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2.  Material und Methoden

Allgemeine Materialien:

2.1. Identifizierung Magenkrebs-assoziierter Antigene mittels Immunoblots

2.1.1. Charakterisierung der Patienten

Die Patienten wurden in verschiedenen klinischen Zentren Süddeutschlands zwischen 1995 und 2001 rekrutiert. Sowohl die Diagnose der H. pylori Infektion als auch der Erkrankungen des gastrointestinalen Traktes wurden durch einen Pathologen erstellt. Die Serenproben wurden zum Zeitpunkt der Diagnose entnommen und bei –20°C eingefroren. Für die Rekrutierung der Patienten galten folgende Ausschlusskriterien: gescheiterte H. pylori Eradizierungsversuche, Einnahme von Antibiotika oder Protonenpumpenhemmern innerhalb der letzten zwei Wochen vor Endoskopie sowie überstandene Magenoperationen. Patientenparameter wie Alter, Geschlecht und Grad der Besiedlung mit H. pylori wurden aufgezeichnet (Tabelle 1). Abgesehen vom Alter waren beide Patientengruppen sehr ähnlich. Obwohl 2/3 der Patienten in den überlappenden Altersbereich von 41-71 Jahren fielen, waren Magenkrebspatienten im Durchschnitt älter als Ulkuspatienten.

Tabelle 1 : Patientenparameter.

Patienten­gruppe

Anzahl

Alters

bereich

Durchschnittsalter (σ)a

männlich

weiblich

H. pylori Status

Besiedlungs-grad b (σ)

Magenkrebs

30

41-87

66 (±10)

14

16

alle pos.

2.3 (±0.8)

Ulkus

30

24-71

47 (±13)

15

15

alle pos.

2.0 (±0.8)

a σ = Standardabweichung; b Kolonisierungsgrad mit H. pylori lt. Histologie (Stufen 1-3).

2.1.2.  Aufzucht von Helicobacter pylori

Die Kultivierung des H. pylori Stammes 26695 erfolgte unter mikroaeroben Bedingungen (5% O2, 10% CO2, 85% N2; Verwendung von CampyGen, Oxoid, Basingstoke, UK). Die Zellen wurden auf Agarplatten (mit 10 µg/ml Vancomycin) angeimpft und einzelne Klone wurden nach drei Tagen in BHI Medium (mit 10% FCS) gelöst und auf Agarplatten expandiert. Nach zwei Tagen erfolgte die Ernte mit Wattestäbchen und die Bakterien wurden in eiskaltem PBS (mit Complete protease inhibitors, Roche, Basel) resuspendiert. Mithilfe einer zehnminütigen Zentrifugation bei 3000xg und 4°C wurden die Zellen pelletiert und anschließend einmal [Seite 30↓]gewaschen.

2.1.3.  Proteinseparation mittels 2-DE und Blotten

2.1.3.1. Zweidimensionale Gelelektrophorese

Die Bakterienpellets wurden mit einem halben Volumen Wasser verdünnt und die folgenden Chemikalien wurden zugegeben, so dass die angegebenen Endkonzentrationen erreicht wurden: 9 M Harnstoff, 1,4% CHAPS, 2% Servalyte pI 2-11 (Serva, Heidelberg, Germany) und 70 mM DTT. Zur Solubilisierung wurde die Lösung 30 min bei RT geschüttelt und dann wurden die unlöslichen Bestandteile bei 100,000xg abzentrifugiert. Die Proteinlösung wurde bis zur Verwendung bei –70°C gelagert. Die Separation der Proteine erfolgte mittels hochauflösender 2-DE in 23x30 cm umfassenden Großgelen, die ein Auflösungsvermögen von bis zu 5000 Spots haben. Die Herstellung dieser 2-DE Gele wurde ausführlich beschrieben [76]. In Kürze: für die erste Dimension wurden 150 µg (für Immunoblots) bzw. bis zu 500 µg Protein (für präparative Gele) auf die anionische Seite des IEF-Rundgels aufgetragen. Nach der isoelektrischen Fokussierung (IEF) wurden die Rundgele mit SDS äquilibriert, auf das Gel der zweiten Dimension platziert und mit Agarose fixiert. Hierauf erfolgte die Trennung nach dem MG senkrecht zur ersten Dimension.

2.1.3.2.  Kolloidale Coomassie Färbung

Die präparativen Gele zur Proteinidentifizierung wurden mit Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G-250, BioRad, Hercules, CA ) gefärbt. Für diese MS-kompatible Färbung wurden die Gele in 50% Methanol, 2% Phosphorsäure über Nacht fixiert, 3x für 30 min mit Wasser gewaschen, anschließend in 34% Methanol, 17% w/v Ammoniumsulfat, 2% Phosphorsäure inkubiert und nach einer Stunde erfolgte die Zugabe von 0,66 g/l CBB G-250 worin die Gele nun für fünf Tage bei RT geschüttelt wurden. Am Ende wurden die Gele mit 25% Methanol gespült und mit Wasser in Folie eingeschweißt bei 4°C gelagert.

2.1.3.3. Das Blotten

Blotpuffer für hohes MG (ca. 30-150 kD):

Blotpuffer für niedriges MG (ca. 4-30 kD):


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Der Elektrotransfer der Proteine erfolgte auf PVDF-Membranen (Immobilon-P, Millipore, Bedford, USA) im semi-dry Verfahren [77]. Vorher wurden die Gele so halbiert, dass hohe und niedrige MG getrennt waren. Anschließend wurde für jede Hälfte der folgende Sandwich gebaut: Anode (+) – drei Schichten Filterpapier (in Anodenpuffer getränkt) – PVDF – Gel – drei Schichten Filterpapier (in Kathodenpuffer getränkt) – Kathode (-). Für zwei Stunden wurden 1 mA/cm² appliziert und anschließend die Membranen getrocknet und bei –20°C aufbewahrt.

2.1.4. Inkubation der Immunoblots mit Patientenseren

Die 60 verschiedenen Immunoblots wurden mit jeweils einem Patientenserum inkubiert – keiner der Blots wurde ein zweites mal verwendet um quantitative Vergleiche zwischen den Blots zu ermöglichen. Aufgrund der geringen Menge an vorhandenen Patientenseren wurde die gesamte Prozedur auf minimalen Serenverbrauch hin optimiert. Hierzu wurden jeweils die beiden zusammengehörenden Membranhälften (Proteinseite nach außen) in eine Kunststofftüte eingeschweißt. Durch Abdecken der Tüten mit Glasplatten konnte die Lösung während des Schüttelns gut innerhalb der Tüte zirkulieren und die Membranen in einem Flüssigkeitsfilm schwimmen. Somit konnte das Volumen an benötigter Lösung auf 0,125 ml/cm² (= 50 ml pro Tüte) minimiert werden. Die PVDF Membranen wurden kurz in Methanol getränkt und für mind. 1h in den Tüten mit PBST + 5% Milchpulver blockiert. Über Nacht erfolgte bei 4°C die Inkubation mit den primären AK durch direkte Zugabe von Patientenseren in die Tüte (1:200 Verdünnung). Nach viermaligem Waschen für je 15 min in PBST erfolgte die einstündige Inkubation mit dem sekundärem AK (Goat anti human polyvalent IgG - Peroxidase Conjugate, A-8400, Sigma, St. Louis, MO; 1:5.000 in PBST mit 5% Milchpulver). Nach erneutem viermaligem Waschen wurden die Membranen mit ECL Reagenz benetzt (NEL-101, PE, Boston, MA; auf RT aufgewärmt und frisch gemixt), zwischen Folien verpackt und dann wurden zwei Filme (Biomax MR1, Kodak, Rochester, NY) für 1,5 bzw. 5 min belichtet. Zur Kontrolle der Blotqualität wurden die Membranen anschließend mit CBB R-250 wie folgt gefärbt. Nach 5 min Färbung in 50% Methanol, 10% Essigsäure und 0,1% CBB R-250 erfolgte die Entfärbung des Hintergrundes für 3x2 min in 50% Methanol, 10% Essigsäure. Am Ende wurden die Blots getrocknet und bei RT aufbewahrt. Zu Vergleichszwecken wurde auch ein Blot vom Stamm H. pylori J99 angefertigt und wie oben beschrieben behandelt.


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2.1.5.  Auswertung der Antigen-Erkennungsmuster

2.1.5.1. Bildanalyse

Die 1,5 min belichteten Filme wurden alle unter Verwendung identischer Parameter eingescannt (8 bit Grauwerte, 100 dpi, gleiche Helligkeits- und Kontrastwerte). Die Auswertung erfolgte mithilfe der Software PDQuest (Version 7.1, BioRad, Hercules, CA). Die Spotdetektion und Quantifizierung erfolgten automatisch indem die Software die Intensitäten (Grauwerte) der gefundenen Spots in ein zweidimensionales Gaußmodell fittet. Dann wurden unter Verwendung eines mathematischen Verzerrungsmodels die Laufunterschiede der Spots in den verschiedenen Gelen ausgeglichen und jeweils korrespondierende Spots aus den verschiedenen Blots einander zugeordnet. Die Ergebnisse dieses Prozesses wurden mithilfe eines Masterblots dargestellt, der die theoretischen Grauwerteverteilungen aller Spots enthielt. Nun wurden in aufwendiger manueller Arbeit die automatischen Ergebnisse überprüft. Hierzu konnten Spots hinzugefügt oder gelöscht werden sowie das Matchen („Zuordnen“) der Spots verändert werden. Diese Kontrolle war unbedingt erforderlich, da derzeit keine der uns bekannten automatischen Analysesoftwares fehlerfrei arbeitet. PDQuest eignete sich hierzu besonders gut, da es manuelle Eingriffe in die Analyse ermöglichte.

2.1.5.2.  Multivariate Statistik

Statistische Analysen ohne Verwendung von Patientendaten wurden mit der hierarchischen Clusteranalyse und der KA durchgeführt. Mit beiden Methoden wurde nach Patientengruppen gesucht, die durch gewisse Ähnlichkeiten der Ag-Erkennungsmuster gruppiert werden konnten. Die verwendete Datenmatrix bestand aus den Intensitäten der insgesamt 611 verschiedenen Spots in den 60 Blots. Für die Analyse mittels KA wurde ein Softwarepaket verwendet, dass in DELPHI geschrieben wurde und auf Windows PCs läuft [71]. Das hierarchische agglomerative Clusterverfahren wurde in der statistischen Programmier­umgebung R (http://www.r-project.org) durchgeführt. Hierzu wurde die Datenmatrix binarisiert und eine binäre Distanzmetrik verwendet.

2.1.5.3. Univariate Statistik

Zur Analyse der Korrelationen zwischen den Erkrankungen der Patienten und der Erkennung bestimmter Ag wurden die Blots in zwei Gruppen eingeteilt: 30 Blots von Magenkrebs- und 30 von Ulkusseren. Anschließend wurden mithilfe des Signifikanztests „t-Test“ diejenigen Spots ermittelt, deren Intensitätsmittelwerte mit unterschiedlichen Signifikanzniveaus mit den Erkrankungen korrelierten (p<0,1 bis p<0,01). PDQuest bot auch die Möglichkeit quantitative [Seite 33↓]Analysen zu machen, zum Beispiel Spots anzuzeigen, deren Mittelwerte der Intensitäten in einer von beiden Gruppen um einen bestimmten Faktor hoch- oder herunterreguliert waren. Zusätzlich konnten verschiedene Analysen logisch verknüpft werden.

2.1.6. Identifizierung der Antigene

2.1.6.1. Spotmustervergleich mit 2-DE Datenbank

Unsere institutseigene 2-DE Datenbank enthält Referenzgele verschiedener Mikroorganismen, u.a. auch von H. pylori 26695 (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-PAGE). Durch den Vergleich „regionaler“ Spotmuster auf den Blots mit dem Referenzgel konnten Spots eindeutig zugeordnet und damit identifiziert werden. Die Zuordnung musste dabei sehr vorsichtig erfolgen, da sich die Spotmuster von Blots und silbergefärbten Gelen stark unterscheiden.

2.1.6.2.  Identifizierung mittels PMF

Tryptischer Verdau

Die zu identifizierenden Spots wurden in keratinarmer Umgebung mit einer gekürzten Pasteurpipette (Innendurchmesser ca. 1 mm) ausgestochen. Dann erfolgte die Entfärbung für 30 min bei 37°C in Entfärbepuffer. Anschließend wurden die Spots in Verdaupuffer (30 min bei 37°C) geschüttelt. Die entfärbten Spots wurden nun in einer Speed Vac getrocknet und 0,25 µl Trypsinlösung wurde direkt auf die Spots pipettiert und anschließend 25 µl Verdaupuffer hinzugefügt. Der Verdau erfolgte über Nacht bei 37°C. Am nächsten Tag wurde der Verdaupuffer abgenommen und in neue Reaktionsgefäße überführt. Zum vollständigen Herauslösen aller Peptide wurden die Spots für 10 min mit 20 µl Schrumpfpuffer geschüttelt und die Überstände mit dem bereits entnommenen Verdaupuffern vereinigt. Die Peptidlösungen wurden anschließend in der Speed Vac vollständig eingetrocknet und bei –70°C gelagert. Für die Messung wurden die Peptide in 1,3 µl Probenpuffer gelöst und 0,25 µl davon mit dem gleichen [Seite 34↓]Volumen an Matrixlösung gemischt und auf die MALDI-Platte aufgetragen („dried droplet“ Methode).

MALDI-TOF MS Messung

Die Messung der charakteristischen Peptidmassen erfolgte manuell an einem MALDI-TOF Massenspektrometer (Voyager Elite DE, Applied Biosystems, Framingham, MA) mit folgenden Parametern: 20 kV Beschleunigungsspannung, 70% Gitterspannung, 0,08% Leitdrahtspannung, 200 ns Verzögerungszeit und einer Einlasssperre für Massen kleiner als 500 Da.

Datenbanksuchen

Die Peaks der Spektren wurden per Hand in der Software Grams (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA) gelabelt und dann in Form von Peaklisten exportiert. Anschließend erfolgte die Datenbanksuche gegen die folgenden Proteindatenbanken: NCBInr (http://www.ncbi.nih.gov/Ftp/) und SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/index.html) mit den Suchmaschinen Mascot (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html), ProFound (http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe) und MSFit (http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm) unter Verwendung folgender Parameter: 100 ppm Peptidmassentoleranz, maximal zwei übersprungene Trypsinschnittstellen und mögliche Methioninoxidationen. Die Kriterien für eine eindeutige Identifizierung waren signifikante Scorewerte bei Suchen gegen alle Spezies und ein Minimum an 30% Sequenzabdeckung. Die Identifizierungen wurden zusätzlich manuell überprüft.

2.2. Detaillierte Analysen von Massenspektren

2.2.1. Proteinseparation

Die Aufzucht der H. pylori Zellen, die Proteinseparation mittels 2-DE und die CBB-Färbung der präparativen Gele erfolgte wie in den Kapiteln 2.1.2und2.1.3 beschrieben. Bei den hier verwendeten präparativen Gelen wurden 250 µg Protein aufgetragen.

2.2.2. Automatisches Ausstechen der Spots und tryptischer Verdau

Alle Arbeitsschritte vom Ausstechen der Spots bis einschließlich der MS Messungen wurden in Kooperation mit dem Institut für Mikrobiologie der Ernst Moritz Arndt Universität Greifswald durchgeführt. Für das automatische Ausstechen der Spots wurde ein großer Ausschnitt verwendet, der etwa 2/3 des Gels umfasste (ca. 20-80 kD, gesamter pI-Bereich). Mit einem automatischen Pickroboter (Proteome Works, BioRad) wurden 384 verschiedene Spots aller Färbeintensitäten in dreifacher Wiederholung ausgestochen. Diese Spots wurden vorher manuell ausgewählt und in die Steuerungssoftware eingegeben. Der Stanzkopf hatte einen Durchmesser von 2 mm. Die Spots wurden in Mikrotiterplatten (96er Format) überführt und dort verdaut. Der tryptische Verdau und das Auftragen auf die MALDI-Platten wurde mithilfe eines Verdauroboters (Ettan spot-handling workstation, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) durchgeführt. Die Gelstücke wurden zweimal für 30 min mit 100 µl Waschpuffer I und anschließend für 10 min mit Waschpuffer II gewaschen. Danach wurden die Spots bei 37°C getrocknet und 10 µl Trypsinlösung appliziert. Im Anschluss erfolgte ein zweistündiger Verdau bei 37°C. Für die Peptidextraktion wurden die Spots mit 60 µl Schrumpfpuffer bedeckt und die Lösungen nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 40°C in neue Mikrotiterplatten transferiert. Die Extraktion wurde mit 40 µl der gleichen Lösung wiederholt und die vereinigten Überstände bei 40°C getrocknet. Die Peptide wurden nun in 3 µl Probenpuffer gelöst und 0,4 µl davon wurden auf die MALDI-Platten aufgetragen. Am Ende wurden 0,4 µl Matrixlösung zu jeder Probe hinzu pipettiert und beide Lösungen durch fünfmaliges Ansaugen und Ausstoßen gemischt und 15 min trocknen gelassen, so dass der Matrix-Proben-Mix auskristallisieren konnte.

2.2.3.  Messung mittels MALDI-TOF MS

Die MALDI-TOF Messungen wurden am 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems, Framingham, MA) durchgeführt. Dieses Gerät ist für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen geeignet, ist also in der Lage automatisch Proben zu messen, Spektren zu kalibrieren und zu prozessieren. Die Spektren wurden in einem Massenbereich von 900-3700 Da und einer Fokusmasse von 2000 Da aufgenommen. Pro Spektrum wurden in einem Zufallsmuster 20 Subspektren mit jeweils 100 Laserschüssen akkumuliert. Wenn das autolytische Trypsinfragment m/z=2211,104 ein Signal-zu-Rausch Verhältnis (S/N) von mindestens 10 erreichte, wurde das Spektrum mit diesem Peak intern kalibriert. Falls diese Prozedur fehlschlug wurde automatisch die Gerätekalibrierung verwendet und das Spektrum später manuell nachkalibriert. Peakdetektion und Export der Peaklisten erfolgte mithilfe des Skriptes „Peak to Mascot“ der 4700 Explorer Software (Steuersoftware des Gerätes) mit folgenden Parametern: [Seite 36↓]Massenbereich 900-3500 Da, maximale Peakdichte von 50 Peaks/200 Da, minimale Fläche von 0 und einer maximalen Anzahl von 200 Peaks pro Spektrum. Drei verschiedene Peaklisten für S/N 5, 7 und 10 wurden generiert. Für die manuelle Inspektion der Spektren und der Überprüfung der Peakdetektion wurde der Data Explorer (Applied Biosystems, Framingham, MA) verwendet. Zur Bestätigung der Identifizierung bestimmter Peptide wurden einzelne MS/MS Spektren später manuell aufgenommen.

2.2.4. Identifizierung von Haupt- und Nebenkomponenten der Spots

2.2.4.1. Datenbanksuche mit Mascot

Die Datenbanksuchen erfolgten im Batch-Verfahren mit dem Mascot protein identification system (Matrix Science, London, UK [78]) auf unserem institutseigenen Mascot Server. Hierzu wurde die aktuelle Version der H. pylori 26695 Proteindatenbank vom „The institute of genomic research“ (TIGR, www.tigr.org) heruntergeladen. Die Suchparameter wurden sorgfältig optimiert und die besten Identifizierungsergebnisse konnten mit folgenden Parametern erzielt werden: 30 ppm Peptidmassentoleranz, Oxidation von Methionin und ein Maximum von einer übersprungenen Trypsinschnittstelle. Das Identifizierungskriterium war ein signifikanter Mascot Score >45 (p<0,05).

2.2.4.2. Analyse der PMFs mithilfe des Programms MS-Screener

Zur Unterstützung bei der Analyse großer Datenmengen wurde in unserer Gruppe die Software MS-Screener entwickelt. Das anfänglich in Perl (http://www.perl.com) programmierte Tool wurde später in Java (http://java.sun.com) umgeschrieben und mit einer benutzerfreundlichen graphischen Oberfläche versehen [59]. Der MS-Screener kann ASCII Dateien aus verschiedenen Analysesoftwares (Grams, Data Explorer, Peak to Mascot usw.) importieren und bearbeiten. Folgende Funktionen wurden implementiert: die Suche und Entfernung von Kontaminantenpeaks, die Berechnung der Nachkommastellen der Massen in Bezug zur HDPR, die Suche nach bestimmten Massen, der Vergleich verschiedener Spektren und ihr Ranking sowie die Intervallisierung der Daten zur Erzeugung einer Datenmatrix für externe Clusteranalysen. Peakmassen, die in mehr als 5% aller Spektren auftraten (30 ppm Toleranz), wurden aus den Daten entfernt. Zur Berechnung der HDPR-Ausreißer wurde eine absolute Toleranz von 0,12 Da verwendet und in Form einer Tabelle extrahiert. Zur Erzeugung der Datenmatrix wurde eine Intervallweite von 30 ppm verwendet, so dass etwa 1600 Massenintervalle für jedes Gel entstanden. Somit hatte die Datenmatrix eine Größe von 1600 x 384 (Spalten x Zeilen).


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2.2.4.3.  Hierarchisches Clustering mittels R

Zur Analyse der Beziehungen zwischen den einzelnen Spots eines Gels wurden multivariate statistische Verfahren benutzt. Ein solches Verfahren ist das bereits erwähnte hierarchische agglomerative Clusterverfahren, welches die Analyse der Ähnlichkeiten von Peaklisten ermöglicht und diese in Form eines Dendrogramms ausgibt. Die Untersuchung wurde in der statistischen Programmierumgebung R (http://www.r-project.org) durchgeführt. Hierzu wurde die Datenmatrix binarisiert und eine binäre Distanzmetrik verwendet. Die Ähnlichkeiten zwischen den Spots, d.h. bestimmte Proteine als mögliche Nebenbestandteile anderer Spots, wurden durch manuelle Auswertung der Dendrogramme näher untersucht.

2.2.4.4. Korrespondenzanalyse mit weiterentwickelter Software “CorrAn“

Für die Analyse von Ähnlichkeiten zwischen Spots wurde das in Kapitel 2.1.5.2 erwähnte Softwarepaket weiterentwickelt und CorrAn genannt. Die KA ermöglichte die Projektion des hochdimensionalen Datenraumes (hier 284 Spots eines Gels = 284 Dimensionen) in einen zweidimensionalen Faktorraum, der leicht graphisch darstellbar war. Somit konnten Cluster ähnlicher Peaklisten gefunden werden. Im Gegensatz zum hierarchischen Clustering wurden die Intensitäten der einzelnen Peaks mit in die Analyse einbezogen. Die in Folge der Intervallisierung entstandenen Nullwerte (nicht jedes Spektrum enthält in jedem Intervall einen Peak) wurden mithilfe der Zufallsfunktion „rnorm“ in R verrauscht. Weiterhin bot die KA die Möglichkeit, die absoluten Beiträge der einzelnen Massen zur Gruppenbildung darzustellen. Die Software wurde in diesem Projekt so modifiziert, dass Beiträge ober- oder unterhalb eines manuell gesetzten Schwellenwertes gelöscht werden konnten. Nach der anschließenden Neuberechnung wurden neue Cluster sichtbar, die sonst in der Mehrheit der nicht-signifikanten Beiträge untergegangen waren. Im „Versuch und Irrtum“ Verfahren konnten so neue Zusammenhänge zwischen Spots gefunden werden.

2.2.5. Identifizierung von in-vivo exprimierten Proteinen von S. enterica

2.2.5.1. Separation der Proteine

Ziel dieses Projektes war die Identifizierung von Proteinen von Salmonella enterica subspecies typhimurium SL1344, die in-vivo exprimiert wurden und für die Virulenz dieser Bakterien eine große Rolle spielen könnten. Die Prozedur wurde ausführlich in [79] beschrieben, deshalb gebe ich hier nur eine kurze Übersicht. Balb/c Mäuse wurden mit S. enterica intravenös infiziert. Nach 20 h wurden die Bakterien aus dem Caecum präpariert, gewaschen und mit einem 35 µm Zellsieb filtriert. Die GFP-markierten Salmonellen wurden dann mittels „Fluorescence Activated [Seite 38↓]Cell Sorting“ (FACS) sortiert. Die Probenaufarbeitung, 2-DE und CBB-G250 Färbung erfolgte wie in Kapitel 2.1.3 beschrieben.

2.2.5.2. MALDI-TOF/TOF MS Messung der Spots

Anschließend wurden alle 194 sichtbaren Spots ausgestochen und manuell in Mikrotiterplatten verdaut. Hierfür wurde eine ähnliche Prozedur verwendet wie in Kapitel 2.1.6.2 beschrieben. Im Unterschied zu o.g. Prozedur wurde nach der Entfärbung ein weiterer Schritt mit 75% Acetonitril eingeführt um die Trocknung der Proben in den Mikrotiterplatten bei RT zu beschleunigen. Um die Extraktion der Proteine zu verbessern wurde die Konzentration von TFA auf 0,5% erhöht und ein zweiter Schritt mit Schrumpfpuffer (erst 60% dann 100% Acetonitril) hinzugefügt. Anschließend wurden 0,4 µl Probe auf Parafilm mit 0,4 µl Matrixlösung (5 mg/ml α-cyano-4-hydroxy-Zimtsäure in 50% Acetonitril, 0,1% TFA) gemixt und dann auf eine 192er MALDI-Platte aufgetragen. Nach der Kristallisierung der Proben erfolgte die Messung an unserem institutseigenen 4700 Proteomics Analyzer. Die Messparameter waren die folgenden: Messbereich 800-4000 Da und Fokusmasse 2000 Da. Unmittelbar vor der Messung wurde die Geräteeichung sowohl für PMF als auch für MS/MS Spektren aktualisiert. Für die PMFs wurden 30 Subspektren (S/N je mindestens 20) mit jeweils 50 Laserschüssen (Intensität 2380) aufsummiert, bis zu 100 Subspektren wurden hierzu getestet. Für die MS/MS Spektren wurden alle Subspektren (je 125 Schüsse, Laserintensität 3800) akzeptiert bis das resultierende Spektrum S/N 30 erreichte (minimal 15, maximal 80 Subspektren). Die PMF-Spektren wurden mit mindestens einer der folgenden Trypsin bzw. Matrixpeaks intern kalibriert: 515,32 Da; 842,51 Da; 877,03 Da; 2211,10 Da; (S/N>30). Die MS/MS Spektren wurden mit der Gerätekalibrierung gemessen. In der Interpretationsmethode wurden automatisch Peaks ausgewählt, von denen MS/MS Spektren aufgenommen wurden. Es wurden die drei intensivsten Peaks verwendet, die den folgenden Kriterien genügten: S/N mindestens 20, keine der Ausschlussmassen (Trypsin-, Keratin-, Matrix-, CBB- Peaks) und kein Natriumaddukt eines bereits ausgewählten Peaks. Bei nicht automatisch identifizierten Spots wurde die Messung mit neu aufgetragener Probe wiederholt und bei einigen ausgewählten Peaks wurden manuelle MS/MS Messungen mit CID (Stoßgas: Luft mittleren Drucks) vorgenommen.

2.2.5.3. Datenbanksuche mit dem GPS Explorer

Die Auswertung der Messergebnisse erfolgte mit der Software GPS Explorer (Applied Biosystems, Framingham, MA), deren integrierte Datenbanksuchmaschine auf dem Mascot protein identification system basiert. Die Suchen erfolgten gegen die neusten Versionen der Proteindatenbanken NCBInr und UniProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/index.html) als [Seite 39↓]kombinierte Suchen von PMF und MS/MS Spektren. Folgende Toleranzen wurden verwendet: 30 ppm für Peptide und 0,5 Da für Fragmente. Mögliche Modifikationen waren Methioninoxidationen und Natriumaddukte an Aspartat und Glutamat. Die Suche erfolgte gegen alle Spezies mit maximal einer übersprungenen Trypsinschnittstelle. Die Peakdetektion für PMF Spektren wurde mit folgenden Parametern durchgeführt: S/N>10, maximal 10 Peaks/200 Da, maximal 100 Peaks/Spektrum – eine Liste von typischen Kontaminantenpeaks und Natriumaddukte wurden ausgeschlossen. Für MS/MS Spektren galten diese Parameter: S/N>3, maximal 50 Peaks/200 Da und maximal 100 Peaks/Spektrum. Die Kriterien für eine eindeutige Identifizierung waren signifikante Scorewerte (p<0,01) bei Suchen gegen alle Spezies. Diese wurden entweder durch gute PMF Spektren allein oder durch Bestätigung des Ergebnisses mithilfe von MS/MS Daten einiger Peaks erreicht. Alle Identifizierungen wurden manuell bestätigt.

2.3. Immunopräzipitation von H. pylori Antigenen

2.3.1.  H. pylori Lyse

Lysepuffer:

Die H. pylori 26695 Aufzucht erfolgte wie in Kapitel 2.1.2 beschrieben. Um die Bakterienzellen intakt zu erhalten wurde das Pellet nach der Ernte in 25% Glycerol in PBS bei –80°C gelagert. Zum Zwecke der Lyse wurden die Bakterien nach dem Auftauen bei 4°C für 5 min mit 2000xg pelletiert und zweimal in eiskaltem PBS+Complete gewaschen. Für 400 mg Zellpellet (Volumen: ca. 450 µl) wurden 600 µl Lysepuffer zugegeben und kurz gevortext. Mit dem Ultraschallstab wurden die Zellen zerstört (4 x 30 s auf Eis, Stufe 7, 15%) und anschließend weitere 600 µl Lysepuffer zugegeben. Die Suspension wurde nun für 10 min auf Eis stehen gelassen und zeitweilig gevortext. Am Ende wurden die unlöslichen Bestandteile bei 16.000xg 10 min abzentrifugiert und der klare Überstand (ca. 5 mg/ml Protein) bei –20°C gelagert. Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde der Micro BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL) eingesetzt.


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2.3.2.  Affinitätsreinigung von H. pylori spezifischen Antikörpern

2.3.2.1. Affinitätsreinigung mittels Nitrocellulosepartikel

Herstellung der Nitrocellulosepartikel

Die Herstellung der Partikel aus NC erfolgte unmittelbar vor der Inkubation. Eine Blotmembran aus Nitrocellulose (Protran Nitrocellulose Hybridization Transfer Membrane, 0.45 µm, Schleicher und Schüll, Perkin Elmer, Boston, MA) wurde in kleine Stücke geschnitten. Ein Stück von 1 cm² Größe wurde in 1,25 ml DMSO gelöst und das gleiche Volumen an Na2CO3/NaHCO3 Puffer (14/36 mM, pH 9,6) tropfenweise zugegeben während ständig mit einem Rührfisch stark gerührt wurde. Anschließend wurden die NC-Partikel für 5 min bei 1200xg abzentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen in jeweils 1,5 ml PBS waren diese fertig zur weiteren Verwendung. Pro cm² entstanden so etwa 70 µl NC-Partikel.

Affinitätsreinigung

Elutionspuffer:

Das Proteinbindungsvermögen von NC beträgt ca. 50 µg/cm². Zur vollständigen Absättigung der NC mit H. pylori Proteinen wurde die vierfache Proteinmenge verwendet. Dementsprechend wurden für 70 µl NC-Partikel 40 µl H. pylori Lysat (200 µg Protein) verwendet. Lysat und NC-Partikel wurden in insgesamt 1 ml PBS+Complete bei RT für 1 h inkubiert. Danach wurden überschüssige Proteine durch Waschen mit 1 ml PBS+Complete, 50 µl Elutionspuffer und 1 ml PBS+Complete entfernt. Anschließend erfolgte die Inkubation mit 1 ml 1:20 oder 1:40 in PBS+Complete verdünntem Testserum. Dieser Schritt erfolgte unter ständigem Schütteln entweder für 1 h bei RT oder über Nacht auf Eis. Nach zweimaligem Waschen mit 1 ml PBS+Complete erfolgte die Elution der AK in drei Fraktionen mit je 40 µl Elutionspuffer. Zur Überprüfung der Elution wurde die NC bei –20°C aufgehoben und später mit auf die SDS-PAGE aufgetragen.


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2.3.2.2.  Affinitätsreinigung mittels H. pylori

Intakte Bakterien

Alle hier beschriebenen Prozeduren wurden auf Eis mit kaltem PBS+Complete durchgeführt. Die bei –70°C in PBS + 25% Glycerol eingefrorenen H. pylori Zellen wurden unter Zugabe von 1 ml eiskaltem PBS+C vorsichtig aufgetaut und zweimal in PBS+Complete gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 2000xg bei 4°C pelletiert und wieder in 1 ml kaltem PBS aufgenommen. Nun erfolgte die Inkubation durch Zugabe von 1:20 verdünntem Patientenserum und über Nacht Schwenken auf Eis. Anschließend erfolgten zwei Waschschritte mit 1 ml kaltem PBS+Complete. Die AK wurden von den Bakterienoberflächen in drei Fraktionen mit je 100 µl Elution Buffer eluiert und mit 5 µl 1 M Tris pH 9,5 neutralisiert. Bakterienreste wurden mit einer Zentrifugation von 5 min bei 16,000xg entfernt. Die IgG der Eluate wurden nun von coeluierten Proteinen durch einen Anreicherungsschritt mit Protein-G Sepharose (GammaBind G Sepharose, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, SE) gereinigt. Dazu wurden 0,1 ml Sepharose-G (50% slurry) zweimal in 0,5 ml Binding Buffer gewaschen und die gepoolten Eluate in 500 µl Binding Buffer 3 h bei RT geschüttelt. Danach folgte viermaliges Waschen mit Quenching buffer und die Elution der IgG mit 50 µl Elution Buffer (aus SeizeX Kit, s.o.). Anschließend wurden die Lösungen mit je 2,5 µl 1 M Tris pH 9,5 neutralisiert. Die Sepharose wurde durch zweimaliges Waschen in Quenching buffer regeneriert und bei 4°C zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

Membranfraktion

Als Membranfraktion wurden die Pellets nach der H. pylori Lyse (s. Kapitel 2.3.1) verwendet. Ca. 130 mg Membranen wurden in 1 ml kaltem PBS+Complete resuspendiert und dann wurde 1:20 verdünntes Patientenserum zugegeben. Die Inkubation erfolgte über Nacht auf Eis. Am nächsten Tag wurde die Suspension für 5 min bei 4000xg und 2°C zentrifugiert und anschließend zweimal mit 1 ml kaltem PBS+Complete gewaschen. Die Elution erfolgte mit 200 µl Elution Buffer und die AK wurden mit 10 µl 1 M Tris pH 9,5 neutralisiert. Am Ende der Prozedur wurden die Bakterienreste abzentrifugiert. Wie im vorangehenden Kapitel beschrieben, wurden auch hier die IgG mittels Protein-G Sepharose angereichert.


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2.3.3.  Bestimmung der AK Konzentration mittels ELISA

2.3.3.1. Aufkonzentrierung der Eluate

Zum Aufkonzentrieren und Umpuffern der AK und IP Eluate wurden Ultrafree-Röhrchen (Ultrafree 0,5 centrifugal filter device, Millipore, Billerica, MA) verwendet. Nach dem Spülen der Ultrafrees mit 0,5 ml PBS wurde die Membran für 30 min mit 0,5 ml PBS + 1% BSA abgesättigt (Zentrifugationen mit 12,000xg) um den Verlust an adsorbierenden AK bzw. Proteinen zu minimieren. Anschließend wurde mit 0,5 ml PBS gewaschen, ausgeschüttelt und dann wurden die Eluate umgepuffert mit 2x 500 µl PBS oder Binding buffer, und eingeengt auf etwa 30 µl. Alternativ wurde eine TCA Fällung durchgeführt. Hierbei wurde zum Eluat TCA zugegeben (Endkonzentration 10%) und eine Stunde bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde für 10 min bei 2°C und 16,000xg zentrifugiert, zweimal mit 1 ml –20°C kaltem Aceton gewaschen und wieder zentrifugiert. Das Pellet wurde an der Luft getrocknet und am Ende in PBS+Complete aufgenommen.

2.3.3.2. ELISA mit H. pylori Lysat

Titertest H. pylori spezifischer AK:

Die Mikrotiterplatte (MaxiSorp, Nunc, eBioscience, San Diego, CA) wurde über Nacht bei 4°C mit 1:1000 in Wienpuffer verdünntem H. pylori Lysat gecoatet (50 µl je well). Mit einem ELISA-washer wurde die Platte dreimal mit PBS + 0,05% Tween-20 gewaschen und freie Adsorptionsstellen für 2 h bei RT in 100 µl 2% BSA in PBS blockiert. Nach erneutem Waschen erfolgte die zweistündige Inkubation mit 50 µl Seren bzw. Eluaten, die jeweils als Doppelwerte in 1:2 Schritten in Standard Diluent verdünnt wurden. Die Eluate wurden mit 1:20 beginnend bis 1:2560 verdünnt; die Seren von 1:400 bis 1:51,200. Nach dem Waschen der Platte wurde mit 50 µl 1:200,000 in Standard Diluent verdünntem anti-human horseradish peroxidase-konjugiertem IgG für 1 h inkubiert. Nach weiterem Waschen erfolgte die Detektion mit 100 µl TMB (frisch gemixtes Peroxidase Substrate + Solution B, KPL, Gaithersburg, Maryland). Nach 10-20 min schütteln bei RT wurde die Reaktion mit 50 µl 1 M H2SO4 gestoppt und die Färbung bei 450 nm im ELISA reader gemessen. Als Standards wurden Patientenseren vor und nach der Inkubation eingesetzt. Zur quantitativen Bestimmung der IgG Konzentrationen wurde ein [Seite 43↓]humaner IgG Standard mit 10 mg/ml verwendet.

Normierung mit gesamt-IgG-Gehalt

Die Mikrotiterplatte wurde über Nacht bei 4°C mit den Seren bzw. Eluaten gecoated (50µl je well, Doppelwerte). Die Verdünnung erfolgte von 1:2 bis 1:2560 in Wienpuffer. Waschschritte, Blockierung, sekundärer AK und Detektion erfolgten wie oben beschrieben. Anschließend wurde der Anreicherungsfaktor an IgG im Vergleich zum Patientenserum und die IgG Ausbeute berechnet:

mit T = Titer bei einer OD im linearen Bereich und V = Volumen der Lösung

2.3.3.3. ELISA mit intakten Bakterien

Zur Bestimmung des Titers der H. pylori oberflächenspezifischen AK wurden intakte Bakterien in Mikrotiterplatten fixiert. Dazu wurden die bei –70°C in 25% Glycerol aufbewahrten Zellen aufgetaut und zweimal mit PBS gewaschen. Mithilfe einer OD Bestimmung und des Vergleichs mit einer Wachstumskurve wurde eine Konzentration von 108–109 Zellen pro ml eingestellt. Die Mikrotiterplatten wurden nun mit 50 µl Bakteriensuspension versehen und für 10 min bei 500xg zentrifugiert. Der Überstand wurde abgezogen und die Platte trocknen gelassen. Anschließend wurden die Zellen mit 50 µl eiskaltem Methanol fixiert und die Platte dreimal mit PBS + 0,05% Tween-20 gewaschen. Die folgenden Schritte fanden wie oben beschrieben statt: Blockierung, Inkubation mit Serum, sekundärem AK und Detektion. Ebenso wurde eine Normierung nach gesamt-IgG-Gehalt wie oben durchgeführt.

2.3.4. Präzipitation der Antigene

Die 0,1 ml 50% slurry ImmunoPure Plus Immobilized Protein G (aus SeizeX Kit, s.o.) wurden zweimal in 0,4 ml binding buffer gewaschen. Anschließend wurden die AK verdünnt in 0,3 ml binding buffer auf die Sepharose gegeben und für 1 h geschüttelt. Ungebundene Moleküle wurden dreimal mit 0,4 ml Binding Buffer weggewaschen. Zum Zwecke der kovalenten Kopplung von AK mit der Sepharose wurde letztere in 0,1 ml Binding Buffer resuspendiert und 250 µg des Kopplungsreagenz DSS (aus SeizeX Kit, frisch gelöst in DMSO) zugegeben. Nach einer Stunde Schütteln erfolgte eine aufwendige Waschprozedur: 2x Quenching Buffer, 5x [Seite 44↓]Elution Buffer, 3x Quenching Buffer und am Ende 1x mit Binding Buffer. Für die eigentliche IP wurde 200 µl H. pylori Lysat 1:1 verdünnt in Binding Buffer+Complete zur Sepharose gegeben und für 2 h geschüttelt. Danach erfolgte viermaliges Waschen mit Quenching Buffer. Die Elution fand in drei Schritten a 50 µl Elution Buffer statt. Am Ende wurde die Sepharose durch viermaliges Waschen in 0,5 ml Quenching Buffer regeneriert und bei 4°C gelagert.

Für einige Versuche wurde das H. pylori Lysat vor der IP mit Protein-G Sepharose präinkubiert um unspezifisch bindende Proteine zu entfernen. Hierzu wurde die Sepharose mit dem Lysat für 2 h geschüttelt und dann abzentrifugiert.

2.3.5. Separation der Präzipitate mittels 1-DE

2.3.5.1.  1-DE

Zur Auftrennung immunopräzipitierter Proteine wurden zehnprozentige 1 mm dicke eindimensionale SDS-Polyacrylamidgele (1-DE) angefertigt. Die Proben wurden direkt vor dem Auftragen in reduzierendem Probenpuffer für 10 min bei 95°C gekocht. Der Lauf der Gele erfolgte mit maximal 40 mA (Kühlung mit Eis).

2.3.5.2.  Silberfärbung

In Anlehnung an [80] wurden die Gele nach dem Lauf für 1 h in der Fixierlösung geschüttelt. Anschließend erfolgte eine zweistündige Inkubation in Inkubationslösung. Die Gele wurden nun dreimal für 20 min in Wasser gewaschen, dann für 30 min in Silberlösung geschüttelt und nochmals für 30 s in Wasser gespült. Die Entwicklung in entsprechender Lösung wurde mit der Stopplösung nach dem Erreichen guter Kontraste beendet. Am Ende wurden die Gele bei 50 mbar und 75°C in einem Vakuumtrockner getrocknet.


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2.3.5.3.  CBB G-250 Färbung und Identifizierung

Für die Identifizierung von Banden wurde die MS verträgliche colloidale CBB Färbung und MALDI -TOF MS verwendet. Die Prozeduren sind im Einzelnen in den Kapiteln 2.1.3.2 und 2.1.6.2 beschrieben worden.

2.3.5.4. Immunoblots

Die Gele wurden für 100 min bei 100 mA in folgendem Sandwich geblottet: Kathode(-) – drei Filter (getränkt in Blotpuffer) – Gel – PVDF-Membran (getränkt in Methanol; 0,45µm; Immobilon-P, Millipore, Bedford, USA) – drei Filter (getränkt in Blotpuffer) – Anode(+). Anschließend wurden die Blots getrocknet. Im weiteren wurden die Blots kurz in Methanol eingelegt und dann über Nacht bei 4°C in PBST mit 5% Milchpulver blockiert. Die Inkubation mit 1:200 in Blockierlösung verdünntem Patientenserum erfolgte für eine Stunde. Nach viermaligem Waschen in PBS+0,05% Tween-20 wurden die Blots für 1 h in 1:5.000 in PBST mit 5% Milchpulver verdünntem Anti-humanem sekundärem AK (Goat anti human polyvalent IgG - Peroxidase Conjugate, A-8400, Sigma, St. Louis, MO) inkubiert. Wieder erfolgte viermaliges Waschen und anschließend wurde eine Minute in frisch gemixtem ECL (Renaissance NEL-101, PE, Boston, MA) geschüttelt und Filme (Biomax MR1, Kodak, Rochester, NY) je nach Signalstärke unterschiedlich lang aufgelegt. Zur Kontrolle der Blotqualität wurden diese mit CBB R-250 wie folgt angefärbt: 5 min Färbung in 50% Methanol, 10% Essigsäure, 0,1% Serva Blue R-250, 3x2 min Entfärbung in 50% Methanol, 10% Essigsäure und am Ende Lufttrocknung.


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08.02.2005