Die Entwicklung von Immunoproteomics-Methoden am Beispiel der Identifizierung Magenkarzinom-assoziierter Helicobacter pylori Antigene

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
( Dr. rer. nat. )

im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Dipl. Biophys. Alexander Krah

geboren am 05. November 1973 in Erfurt

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter-Michael Kloetzel
2. Prof. Dr. Thomas F. Meyer
3. Prof. Dr. Wolfgang Lockau

Tag der mündlichen Prüfung: 17.12.2004

Zusammenfassung

Das magenbesiedelnde Bakterium Helicobacter pylori gehört zu den am weitesten verbreiteten Infektionserregern. Obwohl die Infektion meist lebenslang symptomlos verläuft, kann H. pylori bei einigen Menschen schwere Erkrankungen bis hin zum Magenkarzinom verursachen. Ziele dieser Arbeit waren Magenkarzinom-assoziierte Antigene für einen diagnostischen Test zu finden und Methoden zur Untersuchung von Spotkompositionen mittels MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie zu entwickeln.

Im ersten Teil der Promotion wurden die Antigenerkennungsmuster von 30 Magenadeno­karzinom- mit 30 Ulkus duodeni-Patienten mithilfe hochauflösender zwei­dimensionaler Immunoblots von H. pylori Lysat verglichen. Diese fokussierte Gegenüberstellung eignet sich gut für diese Fragestellung, da beide Erkrankungen von diesem Bakterium verursacht werden, aber nur sehr selten gemeinsam auftreten. Durch univariate statistische Analysen wurden 14 Magenkarzinom korrelierte Spots gefunden (p<0,01), die mit MALDI-TOF Massen­spektrometrie als folgende Proteine identifiziert wurden: GroES, GroEL und HyuA. Diese drei ORFs kodieren für hochkonservierte Antigene, die keine evidente Rolle in der Virulenz spielen und deshalb als Surrogatmarker der Erkrankung angesehen werden können.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die genaue Zusammensetzung mittels zweidimensionaler Gel­elektrophorese separierter Spots untersucht. Diese können mehr als eine Komponente enthalten, so dass nicht immer eindeutig entschieden werden kann, welche von Antikörpern erkannt wurde. Für die Analyse von Spotkompositionen gibt es bisher keine Standard­vorgehensweise. Aus diesem Grunde wurden hier Methoden entwickelt, mit denen Neben­komponenten von Spots detektiert werden können. Dies geschah durch Anwendung der hierarchischen Clusteranalyse und der Weiterentwicklung der Korrespondenz­analyse für MALDI-TOF Massenspektren. Für die o.g. Magenkarzinom-korrelierten Spots konnten damit entsprechend der Empfindlichkeit unserer Methode Nebenkomponenten ausgeschlossen werden.

Als alternativer Ansatz zur Detektion von H. pylori Antigenen sollte im dritten Teil dieser Doktorarbeit eine Immunopräzipitation mit Patientenseren etabliert werden. Da nur ein geringer Anteil der Serumantikörper gegen H. pylori gerichtet ist, wurde mittels Affinitätsreinigung versucht, die spezifischen Antikörper anzureichern. Aufgrund der knappen Serenmenge und der letztlich nicht ausreichenden Ausbeute der Affinitätsreinigung konnte dieses Verfahren jedoch nicht realisiert werden.

Abstract

The stomach-colonizing bacterium Helicobacter pylori is one of the most widespread infectious agents. Although infection mostly persists unnoticed, it may cause serious diseases like gastric carcinoma. Aims of this project were to find gastric carcinoma-associated antigens for a diagnostic test and to develop methods to analyze spot compositions using MALDI-TOF/TOF mass spectrometry.

In the first part of this project antigen recognition patterns of 30 gastric carcinoma- and 30 duodenal ulcer- patients were compared using high-resolution two-dimensional immunoblots of H. pylori lysate. This focused comparison lent itself to this question because both diseases are caused by the bacterium but rarely occur conjointly. Utilizing univariate statistical tests 14 gastric carcinoma-associated spots were found (p<0.01) which were identified by MALDI-TOF mass spectrometry to contain the following proteins: GroES, GroEL and HyuA. These ORFs code for highly conserved antigens that do not play any evident role in virulence and may therefore be considered as surrogate markers for this condition.

In the second part of this doctorate compositions of spots separated by two-dimensional gel electrophoresis were analyzed. Such spots may contain more than one component and it therefore cannot easily be decided which of them was recognized by antibodies. So far there is no standard approach towards this problem. Therefore, methods were developed to detect minor components of spots in an automatic manner. For this purpose hierarchical clustering was applied and correspondence analysis advanced for MALDI-TOF mass spectra. For the above mentioned gastric carcinoma-associated spots minor components could be ruled out according to the sensitivity of our method.

As an alternative approach to detect H. pylori antigens an immunoprecipitation using patient sera ought to be established in the third part of this project. Since only a small portion of antibodies in the serum is directed against H. pylori an affinity purification was to be established to enrich specific antibodies. Due to the poor amount of patient serum and the insufficient yield of the affinity purification this procedure could not be realized.

Eigene Schlagwörter: Helicobacter pylori , Immunoproteomics, Magenkarzinom, Ulkus duodeni, Antigen, Antikörper, Patientenserum, Immunoblot, Proteinidentifizierung, MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie, Immunopräzipitation, Affinitätsreinigung

Keywords: Helicobacter pylori , Immunoproteomics, gastric carcinoma, duodenal ulcer, antigen, antibody, patient serum, immunoblot, protein identification, MALDI-TOF/TOF mass spectrometry, Immunoprecipitation, affinity purification

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Helicobacter pylori
    • 1.1.1. Die Helicobacter pylori Infektion
    • 1.1.2.  Suche nach Antigenen
  • 1.2. Immunoproteomics
    • 1.2.1. Das Proteom und dessen Auftrennung
    • 1.2.2. Antigen-Erkennungsmuster von H. pylori
    • 1.2.3. Fokus: H. pylori Antigene als diagnostische Marker
    • 1.2.4.  Die Komposition von 2-DE separierten Spots
  • 1.3. Immunopräzipitation
    • 1.3.1. Konformationelle Epitope
    • 1.3.2.  Immunopräzipitation mit Patientenseren
  • 1.4. MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie
    • 1.4.1. Identifizierung von Proteinen
      • 1.4.1.1. Ionisierung der Peptide
      • 1.4.1.2. Analyse der Peptidmassen
      • 1.4.1.3. Peptide Mass Fingerprint
      • 1.4.1.4. Tandem Massenspektrometrie
    • 1.4.2. Automatisierung des Identifizierungsprozesses
    • 1.4.3.  Suche nach Nebenkomponenten in Spots
      • 1.4.3.1. Die Spotkomposition
      • 1.4.3.2. Voranalyse mittels „MS-Screener“
      • 1.4.3.3. Analyse mit multivariaten statistischen Methoden
  • 1.5. Ziele dieser Arbeit
• 2.  Material und Methoden
  • 2.1. Identifizierung Magenkrebs-assoziierter Antigene mittels Immunoblots
    • 2.1.1. Charakterisierung der Patienten
    • 2.1.2.  Aufzucht von Helicobacter pylori
    • 2.1.3.  Proteinseparation mittels 2-DE und Blotten
      • 2.1.3.1. Zweidimensionale Gelelektrophorese
      • 2.1.3.2.  Kolloidale Coomassie Färbung
      • 2.1.3.3. Das Blotten
    • 2.1.4. Inkubation der Immunoblots mit Patientenseren
    • 2.1.5.  Auswertung der Antigen-Erkennungsmuster
      • 2.1.5.1. Bildanalyse
      • 2.1.5.2.  Multivariate Statistik
      • 2.1.5.3. Univariate Statistik
    • 2.1.6. Identifizierung der Antigene
      • 2.1.6.1. Spotmustervergleich mit 2-DE Datenbank
      • 2.1.6.2.  Identifizierung mittels PMF
  • 2.2. Detaillierte Analysen von Massenspektren
    • 2.2.1. Proteinseparation
    • 2.2.2. Automatisches Ausstechen der Spots und tryptischer Verdau
    • 2.2.3.  Messung mittels MALDI-TOF MS
    • 2.2.4. Identifizierung von Haupt- und Nebenkomponenten der Spots
      • 2.2.4.1. Datenbanksuche mit Mascot
      • 2.2.4.2. Analyse der PMFs mithilfe des Programms MS-Screener
      • 2.2.4.3.  Hierarchisches Clustering mittels R
      • 2.2.4.4. Korrespondenzanalyse mit weiterentwickelter Software “CorrAn“
    • 2.2.5. Identifizierung von in-vivo exprimierten Proteinen von S. enterica
      • 2.2.5.1. Separation der Proteine
      • 2.2.5.2. MALDI-TOF/TOF MS Messung der Spots
      • 2.2.5.3. Datenbanksuche mit dem GPS Explorer
  • 2.3. Immunopräzipitation von H. pylori Antigenen
    • 2.3.1.  H. pylori Lyse
    • 2.3.2.  Affinitätsreinigung von H. pylori spezifischen Antikörpern
      • 2.3.2.1. Affinitätsreinigung mittels Nitrocellulosepartikel
      • 2.3.2.2.  Affinitätsreinigung mittels H. pylori
    • 2.3.3.  Bestimmung der AK Konzentration mittels ELISA
      • 2.3.3.1. Aufkonzentrierung der Eluate
      • 2.3.3.2. ELISA mit H. pylori Lysat
      • 2.3.3.3. ELISA mit intakten Bakterien
    • 2.3.4. Präzipitation der Antigene
    • 2.3.5. Separation der Präzipitate mittels 1-DE
      • 2.3.5.1.  1-DE
      • 2.3.5.2.  Silberfärbung
      • 2.3.5.3.  CBB G-250 Färbung und Identifizierung
      • 2.3.5.4. Immunoblots
• 3.  Ergebnisse
  • 3.1.  Identifizierung Magenkrebs-assoziierter Antigene mittels Immunoblots
    • 3.1.1. Verschiedene Subproteome von H. pylori
    • 3.1.2. Hohe Variabilität der Antigenmuster
    • 3.1.3. Globaler Vergleich der Antigenerkennungsmuster
    • 3.1.4.  Erkrankungskorrelierte Antigene
    • 3.1.5. Einfluss der Patientenparameter
    • 3.1.6. Identifizierung der Spots
    • 3.1.7.  Die Antigenität verschiedener Proteinspezies
    • 3.1.8.  Ein hypothetischer serologischer Test
  • 3.2. Detaillierte Analysen von Massenspektren
    • 3.2.1. Automatisierung des Identifizierungsprozesses
    • 3.2.2. Überprüfung der Zuverlässigkeit der Identifizierungen
    • 3.2.3. Verbesserung der Identifizierungsergebnisse
    • 3.2.4.  Untersuchung von H. pylori Antigenen
    • 3.2.5.  Proteinspezies in 2-DE Gelen
      • 3.2.5.1.  Verteilung von GroEL Spezies
      • 3.2.5.2. Weitere Beispiele für Proteinspezies
    • 3.2.6. Suche nach weiteren Spotkomponenten mittels Korrespondenzanalyse
    • 3.2.7. Vervollständigung des H. pylori Proteoms
    • 3.2.8. Identifizierung von in-vivo exprimierten Proteinen von S. enterica
  • 3.3. Immunopräzipitation von H. pylori Antigenen
    • 3.3.1. Abschätzung der nötigen IgG Menge für die Immunopräzipitation
    • 3.3.2. Affinitätsreinigung H. pylori spezifischer Antikörper
      • 3.3.2.1. Affinitätsreinigung mittels Nitrocellulosepartikel
      • 3.3.2.2. Affinitätsreinigung mittels H. pylori
    • 3.3.3.  Präzipitation der Antigene
• 4.  Diskussion
  • 4.1.  Identifizierung Magenkrebs-assoziierter Antigene mittels Immunoblots
  • 4.2.  Detaillierte Analysen von Massenspektren
  • 4.3.  Immunopräzipitation von H. pylori Antigenen
• Abkürzungen
• Referenzen
• Danksagung
• Publikationsliste
• Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1 : Patientenparameter.
• Tabelle 2 : Vergleich verschiedener Korrelationsanalysen. Die Tabelle zeigt die je nach verwendeter Methode unterschiedliche Anzahl der erkrankungskorrelierten Ag. Bemerkenswert ist hierbei der Unterschied zwischen Analysen mithilfe eines simplen Faktors und den statistischen Analysen.
• Tabelle 3 : Liste der identifizierten Magenkrebs-korrelierten Antigene.
• Tabelle 4 : Liste der Kontaminantenmassen und deren mögliche Quellen.
• Tabelle 5 : Untersuchung der Spotkomposition serumreaktiver Spots
• Tabelle 6 : Verteilung von GroEL Peaks.
• Tabelle 7 : PMF Identifizierungsergebnisse der IP Banden aus Abbildung 13.

Bilder

• Abbildung 1 : Langfristige Verlaufsmöglichkeiten der H. pylori Infektion. Während alle Infizierten Anzeichen einer Gastritis zeigen, wird der weitere Verlauf von Wirts-, Bakterien-, und/oder Umweltfaktoren beeinflusst. Magenkrebs und Ulkus sind divergierende Erkrankungen, die nur vereinzelt gemeinsam vorkommen. Das seltene MALT-Lymphom bleibt hier außer Acht.
• Abbildung 2 : Peptide Mass Fingerprint eines 2-DE separierten H. pylori Spots. Das Spektrum wurde mit dem 4700 Proteomics Analyzer aufgenommen. Alle zum Hitzeschockprotein 70 (HP0109) zugeordneten Peaks sind mit Pfeilspitzen gekennzeichnet. Die hohe Auflösung des Massen­spektrometers bis in den Bereich großer Massen wird in dem Zoomfenster des Peaks m/z = 3231,584 gezeigt – hier ist die Isotopenverteilung der Peptidmassen erkennbar.
• Abbildung 3 : Prinzipschema eines MALDI-TOF/TOF MS. Durch einen kurzen Laserblitz werden Matrix und Peptide desorbiert und ionisiert. Bei der Messung eines PMF (MALDI-TOF MS) werden die Ionen in Source 1 beschleunigt, durchfliegen die leere Kollisionszelle, werden im Reflektor umgelenkt sowie fokussiert und beim Eintreffen am Detektor wird die Flugzeit bestimmt. Bei der Messung eines MALDI-TOF/TOF Spektrums (MS/MS) werden die Ionen in Source 1 beschleunigt und an der Source 2 Ionenoptik wird das zu fragmentierende Peptid ausgewählt (1. TOF-Messung). Nur dieses Peptid wird nun abgebremst, gelangt in die Kollisionszelle und wird dort durch Stöße mit Gasatomen fragmentiert. Die entstandenen Fragmente werden in Source 2 erneut beschleunigt und ihre Flugzeit bis zum Detektor bestimmt (2. TOF-Messung). Die gesamte Messung findet im Hochvakuum statt.
• Abbildung 4 : Flussdiagramm der drei Teilprojekte meiner Promotion.
• Abbildung 5 : Vergleich eines großen 2-DE Gels (links) und eines großen 2-DE Immunoblots (rechts). Links ist ein silbergefärbtes 23 x 30 cm großes Gel von H. pylori Lysat zu sehen. Es enthält ca. 1800 Spots, deren Identifizierungsergebnisse interaktiv in unserer Datenbank (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-PAGE) erkundet werden können. Rechts ist ein 23 x 30 cm großer 2-DE Immunoblot mit 198 Spots zu sehen, der mit dem Serum eines Ulkuspatienten inkubiert wurde (Serum DU23). Durch die hohe Spezifität und Sensitivität der Methode wurden einerseits Spots detektiert, die nicht im Silbergel zu sehen sind, z.B. die diagonale Spotserie im oberen MG-Bereich; andererseits wurden viele abundante Proteine nicht von den Serum-AK erkannt.
• Abbildung 6 : Dendrogramm der hierarchischen Clusteranalyse und Beispiele von Immunoblots mit charakteristischen Spotmustern. Die Analyse basiert ausschließlich auf den Ag-Erkennungsmustern der 60 Blots. Die linke Skala zeigt die Distanz zwischen den einzelnen Blots an, d.h. je niedriger die waagerechten Verbindungslinien zwischen Blots ist, desto ähnlicher sind sich diese. Fünf gut erkennbare Gruppen von Blots wurden mit Nummern 1-5 beschriftet. Im unteren Teil ist für jede Gruppe ein Blot dargestellt, der typische Merkmale enthält (Pfeile, Erläuterungen im Text). Diese Blots geben einen guten Überblick über die Variabilität der Erkennungsmuster, die sich besonders in unterschiedlicher Anzahl und Intensität von Spots bemerkbar macht. Alle Seren wurden mit dem Kürzel der Erkrankung (GC = Magenkrebs (blau) oder DU = Ulkus (grün)) beschriftet und durchnummeriert.
• Abbildung 7 : Masterblot mit den Spotintensitäten der 14 von Magenkrebsseren stärker erkannten Spots. Dieser virtuelle Blot enthält alle 611 Spots der 60 Blots der Analyse. Die 14 Magenkrebs-spezifischen Spots (t-Test, p<0,01) sind mit Pfeilen markiert. Die bildnahen Kästchen enthalten die individuellen Spotintensitäten des jeweiligen Spots in den 60 Blots (30 links: GC=Magenkrebs, 30 rechts: DU= Ulkus). Die äußeren Boxen enthalten die Balken der Durchschnittsintensitäten (schwarzer Querbalken) und die Bereiche der Standardabweichungen (weiße Füllungen). Zu beachten ist, dass alle Intensitäten auf die Maximalintensität je Box normiert sind. SSP: automatisch generierte Spotnummer.
• Abbildung 8 : Kontaminantenpeaks im gesamten Datensatz. Die Höhe der Balken gibt die Anzahl der Spektren an, in denen die entsprechende Peakmasse vorkommt. Insgesamt 61 Massen wurden in mehr als 5% der Spektren gefunden (über dem grünschraffiertem Bereich) und als Kontaminanten definiert. Die Peptidmassen wurden mit dem MS-Screener mit 30 ppm Toleranz intervallisiert und gezählt.
• Abbildung 9 : Verteilung von GroEL Proteinspezies in einem 2-DE Gel und Immunoblot. Das Gel (links) wurde mit CBB G-250 gefärbt und der Immunoblot (rechts) mit einem Magenkrebsserum inkubiert. Die roten Dreiecke zeigen die 15 Spots, deren Hauptkomponente GroEL darstellt. Alle diese Spots wurden immer gemeinsam von den Serum-AK erkannt.
• Abbildung 10 : Ein Protein und sein Dimer. Ein Sektor des CBB G-250 gefärbten 2-DE Gels ist oben rechts zu sehen. Spot 312 enthält Dimere des Proteins aus Spot 413. In beiden Spots wurde Alkyl Hydroperoxide Reductase mit Sequenzabdeckungen von 48 bzw., 72% identifiziert (PMF Spektren links vom Gel). Die Sterne markieren die cysteinhaltigen Peptide, die nicht im Dimer detektiert wurden (Erläuterungen siehe Text).Die schwarzen Quadrate markieren Kontaminantenmassen im oberen Spektrum, die auftraten weil dieses Spektrum insgesamt sehr geringe Intensität aufwies. Zwei cysteinhaltige Peptide wurden mittels MALDI-TOF/TOF mit Mascotscores, dieextensive Homologie indizieren, bestätigt (untere MS/MS Spektren). Die gefundenen Fragmente sind im Spektrum gelabelt und die y und b-Serien sind in der Sequenz markiert. Ein * markiert einen Verlust von NH₃, eine 0 den Verlust an H₂O und int zeigt ein internes Fragment an.
• Abbildung 11 : Ergebnisse der Korrespondenzanalyse. Links sind die zweidimensionalen Faktorräume eines aus 284 PMF Spektren bestehenden Datensatzes dargestellt. Links oben: Faktorraum mit gesamter Datenmatrix (284 Spots x 1888 Massen). Links unten: Faktorraum nach dem Löschen der Massen mit kleinen Clusterbeiträgen aus der Datenmatrix (284 Spots x 94 Massen). Rechts: Gelsektor eines CBB G-250 gefärbten H. pylori Gels. Die Spotgruppen 1 und 2 sind jeweils im Faktorraum und im Gel markiert. Gefüllte Punkte – Spots, ungefüllte Vierecke – charakteristische Massen.
• Abbildung 12 : ELISA Ergebnisse zur Bestimmung der IgG Konzentrationen in den Eluaten. Es sind jeweils die OD Werte bei 450 nm für die verschiedenen Verdünnungen dargestellt. Zur Kontrolle wurde jeweils das Serum vor und nach der Inkubation mit den NC-Partikeln mitgemessen. Der obere Teil der Abbildung zeigt die OD für die H. pylori spezifischen IgG und unten werden die gesamt-IgG Werte gezeigt.
• Abbildung 13 : CBB G-250 gefärbtes Gel der IP mit NC-Partikeln angereicherter H. pylori-spezifischer AK (nicht-reduzierende Bedingungen). M – MG-Marker (Angaben in kD); L – 0,5 µl H. pylori Lysat; D1-D3 – je 5 µl der Durchläufe der Waschschritte vor der Elution; IP – gesamte IP Elutionsfraktionen aus drei Wiederholungen gepoolt und aufkonzentriert (links und rechts davon befinden sich je eine leere Spur); DIP – Durchlauf durch Ultrafree Röhrchen beim Aufkonzentrieren. In der IP Spur sind zehn Banden eingezeichnet, deren Identifizierungsergebnisse in Tabelle 7 aufgelistet sind.
• Abbildung 14 : Links: Silbergefärbtes Gel der IP mit NC-Partikeln angereicherter H. pylori-spezifischer AK und mit in Sepharose präinkubiertem H. pylori Lysat. M – MG Marker (in kD); L – H. pylori Lysat; E – Eluat der IP; K – Kontrolle ohne AK; Rechts: CBB G-250 gefärbtes Gel der IP mit allen Serum-AK. M – MG Marker (in kD); L – H. pylori Lysat; + Eluat der IP mit H. pylori positivem Patientenserum; – Eluat der IP mit H. pylori negativem Patientenserum, K – Kontrolle ohne AK.