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1.  Einleitung

1.1. Helicobacter pylori

1.1.1. Die Helicobacter pylori Infektion

Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein magenbesiedelndes Gram-negatives Bakterium. Es tritt entweder spiralförmig und unipolar begeißelt oder coccoid in Erscheinung und ist etwa 0,5 x 3 µm groß. H. pylori lebt unter mikroaeroben Bedingungen in der Region zwischen Magenschleimhaut und Magenepithelzellen. Dort ist es in der Lage eine Reihe von Erkrankungen zu verursachen – das Spektrum reicht von asymptomatischer Gastritis bis zum Magenkarzinom. Die Frage nach den Pathogenitätsmechanismen, besonders bei der Krebsentstehung, macht es zu einem äußerst wichtigen Untersuchungsobjekt.

In den Jahren 1983 und 1984 wurde dieses Bakterium erstmalig von Marshall und Warren als möglicher Verursacher von Gastritis und Ulkus duodeni genannt [1,2]. Diese Hypothese blieb lange Zeit umstritten, da man die Besiedlung mit H. pylori für eine rein opportunistische Infektion hielt [3].

H. pylori ist vermutlich die am weitesten verbreitete chronische Bakterieninfektion des Menschen [4]. Die Rate der infizierten Erwachsenen ist außerordentlich unterschiedlich, sie reicht von 20% in einigen Industrieländern bis zu 90% in einigen Entwicklungsländern [5,6]. Die hohe Durchseuchungsrate weist auf eine hervorragende Anpassung des Bakteriums an seinen Wirt hin. Es besteht die Vermutung, dass Menschen bereits seit Jahrtausenden mit H. pylori infiziert sind; eine Studie konnte große Wanderungs­bewegungen der Menschheit (z.B. die Besiedlung Amerikas vor ca. 12.000 Jahren) anhand der genetischen Variabilität einzelner Bakterienstämme nachvollziehen [7]. Die Übertragung von H. pylori erfolgt vermutlich auf fäkal-oralem oder oral-oralem Wege hauptsächlich in der Kindheit, wobei die genauen Transmissionswege immer noch unklar sind. Als natürliche Reservoirs werden die Menschen selbst genannt, andere Infektionsquellen könnten Trinkwasser, Hauskatzen oder sogar Hausfliegen sein. Die Infektion persistiert bei den meisten Betroffenen lebenslang völlig symptomlos. Durch das fehlende Verständnis der genauen Infektionswege ist eine Prävention schwierig [8].

Jede Infektion mit H. pylori führt zu einer komplexen Immunantwort. Es kommt zu einer lokalen Entzündungsreaktion und einem Anstieg der Cytokinkonzentrationen von IL-1ß, IL-2, IL-6 und IL-8 sowie der Einwanderung von Neutrophilen, Macrophagen, T- und B-Lymphozyten in die Magenschleimhaut [9,6]. Ebenso sind in der entzündeten Schleimhaut hohe Antikörpertiter der Klassen IgG, IgM und IgA zu finden. Einen sehr sensitiven Infektionsmarker stellt der Titer an [Seite 11↓]spezifischem Serum-IgG dar. Die T-Zell Antwort auf die H. pylori Infektion ist vom Th-1 Typ; die Th-2 Antwort wird herunterreguliert, was zu einer Überproduktion von Interferon-γ und somit der Aktivierung von Macrophagen und Neutrophilen führt. Diese Zellen erreichen keine effiziente Bekämpfung des Bakteriums sondern können sogar das Magenepithel schädigen [6]. Weitere evolutionäre Anpassungen des Bakteriums führen zu einer Abschwächung der Immunantwort. Beispiele hierfür sind das Abtöten von T-Zellen durch Fas-FasL Interaktionen sowie die molekulare Mimikrie von Wirtsantigenen des Lewis-Phänotyps durch H. pylori[10,11]. Insgesamt reicht die Reaktion des Immunsystems in vielen Fällen nicht aus, um die Infektion zu beseitigen [6], was die hohen Durchseuchungsraten erklärt.

Die meisten der H. pylori Infizierten bemerken lebenslang nichts von der Infektion. Trotzdem ist der Erreger in der Lage, bei einigen Menschen nach Jahrzehnten der Besiedlung Erkrankungen zu verursachen. Mit der Infektion erfolgt eine Entzündung der Magenschleimhaut, die meist unbemerkt lebenslang persistiert. Mit einer Wahrscheinlichkeit von geschätzten 10% kann sich im Laufe des Lebens ein gastroduodenales Ulkus entwickeln. Für ca. 90% aller Ulkus duodeni (im Weiteren als Ulkus bezeichnet) in Europa zeichnet sich H. pylori verantwortlich [12]. Gefährlicher jedoch ist die Möglichkeit der Krebsentstehung. Hier sind das Mucosa associated Lymphoid Tissue-Lymphom (MALT-Lymphom) und das Adenokarzinom des Magens (im Weiteren als Magenkrebs bezeichnet) zu nennen. Während erstere Erkrankung selten auftritt, ist die zweite eine der häufigsten Todesursachen bei Krebskranken (Inzidenz in Europa: 10/100.000 Menschen pro Jahr) [8,13]. H. pylori ist das erste Bakterium, das von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als „Gruppe I Karzinogen“ ausgewiesen wurde [8].

Bei Auftreten von Magenbeschwerden und/oder Diagnose einer der o.g. Erkrankungen in Zusammenhang mit einer H. pylori Infektion ist eine Therapierung angezeigt. Hierfür stehen eine ganze Reihe von Antibiotika (z.B. Amoxicillin, Clarithromycin, Metronidazol, Tetrazyklin, Wismutsubsalizylat) und Protonenpumpenhemmer (z.B. Omeprazol) zur Verfügung. Üblicherweise führt eine Kurzzeit-Tripeltherapie (zwei Antibiotika und ein Protonenpumpenhemmer) zu einer Sanierung in ca. 96% der Fälle [12]. Wesentliche Nachteile der Behandlung sind Komplikationen durch Nebenwirkungen, das Auftreten von resistenten Stämmen, die Reinfektionsgefahr und die hohen Kosten. Aus letzterem Grund ist die Anwendung der Therapie in Entwicklungsländern kaum möglich, aber gerade dort erreichen die Durchseuchungsraten Spitzenwerte. Ein weiterer gewichtiger Nachteil der Eradikation von H. pylori ist das verstärkte Auftreten von Ulzera des Ösophagus, des sogenannten BARRETT Ösophagus, der als Präkanzerose für das Ösophaguskarzinom gilt [14,15].


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1.1.2.  Suche nach Antigenen

Als Alternative zur medikamentösen Behandlung wird an der Entwicklung eines prophylaktischen und/oder therapeutischen Impfstoffes gegen H. pylori gearbeitet. Im Mausmodell gelangen bereits solche Immunisierungen. Beim Menschen waren die Versuche allerdings bisher ohne Durchbruch [12,16,17], obwohl das Mausmodell für Vakzinestudien weiterhin geeignet erscheint [18]. Große Bedeutung hat auch die Suche nach einem diagnostischen Test, mit dem Helicobacterinfizierte mit hohem Krebsrisiko von denen unterschieden werden könnten, die keine schweren Komplikationen zu erwarten haben. Dann wäre man in der Lage, Risikopatienten bereits lange vor den erstem Symptomen gegen H. pylori zu behandeln und somit bereits die Entstehung des Karzinoms zu verhindern. Zur Suche nach geeigneten Antigenen (Ag) für die beiden oben genannten Zwecke wurde unter anderem der hypothesefreie Ansatz von Immunoproteomics gewählt [19].

1.2. Immunoproteomics

1.2.1. Das Proteom und dessen Auftrennung

Das Proteom wurde von Wasinger et al. definiert als die Gesamtheit aller Proteine eines Genoms [20]; exakter definiert kann man darunter die Gesamtheit aller zu einem bestimmten Zeitpunkt an einem bestimmten Ort und unter bestimmten Umweltbedingungen vorhandenen Proteine verstehen. Im Vergleich zum Genom ist das Proteom also dynamischer und aufgrund diverser Regulationsmechanismen auch wesentlich komplexer (u.a. alternatives Spleißen, Posttranslationale Modifikationen (PTM), Degradation, Transport). Untersuchungsmethoden des Proteoms werden unter dem Begriff „Proteomics“ zusammengefasst, oft handelt es sich dabei um hypothesefreie Methoden. Die klassische, aber immer noch moderne, hypothesefreie Methode zur Untersuchung des Proteoms ist die zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2-DE) [21], die bereits vor ca. 30 Jahren erfunden wurde [22,23]. Hierbei werden komplexe Proteingemische unmittelbar nacheinander nach isoelektrischem Punkt (pI) und Molekulargewicht (MG) aufgetrennt. Das Ergebnis ist ein Muster an Punkten (Spots), die einzelne Proteinspezies darstellen [24]. Diese werden durch ihre exakte chemische Struktur definiert, können also z.B. modifiziert oder partiell degradiert sein. Die 2-DE ist in ihrer hochauflösenden Variante („Großgeltechnik“) in der Lage, etwa 5000 verschiedene Proteinspezies auf einem 23 x 30 cm großen Gel aufzulösen [24]. Die im Vergleich zu eukaryotischen Organismen geringere Komplexität von Prokaryoten- Proteomen macht diese für die 2-DE zu geeigneten Untersuchungsobjekten [19]. Für H. pylori 26695 mit 1590 vorhergesagten Genen [4] bedeutet die o.g. Auflösung der Gele, dass theoretisch mehr als drei Proteinspezies pro Gen detektiert werden können. Aufgrund der technischen Begrenzungen auf [Seite 13↓]pI-Werte zwischen 4 und 10 und MG-Werte zwischen 6 und 130 kD sowie der extrem unterschiedlichen Abundanz der Proteine, die von einer bis zu einigen hundert Millionen Kopien pro Zelle reichen, können nie alle Proteinspezies auf einem Gel aufgetrennt werden. Wie von den genetischen Studien über H. pylori zu erwarten, zeigte sich auch bei den Proteomen verschiedener Stämme eine hohe Variabilität, wie der Vergleich mit H. pylori J99 zeigte [25]. Die Proteomdatenbank am MPIIB (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-PAGE/) [26] enthält Informationen von verschiedenen Mikroorganismen, ermöglicht Suchabfragen und Recherchen zur funktionellen Klassifizierung von Proteinen. Unter anderem sind dort auch die Proteome der H. pylori Stämme 26695 und J99 sowie Subproteome (das Sekretom und Oberflächenproteine) öffentlich zugänglich [27,25,28].

Eine vielversprechende Impfstrategie gegen H. pylori ist die Verwendung eines attenuierten Salmonella Stammes, der rekombinante H. pylori Ag exprimiert [29,30,31,32,33]. Von besonderem Interesse ist es hierbei, das in-vivo Proteom der Salmonellen während der Infektion zu untersuchen, welches besondere Aufschlüsse über tatsächlich exprimierte Virulenzfaktoren zulässt.

1.2.2. Antigen-Erkennungsmuster von H. pylori

Bei Immunoproteomics wird der klassische Proteomics-Ansatz mit einer immunologischen Detektionsmethode verbunden [19,34]. Hierbei werden Ag auf zweidimensionalen Immunoblots (Western Blots) durch die Inkubation mit Antikörpern (AK), z.B. aus Patientenseren, detektiert. Die entstehenden Spotmuster werden als Ag-Erkennungsmuster bezeichnet. Mittels Datenbankvergleichs, Massenspektrometrie oder N-terminaler Sequenzierung können die so gefundenen Ag identifiziert werden. Auf diese Weise wurden bereits nicht nur H. pylori spezifische Ag identifiziert (Vaccinekandidaten) sondern auch Pathogenitätsfaktoren und deren Assoziation mit Erkrankungen (diagnostische Marker) untersucht.

McAtee et al. [35] verglichen mit dieser Methode die Ag-Erkennung eines Serumpools von 14 H. pylori Infizierten mit einem Kontrollserumpool von 14 H. pylori negativen Patienten. Insgesamt wurden mehr als 30 Antigene identifiziert. Einige bereits bekannte Ag wie Flagellin (Motilität), Urease (Pufferung des pH-Wertes), VacA (Schädigung von Magenepithelzellen durch Vakuolisierung) und CagA (vermutlich Transport in Epithelzellen durch Typ IV Sekretionsweg und Verstärkung der Entzündungsreaktion [36]) konnten mit dieser Studie bestätigt werden. Dies zeigte, dass Immunoproteomics eine geeignete Methode zum Auffinden von Ag ist. Ein Nachteil der Studie ist der Verlust jeglicher Information über die Variabilität der Immunreaktionen der einzelnen Patienten durch das Poolen der Seren.

In einer Studie von Kimmel et al. [37] wurden die Korrelationen von Ag mit verschiedenen [Seite 14↓]Erkrankungen untersucht. Hierbei wurden 2-DE Immunoblots von H. pylori positiven Patienten mit Gastritis (6 Patientenseren), Ulkus ventriculi oder Ulkus (5), Magenkrebs (4) sowie MALT-Lymphom (1) verglichen. Als Kontrolle wurden fünf H. pylori negative Seren verwendet. In dieser Arbeit konnten 29 Ag identifiziert werden, die teilweise mit denen der Studie von McAtee et al. [35] übereinstimmten. Die außerordentlich großen Variabilitäten der Immunreaktionen der einzelnen Patienten führten dazu, dass keine Korrelationen zwischen Ag und Erkrankungen gefunden wurden. Die Autoren vermuten folgende Ursachen: mögliche Ag könnten unter dem Detektionslimit der Methode liegen, H. pylori könnte in Kultur nicht alle Virulenzfaktoren exprimieren oder die Anzahl der untersuchten Seren pro Erkrankungsgruppe könnte zu gering gewesen sein.

In einer Studie aus unserem Institut [38] wurde eine größere Anzahl von Patientenseren mit kleinen 2-DE Blots (7 x 8 cm) untersucht. Zur Identifizierung von Vaccinekandidaten erfolgte der Vergleich von zwölf Seren nicht infizierter Patienten mit 24 Infizierten. Außerdem wurden in dieser Studie 15 Gastritis-, neun Ulkus-, fünf Magenkrebs- und ein MALT-Lymphom- Patientenserum verglichen. Insgesamt konnten 32 Ag identifiziert werden, von denen neun bisher nicht bekannt waren. Es wurden auch Ag gefunden, die mit der Erkrankung der Patienten korrelierten. Zum Beispiel wurden 15 Ag identifiziert, die bevorzugt von Magenkrebspatienten im Vergleich mit Ulkus­patienten erkannt wurden.

Es gibt eine ganze Reihe weiterer Veröffentlichungen, die mit der o.g. Immunoproteomics Methode H. pylori Ag identifiziert haben, hier aber nur erwähnt werden sollen [39,40,41,42]. Aus all diesen Studien resultiert eine Anzahl von Ag, die potentielle Kandidaten für Impfstoffe oder diagnostische Marker sind. Sabarth et al. [43] haben versucht, durch eine Multiparameter–Selektion aus 59 Ag diejenigen zu finden, die das höchste protektive Potential aufweisen und als Impfstoffkandidaten besonders geeignet erscheinen. Im Tiermodell zeigten die so selektierten Antigene bereits vielversprechende Ergebnisse.

1.2.3. Fokus: H. pylori Antigene als diagnostische Marker

Meine Arbeit befasst sich in besonderem Maße mit der Suche nach Ag, die als diagnostische Marker für Magenkrebsverwendet werden könnten. Wie bereits erwähnt, könnte mit einer einfachen diagnostischen Methode ein „Bevölkerungsscreening“ durchgeführt werden, mit dem man in der Lage wäre, die geringe Anzahl an H. pylori infizierten Menschen mit hohem Magenkrebs-Risiko aus der großen Menge der „unkritischen“ Infizierten herauszufiltern. Da Serum IgG gute Infektionsmarker darstellen, wäre hierfür ein einfacher serologischer Test gut geeignet [6]. Bei Risikopatienten könnte sofort nach dem Test die Eradikation von H. pylori durchgeführt werden, also lange bevor erste Beschwerden auftreten. Diese prophylaktische [Seite 15↓]Maßnahme wäre möglicherweise in der Lage den Sieg gegen den Magenkrebs einzuläuten, denn es wird vermutet, dass etwa 90% aller Magenkrebfälle ursächlich auf eine aktive oder überstandene H. pylori Infektion zurückzuführen sind [12]. Die bereits bekannten Virulenzfaktoren wie z.B. cag PAI („Cag-Pathogenitätsinsel“ – ein Genabschnitt mit 27 Genen) oder vacA erhöhen vermutlich allgemein das Risiko schwerer Erkrankungen [44], sind allerdings nicht direkt mit einer Erkrankung korreliert [45]. Somit ist die spezifische Suche nach Erkrankungs-korrelierten Ag notwendig.

Ein günstiger Startpunkt für die Suche nach Magenkrebs-assoziierten Ag mittels Immunoproteomics ist der Vergleich der Ag-Erkennungsmuster mit einer klinisch divergierenden Erkrankung gleicher Ursache. Ein Beispiel für eine solche Erkrankung ist das ebenfalls meist von H. pylori verursachte Ulkus [46,47]. Patienten mit Ulkus sind gut davor geschützt zusätzlich an Magenkrebs zu erkranken da beide Erkrankungen nur selten gemeinsam auftreten [48,49,50,51]. Abbildung 1 zeigt mögliche langfristige Verläufe der H. pylori Infektion. Ein Indikator für den Erkrankungsverlauf scheint die Magensäuresekretion zu sein; Hyposekretion ist ein Risikofaktor für Magenkrebs, wohingegen Hypersekretion das Ulkusrisiko erhöht [52].

Abbildung 1 : Langfristige Verlaufsmöglichkeiten der H. pylori Infektion. Während alle Infizierten Anzeichen einer Gastritis zeigen, wird der weitere Verlauf von Wirts-, Bakterien-, und/oder Umweltfaktoren beeinflusst. Magenkrebs und Ulkus sind divergierende Erkrankungen, die nur vereinzelt gemeinsam vorkommen. Das seltene MALT-Lymphom bleibt hier außer Acht.

Für die Entstehung von Magenkrebs wird ein multifaktorieller Mechanismus vermutet. Die chronische Entzündung der Magenschleimhaut sowie die damit verbundene Epithelzellschädigung führt zu einer erhöhten Zellproliferation. Durch erhöhte DNA Replikation steigt die Fehlerrate. Dieser Effekt wird verstärkt durch die entzündungsbedingte Erhöhung der [Seite 16↓]Konzentration an reaktiven Sauerstoffradikalen, die Verringerung der Konzentration an antioxidativen Substanzen (z.B. Ascorbinsäure) und die Entstehung kanzerogener Nitrosamine [46,47]. Die Krebsentstehung geht mit einer Erhöhung des Magen pH-Wertes bedingt durch die Schädigung der säuresekretierenden Zellen (Atrophie) einher, was zu einer Ausbreitung von H. pylori im Korpus des Magens beiträgt [53]. Dies führt in einem Kreislauf zur weiteren Verschlechterung des Zustandes und könnte letztendlich eine Ursache der Krebsentstehung sein. Die Eradikation von H. pylori führt in den meisten Fällen zu einer Normalisierung der Säuresekretion [47] und ebenso zur Verringerung des Krebsrisikos.

Eine Reihe von Autoren beschäftigten sich bereits mit der Frage, welche Faktoren über den Verlauf der Infektion entscheiden. Es kommen prinzipiell drei Möglichkeiten in Frage. Erstens: Wirtsfaktoren wie z.B. genetische Prädispositionen könnten eine wichtige Rolle spielen. Polymorphismen der IL-1β und TNF-A Gene wurden bereits als Risikofaktoren beschrieben [54,9]. Ein reines Screening nach IL-1β Polymorphismen scheint allerdings nicht für eine Vorhersage auszureichen [55]. Als zweites könnten Bakterienfaktoren entscheidend sein. Hierfür spricht die hohe genetische Diversität der bekannten H. pylori Stämme und im besonderen die unterschiedliche Expression von Virulenzfaktoren [56,25,57,58] sowie die o.g. Studie von Haas et al. [38]. Drittens könnten auch Umweltfaktoren eine Rolle spielen. Eine gesunde und vitaminreiche Ernährung kann zu einer Verringerung des Risikos führen [9].

1.2.4.  Die Komposition von 2-DE separierten Spots

Die 2-DE stellt ein Verfahren zur Trennung komplexer Proteingemische dar. Das hohe Auflösungsvermögen dieser Methode führte zu der allgemein verbreiteten Ansicht, dass klar separierte Spots einzelne Protein­spezies darstellen. Dies ist jedoch nicht immer der Fall, wie Untersuchungen unserer Gruppe gezeigt haben [59]. Ein Spot kann neben einem Protein als Hauptkomponente noch ein oder mehrere Nebenkomponenten enthalten, die entweder andere Proteinspezies des gleichen Proteins oder gänzlich andere Proteine sind. Während die Hauptkomponente eines Spots leicht mit einer Datenbanksuche eines PMFs identifiziert wird, bleiben Nebenkomponenten, die in geringerer Menge im Spot vorliegen, bei einer solchen Analyse meist unerkannt. In Umkehrung können auch Proteine in mehreren Spots über das Gel verteilt auftreten. Diese Proteinspezies unterscheiden sich im Laufverhalten während der 2-DE, also in MG und/oder pI, was durch verschiedene Größen der Proteinspezies und/oder durch Modifikationen verursacht wird. Dabei ist es ein prinzipieller Vorteil von Immunoproteomics, eventuelle Unterschiede in Immunogenität bzw. Antigenität einzelner Spezies eines Proteins erkennen zu können.

Die mögliche Zusammensetzung von Spots aus mehreren Komponenten hat den Nachteil, dass [Seite 17↓]bei hochsensitiven Detektionsmethoden nicht eindeutig festgestellt werden kann, welche der Komponenten des Spots detektiert wird. Dies trifft auch für die Ag-AK Wechselwirkung zu, wie sie beim Immunoblotting stattfindet. Falls ein hochaffiner AK aus dem Patientenserum eine Nebenkomponente anstelle der Hauptkomponente eines Spots erkennt, kann dies nicht unterschieden werden, da in beiden Fällen der Spot vom sekundären AK detektiert wird. Um das tatsächlich erkannte Ag mit hoher Sicherheit zu identifizieren, müssen möglichst alle Komponenten des betroffenen Spots gefunden werden. Hierfür können z.B. Ähnlichkeiten zwischen den Massenspektren der Spots genutzt werden (s. Kapitel 1.4.3).

1.3. Immunopräzipitation

1.3.1. Konformationelle Epitope

Immunoblots haben hinsichtlich der Ag-Erkennung eine Einschränkung: durch die Auftrennung der Proteine mittels 2-DE werden u.a. durch die hohen Konzentrationen an Harnstoff im Probenpuffer die Proteine partiell aufgefaltet. Dies zerstört die native dreidimensionale Struktur für viele Proteine unwiederbringlich. Da AK nicht nur gegen sequentielle sondern auch gegen konformationelle Epitope gerichtet sein können, sind letztere mit Immunoblots nicht detektierbar. Um diese zusätzliche Untergruppe von Ag der Analyse zugänglich zu machen, soll die Immunopräzipitation (IP) eingesetzt werden. Hierbei handelt es sich um eine Methode, bei der die Ag-AK Wechselwirkung unter physiologischen Bedingungen in wässriger Lösung stattfinden kann. Üblicherweise werden die AK über die Bindung an Protein-G, welches eine hohe Affinität für die Fc-Region von Immunoglobulinen aufweist, an Sepharose gebunden. Diese Aufschlämmung wird dann mit dem Bakterienlysat inkubiert, so dass Ag an die IgG der Protein-G Sepharose binden können. Nach dem Waschen können nun die Ag unter nicht-physiologischen Bedingungen eluiert und anschließend z.B. mittels 1-DE oder 2-DE aufgetrennt werden. Eine Reihe von Studien haben bereits IPs in Verbindung mit 2-DE erfolgreich genutzt [60,61,62,63]. Zusätzlich hat die IP den prinzipiellen Vorteil, dass keine Beschränkungen hinsichtlich MG und pI der präzipitierbaren Proteine auftreten. Obwohl die meisten Ag polyklonale Immunantworten hervorrufen, die höchstwahrscheinlich AK sowohl gegen sequentielle als auch gegen konformationelle Epitope bilden, kann die IP als ergänzende Methode zu dem Immunoblots gesehen werden, da die Hoffnung besteht, mittels einer komplementären Herangehensweise zusätzliche Ag zu finden. Parallel zur Studie mit den Immunoblots könnten hier die IPs von Magenkrebs- und Ulkus-Patientenseren verglichen werden.


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1.3.2.  Immunopräzipitation mit Patientenseren

Üblicherweise werden für IPs gereinigte AK verwendet um das betreffende Ag hochspezifisch zu präzipitieren. In diesem Fall liegen die AK jedoch in Form von Patientenseren vor, also sind, konservativ geschätzt, nur 1% der AK spezifisch gegen H. pylori gerichtet. Aus diesem Grund sollen diese AK mittels Affinitätsreinigung angereichert und dann erst an Protein-G Sepharose gebunden werden. Diese Prozedur soll das unspezifische Binden von crossreaktiven Ag verringern. Für die Affinitätsreinigung sollen entweder Nitrocellulosepartikel (NC-Partikel) oder Bakterienoberflächen verwendet werden. Die frisch hergestellten NC-Partikel [64] werden mit Bakterienlysat „beladen“ und anschließend können durch Inkubation mit Patientenserum die spezifischen AK gebunden und am Ende eluiert werden. Für die Durchführung des Experiments muss beachtet werden, dass nur eine geringe Menge an Serum (max. 500 µl pro Patient) vorhandenen ist. Folgende Abschätzung soll aber die prinzipielle Durchführbarkeit darlegen: humanes Serum enthält etwa 13 mg/ml IgG; jedes IgG Molekül kann im molaren Maßstab 1:2 Ag binden; das MG von IgG = 146 kD; bei durchschnittlich 73 kD großen Ag kann also IgG im MG-Verhältnis 1:1 Ag binden. Wenn nun 1% der IgG im humanen Serum H. pylori spezifisch sind (0,13 mg/ml), können mit 500 µl Serum 65 µg Ag präzipitiert werden. Diese Menge würde für die Auftrennung in 2-DE mittels „Kleingeltechnik“ ausreichen. Zusätzlich könnten die AK durch kovalente Kopplung an die Protein-G Sepharose mehrfach für IPs verwendet werden.

1.4. MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie

1.4.1. Identifizierung von Proteinen

1.4.1.1. Ionisierung der Peptide

Nachdem Sir J. J. Thomson bereits im Jahre 1912 ein Massenspektrometer vorgestellt hatte, dauerte es noch bis in die 1980iger Jahre bis langkettige Biomoleküle durch „sanfte“ Ionisierungsmethoden der Analyse zugänglich wurden. Im Jahre 1988 wurde die Elektrospray-Ionisierung (ESI) erstmals zur Messung gelöster Polypeptide eingesetzt [65]. Ein weiteres sanftes Ionisierungsverfahren ist die Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation (MALDI) Technik, die im Jahre 1987 erstmals präsentiert [66] und 1988 für Proteine angewendet wurde [67]. Für diese beiden Ionisierungstechniken gab es im Jahre 2002 den Nobelpreis für John B. Fenn (ESI) und Koichi Tanaka (MALDI).

Die in dieser Arbeit vorgestellte MALDI Technik ermöglicht die Ionisierung von zwischen Matrixkristallen eingelagerten Peptiden oder Proteinen durch Laserbeschuss. Das Prinzip ist einfach: die Energie eines Laserpulses wird von den Matrixmolekülen absorbiert und auf die [Seite 19↓]Peptide übertragen. Diese desorbieren von der Oberfläche des Probenträgers in einer „Wolke“ aus protonierten Peptiden und Elektronen. Die meisten dieser Ionen werden durch die Elektronen neutralisiert und am Ende des Prozesses „überleben“ fast ausschließlich einfach geladene Analytmoleküle [68]. Voraussetzung hierfür sind jedoch Matrices, die Absorption und Transfer der Laserenergie, dessen Wellenlänge am Absorptionsmaximum der Matrix liegt, ohne Schädigung der Analyten ermöglichen. Beispiele hierfür sind die häufig verwendeten organischen Säuren 2,5-Dihydroxybenzoesäure und α-cyano-4-hydroxy-Zimtsäure. Die wesentlichen Vorteile der MALDI- gegenüber der ESI-Ionisierung sind die beinahe ausschließliche Entstehung einfach geladener Ionen, die relativ hohe Toleranz gegenüber Verunreinigungen, z.B. mit Salzen oder Detergenzien, sowie die schnelle Identifizierung von Proben mit geringerer Komplexität.

1.4.1.2. Analyse der Peptidmassen

In Kombination mit der MALDI Ionisierung wird meist eine Flugzeitmassenanalyse (TOF = time of flight) eingesetzt. Hierbei werden die Analytionen in einem elektrischen Feld beschleunigt und im feldfreien Raum geschieht die Separation nach der Geschwindigkeit der Teilchen. Erfolgt nun eine Messung der Flugzeit, so kann die Masse wie folgt berechnet werden:

Da die Parameter z, e, U und s während einer Messung festgelegt sind, ist die Masse pro Ladung proportional zum Quadrat der Flugzeit und kann mittels Messung der letzteren exakt bestimmt werden. Da bei der Ionisierung mittels MALDI fast ausschließlich einfach geladene Ionen entstehen (z=1) ist die Masse leicht zu bestimmen. Ein großer Vorteil der TOF Messung ist die hohe Genauigkeit der Massenbestimmung. Ein Nachteil ist, dass nur definiert gepulste Messungen durchgeführt werden können und somit keine einfache online Kopplung mit der Flüssigkeits­chromatographie möglich ist. Die Detektion der geladenen Teilchen erfolgt mit einer Vielkanalplatte (Microchannel Plate). Weitere technische „Tricks“ verbessern die Auflösung und Massengenauigkeit:

In Abbildung 3 ist auch das Prinzip einer MALDI-TOF MS Messung dargestellt.

1.4.1.3. Peptide Mass Fingerprint

In Analogie zum Fingerabdruck in der Kriminologie, der durch Vergleich bestimmter Merkmale eine sehr sichere Identifizierung einer Person erlaubt, kann ein Protein durch einen Peptidmassen-Fingerabdruck (PMF = Peptide Mass Fingerprint, Abbildung 2) identifiziert werden. Hierzu wird das Protein durch ein Enzym spezifisch an bestimmten Schnittstellen geschnitten, so dass charakteristische Peptide entstehen. Vergleicht man die gemessenen Peptidmassen einer Probe mit den theoretisch verdauten Massen einer Proteindatenbank, so ist die Identifizierung eines Proteins unter Angabe der Irrtumswahrscheinlichkeit möglich. Hierzu sind keine experimentellen Informationen über die eigentliche Sequenz der Aminosäuren (AS) nötig. Häufig wird das zu identifizierende Protein mit Trypsin verdaut, das spezifisch nach Arginin und Lysin schneidet. Ein wesentlicher Nachteil der Prozedur ist, dass Proteine nur dann identifiziert werden können, wenn sie in einer Datenbank eingetragen sind oder in anderen Organismen Homologe vorkommen.


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Abbildung 2 : Peptide Mass Fingerprint eines 2-DE separierten H. pylori Spots. Das Spektrum wurde mit dem 4700 Proteomics Analyzer aufgenommen. Alle zum Hitzeschockprotein 70 (HP0109) zugeordneten Peaks sind mit Pfeilspitzen gekennzeichnet. Die hohe Auflösung des Massen­spektrometers bis in den Bereich großer Massen wird in dem Zoomfenster des Peaks m/z = 3231,584 gezeigt – hier ist die Isotopenverteilung der Peptidmassen erkennbar.

1.4.1.4. Tandem Massenspektrometrie

Werden Peptide in einem Massenspektrometer fragmentiert und die Massen der Fragmente bestimmt, spricht man von Tandem Massenspektrometrie (MS/MS). Dies kann z.B. in einem MALDI-TOF/TOF MS passieren. Das Prinzip der Messung wird in Abbildung 3 erläutert. Nach Beschleunigung (meist mit 20 kV) und zeitlicher Auswahl des zu fragmentierenden Peptids („Timed Ion Selector“) gelangt dieses in die Kollisionszelle. Durch das Abbremsen der Peptide vor Eintritt in die Zelle (üblicherweise bis auf 1 oder 2 keV Energie) und verschiedene Gasdrücke können Stoßenergien eingestellt werden, die bevorzugt zu Fragmentierungen an den Peptidbindungen oder von Seitenketten führen. Die Fragmente werden anschließend in Source 2 wieder beschleunigt und die Auftrennung nach Flugzeit erfolgt im anschließenden Flugrohr und Reflektor. Durch die kürzere Länge des verbleibenden Flugrohres und Unschärfen, die bei den Stoßprozessen entstehen, ist die Massen­genauigkeit bei MS/MS Spektren deutlich niedriger als bei PMFs. Ein Vorteil dieser Fragmentierungsmethode ist, dass die Peptide hauptsächlich an der Peptidbindung fragmentieren, so dass die Massendifferenzen zwischen den Fragmenten AS [Seite 22↓]entsprechen, die idealerweise aus dem Spektrum abgelesen werden können. Sind die Fragmente vom C-Terminus her intakt, spricht man von y-Ionen; sind sie hingegen vom N-Terminus her intakt, spricht man von b-Ionen. Es gibt noch eine ganze Reihe weiterer Fragmente, die durch Brüche an anderen Bindungen entstehen, die aber bei MALDI-TOF/TOF relativ selten auftreten (a, c, x, z sowie interne Fragmente). Mithilfe von MS/MS Spektren können vielfältige Informationen über die AS-Sequenz gewonnen werden. Dies eignet sich besonders für die Bestätigung von nicht-eindeutigen Identifizierungen mittels PMF und die Charakterisierung von PTMs. Die Suche basiert dabei genau wie beim PMF auf dem Vergleich mit einer Datenbank. In Idealfällen ist allerdings auch eine de-novo Sequenzierung möglich, d.h. ein Ablesen längerer AS-Sequenzen direkt aus dem Spektrum.

Abbildung 3 : Prinzipschema eines MALDI-TOF/TOF MS. Durch einen kurzen Laserblitz werden Matrix und Peptide desorbiert und ionisiert. Bei der Messung eines PMF (MALDI-TOF MS) werden die Ionen in Source 1 beschleunigt, durchfliegen die leere Kollisionszelle, werden im Reflektor umgelenkt sowie fokussiert und beim Eintreffen am Detektor wird die Flugzeit bestimmt. Bei der Messung eines MALDI-TOF/TOF Spektrums (MS/MS) werden die Ionen in Source 1 beschleunigt und an der Source 2 Ionenoptik wird das zu fragmentierende Peptid ausgewählt (1. TOF-Messung). Nur dieses Peptid wird nun abgebremst, gelangt in die Kollisionszelle und wird dort durch Stöße mit Gasatomen fragmentiert. Die entstandenen Fragmente werden in Source 2 erneut beschleunigt und ihre Flugzeit bis zum Detektor bestimmt (2. TOF-Messung). Die gesamte Messung findet im Hochvakuum statt.

1.4.2. Automatisierung des Identifizierungsprozesses

Eine moderne Geräteausstattung erlaubt die Identifizierung von Proteinen im Hochdurchsatz. Folgende Geräte sind hierfür erhältlich: Roboterstationen für das Ausstechen, Verdauen der Spots und Auftragen der Peptide auf die Probenplatte; MALDI-TOF/TOF Massen­spektrometer mit automatischen Messmodi, Datenprozessierung und –interpretation; und Auswertesoftwares für automatische Datenbanksuchen. Mit derartiger Ausstattung wurden Durchsätze von 15.000 [Seite 23↓]Spots pro Tag berichtet [69]. Entscheidende Schwierigkeiten bestehen aber bei allen Prozessen, die manuelle Kontrollen benötigen. Dazu gehören insbesondere die Auswahl der zu identifizierenden Spots (Bildanalyse) und die Interpretation der Datenbanksuchergebnisse. Für komplexere Fragestellungen wie die Analyse von PTMs, Bestätigung von Identifizierungskandidaten und die Suche nach weiteren Spotkomponenten sind diese Techniken nur bedingt geeignet und die Auswertung muss weitgehend manuell erfolgen. Für derartige Fragestellungen ist es sinnvoll, eine Strategie zu wählen, die den Anteil an manueller Arbeit minimiert. Eine Möglichkeit die Sicherheit automatischer Identifizierungen zu erhöhen ist die Wiederholung der Messungen mit unabhängig präparierten Proben, so dass nur noch widersprüchliche Suchergebnisse manuell kontrolliert werden müssen. Auch können automatische Datenbanksuchen bereits mit verschiedenen Parametern durchgeführt werden, so dass die bei der nachfolgenden manuellen Kontrolle eventuell benötigten Ergebnisse dann bereits vorliegen. Für weniger komplexe Fragestellungen wie die Identifizierung aller Spots eines Gels, z.B. für das in-vivo S. enterica Proteom, sind Hochdurchsatzverfahren sehr gut geeignet.

1.4.3.  Suche nach Nebenkomponenten in Spots

1.4.3.1. Die Spotkomposition

Aufgrund des hohen Auflösungsvermögens der 2-DE wird vielfach davon ausgegangen, dass ein Spot genau ein Protein bzw. eine Proteinspezies enthält. Wie bereits in Kapitel 1.2.4 erwähnt, ist dies jedoch nicht immer der Fall. Einerseits können Proteine in verschiedenen Spots über ein Gel verteilt auftreten und andererseits können Spots aus mehreren Komponenten bestehen. Die genaue Analyse der Spotkompositionen ist eine wichtige Voraussetzung sowohl für quantitative Analysen als auch für hochspezifische Detektionsmethoden wie u.a. bei Immunoblots. Automatische Datenbanksuchen führen meist nur zur Identifizierung der Hauptkomponente eines Spots. Die Suche nach weiteren Komponenten mithilfe von nicht zuordenbaren Peaks in den PMFs ist sehr aufwendig und derzeit nicht automatisiert möglich. Liegt nun ein großer Datensatz mit vielen Spektren eines Gels vor, so kann mit statistischen Methoden versucht werden, Ähnlichkeiten zwischen den Spektren zu nutzen, um Nebenkomponenten in Spots zu finden. Wenn beispielsweise ein Protein neben dem Hauptspot noch in mehreren anderen Spots als Nebenkomponente auftritt, sind einige Peptidmassen in den Spektren gleich, welche bei Verwendung geeigneter Verfahren, z.B. von Clusteranalysen, gefunden werden können.

1.4.3.2. Voranalyse mittels „MS-Screener“

Für das Clustern von MS-Daten werden zuerst Peaklisten erzeugt. Einige Peaks enthalten [Seite 24↓]allerdings keine Spot-spezifischen Informationen, da sie in vielen Spots vorkommen, wie z.B. Trypsin- und Matrixpeaks - diese werden hier als Kontaminanten bezeichnet. In einer statistischen Analyse würden solche Peaks zu einer Gruppierung führen und sollten daher zuerst entfernt werden. Außerdem werden die MS-Daten in Form einer Datenmatrix benötigt, um weitere Analysen durchführen zu können. Zu diesem Zwecke wurde in unserer Arbeitsgruppe das Softwareprogramm „MS-Screener“ entwickelt [59]. Nach dem Einladen der Peaklisten eines Datensatzes können damit Kontaminantenpeaks entfernt werden, Spektren miteinander verglichen und am Ende die Daten intervallisiert als Matrix exportiert werden. Eine Intervallisierung ist nötig, da aufgrund von Messungenauigkeiten für ein Peptid Massen­abweichungen zwischen verschiedenen Spektren auftreten, und trotzdem jedes Peptid in die korrekte Spalte der Matrix zugeordnet werden soll. Eine weitere Fähigkeit des MS-Screener ist die graphische Darstellung der Peakmassen und ihrer Nachkommastellen um Peptide von anderen Substanzen unterscheiden zu können. Aufgrund der elementaren Zusammensetzung von Peptiden sind die Nachkommastellen der Massen nicht gleichverteilt, sondern folgen linear der Masse an sich. Entsprechend der „Half decimal place rule“ (HDPR) berechnet sich die erste Nachkommastelle als die Hälfte der ersten Ziffer (500-999 Da und 2000-3000 Da) bzw. der ersten beiden Ziffern (1000-1999 Da) [70]. Für ein Peptid mit 1000 Da ist also eine Nachkommastelle von etwa fünf zu erwarten (= 1000,5 Da). Peakmassen, die weit von dieser Regel abweichen, stammen höchstwahrscheinlich nicht von Peptiden, sondern z.B. von Matrixclustern oder anderen Verunreinigungen. Eine Analyse eines Datensatzes in bezug auf die HDPR ermöglicht also das Finden weitere Kontaminanten.

1.4.3.3. Analyse mit multivariaten statistischen Methoden

Bei multivariaten Verfahren wird nicht eine Variable isoliert, sondern das Zusammenwirken mehrerer Variablen in einem Datensatz gleichzeitig untersucht. Im Falle eines Satzes von MS Daten wird also nicht das Vorkommen einzelner Massen analysiert, sondern es werden die Ähnlichkeiten ganzer Spektren miteinander verglichen und bewertet. Spektren, die bei der Analyse die größte Anzahl gemeinsamer Massen haben, also stark verwandt sind, werden einer Gruppe zugeordnet. Clusteranalysen und die Korrespondenzanalyse stellen typische multivariate statistische Methoden dar.

Hierarchisches Clustern

Verschiedene multivariate statistische Analysen wurden bereits zur Analyse von 2-DE Daten angewendet [71,72,73], hier sollen diese Methoden jedoch für Massenspektren Verwendung finden. Das hierarchische agglomerative Clusterverfahren liefert Aussagen über die globale Ähnlichkeit von Daten. Hierzu wird zuerst jedem Datenpunkt der ähnlichste Partner zugeordnet. [Seite 25↓]Durch Mittelung der Werte der Pärchen kann im nächsten Schritt ein weiterer verwandter Partner zugeordnet werden. Somit entsteht agglomerativ eine Baumstruktur (ausgegeben als Dendrogramm), in der ähnliche Datenpunkte nahe beieinander liegen. Zusätzlich wird ein Distanzmaß ausgegeben, das die Ähnlichkeiten zwischen den einzelnen Datenpunkten quantifiziert. Mit dieser Methode wurden bereits Spots eines Gels identifiziert, die GroEL als Haupt- bzw. Nebenkomponente enthielten [59].

Korrespondenzanalyse

Die Korrespondenzanalyse (KA) ermöglicht die Untersuchung von Assoziationen zwischen Objekten und Merkmalen, indem der hochdimensionale Datenraum in einen zweidimensionalen Faktorraum projiziert wird. Diese Methode hat den entscheidenden Vorteil, dass Objekte und Merkmale gleichzeitig dargestellt werden können. Für die Analyse von Massenspektren wurde die mit dem MS-Screener erstellte Datenmatrix aus intervallisierten Peaklisten verwendet. Hier stellen die Peaklisten der Spots die Objekte und die Massenintervalle die Merkmale dar. Durch die Projektion vom hochdimensionalen Datenraum (z.B. 284 Spots x 1600 Massen) in eine zweidimensionale Fläche können per Auge Gruppen von ähnlichen Spots und gleichzeitig die für diese Gruppen charakteristischen Massen gefunden werden. Da die Datenmatrix für alle Massenintervalle in denen kein Peak vorkommt den Wert null hat, wurden die Daten mit einem kleinen additiven Beitrag verrauscht, der auf die Ergebnisse der Analyse keinerlei Einfluss hatte. Wesentliche Vorteile gegenüber dem hierarchischen Clustern sind, dass keine künstliche Pärchenbildung stattfindet und dass mit den Gruppen gleichzeitig deren wichtigste Merkmale identifiziert werden können. Für die Realisierung der KA wurde von R. Wessel und K.-P. Pleißner ein Softwareprogramm geschrieben, dass die Berechnungen in Anlehnung an [72] realisiert. Der Nachteil der Methode, dass bei großen Datensätzen nur wenige Gruppen von Spots in einer einzigen Fläche gefunden werden können, wurde mit dieser Arbeit durch eine Weiterentwicklung der Software, die jetzt CorrAn genannt wird, ausgeglichen [74]. Durch die Ausgabe der absoluten Beiträge der Merkmale zu den Clustern, ermöglicht die KA das selektive Löschen von Beiträgen, die ober- oder unterhalb einer bestimmten Schwelle liegen. Durch Implementierung der Schwellensetzung in CorrAn wurde ein iteratives Vorgehen möglich, indem schrittweise mit Versuch und Irrtum der Datensatz reduziert und jeweils erneut eine KA berechnet wird. Das Ziel dieser Prozedur ist es, mit jedem Schritt Gruppen von Spots zum Vorschein zu bringen, deren charakteristische Merkmale sonst durch die Größe des Datensatzes untergehen. Werden also in der ersten Iteration nur Gruppen von Spots mit einem bestimmten Protein als Hauptkomponente gefunden, so können durch weitere Iterationen auch Gruppen gefunden werden, die ein Protein als Haupt- oder Nebenkomponente enthalten. Durch die genaue Analyse solcher Gruppen können also Nebenkomponenten in Spots gefunden und später mit [Seite 26↓]MS/MS bestätigt werden.

1.5. Ziele dieser Arbeit

Meine Doktorarbeit besteht aus drei Teilprojekten: 1. Identifizierung Magenkrebs-korrelierter Ag mittels Immunoblots, 2. Untersuchung der Komposition von 2-DE separierten Spots und 3. IP von H. pylori Ag. In einem Flussdiagramm (Abbildung 4) sind die wichtigsten Arbeiten zusammengefasst und die Zusammenhänge zwischen den Projekten dargestellt. Das Ziel aller Projekte ist es, durch hypothesefreie Herangehensweisen diagnostische Markerkandidaten für das von H. pylori verursachte Magenkarzinom zu finden. Der Vergleich der Ag-Erkennung der Seren H. pylori infizierter Patienten, die unter den divergierenden Erkrankungen Magenkrebs bzw. Ulkus leiden, sowohl mit Immunoblots als auch mit einer IP soll Magenkrebs-korrelierte Ag identifizieren, die Serummarker für diese Erkrankung darstellen. Falls diese Marker auch prognostischen Wert haben, könnte ein einfacher Bluttest H. pylori Infizierte mit hohem Magenkrebsrisiko identifizieren.

Trotz einiger Zweifel [45] konnten bereits Korrelationen von Ag mit Erkrankungen gezeigt werden [38]. Die Schwächen bisheriger Studien wie geringe Serenanzahl [38,37], gepoolte Seren [35] und geringe Auflösung durch Verwendung kleiner 2-DE Gele sollten in dieser Arbeit vermieden werden. Die Blots werden von 2-DE Gelen in „Großgeltechnik“ angefertigt, die bei H. pylori ein Auflösungsvermögen von 1800 Spots haben [25]. Im Vergleich zu den 1590 vorhergesagten Genen [4] kann also theoretisch mehr als eine Proteinspezies pro Gen aufgetrennt werden. Um statistisch gesicherte Aussagen zu erhalten werden 30 Patientenseren pro Gruppe miteinander verglichen. Diese große Anzahl wurde aufgrund der großen Variabilität der Ag-Muster auf den Immunoblots nötig. Die Verwendung des Referenzstammes H. pylori 26695 für die Analyse hat den Vorteil, dass Protein­identifizierungen leicht möglich sind, da er bereits vollständig sequenziert ist. Außerdem eignen sich die autologen Patientenstämme nicht für eine solche Analyse, da nur konservierte Marker für einen diagnostischen Test in Frage kommen.

Aufgrund der hochspezifischen Ag Detektion mittels Serum-AK muss es ein Ziel sein, möglichst alle Spotkomponenten zu identifizieren, um irreführende Identifizierungen von Ag zu vermeiden. Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden basieren auf der Idee, mittels der Identifizierung möglichst vieler Spots eines Gels die nicht zur Hauptkomponente eines Spots zugeordneten Peaks mithilfe multivariater statistischer Methoden zum Auffinden von Nebenkomponenten zu nutzen. Hierfür wird methodisch an der Verbesserung der automatischen Identifizierung mittels MALDI-TOF/TOF MS gearbeitet, was auch zur Identifizierung weiterer H. pylori und S. enterica Proteine genutzt werden soll. Zur Untersuchung der Komposition von Spots wird das in unserer Gruppe entwickelte Programm MS-Screener verwendet und die [Seite 27↓]hierarchische Clustermethode für MS-Spektren angewendet. Das Programm CorrAn zur Realisierung der KA wird weiterentwickelt, um in einem iterativen Verfahren weitere Nebenkomponenten von Spots zu finden. Die Messungen am MALDI-TOF/TOF Massenspektrometer wurden anfangs in Kooperation mit der Universität Greifswald und ab Anfang 2004 an unserem institutseigenen Gerät durchgeführt. Ein wichtiges Ziel dieser methodischen Entwicklungen ist die Bestätigung der mittels Immunoblots gefundenen H. pylori Ag. Weitere Ziele der Analyse von MS-Spektren waren die Verbesserungen der Identifizierungsquoten automatischer Messungen und die Untersuchung der Verteilung von Proteinspezies in 2-DE Gelen.

Als komplementäre Methode bei der Suche nach diagnostischen Ag soll eine IP mit Patientenseren entwickelt werden. Nach der Wechselwirkung von AK und Ag im nativen Zustand werden die Ag präzipitiert und mittels 2-DE aufgetrennt. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass konformationelle Epitope erkannt werden können, also eine zusätzliche Gruppe von Ag der Analyse zugänglich wird [75]. Um unspezifische Bindungen zu minimieren, sollen die H. pylori spezifischen AK durch eine Affinitätsreinigung angereichert werden. Wie in der Immunoblotstudie könnte auch hier eine große Anzahl an individuellen Patientenseren eingesetzt und hochauflösende 2-DE zur Ag-Separation verwendet werden.


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Abbildung 4 : Flussdiagramm der drei Teilprojekte meiner Promotion.


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08.02.2005