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4  Diskussion

Im Ersatz von menschlichen Herzklappen sind zurzeit drei verschiedene Herzklappentypen klinisch im Einsatz: das glutaraldehydfixierte Xenograft, die mechanische Klappenprothese und Homografts. Alle drei weisen eine gute hämodynamische Funktion auf. Doch gibt es bei jeder einzelnen dieser Prothesen spezifische Limitationen, die alle mit Komplikationen und Einschränkungen für die einzelnen Patienten verbunden sind.64 65

Den eingesetzten Prothesen ist gemeinsam, dass sie Fremdmaterial für den Körper des Patienten darstellen. Sie wachsen weder mit noch können sie regenerieren. Die Herzklappenprothesen haben demnach eine eingeschränkte Haltbarkeit und stellen ein erhöhtes Infektionsrisiko dar. Gegebenenfalls müssen sie durch einen weiteren operativen Eingriff entfernt bzw. ersetzt werden. Besonders schwerwiegend ist die Problematik des Nichtmitwachsens bei pädiatrischen Patienten. Diese „entwachsen“ ihrer Klappe und müssen sich deswegen Re-Operationen unterziehen.

Um einen Herzklappenersatz zu entwickeln, welcher diese Nachteile womöglich nicht aufweist, wurden in dieser Arbeit, die Prinzipien des Tissue Engineerings zur Herstellung einer vitalen und autologen Klappe angewandt.

Das Prinzip des „Tissue Engineering“ besteht darin, dreidimensionale Polymergerüste mit autologen Zellen zu besiedeln und in einem Bioreaktor zu konditionieren, um einen individuellen und funktionellen Gewebeersatz herzustellen.66 Dieser so geschaffene vitale autologe Gewebeersatz wäre in der Lage, mitzuwachsen und sich gut der biologischen Umgebung anzupassen. Dieses „tissue engineerte“ Konstrukt könnte somit in den Körper, aus dem die Zellen ursprünglich entnommen wurden, reimplantiert werden.

Durch die Verwendung körpereigener Zellen für die Herstellung einer tissue engineerten Herzklappe könnten die genannten Probleme einer Fremdkörperreaktion umgangen werden. Diese Herzklappe hätte unter Umständen das Potential mitzuwachsen und könnte sich wie biologisches Material in das umgebende Gewebe integrieren.67

Für die Herstellung eines „tissue engineerten“ Konstruktes ist die Wahl der Zellquelle sehr wichtig. Insbesondere bei kongenitalen Herzfehlern, die man pränatal im Ultraschall erkennt, sollte eine Zellquelle gewählt werden, die in einer kurzen Zeit genügend Zellmaterial zur Verfügung stellt und keinen weiteren operativen Eingriff benötigt.


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Bis jetzt stehen für die Besiedlung von Polymergerüsten für das kardiovaskuläre Tissue Engineering verschiedene vaskuläre Zellquellen zur Verfügung.68 So werden sowohl arterielle als auch venöse Myofibroblasten als Zellquelle eingesetzt. Der Vorteil der venösen Zellen aus z.B. Fragmenten der Vena saphena magna besteht in der einfachen Gewinnung durch nur kleine chirurgische Eingriffe. Seit kurzem werden auch mesenchymalen Progenitorzellen aus dem Knochenmark benutzt. Sie besitzen noch die Fähigkeit, sich in verschiedene Ziellinien mesenchymalen Charakters zu differenzieren.

Die Nabelschnur stellt eine weitere attraktive Zellquelle für autogene Zellen dar. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Zellquellen ist die Nabelschnur nach der Geburt überflüssig und wird verworfen. Zudem stellt sie eine unkomplizierte Methode der Zellgewinnung dar, bei der in kürzester Zeit, ohne weitere operative Eingriffe, eine genügend hohe Zellzahl gewonnen werden kann. Es entfallen somit Entnahmeoperationen und das damit verbundene erhöhte perioperative Risiko.

Die Limitation dieser „frischen Nabelschnüre“ besteht darin, dass die Verwendung dieser Zellen auf die ersten Wochen nach der Geburt begrenzt ist, weil es bis jetzt keine geeignete Möglichkeit ihrer Haltbarmachung gab. Falls in diesem Zeitraum die vaskulären Zellen nicht aus der Nabelschnur isoliert wurden, weil kein Bedarf an „tissue engineerten“ Konstrukten vorlag, war diese Zellquelle für spätere Nutzungen nicht mehr zugänglich.

Durch die Möglichkeit der Kryokonservierung wäre ihre Verwendung nicht nur auf Neugeborene, deren Herzfehler in der Schwangerschaft diagnostiziert wurden, beschränkt. Auch bei Jugendlichen und älteren Patienten wäre eine Verwendung zu jedem ausgewählten Zeitpunkt potentiell möglich. Wie sich die Zellen nach längerfristigen Kryokonservierung verhalten und potentiell für eine womöglich lebenslange Zellbank in Frage kommen, wird aktuell im Labor für Tissue Engineering am Deutschen Herzzentrum evaluiert. Dieses Vorgehen setzt natürlich eine Etablierung einer individuellen Zellbank voraus.

In dieser Arbeit konnte die Möglichkeit der Kryokonservierung von vaskulären Zellen aus Nabelschnurgefäßen für das Tissue Engineering kardiovaskulärer Strukturen am Beispiel der Herzklappe demonstriert werden.


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In den ersten Versuchsansätzen zeigte sich, dass nach dem Auftauprozess der im Einfriermedium eingefrorenen gesamten Nabelschnur kein Wachstum der Fibroblasten und der glatten Muskelzellen nachzuweisen war. Im Gegensatz dazu konnten die oberflächlichen Endothelzellen isoliert und weiter kultiviert werden. Sie wuchsen jedoch wesentlich langsamer als die aus der frischen Nabelschnur gewonnenen Zellen.

Der Einfrierprozess scheint durch pH-Wert Veränderung, Kristallbildung und Dehydratation zur Zerstörung der Gewebe zu führen.69 Es ist bekannt, dass DMSO (Dimethylsulfoxide, ein gebräuchlicher Gefrierschutzzusatz) diesen Zerstörungseffekt minimiert.70 Allerdings scheint DMSO nur die oberflächlichen Schichten der Nabelschnurgefäße zu schützten und dringt scheinbar nicht bis in die tieferen Schichten des Gewebes vor. So würde sich unserer Meinung nach die Tatsache erklären, dass das Wachstum der Myofibroblasten bei der Kryokonservierung der gesamten Nabelschnur nicht möglich war.

Deshalb wurde ein anderer Ansatz verfolgt. Die Zellen wurden jetzt zuerst aus den Nabelschnurgefäßen isoliert, kultiviert und erst dann mit DMSO Zusatz kryokonserviert.

Bei dieser Methode scheint DMSO fast jede Zelle einzeln zu ummanteln und diese beim Konservierungsvorgang vor dem „osmotischen Schock“ zu schützen, so wie es bei zahlreichen anderen Zellarten bereits beschrieben wurde.71

Die so kryokonservierten Endothelzellen und Myofibroblasten unterschieden sich weder in ihrer Morphologie, in der Histologie noch in ihrem Wachstumsverhalten von denen aus der frischen Nabelschnur präparierten Zellen.

Mit dieser neuen Zellquelle und ihrer Kryokonservierung ist eine Grundlage für die Herstellung sogenannter Zell-Polymer-Konstrukte gleich nach der Geburt oder durch Kryokonservierung zu einem späteren Zeitraum geschaffen worden. Es besteht so die Möglichkeit, autologe Zellen zu gewinnen, ohne einen zusätzlichen operativen Eingriff vornehmen zu müssen, wie es z.B. bei der arteriellen Zellgewinnung der Fall ist.

Für welchen Zeitraum die Zellen kryokonserviert werden können ohne an Funktion einzubüssen, ist bis jetzt noch nicht untersucht worden.

In dieser Arbeit wurden die Zellen exemplarisch für 3-6 Monate kryokonserviert. Wie die Zellen sich bei einer Konservierungszeit von mehreren Jahren verhalten, ist noch zu prüfen und wird aktuell in unserem Labor untersucht.


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Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die kryokonservierten humanen vaskulären Zellen der Nabelschnur rekultiviert und expandiert werden können, um anschließend auf das entsprechende Polymergerüst besiedelt zu werden.

Da eine größere Anzahl von Zellen aus der Nabelschnur isoliert und kultiviert werden kann, als für ein „tissue engineertes“ Konstrukt benötigt wird, besteht zudem die Möglichkeit, mehrere Konstrukte zu unterschiedlichen Zeitpunkten herzustellen.

So hätte ein Patient jeder Zeit die Möglichkeit, auf einen Pool seiner eigenen Zellen zurückzugreifen, um unterschiedliche tissue engineerte Konstrukte für sich herstellen zu lassen.

In dieser Arbeit wurde als Gerüstmaterial das P4HB (Poly-4-hydroxybutyrate) verwendet. Es besitzt Eigenschaften, die von besonderer Bedeutung für das Tissue Engineering von Herzklappen sind. Dieses synthetische Polymer ist resorbierbar und biokompatibel. So kann sich parallel zum Resorptionsprozess genügend kardiovaskuläres Gewebe bilden. Es dient dazu der Herzklappe die entsprechende Form sowie ausreichende mechanische Eigenschaften zu verleihen. Es ist zudem thermoplastisch und damit gut formbar.

Um aus diesem Polymer die Form einer Herzklappe zu erhalten, wurde auf ein naturgetreues Stereolithographie-Modell zurückgegriffen. Dieses Modell wurde mittels der „rapid prototyping“ Technik hergestellt.72 Statt eines zylindrischen Konduits konnte ein Herzklappengerüst hergestellt werden, das der anatomischen Struktur von humanen Herzklappen exakt nachempfunden wurde.73 Verwendet wurde dabei eine sogenannte Abdrucktechnik.

Das Herzklappengerüst wurde aus lediglich einem Polymer hergestellt. Dies hatte den Vorteil, dass kein weiteres Nahtmaterial oder andere Polymere verwenden werden mussten.

Durch das physiologische Design der Klappe und die Abwesenheit weiterer Nahtmaterialien erhöht sich unserer Meinung nach die hämodynamische Funktion dieser Klappe. Das Risiko von Thromboseentstehung würde sich damit verringern.74 So war es möglich, selbst die „Sinus of Valsalva“ herzustellen, um ein dynamisch noch günstigeres und anatomisch genaueres Klappenmodell zu schaffen.


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In den Vorversuchen zeigte sich, dass aufgrund der hydrophoben Eigenschaften dieses Polymers die Zellen nur schlecht auf der Polymeroberfläche anhafteten.

Auch wenn das Innere des Polymers porös ist, ist durch das Herstellungsverfahren die Polymeroberfläche glatt (Abb.42), so dass das Einwachsen in das Polymer erschwert ist.

Abb.42
Die weitgehend glatte Oberfläche des verwendeten Polymers P4HB


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Bei höheren mechanischen Belastungen wie z.B. unter den Flüssen im Bioreaktor lösten sich diese Zellen von der Oberfläche ab. Man spricht von einem sogenannten „peel-off-effect“.

Abb.43
Die Zellen sind auf der Oberfläche des Polymers sichtbar, allerdings mit nur losem Kontakt.
Die Zellschichten lösen sich von der Oberfläche ab
(Doppelpfeil zeigt die Ablösung der Zellen vom Polymer „peel-off“ Phänomen)
Ein Einwachsen in das Polymerinnere wird kaum beobachtet

Zur Umgehung dieser Problematik musste die Polymeroberfläche zum einen mechanisch angeraut werden, um das Einwachsen der Zellen zu gewährleisten. Zum anderen musste das Polymer beschichtet werden, um eine gute Adhärenz der Zellen bewirken zu können.

In den Vorversuchen ergab die Beschichtung mit fetalem Kälberserum die beste Zelladhärenz. Damit das fetale Kälberserum tatsächlich die Fasern des Polymers beschichtet und nicht durch das zugegebene Medium wieder abgespült werden konnte, musste diese Klappenkonstruktion für 24-48 Stunden in einem Exikator unter sterilen Bedingungen bei Unterdruck getrocknet werden. Erst dann konnte diese Klappe mit Zellen besiedelt werden.

Die bessere Zelladhärenz auf dem Polymer wurde einerseits durch eine längere Einwirkzeit der Zellen auf dem Polymer bis zur Mediumzugabe bewirkt. Andererseits war bei der Besiedlung auf eine gleichmäßige Verteilung der Zellen auf dem Polymer zu achten.


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Eine Inkubationszeit von 7 Tagen vor dem Einbau der Klappe in den Bioreaktor zeigte auch einen günstigen Effekt auf die Entstehung extrazellulärer Matrix und der Zelladhärenz.

Die Ergebnisse zeigen, dass aufgetaute vaskuläre Zellen aus Nabelschnurarterien am porösen Gerüstmaterial adhärend waren, proliferierten und ein vitales mehrschichtiges Gewebe produziert wurde. Die extrazelluläre Matrixbildung ließ sich, wie auch von anderen Forschungsgruppen beschrieben,75 durch eine pulsatile Konditionierung deutlich steigern.

Bei den dynamisch im Bioreaktor konditionierten Klappen waren aus histologischer Sicht alle Oberflächen komplett mit Zellen in organisiertem Zustand bedeckt. Zusätzlich wuchsen die Zellen von der Oberfläche in die Poren des Gerüstmaterials hinein. Sie formten hier komplexe Zell-Polymerkonstrukte.

Abb.44
Hämotoxilin-Eosin Färbung der im Bioreaktor konditionierten Klappe. Der Pfeil deutet auf die mehrschichtigen Zelllagen hin. Ein Einwachsen der Zellen ins Polymerinnere ist zu erkennen (Pfeilspitze)

Die parallel im Inkubator geführten Kontrollen hingegen zeigten nur eine geringere Menge an Zellen im Inneren der Polymere und wirkten weniger organisiert als die im Bioreaktor konditionierten Klappen. Zudem konnte das extrazelluläre Matrixprotein Kollagen nachgewiesen werden, und zwar bei den dynamisch in stärkerem Maße als bei den statisch durchgeführten Kontrollen.


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Die immunhistologischen Untersuchungen der tissue engineerten Konstrukte ergaben weiterhin positive Resultate beim Nachweis von smooth-muscle-cell Aktin, Desmin, Kollagen und Fibronektin. So scheint die in vitro Konditionierung von den besiedelten Klappenpolymeren ausschlaggebend für die entsprechende Gewebeentstehung zu sein.

Auch die elektronenmikroskopischen Aufnahmen konnten diese Annahme bestätigen. Hier wurde wiederum das stärkere Zellwachstum nicht nur an der Polymeroberfläche, sondern auch im Inneren unter dynamischer Konditionierung im Gegensatz zur statisch geführten Kontrolle deutlich.

Durch das „Imaging“ der intrazellulären Ca-Konzentrationen und zusätzlicher Histaminstimulation konnte die funktionelle Integrität von Fibroblasten nach Besiedlung der Herzklappen mittels fluoreszenzmikroskopischer real-time Bildgebung gezeigt werden.

Die fluoreszenztechnische Messung der intrazellulären Ca-Konzentration mittels der Flura-2 Ratio-Imaging Technik wurde bereits zur Messung von endothelialen Reaktionsmechanismen erfolgreich eingesetzt, sowohl in vitro als auch in vivo.64 76

Mit diesem Verfahren konnte gezeigt werden, dass die Myofibroblasten und Endothelzellen aus den Nabelschnurgefäßen sowohl in Kultur, nach Kryokonservierung als auch nach erfolgreicher Klappenbesiedlung hinsichtlich ihrer zellulären Homöostase und ihrer Fähigkeit zu zellphysiologischen Reaktionen keinen Unterschied zeigten. Die intrazelluläre Kalzium Konzentration unter Ausgangsbedingungen als auch nach Stimulation mit Histamin, einem typischen Kalzium-Mobilisator, wurde gemessen. Dabei war kein Unterschied in der Kalzium-Antwort hinsichtlich des Zeitverlaufs, der Amplitude oder Reversibilität zu erkennen.

So lässt sich daraus schließen, dass die Zellen durch den Kryokonservierungsvorgang nicht an Funktion eingebüsst haben und auch nach Besiedlung auf dem Polymer immer noch vital sind.

Durch Kryokonservierung haltbar gemachte Nabelschnurzellen kommen somit als potentielle Zellquelle für das Tissue Engineering von kardiovaskulären Geweben in Frage. Ab welchem Zeitraum der Kryokonservierung die Zellen an Funktionalität verlieren, sei noch zu prüfen. Eine Einrichtung einer autologen, humanen Zellbank sollte ebenso in Erwägung gezogen werden.

Es scheint grundsätzlich möglich zu sein, mit vitalen autologen kryokonservierten Nabelschnurzellen tissue engineerte Herzklappen herzustellen.


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Zudem besaßen diese Klappen durch das Einwandern der Zellen in das poröse Polymer genügend eigene Matrix, um der mechanischen Beanspruchung durch Druck- und Scherkräften standhalten zu können.

Die dynamische Konditionierung der Klappen im Bioreaktor scheint ein wesentlich besseres Einwachsen der Zellen hervorzurufen77 und sich positiv auf die Bildung der extrazelluläreren Matrix und der Zellproliferation auszuwirken. In weiterführenden Studien müssten neue Systeme mit unterschiedlichen Druckprofilen getestet werden, um eine optimale Matrixproduktion zu fördern.

Zurzeit werden die Besiedlung der Klappe und ihre Konditionierung in zwei verschiedenen, voneinander unabhängigen Systemen durchgeführt. Um die Gefahr einer Kontamination zu minimieren, wäre die Entwicklung von einem kombinierten Besiedlungs- und Konditionierungssystem ein möglicher neuer Arbeitsschritt.

Bevor sich ein klinischer Einsatz tissue engineerter Herzklappen realisieren lässt, wäre ein weiterer Schritt, nicht nur Myofibroblasten, sondern noch zusätzlich Endothelzellen für die Besiedlung zu benutzen. Damit würde nicht nur ein stabiler Gewebeverband entstehen, der durch die extrazelluläre Matrix-Produktion von den Myofibroblasten hergestellt worden wäre, sondern man hätte zusätzlich noch eine funktionsfähige Endothelzellschicht, die eventuell für eine noch bessere hämodynamische Funktion sorgen und eine Antikoagulation in vivo überflüssig machen würde.

Die Wahl eines geeigneten Polymergerüstes und seine Beschaffenheit sind von entscheidender Bedeutung für das Einwachsen der Zellen in das Polymer. Es muss nicht nur eine gewisse Porosität im Inneren aufweisen, sondern auch eine poröse Oberfläche besitzen, an der die Zellen imstande sind zu adhärieren und ins Polymer einzuwachsen. Es wäre also weiterhin nötig, Untersuchungen durchzuführen, die klären, mit welcher Beschichtung, welcher Porosität und mit welchem Klappendesign ein solches Herzklappengerüst idealerweise herzustellen ist, um letztendlich eine Anwendung am Menschen zu ermöglichen.


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27.05.2005