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3  Ergebnisse

3.1 Zellkultur

Zellgewinnung

Glatte Muskelzellen und Fibroblasten konnten nicht auf enzymatischer Weise getrennt werden, so dass sie ein Zellgemisch darstellen und im folgenden als Myofibroblasten bezeichnet werden. Eine ausreichende Menge an diesen sogenannten Myofibroblasten ließ sich mit der mechanischen Isolierungsweise, der sog „mincing technique“, erzielen. Die Zellausbeute konnte gesteigert werden, in dem die Explantatstücken aus der Arterie statt aus der Vene entnommen wurden und indem diese Explantatstücke kleiner als 1mm² präpariert wurden. Die Endothelzellen ließen sich in ausreichender Menge mit der enzymatischen Methode mittels Diapase aus der Vene gewinnen. Ihre Zellausbeute konnte durch Inkubation bei 37°C gesteigert werden.

Morphologie der gewonnen Zellen

Die auflichtmikroskopischen Untersuchungen der Endothelzellen und der Myofibroblasten aus der frischen (Gruppe A), eingefrorenen (Gruppe B) Nabelschnur oder aus der eingefrorenen Nabelschnurzellkultur (Gruppe C) ergaben hinsichtlich der Morphologie keine Unterschiede.

24 Stunden nach der Isolierung ließen sich unter dem Mikroskop (Olympus CK2) adhärierte Endothelzellen erkennen (Abb.16).

Abb.16
Adhärierte Endothelzellen 24h nach Isolation


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Nach ca. 2-3 Tagen war bei den Endothelzellen der Gruppe A und C mikroskopisch eine konfluente, einschichtige Zellschicht sichtbar. Die Endothelzellen der eingefrorenen Nabelschnur (Gruppe B) waren erst nach ca. 12-14 Tagen konfluent.

Die konfluenten Endothelzellmonolayern ließen das typische mikroskopisch sichtbare pflastersteinartige Muster erkennen (Abb.17).

Abb.17
Konfluente Endothelzellmonolayer mit dem typischen pflastersteinartigen Muster


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Das Auswachsen der Myofibroblasten aus den Explantatstücken war nach ca. 1-2 Wochen unter dem Mikroskop erkennbar. (Abb.18)

Abb.18
Auswachsen der Zellen aus dem Gewebe

Erst nach ca. 3-4 Wochen war bei den Myofibroblasten ein deutlicher Zellrasen zu beobachten, der unter dem Mikroskop das für diesen Zelltyp typische fischschwarmartige Muster zeigte. (Abb19)

Abb.19
Konfluente Myofibroblasten mit typischem „fischschwarm“ ähnlichem Muster


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Identifikation mittels indirekter Immunfluoreszenz

Mit Hilfe spezifischer Marker ließen sich die Endothelzellkulturen nachweisen. Hier konnte kein Unterschied zwischen den Gruppen dargestellt werden.

Der Oberflächenmarker CD 31 zeigte in den Endothelzellkulturen aller drei Gruppen eine starke homogene Signalintensität (Abb.20). Bei der Markierung mit dem von-Willebrand Faktor ließ sich das typische punktförmige zytoplasmatische Muster erkennen. Als Kontrolle wurde die DAPI (Diamin-Phenylindol-Dihydrochlorid) Färbung für die genaue Lokalisation der Proteine verwendet. (Abb.21)

Abb.20
Von-Willebrandt-Faktor in der indirekten Immunfluoreszenz
Frische und kryokonservierte Endothelzellmonolayer (H UVEC, human umbilical vein endothelial cells) wurden in der 3. Passage mit monoclonalem Anti-von-Willebrandt-Faktor-Antikörpern (grüne Fluoreszenz) markiert und mit DAPI als Kontrolle (blaue Fluoreszenz) dargestellt. In frischen und eingefrorenen HUVECs: Darstellung der zytoplasmatischen Lokalisation des von-Willebrandt-Faktors und des Zellkerns. (bar 100µm)


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Abb.21
Konfluente frische und kryokonservative Endothelzellen der 3.Passage, markiert mit dem CD 31 Marker (grüne Fluoreszenz) und der DAPI Anfärbung als Kontrolle; starke Signalintensität beider Gruppen. In frischen und eingefrorenen HUVECs Darstellung von CD 31 und des Zellkerns. (bar 100µm)


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Bei den Myofibroblasten zeigte sich das α-Smooth Muscle Aktin als fibrilläre Stränge (Abb.22). Dabei waren keine Unterschiede bezüglich der frischen und kryokonservierten Myofibroblasten erkennbar. Kollagen IV (Abb.23) und Fibronektin (Abb.24) ließen sich an der Zellperipherie nachweisen. Auch Kollagen I und Elastin zeigten eine hohe Signalintensität. Die aus der kryokonservierten Nabelschnur stammenden Myofibroblasten werden nicht untersucht, da eine Isolierung dieser Zellen nicht möglich war.

Abb.22
Darstellung von endogenem α-Aktin
Konfluente Myofibroblasten der dritten Passage wurden mit monoklonalem Anti-α-Aktin Antikörpern markiert (grüne Fluoreszenz). Als Kontrolle diente das Phasenkontrastbild derselben Zellen. In frischen und eingefrorenen Myofibroblasten Darstellung der fibrillären Lokalisation des α-Aktin. (bar 100µm)


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Abb.23
Darstellung von Kollagen IV. Konfluente Myofibroblasten der dritten Passage wurden mit monoklonalem Anti-Kollagen-IV Antikörpern markiert (grüne Fluoreszenz). Als Kontrolle diente das Phasenkontrastbild.(bar200µm)

Abb.24 Darstellung von Fibronektin als dünne Fasern. Konfluente Myofibroblasten der dritten Passage wurden mit monoklonalem Anti-Elastin Antikörpern markiert (grüne Fluoreszenz). Als Kontrolle diente das Phasenkontrastbild.


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Wachstumsverhalten der Zellkulturen

Das Wachstumsverhalten der vaskulären Zellen der frisch präparierten Nabelschnur (GruppeA), der eingefrorenen Nabelschnur (Gruppe B) und die eingefrorenen Nabelschnurzellkulturen (Gruppe C) sind in der Abbildung 24 (Endothelzellen) und in Abbildung 25 (Myofibroblasten) zusammengefasst.

Die Gruppe A (Zellen aus der frischen Nabelschnur) diente als Kontrollgruppe.

Gruppeneinteilung:

Gruppe A: Vaskuläre Zellen aus der frischen Nabelschnur (Kontrollgruppe)

Gruppe B: Vaskuläre Zellen aus der eingefrorenen Nabelschnur

Gruppe C: Vaskuläre Zellen aus eingefrorenen Nabelschnurzellkulturen

Die Proliferationsrate der Endothelzellen der frisch isolierten Nabelschnur (Gruppe A, n=14), der eingefrorenen Nabelschnur (Gruppe B, n=3) und der eingefrorenen Nabelschnurzellkulturen (Gruppe C, n=8) wurden in einer Konzentration von 1x105 Zellen in den 6 well-Kulturplatten ausgesät (siehe Methodenteil) und über 6 Tage kultiviert. Graphisch dargestellt sind die Ergebnisse der 3. Passage, da die 3.- 4. Passage für die Besiedlung der Herzklappenpolymere benutzt werden sollten.

Die Endothelzellen der frisch isolierten Nabelschnur (Gruppe A) wurden als Kontrolle angesehen und mit den anderen Gruppen verglichen. Die Zellen der Gruppe A zeigten eine konstant steigende Proliferation über 6 Tage mit einem Maximum am 4.Tag mit einer Zellzahl von 3.1x105.

Die Endothelzellen der eingefrorenen Nabelschnur (Gruppe B) konnten zum Großteil nicht aus der wieder aufgetauten Nabelschnur isoliert werden. In der dennoch kultivierten Endothelzellenkultur der Gruppe B befanden sich nach 4-5 Tagen hauptsächlich abgestorbene Zellen. Nur bei einem kleinen Anteil (n=3) der aus den aufgetauten Nabelschnüren isolierten Zellen konnte ein Wachstum bis zur 3. Passage beobachtet werden. Diese zeigten am 5.Tag ein Maximum von 2,1x105 Zellen. Die Gruppe C -eingefrorene Endothelzellkulturen- zeigte ein ähnliches Proliferationsverhalten wie Gruppe A. Die Werte wurden als „standard error of the mean“ angegeben.


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Für Endothelzellen der Gruppe B ergab sich zur Kontrollgruppe (Gruppe A) ein signifikanter Unterschied mit einem p-Wert von p< 0.005 am Tag 1 und ein p- Wert von <0.043 am Tag 4.

Die Gruppe C (eingefrorene Zellkultur) zeigte keine signifikanten Unterschiede zur Kontrollgruppe A (frische Nabelschnurzellen).

Abb.25
Wachstumskinetik der Endothelzellen aus humanen Nabelschnüren
Die dritte Passage der Endothelzellen isoliert aus frischen (Gruppe A, n=14), kryokonservierten Nabelschnüren (Gruppe B, n=3) und aus kryokonservierten Zellkulturen (Gruppe C, n=8). Die Zellen wurden auf 6 Plattenvertiefungen in einer Konzentration von 1,0x105 Zellen ausgesät und über 6 Tage kultiviert. Jeden Tag wurden die Zellen mit Trypanblau angefärbt und in der Neubauer-Zählkammer gezählt.


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Die Proliferationsrate der Myofibroblasten der frisch isolierten Nabelschnur (Gruppe A), der eingefrorenen Nabelschnur (Gruppe B) und der eingefrorenen Nabelschnurzellkulturen (Gruppe C) wurden in einer Konzentration von 5.0x104 Zellen in den 6 well-Kulturplatten ausgesät (siehe Methodenteil) und über 6 Tage kultiviert. Graphisch dargestellt sind die Ergebnisse der 3. Passage, da die 3.- 4. Passage für die Besiedlung der Herzklappenpolymere benutzt werden sollten. Als Kontrollgruppe diente die Gruppe A (Myofibroblasten der frischen Nabelschnur).

Die Gruppe B wurde in der Graphik nicht berücksichtigt, da die Zellen sich nicht aus der eingefrorenen Nabelschnur isolieren ließen. Für die Gruppe B ergab sich mit einem p-Wert von <0.052 für den Tag 6 kein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe.

Abb.26
Wachstumskinetik der Myofibroblasten aus humanen Nabelschnüren
Dargestellt ist die dritte Passage der Zellen isoliert aus frischen (Gruppe A, n=7) und aus kryokonservierten Zellkulturen (Gruppe C, n=5). Gruppe B wurde in der Graphik nicht berücksichtigt, weil keine Zellen aus dem Explantatstück auswuchsen. Die Daten wurden als „standard of the mean“ dargestellt. P<0,051 am 6.Tag ergab keinen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe.

Die eingefrorenen Zellen der Nabelschnurgefäße zeigten ein ähnliches Wachstumsverhalten wie die frisch präparierten Zellen. Basierend auf diesem Ergebnis stellen diese eingefrorenen Zellen eine potentielle Zellquelle für das Tissue Engineering von Herzklappen dar.


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3.2  Herstellung der Polymerkonstrukte

Gerüstmaterial

Aufgrund des Herstellungsverfahrens wurde das verwendete Polymer P4HB (Poly-4-Hydroxybutyrate) mit einer glatten, nicht porösen Oberfläche geliefert.

Abb.27
Eine makroskopische Aufsicht des P4HB Polymers (Ausschnitt)

Die innere Struktur des Polymers dagegen war porös, die einzelnen Löcher standen miteinander in Verbindung, in denen die Zellen einwandern konnten.

Das Aufrauen wirkte sich positiv auf die Zelladhäsion aus. Durch diese Schritte wurde das Einwachsen der Zellen in das Polymer erleichtert.

So konnte gezeigt werden, dass die Beschichtung des hydrophoben Polymermaterials mit fetalem Kälberserum scheinbar die Adhärenz der Zellen fördert. Sie scheinen dadurch in der Lage zu sein, in das Polymer einzuwachsen und ihre eigene Matrix zu bilden. Im Gegensatz zu den beschichteten Polymerkonstrukten war die Adhärenz auf den unbeschichteten schlecht. Bei diesen konnte nur ein spärliches Zellwachstum beobachtet werden.


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Klappenherstellung

Mittels des CT (Computertomographie) Scans und des Softwarecomputerprogramms (AMIRA-ANAPLAST) hergestellte Stereolithographymodel und des daraus entwickelten Silikonmodels konnte weitgehend das Design einer Aortenklappe hergestellt werden.

Abb.28
Hergestelltes Klappenkonstrukt aus porösem P4HB
-A. Seitliche Ansicht B. Aortale Ansicht mit Blick auf die Segel

Durch die Bildung der „Sinus of Valsalva“ sollten die hämodynamischen Eigenschaften der Klappe verbessert werden. Diese Klappe konnte ohne jegliches Nahtmaterial hergestellt werden, so dass ein weitgehend naturgetreues anatomisches Konstrukt einer menschlichen aortalen Herzklappe hergestellt werden konnte.


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Klappenbesiedlung

Beim Besiedlungsvorgang war eine Pause zwischen den Besiedlungsvorgängen sehr wichtig, um eine bessere Adhärenz der Zellen auf der aufgerauten und mit fetalem Kälberserum beschichteten Polymeroberfläche zu ermöglichen. Das Auswaschen der nicht adhärenten Zellen nach Zugabe des Mediums konnte dadurch verhindert werden. Nach 5 Besiedlungstagen mit je 2 Besiedlungen konnte bereits makroskopisch eine gelblich schimmernde Oberfläche beobachtet werden. Dieses wies aufgrund zahlreicher Beobachtungen auf ein üppiges Zellwachstum hin.

Mit dieser Technik war es möglich, das Polymer mit einer ausreichend hohen Zellzahl zu besiedeln und ein Wachstum der Zellen zu ermöglichen.

Abb.29
Besiedelte Klappe mit gelblich schimmernder Oberfläche. Pinzettenspitze zeigt auf die Segel.


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Bioreaktor und dynamische Zellkonditionierung

Durch die dynamische Konditionierung des besiedelten Polymers mittels eines "Bioreaktors" konnte ein pulsatiler Fluss hergestellt werden, der die Gewebeentwicklung, d.h. die extrazelluläre Matrixproduktion in-vitro induziert. So konnten vitale autologe Klappenkonstrukte in-vitro hergestellt werden. Bei der Konditionierung sind keine Lecks aufgetreten. Der Bioreaktor wies keine Defekte auf.

Aufgrund des transparenten Acrylmaterials des Bioreaktors ist zudem ein Beobachten der Klappenbewegungen möglich gewesen. Auch konnten Farbveränderungen und Aussehen des Mediums und damit eventuelle Kontaminationen beobachtet werden.

Abb.30
Im Bioreaktor eingebrachtes Klappengerüst (mit Pfeil gekennzeichnet)


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3.3  Evaluierung der Konstrukte

Insgesamt wurden die statischen (n=7) mit den im Bioreaktor (n= 6) dynamisch konditionierten besiedelten Herzklappenkonstrukte verglichen.

Histologie und Immunhistochemie

Lichtmikroskopisch findet man in der Hämatoxilin-Eosin (HE-) Färbung (Abbildung 31) der dynamisch im Bioreaktor konditionierten Klappen auf beiden Oberflächen mehrschichtige Zelllagen von mesenchymalen Zellen. In der Tiefe erkennt man das doppeltbrechende Polymermaterial, in das ein Einwachsen der Zellen beobachtet wird. Diese Zellen mit längsovalem Zellkern stehen mit ihren Zellausläufern miteinander in Berührung.

Die statischen belassenen Kontrollen dagegen zeigen auf der Oberfläche nur ein- bis zweischichtige Zellreihen. Eine konfluente Zellschicht war nicht erkennbar. Die Zellkerne weisen eine eher runde bis ovale Form auf. Im Inneren des Polymers sind keine bis nur wenige Zellen erkennbar.

Abb.31
A.
HE-Färbung der dynamisch im Bioreaktor konditionierten Klappen (Vergrößerung 4x ). Es sind mehrschichtige Zelllagen auf den Oberflächen des Polymers und ins Innere einwachsende Zellen erkennbar.(Pfeil)
B. HE-Färbung der statisch geführten Klappen (Vergrößerung 10x). Nur vereinzelte ein- bis zweischichtige Zelllagen und kaum ein Wachstum ins Innere des Polymers ist sichtbar.


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Die immunhistochemischen Untersuchungen der tissue engineerten Konstrukte zeigten positive Ergebnisse für Kollagen I (Abb. 32), Kollagen IV (Abb.33), Fibronektin (Abb.34), Desmin und α-Aktin (Abb.35). Auch sind die Ergebnisse bei den dynamisch konditionierten Klappen stärker positiv als bei den statisch belassenen Kontrollen (Abb.36) (Abb.37). Für CD 31 und Faktor 8 zeigten die Untersuchungen negative Ergebnisse bei beiden Klappenarten (statisch und dynamisch).

Abb.32
Positiver Kollagen I Nachweis der dynamisch geführten Klappen in der immunhistochemischen Färbung
(grau: Polymer; lila: Kollagen I)

Abb.33
Positiver Kollagen IV Nachweis der dynamisch geführten Klappen in der immunhistochemischen Färbung
(grau: Polymer; lila/ blau: Kollagen IV)


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Abb.34
Positiver Fibronectin Nachweis der dynamisch geführten Klappen in der immunhistochemischen Färbung. Das Polymer ist teilweise bereits resorbiert. (10 fache Vergrößerung)
(grau: Polymer; lila: Fibronectin)

Abb.35
Positiver α-Aktin Nachweis der dynamisch geführten Klappen in der immunhistochemischen Färbung
(grau: Polymer; rosa: α-Aktin) (20 fache Vergrößerung)


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Abb.36
Nur schwach positiver Nachweis von Kollagen I bei der immunhistochemischen
Untersuchung der statischen Klappen (grau:Polymer; blau:Kollagen I Nachweis)

Abb.37
Schwach positiver Nachweis von Fibronektin bei der immunhistochemischen
Untersuchung der statisch belassenen Klappe. Beginnende Resorbtion des Polymers ist sichtbar
(10 fache Vergrößerung)


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Elektronenmikroskopie

Untersucht wurden die besiedelten und 7 Tage im Bioreaktor konditionierten Klappen, sowie die statischen als Kontrolle dienender Konstrukte.

Mit Hilfe der Elektronenmikroskopie konnte man die innere Struktur des Polymers erkennen, in deren Zwischenräume die Zellen einwuchsen, die Zellen selber und die von ihnen gebildete extrazelluläre Matrix.

Bei den konditionierten Konstrukten waren mehrschichtige auf der Oberfläche des Polymers adhärente vitale Zellen erkennbar. Die Zellen waren gleichmäßig verteilt. Ein Einwachen ins Innere des Polymers mit Bildung von Extrazellulärer Matrix war sichtbar.

Bei den statischen Kontrollen waren nur vereinzelt Zellen auf der Oberfläche des Polymers erkennbar, die zum Teil nicht mehr vital waren und nur ein spärliches Einwachsen ins Polymer zeigten (Abb.38). Es sind auf der statisch belassenen Klappe signifikant weniger Zellen sichtbar als auf der dynamisch konditionierten Klappe.

Abb.38
A.
Elektronenmikroskopische Aufnahme der dynamisch geführten Klappe mit mehrschichtigen Zellverbänden Ein Einwachsen der Zellen ins Polymerinnere ist erkennbar (Pfeil zeigt auf Zellen)
B. Elektronenmikroskopische Aufnahme der statisch geführten Klappe mit nur einschichtiger Zelllage auf der Oberfläche des Polymers (Pfeil zeigt auf Zellen)


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Untersuchungen auf Kollagen-Gehalt

Der quantitative Gehalt an Kollagen war bei den dynamisch im Bioreaktor konditionierten Herzklappenkonstrukten höher im Vergleich zu den statisch geführten Kontrollen, allerdings zeigte sich keine Signifikanz (p=0,751).

Abb.39
Kollagengehalt der statischen und dynamischen Klappe im Vergleich


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Strukturelle und funktionelle Untersuchungen von kryokonservierten Zellen und dem besiedelten Herzklappenkonstrukten

Hier zeigte sich bei allen Zellen und auch bei den auf dem Polymer besiedelten Zellen eine starke Kalzium [Ca2+] Antwort auch auf Histaminstimulation.

In den kultivierten Endothelzellen und Myofibroblasten aus der frischen und eingefrorenen Nabelschnur wurde kein Unterschied in der Ca-Antwort auf die Histamin-Stimulation festgestellt. (Abb.40)

Trotz der Eigenfluoreszenz der Polymerfasern erkennt man deutlich die Anlagerung der Zellen (Abb.41). Unter Histaminstimulation zeigten die auf dem Polymer besiedelte Zellen eine vergleichbare [Ca2+]i-Antwort wie die in Kultur belassenen Zellen.

Abb.40
Ca-Antwort auf 10 µM Histamin in kultivierten Endothelzellen und Myofibroblasten aus der frischen und eingefrorenen Nabelschnur. Bei beiden wurde kein Unterschied in ihrer Antwort auf Histaminstimulierung festgestellt


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Abb.41
Ca-Antwort auf 10 µM Histamin in unbesiedelten und mit Fibroblasten besiedelten Klappenpolymeren. In den nicht besiedelten Klappen sind die Einzelfasern des Polymergerüsts sichtbar (weiße Pfeile). In den besiedelten Klappen lagerten sich die Zellen an den Fasern des Gerüstes an (weißer Pfeil). Auf Stimulation mit Histamin zeigten sie eine vergleichbare [Ca2+]i-Antwort wie die kultivierten Zellen.


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27.05.2005