten Gefäßanteil mikroskopisch sichtbar war, wurde das Zellkulturmedium erstmalig gewechselt. Dies geschah durch Absaugen des Mediums mit Hilfe einer Pasteurpipette (Merck) und durch Auffüllung mit 10ml Zellkulturmedium.


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2.2  Kryokonservierung

Kryokonservierung der Zellkultur

Die Endothelzellmonolayer wurden mit 10ml PBS gespült und ca. 300μl Enzym Trypsin- EDTA [0.25%, Gibco] wurde in jede Petrischale hinzugegeben. Nach Ablösen der Zellen wurden die Zellen in 5ml Medium 199 suspendiert und in ein 50ml Falconröhrchen [Merck] aufgefangen. Anschließend wurde aus dieser Zellsuspension mittels der Neubauer-Zählkammer die Zellzahl bestimmt, um die Zellen danach bei 10°C 10min lang bei 800rpm zu zentrifugieren. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet mit 1ml Einfriermedium (Medium 199 mit 10% DMSO (Dimethylsulfoxide, Sigma) resuspendiert. Die Endothelzellen wurden in den 1ml Kryoröhrchen [Roth] in einer Konzentration von 1,5-2,5x106 Zellen kryokonserviert. Diese wurden mit Hilfe des Icecube 1610 Computer Einfriergerätes auf -50°C und anschließend auf -120°C mit 1°C/min eingefroren. Nach dem Einfriervorgang, der ca. 1½ Stunden dauerte, wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff für 12 Wochen aufbewahrt.

Bei den Myofibroblasten verfuhr man beim Einfriervorgang in gleicher Weise. Diese wurden aber in einer Konzentration von 0,9-3,5x106 Zellen eingefroren. Als Einfriermedium diente Medium DMEM (Gibco) (siehe „Zellgewinnung) versetzt mit 10% DMSO (Dimethylsulfoxide).

Kryokonservierung der gesamten Nabelschnur

Die frische Nabelschnur (8-10cm Länge) wurde durch Spülen mit PBS von Blutresten befreit und in eine Einfriertüte (Fresenius, Homofreeze) mit 150ml Medium199, versetzt mit 10% DMSO (Dimethylsulfoxide) [Sigma] gebracht. Zuvor wurden die Nabelschnurgefäße über die Knopfkanüle mit dem Medium durchspült. Mit Hilfe des Icecube 1610 Computer Einfriergerätes wurden sie anschließend auf -50°C und dann auf –120°C mit 1°C/min eingefroren. Nach dem 1½ stündlichem Einfriervorgang wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff für 12 Wochen aufbewahrt.

2.3 Auftauprozess

Auftauen der Zellkulturen

Die im Kryoröhrchen [Roth] nach 12wöchiger Kryokonservierung eingefrorenen Zellen wurden bei 37°C im Wasserbad unter vorsichtigem Schwenken max. 2-3min aufgetaut. Unter der sterilen Werkbank wurde die 1ml Zellsuspension mit einer serologischen Pipette (WCP, Berlin) aus dem Kryoröhrchen in die mit Medium gefüllten Zellkulturflaschen pipettiert. Die [Seite 18↓]aufgetaute Endothelzellsuspension wurde in 5-6 mit 4ml Medium 199 gefüllten 25cm² Flaschen gegeben, die Myofibroblastensuspension in 5-6 mit 9ml Medium DMEM gefüllte 75cm² Zellkulturflaschen.

Diese Zellkulturflaschen wurden im Inkubator unter Standardbedingungen bei 37°C kultiviert. Ein Medienwechsel erfolgte nach 24 Stunden wie bereits beschrieben.

Auftauen der Nabelschnüre

Die kryokonservierten Nabelschnüre wurden zügig in ein mit 37°C vorgeheiztes Wasserbad aufgetaut (ca. 5min) und mit PBS gespült, um das restliche Einfriermedium zu entfernen. Die weitere Endothel- und Myofibroblastenisolierung erfolgte wie im obigen Kapitel „Zellisolierung“ beschrieben.

2.4 Methoden der Zellidentifikation

Identifikation mittels Zellmorphologie

Die Morphologie der Endothelzellen und der Myofibroblasten aller drei Gruppen wurden in einem Auflichtmikroskop (Olympus CK2) bei 100facher Vergrößerung betrachtet, beschrieben und fotografiert.

Identifikation mittels Immunfluoreszenz

Die indirekte Immunfluoreszenz wurde von allen Zellarten, den Endothelzellen und den Myofibroblasten der eingefrorenen Nabelschnur, der eingefrorenen Nabelschnurzellen und der Zellen aus der frisch präparierten Nabelschnur durchgeführt.

Dazu wurden runde Glasplättchen (12mm Durchmesser, WCP) verwendet. Diese wurden auf dem Boden der 6cm² Gewebekulturschalen [Sarstedt] ablegt. Auf diese wurden die Zellen in einer Konzentration von 2x105 Zellen ausgesät.

Diese mit Zellen bewachsenen Deckgläser wurden nach Spülung in PBS mit Methanol (5min., -20°C) und Aceton (10sek., -20°C) fixiert und anschließend mit den antigenspezifischen Erst-Antikörpern (1:50-1:1000 verdünnt in PBS) bedeckt. Bei den Endothelzellen wurden Antikörper gegen die humanen Oberflächenantigene CD 31 (PECAM-1), [Sigma] und den von-Willebrand-Faktor [Chemicon] benutzt. Bei den Myofibroblasen wurden Maus-Erstantikörper gegen humanes α- Aktin (Calbiochem), Kollagen IV (Sigma) und Fibronektin (Calbiochem) verwendet.

Diese wurden für ca. 30-60 min. in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert. [Seite 19↓]Nach erneutem Spülen mit PBS wurde der an einem Farbstoff (FITC oder TRITC) gebundene spezies-spezifische Antikörper (1:100 verdünnt in PBS) á 40µl auf die Deckgläser gegeben. Aufgrund der Lichtempfindlichkeit dieser Fluoreszenzfarbstoffe wurde die 60minütige Inkubation in einer abgedunkelten feuchten Kammer bei Raumtemperatur durchgeführt. Als dazu geführte Kontrollen diente entweder die Phasenkontrastmikroskopie oder die DAPI (4´,6-Diamidin-2´-phenylindol-dihydrochlorid) Färbung, um die genaue Lokalisation der nachgewiesenen Proteine bzw. der Zellkerne zu ermöglichen.

Die Darstellung erfolgte am Fluoreszenzmikroskop (Olympus 3x61).

Wachstumsverhalten der Zellkulturen

Die Proliferationsrate der Endothelzellen und der Myofibroblasten wurde über 5 Passagen an 6 aufeinander folgenden Tagen untersucht. Die Endothelzellen wurden in einer Konzentration von 1x105 Zellen und die Myofibroblasten in einer Konzentration von 5x104 Zellen in je eine Vertiefung einer 6-well-Zellkulturmultischale (Nunc) ausgesät und pro Passage 6 Tage kultiviert. Jeden Tag wurden die Zellen mit Trypanblau angefärbt und mittels der Neubauer-Zählkammer gezählt. Die Kultivierung erfolgte bei 37°C unter den Standardbedingungen im Inkubator. Die Daten wurden als „standard error of the mean“ angegeben. Signifikanz wurde bei p-Werten kleiner als 0,05 erreicht.

Folgende Unterscheidung wurden vorgenommen:

Gruppe A: Vaskuläre Zellen aus der frischen isolierten Nabelschnur (Kontrollgruppe)

Gruppe B: Vaskuläre Zellen aus der ganzen eingefrorenen Nabelschnur

Gruppe C: Vaskuläre Zellen aus eingefrorenen Nabelschnurzellkulturen


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2.5  Herstellung der Polymerkonstrukte

Gerüstmaterial

Für die Besiedlungsversuche hatte sich in verschiedenen Vorversuchen die alleinige Verwendung des resorbierbaren Polymers P4HB (Poyl-4-Hydroxy-Butyrate) als günstig herausgestellt. So konnte ein Herzklappengerüst aus lediglich einem resorbierbaren Polymer hergestellt werden, ohne Nahtmaterial oder andere Polymere zu benötigen. Bei diesem Polymer -einer Neuentwicklung der Firma Tepha (USA)- handelt es ich um ein Polyhydroxyalkanoat, welches von Bakterien (Pseudomonas olevorans) synthetisiert wird.52 Es ist semikrystallin und thermoplastisch mit einem Schmelzpunkt von Tm = 61°C. Zudem besitzt es eine hohe Elastizität und ist gut formbar.

Das Material hat zwar eine hohe Porosität (Porengröße von 180-230µm) (Abb.10), seine Oberfläche ist hingegen glatt, so dass die Zellhaftung unzureichend ist.

Abb.10
Querschnitt durch das Polymer (P4HB)
Erkennbar ist eine poröse Struktur, in das die Zellen hineinwachsen können.

Um die Adhärenz der Zellen zu erhöhen, wurde die Oberfläche mechanisch aufgeraut. Aus diesem Material konnte die Herzklappe geformt (siehe „Klappenherstellung“) und sterilisiert werden.


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Klappenherstellung

Aus den gelieferten Polymerstücken wurden zwei 2x5 cm lange Rechtecke geschnitten. Diese wurden dann nach Vorbild des Stereolithographiemodells und der daraus entwickelten Negativform der Klappe (Abb.11) zur Herzklappe geformt. Aufgrund des niedrigen Schmelzpunktes des Polymers (61°C) und der guten Formbarkeit war dies problemlos möglich (Abb.12).

Abb.11
A) Negativform der Herzklappe von der Ventrikelseite betrachtet
B) Seitliches Bild der Negativform mit den „Sinus of Valsalva“


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Abb.12
Herstellung der Klappenform aus dem Polymermaterial
1. Zugeschnittene Polymere werden um das Stereolithographiemodell gelegt und durch punktuelle Wärme mittels Lötstab an den Rändern adaptiert
2-3. Mittels der Abdrucktechnik wird die Klappe geformt


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Um nach dem Besiedlungsvorgang die Klappe mit den adaptierenden Zellen nicht weiter zu berühren, wurde die Klappe, die für die dynamische Besiedlung vorgesehen war, auf einen Silikonadapter aufgenäht. Mit diesem Adapter konnte die Klappe im Bioreaktor aufgesetzt werden, ohne sie zu traumatisieren (Abb.12).

Abb.12
Fertiges Herzklappenkonstrukt mit aufgenähtem Silikonadapter
1. “Sinus of Valsalva” 2. Konduit 3. Silikonadapter

Die geformten Klappenpolymere wurden von der Firma Vanguard (Berlin) mit Ethylenoxid (EO) bei 37°C kaltsterilisiert.

Nach mehrmaligem Waschen mit PBS wurden die Konstrukte mit FCS (fetalem Kälberserum, Sigma) für 24 Stunden bei 37°C im Inkubator beschichtet. Anschließend wurden sie für weitere 24-48 Stunden in einem Exsikator (KNF Laboport, Kartell) getrocknet.


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Zellbesiedlung

Die hergestellten Klappen wurden mit aufgetauten Myofibroblasten der Nabelschnur aus der 3. bis 4. Passage besiedelt. Für die statisch und die dynamisch konditionierten Herzklappengerüste wurden in Parallelversuchen Zellen der gleichen Zelllinie verwand.

Bei insgesamt 5 Besiedlungstagen wurden pro Besiedlungstag zwei Besiedlungen mit ca. 8-9x106 Zellen durchgeführt. Endothelzellen wurden für diesen Versuch nicht benutzt.

Für die Besiedlung wurden die Zellen in den Zellkulturflaschen durch Trypsin in Suspension gebracht, zentrifugiert und in 1ml Medium resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit einer Eppendorfpipette auf das in einem verschließbaren Polyethylenbehälter (Merck) liegende Herzklappenpolymer gebracht. Dabei wurde versucht, die Zellen auf alle Seiten der Klappe gleichmäßig aufzubringen. Nach einer Wartezeit von ca. 40 min nach jedem Besiedlungsschritt wurde der Behälter mit 150 ml Medium aufgefüllt, so dass das besiedelte Polymer vollständig mit Zellkulturflüssigkeit bedeckt war. Die Klappe wurde nach fünfmaliger Besiedlung und einer Wartezeit von 7-9 Tagen in den Bioreaktor eingebaut und für 7 Tage in diesem konditioniert. Die statische Klappe wurde als Kontrolle parallel im Inkubator bei den üblichen Standardbedingungen (37°C, 5%CO2) geführt. Nach insgesamt 3-4 Wochen wurden beide Klappenkonstrukte untersucht.

Abb.13
Besiedelte Klappe zur Inkubation im Polyethylenbehälter


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Versuchsaufbau

Wie bereits im Kapitel 1 erwähnt, ist die Verwendung eines Bioreaktors für das Tissue Engineering von Konstrukten wichtig, um diese an die in-vitro-Bedingungen kontrolliert heranführen zu können.53 Der Einsatz des Bioreaktors wurde bereits erfolgreich beim Tissue Engineering von autologem Herzklappengewebe angewendet. Bei diesem Experiment lieferte dieses System die dynamischen Zellkulturbedingungen in Form von pulsatilem Fluss und Druck. Diese physikalischen Reize sollten den Zellen den Stimulus geben, in das Polymer einzuwandern und ein Klappengerüst mit entsprechender Extrazellularmatrixbildung herstellen.38

Die Zellkulturbedingungen waren bei den statischen und dynamischen Klappenkonditionierungen exakt vergleichbar. Die Standardbedingungen (37°C, 5%CO2) wurden übernommen. Dem Medium (DMEM, Gibco) wurde neben 10% FCS (Sigma) und 1% GPS (Gibco) nun auch bFGF (basic fibroblast Groth factor) in einer Endkonzentration von 10ng/ml [Sigma] als Wachstumsfaktor zugegeben.

Das pulsatile Flusssystem ist folgender Maßen aufgebaut:

Der Bioreaktor (1) ist durch einen Silikonschlauch (Cole Parmer, USA) mit dem Zellkulturmedium gefüllten Glasreservoir verbunden (2). Dieses Glasreservoir (Wheaton Inc, USA, Trysining Flask) dient als Überlaufbehälter. Der Antrieb der integrierten pneumo-hydraulischen Membranpumpe erfolgt durch eine Tierbeatmungsmaschine (Dual phase control ventilator, Harvard Apparatus Inc. USA, Model 613). Dieser Teil des Apparates (3) steht außerhalb des Inkubators, um Wärmeentwicklung im Inkubator zu vermeiden. Die In- und Exspirationsanschlüsse der Beatmungsmaschine münden über einen Luftdruckschlauch (Cole Parmer, USA) in den Membranpumpenteil des Bioreaktors. Der Bioreaktor selbst ist mit dem mediumgefüllten Überlaufreservoir im Inkubator (4) platziert.

Abb.14 Skizze des Bioreaktors (1) mit Überlaufbehälter (2), Pumpe (3) und Inkubator (4) (rosa: Medium; schwarz: Luft)


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Abb.15
Versuchsanordnung des Klappenbioreaktors;
1.Bioreaktor 2. Reservoir 3. Schlauchsystem zur Pumpe 4. Inkubator

Diese Herzklappen wurden in diesem pulsatilen Bioreaktorsytem unter Fluss (150ml/min) und einem Druck von ca. 10-15 mmHg konditioniert.54 Der Bioreaktor war vollständig transparent, so dass das Öffnen und Schließen der Klappen beobachten werden konnte.


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2.6  Evaluation der Konstrukte

Die „tissue engineerten“ Konstrukte wurden nach 7 Tagen aus dem Bioreaktor entnommen und mit den parallel statisch konditionierten Klappen untersucht und verglichen.

Histologie

Hierbei wurde die HE- (Hämatoxylin-Eosin) Färbung benutzt. Die besiedelten Konstrukte wurden in 8% phosphatgepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Diese wurden in 2µm dicke Stücke geschnitten und anschließend gefärbt.

Immunhistochemie

Der immunhistochemische Nachweis erfolgte mittels der APAAP-Methode (alkalische Phoshatase anti-alkalische Phosphatase) der Firma Biogenics.55 56

Als Erstantikörper dienten folgende:

CD 31- Endothelzellantikörper (Dako)

Dieser monoklonale Maus-Antikörper ist gegen den humanen Oberflächenmarker CD 31 gerichtet, welcher zur Familie der Glykoproteine gehört und in Zellmembranen von Endothelzellen, Lymphozyten und Thrombozyten lokalisiert ist.57

Faktor VIII (von Willebrand Faktor) Antikörper (Dako)

Der Faktor VIII (von-Willebrand-Faktor) ist ein in der Maus hergestellte monoklonale Antikörper, der gegen das gleichnamige humane Antigen gerichtet ist. Dieses ist ein multimeres Glykoprotein und wird von Endothelzellen expremiert.

Kollagen I (Novocastra) und IV (Biogenics) Antikörper

Diese monoklonalen Maus-Antikörper sind gegen das jeweilige humane Kollagenantigen gerichtet. Kollagen gehört unter anderem zu einen der Hauptbestandteile der extrazellulären Matrix vaskulärer Gewebe.58 Von den insgesamt 19 verschiedenen Kollagenarten ist das Kollagen IV das bekannteste nichtfibrilläre Kollagen59 und stellt die Hauptstrukturkomponente der Basalmembran dar.60

Fibronektin Antikörper (Dako)

Dieser ebenfalls von der Maus stammende monoklonale Antikörper ist gegen Fibronektin gerichtet, ein für die Entwicklung der extrazellulären Matrix essentielles Protein,61 da es [Seite 28↓]Polypeptidketten enthält, die als Bindungsstellen sowohl für die Oberflächenrezeptoren anderer Zellen als auch für Fibrin und Kollagen dient.

α-Smooth Muscle Aktin Antikörper (Dako)

Dieser monoklonale Maus-Antikörper ist gegen humanes Aktin, einem cytoskelettales Protein gerichtet, welches von glatten Muskelzellen synthetisiert wird. Das α-Smooth-Muscle-Aktin ist dabei eine Isoform des Aktins.62

Desmin Antikörper (Dako)

Dieser monoklonale Maus-Antikörper richtet sich gegen humanes Desmin. Desmin ist in Herz-, Skelett- und glatten Muskelzellen lokalisiert.

Elektronenmikroskopie

Diese Untersuchung wurde an der Freien Universität Berlin im Institut der Anatomie Prof. Dr. Shakibaei durchgeführt. Dabei wurden kleine Teilstücke der statisch und dynamisch kultivierten Gewebekonstrukte in Karnofski-Lösung fixiert, in einer aufsteigenden Alkohollösung gewaschen und dehydriert. Anschließend wurden sie in Epon eingebettet, mittels des Reichert Ultracut Gerätes zugeschnitten und mit 2% Uranyl Acetat/Citrat Lösung kontrastiert.

Zur weiteren Untersuchung diente das Transmissionselektronenmikroskop (TEM 10 Zeiss).


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Quantifizierung des Kollagen-Gehaltes

Zur quantitativen Kollagenbestimmung wurde der Sircol Collagen Assay (Biocolor, Belfast) verwendet.

Mit dieser Methode wird nur der lösliche Kollagenanteil bestimmt. Aus diesem Grund wurden die Proben mit 0,5M Essigsäure behandelt, um auch den unlöslichen Teil zu extrahieren.

Ca. 0,5g Gewebe wurde in 1ml 0,5M Essigsäure für 24-48 Stunden bei Raumtemperatur resuspendiert, über eine Gaze filtriert, bei 13.000rpm zentrifugiert und mit 2M NaCl präzipitiert. Nach erneuter Zentrifugation wurde das entstandene Pellet in 0,5M Essigsäure gelöst und 100µl des Überstandes für den Assay benutzt.

Bei dem Test wird das Gesamtkollagen quantifiziert und mit einer Standard-Absorptionskurve verglichen.

Die Farbstoffe binden spezifisch an die Moleküle, welche fotometrisch bestimmt werden. Die gebundenen Farbstoffe zur Kollagenbestimmung absorbieren im Bereich von 540nm. Die Menge an gebundenem Farbstoff ist proportional zur Menge des zu bestimmenden Kollagens. Die Ergebnisse wurden zwischen den konditionierten Herzklappen und den statisch geführten Kontrollen mittels des Mann- Whitney Tests statistisch ausgewertet.

Die Regressionsgleichung der ermittelten Standard-Absorptionskurve wurde mittels der Microsoft Exel Software erstellt.


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Strukturelle und funktionelle Untersuchungen von kryokonservierten Zellen und dem besiedelten Herzklappenkonstrukten

Die Untersuchungen mittels quantitativer fluoreszenzmikroskopischer Imaging-Verfahren wurden in Zusammenarbeit mit der physiologischen Abteilung der Freien Universität Berlin (Arbeitsgruppe Prof. Kübler) durchgeführt.

Imaging der intrazellulären Calzium (Ca2+-) Konzentration

Mit Hilfe der fluoreszenzmikroskopischen Verfahren wurden Endothelzellen und Myofibroblasten im Nativzustand, nach Kryokonservierung sowie nach erfolgreicher Klappenbesiedelung hinsichtlich ihrer zellulären Homöostase und ihrer Fähigkeit zu zellphysiologischen Reaktionen untersucht.

Mittels der fluoreszenztechnischer Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration mit Hilfe der Fura-2-Ratio-Imaging-Technik63 wurde die [Ca2+] Antwort auf Histaminstimultion in kryokonservierten, re-kultivierten Endothelzellen und Myofibroblasten von Nabelschnüren, sowie in besiedelten Herzklappen untersucht.

Dazu wurden die mit Zellen bewachsenen Deckgläser (12mm, WCP) (siehe „Kulturbedingungen“) verwendet. Diese und ein kleines Stück der besiedelten Herzklappe (ca. 2 cm²) wurden mit 10µM Fura-2 in PBSMg2+/Ca2+-Lösung 25min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden sie mit 1ml PBS zweimal gespült und bei 340/ 360/ 380 nm unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und mit 5µl Histamin (Endkonzentration = 10µM) stimuliert.

Bei Belichtungszeiten von 50msek. erfolgte die Auswertung schließlich am PC.


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27.05.2005