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3.  Ergebnisse

3.1.  Identifizierung Magenkrebs-assoziierter Antigene mittels Immunoblots

3.1.1. Verschiedene Subproteome von H. pylori

Um Kandidaten für einen diagnostischen Test zu finden, wurden die Ag-Erkennungsmuster von unter Magenkrebs oder Ulkus leidenden H. pylori infizierten Patienten verglichen. Die mittels 2-DE aufgetrennten H. pylori 26695 Proteine wurden geblottet und mit den Patientenseren inkubiert. Hierfür wurde eine Inkubationstechnik für die großen Blots etabliert, die speziell auf minimalen Serenverbrauch hin optimiert wurde. Die verwendete 2-DE Technik ist in der Lage, in Kombination mit der Silberfärbung 1800 H. pylori Proteinspezies aufzulösen (s. Referenzgel unserer Datenbank). Die Muster der Immunoblots unterschieden sich allerdings stark von denen eines silbergefärbten Gels (Abbildung 5), da nur Spots erfasst wurden, die von den AK im Patientenserum erkannt wurden.Bei der Silberfärbung werden Spots bereits ab einem Proteingehalt von etwa 1 ng detektiert. Die Empfindlichkeit der Immunodetektion war jedoch noch größer, da auch Spots erkannt wurden, die auf dem Silbergel nicht zu sehen waren. Ein Beispiel hierfür ist die diagonale Spotserie im oberen Teil der Abbildung 5 rechts; hier wurden Ag erkannt, die vermutlich weniger als 1 ng Protein enthielten, da sie nicht mit der Silberfärbung detektierbar waren. Silberfärbung und Immunofärbung decken also ganz unterschiedliche Subproteome auf. Interessanterweise war nur ein kleiner Teil der H. pylori Proteine antigen – im Durchschnitt wurden 142 Spots pro Blot erkannt – das sind nur 8% der sichtbaren Spots des Silbergels. Der bei ca. 25 kD im Immunoblot sichtbare Streifen bestand vermutlich aus einem (oder mehreren) schlecht fokussierten Protein, das in geringer Konzentration vorlag und deshalb nicht im Silbergel zu sehen war.


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Abbildung 5 : Vergleich eines großen 2-DE Gels (links) und eines großen 2-DE Immunoblots (rechts). Links ist ein silbergefärbtes 23 x 30 cm großes Gel von H. pylori Lysat zu sehen. Es enthält ca. 1800 Spots, deren Identifizierungsergebnisse interaktiv in unserer Datenbank (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-PAGE) erkundet werden können. Rechts ist ein 23 x 30 cm großer 2-DE Immunoblot mit 198 Spots zu sehen, der mit dem Serum eines Ulkuspatienten inkubiert wurde (Serum DU23). Durch die hohe Spezifität und Sensitivität der Methode wurden einerseits Spots detektiert, die nicht im Silbergel zu sehen sind, z.B. die diagonale Spotserie im oberen MG-Bereich; andererseits wurden viele abundante Proteine nicht von den Serum-AK erkannt.

3.1.2. Hohe Variabilität der Antigenmuster

Im unteren Teil der Abbildung 6 ist eine repräsentative Auswahl an Immunoblots dargestellt. Diese fünf Blots demonstrieren die extremen Variationen der Erkennungsmuster der einzelnen Patientenseren unabhängig von den Erkrankungen. Nicht nur die Anzahl erkannter Spots sondern auch die Intensität der Hintergründe unterschieden sich stark. Einzelne Muster sind jedoch wiederholt und reproduzierbar gefunden worden. Zum Beispiel war die bereits erwähnte diagonale Spotserie in den Blots DU17 und DU23 sichtbar; insgesamt wurde diese in 37 der 60 Blots gefunden und definiert somit eine Subgruppe an Patienten. Leider korrespondierte diese nicht mit den klinischen Befunden der Patienten. Insgesamt wurden 611 unterschiedliche Spots von den Seren erkannt, die Anzahl der von individuellen Seren erkannten Ag reichte jedoch von 24 bis 391. Im Durchschnitt detektierten die AK von Magenkrebspatienten 49% mehr Spots mit einer um 75% höheren Gesamtsumme der Spotintensitäten. Nur ein einziger Spot, der Hauptspot [Seite 48↓]von GroEL, wurde von ausnahmslos allen Seren erkannt; sehr häufig wurden auch andere bekannte Ag wie CagA (58 x) und UreB (57 x) erkannt. Die große Mehrheit aller detektierten Spots (531 x) wurde hingegen bei weniger als der Hälfte aller Blots gefunden. Insgesamt 32 wurden sogar nur ein einziges Mal detektiert. Diese außerordentliche Variabilität der Daten war der Grund, die Gruppengröße von anfänglich zehn auf 30 Patienten pro Gruppe anzuheben und verschiedene statistische Analysen durchzuführen.

3.1.3. Globaler Vergleich der Antigenerkennungsmuster

Für eine globale Analyse der Blots ohne Verwendung von Patientendaten wurden multivariate statistische Methoden verwendet. Ziel dieser Analysen war die Gruppierung der Blots allein nach den Informationen, die in den Blotmustern stecken. Mit der ersten Methode, der KA, können Ähnlichkeiten zwischen Objekten durch eine Projektion typischer Merkmale in einen zweidimensionalen Faktorraum gefunden werden. Diese Analyse ergab eine Gruppe, die zwar einen Teil der Magenkrebspatienten enthielt, die anderen Magenkrebs- und auch Ulkusseren waren jedoch gleichmäßig im faktoriellen Raum verteilt. Mit der zweiten Methode, dem hierarchisch agglomerativen Clusterverfahren, wurden jedoch fünf verwandte Gruppen an Blots entdeckt (Nummern 1-5 in Abbildung 6), die sich durch ähnliche Ag-Erkennungsmuster auszeichnen. Für jede Gruppe ist ein Blot mit den typischen Spotmustern dargestellt, die in der Abbildung mit Pfeilen markiert wurden. Die diagonale Spotserie konnte in den Gruppen 2 und 3 gefunden werden (Blots DU23, DU17), während eine typische Spotgruppe in den Clustern 2 und 5 zu sehen war (Blots DU23, GC05). Die Cluster 1 und 4 enthielten im Gegensatz zu den anderen Gruppen nur wenige Spots mit geringen Intensitäten und keines der oben erwähnten Charakteristika, unterschieden sich jedoch durch eine Reihe anderer Spots (Blots DU13, DU08). Keine der hier gefundenen Gruppen war mit den Erkrankungen der Patienten korreliert. Die Existenz von Patientengruppen mit ähnlichen Ag-Erkennungsmustern lässt allerdings darauf schließen, dass Gemeinsamkeiten der Immunreaktion oder der H. pylori Stämme vorliegen. Die globale Analyse schließt jedoch die Korrelation einzelner Spots mit den Erkrankungen nicht aus.


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Abbildung 6 : Dendrogramm der hierarchischen Clusteranalyse und Beispiele von Immunoblots mit charakteristischen Spotmustern. Die Analyse basiert ausschließlich auf den Ag-Erkennungsmustern der 60 Blots. Die linke Skala zeigt die Distanz zwischen den einzelnen Blots an, d.h. je niedriger die waagerechten Verbindungslinien zwischen Blots ist, desto ähnlicher sind sich diese. Fünf gut erkennbare Gruppen von Blots wurden mit Nummern 1-5 beschriftet. Im unteren Teil ist für jede Gruppe ein Blot dargestellt, der typische Merkmale enthält (Pfeile, Erläuterungen im Text). Diese Blots geben einen guten Überblick über die Variabilität der Erkennungsmuster, die sich besonders in unterschiedlicher Anzahl und Intensität von Spots bemerkbar macht. Alle Seren wurden mit dem Kürzel der Erkrankung (GC = Magenkrebs (blau) oder DU = Ulkus (grün)) beschriftet und durchnummeriert.

3.1.4.  Erkrankungskorrelierte Antigene

Die Analyse von 30 einzelnen Patientenseren pro klinischer Gruppe ermöglichte die Verwendung eines univariaten statistischen Tests, des t-Tests. Dies ist eine Methode um mit definierter Sicherheit diejenigen Spots zu finden, die mit einer der Erkrankungen korrelieren. Diese Ag stellen diagnostische Markerkandidaten für die jeweilige Erkrankung dar. Hierfür wurden die Patienten in zwei den Erkrankungen entsprechende Gruppen eingeteilt und t-Tests mit verschiedenen Signifikanzschwellen durchgeführt. Wie in Tabelle 2ersichtlich, führt die Verwendung unterschiedlicher Signifikanzkriterien zu sehr verschiedenen Ergebnissen. Wird ein einfacher Faktor als Signifikanzschwelle verwendet, liefert das eine wesentlich größere Anzahl in Magenkrebsblots stärker oder schwächer erkannter Spots als die statistischen Tests, die schärfere Kriterien darstellen. Dieses Resultat spiegelt die hohe Varianz der Daten wieder. Der t-Test hat den Vorteil, dass 1. die Varianz der Daten mit in die Analyse einbezogen wird und 2. die Zuverlässigkeit der Analyse abgeschätzt werden kann. Es wurde eine Signifikanzschwelle von p<0,01 für unsere Analyse gewählt, so dass davon ausgegangen werden kann, dass die 14 bei Magenkrebs stärker erkannten Spots mit 99%-iger Sicherheit tatsächlich mit Magenkrebs korrelieren.

Tabelle 2 : Vergleich verschiedener Korrelationsanalysen. Die Tabelle zeigt die je nach verwendeter Methode unterschiedliche Anzahl der erkrankungskorrelierten Ag. Bemerkenswert ist hierbei der Unterschied zwischen Analysen mithilfe eines simplen Faktors und den statistischen Analysen.

Intensität der Spoterkennung GC/DU

Anzahl an Spots bei Verwendung von:

Anzahl an Spots bei Verwendung

des t-Tests

Faktor 2

Faktor 3

p<0,1

p<0,05

p<0,01

stärker

315

192

144

78

14

schwächer

49

35

2

0

0

Interessanterweise wurden bei einer Signifikanz von p<0,01 14 Spots von den Magenkrebsseren (GC) stärker erkannt aber kein einziger Spot wurde stärker von den Seren der Ulkuspatienten (DU) detektiert. Dies ist in Übereinstimmung mit dem Befund, dass in Magenkrebsblots eine größere Anzahl Spots und höhere Intensitäten vorkommen. Die 14 Magenkrebs-korrelierten Spots sind in Abbildung 7 mit Pfeilen markiert. Die Abbildung basiert auf dem Masterblot, der in PDQuest künstlich erzeugt wird und alle 611 Spots der Analyse enthält. Es handelt sich um ein virtuelles Bild mit Gauß-gefitteten Spots. Die Intensitäten der Spoterkennung der individuellen Seren sind mit schwarzen Balken dargestellt (bildnahe Boxen). Die äußeren Boxen zeigen jedoch die durchschnittlichen Spotintensitäten in den Erkrankungsgruppen an [Seite 51↓](Erläuterungen s. Abbildung). Die differentiell erkannten Spots fallen in einen großen MG-Bereich (12-80 kD) aber einen recht engen pI Bereich (4,9-6,5).

Abbildung 7 : Masterblot mit den Spotintensitäten der 14 von Magenkrebsseren stärker erkannten Spots. Dieser virtuelle Blot enthält alle 611 Spots der 60 Blots der Analyse. Die 14 Magenkrebs-spezifischen Spots (t-Test, p<0,01) sind mit Pfeilen markiert. Die bildnahen Kästchen enthalten die individuellen Spotintensitäten des jeweiligen Spots in den 60 Blots (30 links: GC=Magenkrebs, 30 rechts: DU= Ulkus). Die äußeren Boxen enthalten die Balken der Durchschnittsintensitäten (schwarzer Querbalken) und die Bereiche der Standardabweichungen (weiße Füllungen). Zu beachten ist, dass alle Intensitäten auf die Maximalintensität je Box normiert sind. SSP: automatisch generierte Spotnummer.

3.1.5. Einfluss der Patientenparameter

Da die Variabilität der Ag-Erkennungsmuster auch andere Ursachen als die Erkrankungen gehabt haben könnte, wurden alle bekannten Patientenparameter genauer untersucht. Die Patienten wurden nacheinander nach Geschlecht, Besiedlungsgrad bzw. Alter gruppiert und dann wurden t-Tests durchgeführt. Für die ersten beider Parameter ergaben sich keine Korrelationen (p<0,01) mit Spots, was auch nicht zu erwarten war, da sich beide Erkrankungsgruppen in Bezug auf diese Parameter nicht signifikant unterschieden. Geschlecht und Besiedlungsgrad hatten also keinen Einfluss auf die Analyse. Anders sah es hingegen mit dem Alter der Patienten aus – die Magenkrebspatienten waren im Durchschnitt signifikant älter als die Ulkuspatienten – Alter und Erkrankung stellten also keine unabhängigen Variablen dar. Ein t-Test (p<0,01) der 30 ältesten gegen die 30 jüngsten Patienten ergab jedoch keine Korrelationen. Im weiteren wurden [Seite 52↓]altersangepasste Subgruppen von 18 Magenkrebs- und 19 Ulkuspatienten verglichen (Altersunterschied mit p = 0,07 nicht mehr signifikant). Beim Vergleich dieser Erkrankungssubgruppen konnten neun (5 mit p<0,01 und weitere vier mit p<0,05) der 14 in der Gesamtanalyse mit Magenkrebs korrelierenden Spots eindeutig validiert werden. Die übrigen fünf Spots wurden bei dieser Analyse nicht als korrelierend gefunden (# in Tabelle 3) – hier könnte das Alter der Patienten einen Einfluss auf die Analyse gehabt haben. Da es sich aber um eine Untergruppe von nur 37 Patienten handelte, waren die Analysen nicht von so hoher Aussagekraft wie die der Gesamtanalyse mit allen 60 Seren.

3.1.6. Identifizierung der Spots

Die 14 von den Magenkrebsseren signifikant stärker erkannten Spots (Abbildung 7) wurden durch Mustervergleich bzw. MALDI-TOF MS identifiziert. Der Mustervergleich erfolgte durch Vergleichen von Spots und deren Abständen zu benachbarten Spots (lokale Spotmuster) auf den Blots mit denen des Referenzgels unserer 2-DE Datenbank. In den Fällen wo kein zugehöriger Spot gefunden werden konnte bzw. dieser noch nicht identifiziert worden war, wurde die Identifizierung aus präparativen Gelen mittels PMF durchgeführt. In Tabelle 3 wurden die Ergebnisse der zehn Spots aufgelistet, die identifiziert werden konnten. Die anderen vier Spots konnten aufgrund der viel geringeren Empfindlichkeit der CBB G-250 Färbung im Vergleich zum Immunoblot nicht im Gel gefunden und somit auch nicht identifiziert werden. Die zehn identifizierten Spots enthielten Proteinspezies von vier verschiedenen Proteinen: AtpA, GroEL, GroES, und HyuA – alles bekannte H. pylori Ag aber keine Virulenzfaktoren. Die o.g. Spots sind in unserer 2-DE Datenbank als Magenkrebs-assoziierte Ag aufrufbar. Leider konnte die Antigenität von AtpA nicht bestätigt werden (s. Kapitel 3.2.4).


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Tabelle 3 : Liste der identifizierten Magenkrebs-korrelierten Antigene.

Spot Nr. (SSP)

TIGR a

Locus

Proteinname

Protein-
spezies
b

GC korreliert lt. Literatur? c

2412

HP1134§

ATP synthase F1, subunit alpha (AtpA)

1/9

nicht erwähnt

2505#

HP0010

Heat shock protein 60 (GroEL)

3/15

ja [38,81]

nein [108]

2508

HP0010

Heat shock protein 60 (GroEL)

2509*

HP0010

Heat shock protein 60 (GroEL)

4003*

HP0011

Heat shock protein 10 (GroES)

3/3

nein [37]

4005*

HP0011

Heat shock protein 10 (GroES)

5002

HP0011

Heat shock protein 10 (GroES)

4720

HP0695

Hydantoin utilization protein A (HyuA)

3/3

ja [38]

5707

HP0695

Hydantoin utilization protein A (HyuA)

5708*#

HP0695

Hydantoin utilization protein A (HyuA)

1511#

-

Nicht identifiziert

-

-

4404#

-

Nicht identifiziert

4706*#

-

Nicht identifiziert

5101

-

Nicht identifiziert

a – Genlocus lt. TIGR Datenbank für H. pylori 26695; b – Anzahl der Magenkrebs-korrelierten Proteinspezies (GC) im Verhältnis zu allen im Referenzgel gefundenen Spezies dieses Proteins; c – Alle Proteine sind bekannte H. pylori Ag, Referenzen für veröffentlichte Analysen bzgl. Magenkrebskorrelation wurden angegeben; # Das Alter der Patienten könnte die Signifikanz dieser Spots beeinflusst haben; * Diese fünf Spots wurden als hypothetischer serologischer Test verwendet (s. Kapitel 3.1.8). § Spot 2412 enthält auch GroEL – die Korrelation von AtpA zu Magenkrebs konnte somit nicht bestätigt werden (s. Kapitel 3.2.4).

3.1.7.  Die Antigenität verschiedener Proteinspezies

Ein wesentlicher Vorteil der 2-DE ist die Separation von Proteinspezies, die sich in pI und/oder MG unterscheiden und z.B. durch PTM entstanden sein können. Die individuellen Spezies eines Proteins können sich in Hinsicht auf Immunogenität oder Antigenität unterscheiden. Zwei der vier verschiedenen Magenkrebs-korrelierten Ag zeigen einen solchen Effekt (s. Tabelle 3): GroEL und AtpA. Der Befund für ersteres Protein muss jedoch mit Vorsicht behandelt werden, da sich die Intensitäten der drei korrelierenden Spots in der Nähe des Detektionslimit befinden. Hier könnte eine Signifikanz nur „vorgetäuscht“ sein, da Intensitäten knapp unter dem Detektionslimit den Wert null erhielten. Dieser systematische Fehler beeinflusste die Mittelwerte der Spotintensitäten schwacher Spots prozentual stärker als diejenigen starker Spots. Für AtpA trifft dieser Fakt jedoch nicht zu, da der Magenkrebs-korrelierte Spot eine mittlere Intensität aufweist und weitere acht AtpA Spots nicht signifikant mit Magenkrebs korrelieren. Diese Proteinspezies könnte also aufgrund einer bestimmten Modifikation eine andere Immunogenität besitzen als die anderen AtpA Spezies, leider konnte diese Vermutung nicht bestätigt werden, [Seite 54↓]wie die Untersuchung der Spotkompositionen in Kapitel 3.2.4 zeigte.

3.1.8.  Ein hypothetischer serologischer Test

Um die diagnostische Relevanz der Ergebnisse einzuschätzen, wurde nach einer Untergruppe von Spots gesucht, die als Antigene für einen diagnostischen Test fungieren sollten. Es wurden verschiedene Kombinationen von Spots manuell zusammengestellt und geprüft, welche die meisten Magenkrebspatienten aus unserem Set von 60 Seren finden würden. Die folgenden fünf Spots lieferten die besten Ergebnisse: 2509, 4003, 4005, 4706 und 5708 (* in Tabelle 3). Mit dem Kriterium, dass mindestens drei der fünf Spots vom jeweiligen Prüfserum erkannt werden sollten, konnten die Magenkrebsfälle mit einer Sensitivität von 77% und einer Spezifität von 83% gefunden werden, d.h. 77% aller Magenkrebsseren wurden richtig erkannt und 83% aller Ulkusseren wurden korrekt als „nicht Magenkrebs“ erkannt.

3.2. Detaillierte Analysen von Massenspektren

3.2.1. Automatisierung des Identifizierungsprozesses

Aus einem großen Bereich eines H. pylori Lysat 2-DE Gels wurden 384 Spots in dreifacher Wiederholung automatisch ausgestochen, verdaut und mittels MALDI-TOF MS vermessen. Das automatische Prozessieren der Spektren führte zu einer Quote von 88% intern kalibrierten Spektren. Weitere 3% konnten manuell nachkalibriert werden, so dass letztlich 960 auswertbare Spektren zur Verfügung standen. Durch die Benutzung automatischer Datenbanksuchsysteme ist eine schnelle Identifizierung einer großen Anzahl an Spots möglich. Allerdings können Massenspektren sehr unterschiedliche Qualitäten aufweisen, so dass die Suchergebnisse stark von den verwendeten Suchparametern abhängen. Zur Optimierung der Suchen wurde deshalb ein Parameteroptimum für diesen Datensatz gesucht. Hierfür wurden ca. 6000 automatische Datenbanksuchen mit den Peaklisten, die mit S/N 5, 7 oder 10 erzeugt wurden, durchgeführt. Zusätzlich wurden verschiedene variable Modifikationen und Peptidmassentoleranzen getestet. Die folgenden Parameter produzierten für diesen Datensatz die höchsten Identifizierungsquoten: Peakdetektion mit S/N 7, fixe Methioninoxidation, 30 ppm Peptidmassentoleranz und maximal eine übersprungene Trypsinschnittstelle. Mit diesem Parameterset konnten 547 Spektren (= 57%) automatisch identifiziert werden. Durch die dreifache Wiederholung des Datensatzes wurden letztlich 75% aller Spots mindestens einmal mit signifikantem Score (p<0,05) identifiziert. Die Verwendung nur des autolytischen Trypsinpeaks bei 2211,104 Da für die interne Einpunktkalibrierung führte zu einer Peptidmassengenauigkeit von 30 ppm. Die Fehlerverteilung zeigte einen Abfall in den negativen Bereich für kleinere Massen. Dies hätte durch einen zweiten Kalibrierpunkt verhindert werden können, leider enthielten aber viele Spektren keinen weiteren [Seite 55↓]geeigneten Peak, so dass die Einpunktkalibrierung einen guten Kompromiss für diesen Datensatz darstellte.

Ein interessanter Peak konnte u.a. im Spektrum von Spot 433d gefunden werden. Dessen Isotopenmuster hatte die für MALDI-TOF MS ungewöhnlichen Abstände von m/z = 0,5, d.h. er war vermutlich zweifach geladen. Auch der einfach geladene Peak war im Spektrum zu finden (m/z2278,1 einfach und m/z 1139,5 zweifach geladen). Das zugehörige Peptid enthielt drei Histidine als potentielle Protonenakzeptoren für die zweite Ladung.

3.2.2. Überprüfung der Zuverlässigkeit der Identifizierungen

Zur Überprüfung der Zuverlässigkeit der automatischen Identifizierungen wurde nach Widersprüchen zwischen den Identifizierungen der drei Wiederholungen eines Spots gesucht. Nur neun Spots (3%) wurden mit signifikanten aber widersprüchlichen Identifizierungs­ergebnissen gefunden. Bei genauerer Analyse des Sachverhaltes wurde gefunden, dass davon drei Widersprüche durch ungenaues Ausstechen in einer Gelregion mit hoher Spotdichte entstanden waren. Zwei Spots enthielten Komponenten von Nachbarspots, die hier als Hauptkomponenten identifiziert wurden. Weitere drei Spots enthielten ein Mix aus mehreren Proteinen, von denen mal das eine und mal das andere als Hauptkomponente identifiziert wurden. Nur ein einziges Spektrum wurde vom Datenbanksuchalgorithmus einem falschen Protein zugeordnet. Der Anteil fehlerhafter Identifizierungen liegt also in der Größenordnung der von Mascot angegebenen Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% (p<0,05) für signifikante Scores.

Eine weitere Möglichkeit die Ergebnisse zu validieren war der Vergleich der automatischen Ergebnisse mit einigen in den letzten Jahren am Institut manuell identifizierten Spots (Benutzung des Voyager Elite MALDI-TOF [36]). Hierfür wurden 28 Spots zufällig ausgewählt und deren Identifizierungsergebnisse, Mascotscores, Anzahl zugeordneter Peptide und Sequenzabdeckungen verglichen. Es wurden, abgesehen von der Peptidmassentoleranz, identische Suchparameter verwendet (automatisch: 30 ppm, manuell: 100 ppm). Diese Werte sind auf die unterschiedlichen Genauigkeiten der verwendeten Geräte zurückzuführen. Durchschnittlich intensiv gefärbte Spots lieferten vergleichbare Ergebnisse. Für die wesentlich interessanteren schwach gefärbten Spots (Proteingehalt nahe an der Nachweisgrenze) wurden allerdings mit der manuellen Methode bessere Ergebnisse erzielt. Bei manuellem Verdau und Messung konnten die Prozeduren zeitaufwendig für die individuellen Proben angepasst und somit letztlich eine höhere Sensitivität erreicht werden.

3.2.3. Verbesserung der Identifizierungsergebnisse

Für diesen Teil der Analysen wurde die neuentwickelte Version des MS-Screener eingesetzt. [Seite 56↓]Zuerst wurden Massen, die häufiger als in 5% der Spektren (>47 von 960 Spektren) auftauchten, eliminiert. Diese Massen wurden als Kontaminanten angesehen, die keine spotspezifischen Informationen enthielten. Sie sind mit der jeweiligen Häufigkeit in Abbildung 8 dargestellt und in Tabelle 4 mit ihren vermuteten Quellen aufgelistet. Insgesamt wurden 61 Kontaminantenmassen gefunden. Davon konnten die folgenden zugeordnet werden: 12x Trypsin, 12x Na+, K+ - Komplexe von α-cyano-4-Hydroxyzimtsäure (Matrix), 7x Isotopenpeaks, 4x Ausreißer des HDPR, 3x GroEL und die anderen Massen waren von unbekannter Herkunft. Interessanterweise wurden keine Keratinpeaks gefunden. Mit dem Entfernen der Kontaminanten aus dem Datensatz konnte die Identifizierungsquote um 3% auf 78% gesteigert werden. Zusätzlich wurde die Sicherheit der Identifizierungen für die meisten Spots erhöht. Eine Ausnahme bilden die GroEL Spots, da drei Peptide dieses Proteins zu den Kontaminanten gerechnet und aus dem Datensatz entfernt wurden. Obwohl dieses Protein „nur“ in 15 verschiedenen Spots identifiziert wurde (nur 3,9% aller Spots) wurden diese Massen in mehr als 6% der Spektren gefunden und somit irrtümlich zu den Kontaminanten gezählt.

Abbildung 8 : Kontaminantenpeaks im gesamten Datensatz. Die Höhe der Balken gibt die Anzahl der Spektren an, in denen die entsprechende Peakmasse vorkommt. Insgesamt 61 Massen wurden in mehr als 5% der Spektren gefunden (über dem grünschraffiertem Bereich) und als Kontaminanten definiert. Die Peptidmassen wurden mit dem MS-Screener mit 30 ppm Toleranz intervallisiert und gezählt.


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Tabelle 4 : Liste der Kontaminantenmassen und deren mögliche Quellen.

m/z

 

Mögliche Quelle

m/z

 

Mögliche Quelle

m/z

 

Mögliche Quelle

1034,1

 

Matrix

1277,1

 

Matrix

2239,1

 

Trypsin

1041,6

 

-

1283,1

 

Matrix

2246,2

 

-

1045,6

 

Trypsin

1289,1

 

HDPR Ausreißer

2283,2

 

Trypsin

1050,1

 

Matrix

1305,8

 

-

2299,2

 

Trypsin

1056,1

 

Matrix

1488,7

 

GroEL

2300,2

 

Isotopenpeak

1062,1

 

HDPR Ausreißer

1595,9

 

GroEL

2313,2

 

-

1066,1

 

Matrix

1674,3

 

HDPR Ausreißer

2435,3

 

-

1072,1

 

Matrix

1674,8

 

-

2678,4

 

-

1078,1

 

Matrix

1677,9

 

-

2807,3

 

Trypsin

1085,7

 

-

1678,4

 

HDPR Ausreißer

2811,3

 

-

1088,0

 

Matrix

1802,9

 

-

2812,3

 

Isotopenpeak

1094,1

 

Matrix

1867,8

 

GroEL

2839,3

 

-

1126,6

 

Trypsin

1922,9

 

-

2840,3

 

Isotopenpeak

1129,7

 

-

1940,9

 

Trypsin

2914,5

 

Trypsin

1150,6

 

-

1962,9

 

-

2915,5

 

Isotopenpeak

1173,7

 

-

2003,1

 

-

3346,7

 

Trypsin

1199,7

 

-

2211,1

 

Trypsin

3347,7

 

Isotopenpeak

1217,7

 

-

2221,1

 

-

3353,7

 

-

1261,1

 

Matrix

2225,1

 

Trypsin

3354,8

 

Isotopenpeak

1261,8

 

-

2233,1

 

Trypsin

   

1267,1

 

Matrix

2234,1

 

Isotopenpeak

   

Alle Peaks, die häufiger als in 5% der Spektren auftraten, wurden als Konzaminanten definiert. Die Massen möglicher Matrixcluster wurden berechnet [82] und die autolytischen Trypsinmassen nach [83,84,59] zugeordnet. Die drei GroEL Peaks gehören zu den intensivsten Peaks im Spektrum des GroEL Hauptspots und wurden irrtümlich als Kontaminanten definiert, da sie in ≥5% der Spektren auftraten. Beim automatischen Peaklabeln wurden insbesondere bei schwachen Peaks hoher Massen auch Isotopenpeaks gelabelt.

3.2.4.  Untersuchung von H. pylori Antigenen

Die Ergebnisse des Vergleichs der Ag-Erkennungsmuster von Magenkrebs- und Ulkuspatienten mittels Immunoproteomics sind in Kapitel 3.1ausführlich beschrieben worden. Für die Methode typisch sind die hohe Spezifität und Sensitivität, da AK der Patientenseren hochaffin an H. pylori Ag binden. Ein mittels 2-DE separierter Spot kann allerdings aus mehr als einem Protein bestehen – also mehrere Komponenten haben. Die hohe Sensitivität von Immunoproteomics macht eine genaue Untersuchung der Spotkomposition notwendig, da eventuell die Nebenkomponente eines Spots von den AK erkannt werden könnte und mittels PMF oft nur die Hauptkomponente eines Spots identifiziert wird. In einem solchen Fall wäre das identifizierte Protein gar nicht das Ag.


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Vierundzwanzig von früheren Studien als erkrankungskorreliert bekannte Ag von H. pylori 26695 [38,85] bzw. in Mäusen protektiv wirkende Ag [43] wurden für die Analyse ausgewählt (Tabelle 5). Die entsprechenden Spots mussten im CBB G-250 Gel angefärbt und zuordenbar sein. Für diese Studie kam mir die dreifache Wiederholung der Spotidentifizierungen zu Gute, so dass nur die reproduzierbar in den PMFs auftretenden Peaks (≥ 2/3 Spektren) untersucht werden mussten. Mithilfe des Programms MS-Screener und des hierarchischen Clusterverfahrens wurden: 1. weitere Proteine in den Spots identifiziert, 2. Peaks aus Proteinen, die in anderen Spots des Gels identifiziert wurden, zugeordnet (hierarchisches Clustering) und 3. mögliche Peptidmodifikationen gefunden (Datenbanksuchen). Um weitere Proteine in einem Spots per Datenbanksuche zu identifizieren wurden die der Hauptkomponente zugeordneten Massen gelöscht und die Suche wiederholt. Diese Methode führte allerdings nur in einem Fall (Spot 154) zum Erfolg, da übrig gebliebene Massen meist nicht zur eindeutigen Identifizierung ausreichten. Das hierarchische Clustering war dabei erfolgreicher. Spots, die im Dendrogramm nahe beieinander lagen und als verschiedene Proteine identifiziert wurden, waren Kandidaten für eine nähere Analyse. Durch Vergleich der Peaklisten dieser Spots wurden die identischen Massen in den betreffenden Spots gefunden, die zur gemeinsamen Gruppierung geführt hatten. In vermutlich acht Spots waren somit Peaks anderer Proteine vorhanden, die also Neben­komponenten waren. Hierbei konnte allerdings nicht unterschieden werden, ob es sich bei der Hauptkomponente des einen Spots und der Nebenkomponente des anderen Spots um die gleichen Proteinspezies handelte. Weiterhin wurden nicht-zugeordnete Peptidmassen der Spektren mittels Datenbanksuchen mit vielen möglichen Modifikationen (Deamidierung (N, Q), Methylester (D, E), N-Acetylierung (Protein), Propionamid (C), N-terminales Pyroglutamin (Q), Natriumaddukte (D, E) sowie zwei übersprungene Trypsinschnittstellen) untersucht. Für die Spots mit übrig gebliebenen, also nicht erklärten Peaks, wurde dieser Fakt in der Tabelle vermerkt. Solche Peaks können in Zukunft per MS/MS genauer untersucht werden, falls die Intensität hierfür ausreicht.

Die Ergebnisse dieser gesamten Prozedur stellten sich folgendermaßen dar. Insgesamt sechs Ag enthielten keine reproduzierbaren Peaks, die nicht zum identifizierten Protein zugeordnet werden konnten. Mit Bezug auf die Empfindlichkeit der verwendeten Methode konnte bei diesen Spots angenommen werden, dass sie keine Nebenkomponenten enthielten. Neun Spots enthielten Peaks die nicht zu anderen Proteinen (aus Nachbarspots oder durch Spots die im Clusterdendrogramm nahe lagen) zugeordnet werden konnten. Diese könnten von seltenen Peptidmodifikationen (die nicht mit den Identifizierungsprogrammen gesucht werden können) stammen, durch unspezifische Trypsinschnitte oder unbekannte Nebenkomponenten verursacht worden sein. In den verbleibenden neun Spots wurden Peaks gefunden, die vermutlich aus anderen Proteinen stammten, sechs davon aus direkt benachbarten Spots. Abgesehen von zwei [Seite 59↓]Proteinen (HP1533, HP0380) sind die anderen sieben bekannte H. pylori Ag und wurden im folgenden näher untersucht. Hierzu wurde in den Immunoblots nachgesehen, ob die betreffenden Spots immer gemeinsam mit den Hauptspots ihrer Nebenkomponenten detektiert wurden. Diese Analyse brachte Hinweise, dass dies bei drei Spots der Fall war und bei jenen die Ag Erkennung durch die Nebenkomponenten verursacht sein könnte (Spots 154, 278, 279). Bei den anderen vier Spots war die Ag-Erkennung unabhängig von der Detektion der Hauptspots der jeweiligen Nebenkomponente – die Antigenität dieser Spots wurden vermutlich nicht durch diese Nebenkomponenten beeinflusst. In der eben beschriebenen Analyse musste allerdings wieder die Proteinspezies-Ebene verlassen werden, d.h. die Aussagen treffen nur zu, wenn bei diesen Spots keinen Unterschied zwischen der Antigenität der Proteinspezies als Nebenkomponente und der (möglicherweise anderen) Proteinspezies des entsprechenden Hauptspots gab.

Das bekannte Ag GroEL (HP0010) wurde in 15 verschiedenen Spots unseres Datensets identifiziert (s. Kapitel 3.2.5.1). Die Untersuchung der Antigenität der einzelnen Proteinspezies in den Immunoblots zeigte, dass alle 15 immer gleichzeitig von den Patientenseren detektiert wurden. Bei der Analyse der 24 Spots im Datensatz, die drei der fünf intensivsten GroEL Peaks enthielten (Tabelle 6), konnte festgestellt werden, dass alle bis auf drei (Spots 313, 314, 372) immer gleichzeitig erkannt wurden. Dies ist ein Hinweis darauf, dass diese 21 Spots tatsächlich GroEL als Haupt- oder Nebenkomponente enthielten. Ebenso gab es keine Hinweise auf eine differentielle Antigenität bzw. Immunogenität einzelner GroEL Spezies. Für Spot 154 (SSP2412) gab es in der Immunoblotanalyse Hinweise, dass nur diese AtpA Spezies signifikant stärker von Magenkrebsseren erkannt wurde (s. Kapitel 3.1.7). Hier wurde jetzt herausgefunden, dass dieser Spot einen Mix aus AtpA (HP1134) und GroEL (HP0010) darstellt und vermutlich keine differentielle Antigenität verschiedener AtpA Proteinspezies vorliegt (Tabelle 5). Die Magenkrebs-Korrelation könnte von einer der beiden Spotkomponenten stammen, von welcher konnte hier allerdings nicht entschieden werden.


[Seite 60↓]

Tabelle 5 : Untersuchung der Spotkomposition serumreaktiver Spots

Spot Nr.

TIGR Locus

Kurzname

Nebenkomponenten

114

HP0072

UreB

unbekannte Peaks

125§

HP0695

HyuA

keine gefunden

126§

HP0695

HyuA

unbekannte Peaks

133

HP0192

FrdA

keine gefunden

154§

HP1134

AtpA

Mix mit HP0010 (GroEL)*

163

HP0010

GroEL

unbekannte Peaks

189

HP0875

KatA

unbekannte Peaks

204

HP1205

TufB

Nebenkomponente HP1132

225

HP0010

GroEL

keine gefunden

265

HP0224#

MsrA

Nebenkomponente HP1012

266

HP0224#

MsrA

Nebenkomponente HP0380

267

HP0224#

MsrA

Nebenkomponente HP0027

278

HP1012

PqqE

Nebenkomponente HP0224*

279

HP1104

Cad

Nebenkomponente HP0224*

287

HP1104

Cad

Nebenkomponente HP1533

338

HP1152

FfH

keine gefunden

346

HP0537

Cag16

unbekannte Peaks

384

HP1562

CeuE

keine gefunden

433

HP0410

HpaA

keine gefunden

436

HP0073

UreA

unbekannte Peaks

439

HP0073

UreA

unbekannte Peaks

442

HP1564

(omp)

Nebenkomponente HP0073

445

HP0231

hypothetisch

unbekannte Peaks

455

HP0175

(cbf 2)

unbekannte Peaks

Die aufgelisteten Spots sind bekannte Ag von H. pylori[38,85,43]. Mit § markierte Spots gehören zu den 14 signifikant stärker von Magenkrebspatientenseren erkannten Ag (s. Kapitel 3.1.4). Loci markiert mit # wurden bei [38] als HP0027 identifiziert (hohe Spotdichte in dieser Region). Die unbekannten Peaks sind in mindestens zwei der drei Replikate aufgetreten und konnten weder zur Hauptkomponente des Spots noch zum Protein eines anderen Spots, der im Dendrogramm in der Nähe lag, zugeordnet werden. „Keine gefunden“ bedeutet, dass alle reproduzierbaren Peaks der Hauptkomponente zugeordnet werden konnten. * diese Neben­komponenten haben wahrscheinlich die Antigenität des Spots beeinflusst (Erläuterungen im Text).

3.2.5.  Proteinspezies in 2-DE Gelen

3.2.5.1.  Verteilung von GroEL Spezies

Ein Vorteil der 2-DE Technik ist die Auftrennung einzelner Proteinspezies, vorausgesetzt diese unterscheiden sich in pI bzw. MG. Somit können mehrere unterschiedlich modifizierte Expressionsprodukte von einem ORF in Form mehrerer Spots in Erscheinung treten. Beispiele für dieses Phänomen sind die folgenden Proteine: Translation Elongation Factor EF-Tu (4 [Seite 61↓]Spots), Catalase (5 Spots), Alkyl Hydroperoxide Reductase (8 Spots), Urease alpha-Subunit (9 Spots) und GroEL (15 Spots). Im Durchschnitt des gesamten Datensatzes wurden 1,6 Proteinspezies pro ORF gefunden. Mit 15 verschiedenen Spots trat GroEL am häufigsten auf (Abbildung 9). Interessanterweise kamen diese Spots in drei Gruppen vor: eine Gruppe um den Hauptspot (5 + 2 Spots), eine Gruppe mit niedrigerem MG und saurerem pI (2 Spots) und eine Gruppe mit niedrigerem MG und basischerem pI (6 Spots). Beim Vergleich der Sequenzabdeckungen mit dem Hauptspot wurde festgestellt, dass die zweite Gruppe möglicherweise N-terminal verkürzt ist (das Peptid mit AS 13-20 wurden nicht gefunden) während die letzte Gruppe vermutlich C-terminal verkürzt ist (7 Peptide mit AS 425-522 fehlen). Die theoretisch berechneten MG und pI Werte für die verkürzten Formen waren dem Laufverhalten der entsprechenden Spots sehr ähnlich.

Abbildung 9 : Verteilung von GroEL Proteinspezies in einem 2-DE Gel und Immunoblot. Das Gel (links) wurde mit CBB G-250 gefärbt und der Immunoblot (rechts) mit einem Magenkrebsserum inkubiert. Die roten Dreiecke zeigen die 15 Spots, deren Hauptkomponente GroEL darstellt. Alle diese Spots wurden immer gemeinsam von den Serum-AK erkannt.

Im folgenden wurde die Verteilung von GroEL im Gel noch weiter analysiert, indem die Peaklisten nach „GroEL-typischen“ Massen durchsucht wurden (s. auch [86]). Wurden die Peaklisten des Datensatzes nach dem intensivsten Peak des Hauptspots (1595,9 Da) durchsucht, konnte dieser in 33 verschiedenen Spots gefunden werden. Die Anwendung des strengeren Kriteriums, dass mindestens drei der fünf intensivsten Peaks (1595,9; 947,5; 1867,8; 1488,7; 1401,6) gefunden werden sollten, brachte immer noch 24 Spots. Drei dieser Massen gehören auch der Kontaminantenliste an (1595,9; 1867,8; 1488,7), d.h. diese wurden in 7, 6 bzw. 6% der Spektren gefunden. Die anderen beiden wurden nur in 4% der Spektren gefunden und sind somit nicht als Kontaminanten definiert worden. Die möglichen GroEL Peptide waren weit über das Gel verteilt, jedoch unterschied sich die Verteilung von Gel zu Gel. In den Gelen A, B und D [Seite 62↓]wurden 21, 12 bzw. 13 Spots mit drei der fünf GroEL Peaks gefunden (Tabelle 6).

Tabelle 6 : Verteilung von GroEL Peaks.

x - Spots in den entsprechenden Gelen enthalten drei der fünf intensivsten GroEL Peaks; gestreift hinterlegt - Spots, die eindeutig mit GroEL als Hauptkomponente identifiziert wurden; o - diese Spots enthalten ein anderes Protein als Hauptkomponente (Spot 154 ist in Gel A ein Mix aus zwei Proteinen); - Spots wurden nicht identifiziert. Die Suche wurde mit dem MS-Screener mit dem Datensatz inklusive Kontaminanten durchgeführt.

3.2.5.2. Weitere Beispiele für Proteinspezies

Dimere von Alkyl Hydroperoxide Reductase

Der Spot 312 wurde als Alkyl Hydroperoxide Reductase identifiziert. Das sichtbare MG im Gel war allerdings etwa doppelt so groß wie das theoretische MG laut Datenbank. Ein weiterer Spot (413) mit dem korrekten MG wurde gefunden und ebenfalls als dieses Protein identifiziert. Daher konnte vermutet werden, dass es sich bei Spot 312 um Dimere des Spots 413 handeln [Seite 63↓]könnte. Beim Vergleich der Sequenzabdeckungen in den PMF wurden Unterschiede festgestellt (Abbildung 10). Beide im Protein vorkommenden Cysteine (AS 49 und 169) wurden im PMF des Hauptspots (413) zugeordnet und konnten nicht in Spot 312 gefunden werden. Das Peptid mit AS 44-58/59 wurde mit den folgenden Modifikationen im Hauptspot gefunden: Propionamid (1816,8 Da), eine übersprungene Spaltstelle und Propionamid (1973,0 Da) und ein zusätzlicher Methylester (1987,0 Da). Beide Modifikationen sind vermutlich Aufarbeitungsartefakte: Propionamid entsteht durch die Reaktion von Cystein mit unpolymerisiertem Acrylamid des Gels und Methylester an Aspartat oder Glutamat entstehen durch die fünf Tage dauernde CBB G-250 Färbung in methanolhaltiger Lösung. Das Peptid der AS 155-147 mit oxidiertem Methionin und Propionamid (2383,1 Da) wurde ebenfalls gefunden. Die Methioninoxidation ist auch ein typischer Aufarbeitungsartefakt. Zur Sicherheit wurden die Sequenzen der beider Peaks 1973,0 und 2383,1 mittels MS/MS bestätigt. Wegen der wesentlich niedrigeren Peakintensitäten des PMF von Spot 312 könnten schwache Peaks von Spot 413 nicht detektierbar sein, der Peak bei 1973,0 Da war allerdings intensiver als der Peak bei 1649,8 Da und wäre somit auf jeden Fall detektierbar gewesen. Aus diesen Fakten folgte, dass das Cystein-49 enthaltende Peptide nicht in Spot 312 gefunden werden konnte und deshalb vermutlich in die Disulfidverbrückung der Dimere involviert sein könnte. Da der zweite cysteinhaltige Peak im Rauschen vom PMF des Spots 312 versteckt sein könnte, war die Entscheidung, ob es sich um Hetero- oder Homodimere handelte, nicht möglich.


[Seite 64↓]

Abbildung 10 : Ein Protein und sein Dimer. Ein Sektor des CBB G-250 gefärbten 2-DE Gels ist oben rechts zu sehen. Spot 312 enthält Dimere des Proteins aus Spot 413. In beiden Spots wurde Alkyl Hydroperoxide Reductase mit Sequenzabdeckungen von 48 bzw., 72% identifiziert (PMF Spektren links vom Gel). Die Sterne markieren die cysteinhaltigen Peptide, die nicht im Dimer detektiert wurden (Erläuterungen siehe Text).Die schwarzen Quadrate markieren Kontaminantenmassen im oberen Spektrum, die auftraten weil dieses Spektrum insgesamt sehr geringe Intensität aufwies. Zwei cysteinhaltige Peptide wurden mittels MALDI-TOF/TOF mit Mascotscores, dieextensive Homologie indizieren, bestätigt (untere MS/MS Spektren). Die gefundenen Fragmente sind im Spektrum gelabelt und die y und b-Serien sind in der Sequenz markiert. Ein * markiert einen Verlust von NH3, eine 0 den Verlust an H2O und int zeigt ein internes Fragment an.

Zwei γ-Glutamyltranspeptidase Fragmente

Ein weiteres Paar Spots mit unterschiedlichem MG und der gleichen Identifizierung (γ-Glutamyltranspeptidase) sind Spots 347 und 494. Durch Vergleich der Sequenzabdeckungen der beiden PMF konnte vermutet werden, dass es sich um zwei Fragmente des Proteins handelt, [Seite 65↓]deren Sequenzen sich gegenseitig ausschließen. Spot 347 deckte bis AS 368 ab und Spot 494 ab AS 427. Im Bereich zwischen den AS 369-426 wurde in beiden Spots kein Peptidmasse zugeordnet – hier konnte also die Schnittstelle vermutet werden. Bei Annahme der Schnittstelle bei AS 370 resultierten vergleichbare pI und MG Werte für die Berechnung und das Laufverhalten der beiden Fragmente (Angaben als pI/MG): Spot 347: im Gel 9,0/40,0 und theoretisch 9,5/39,8; Spot 494: im Gel 6,7/20,0 und theoretisch 6,3/21,0. Ein Spot mit dem ungeschnittenen Protein (theoretisch bei 61,2 kD) wurde nicht gefunden. Aus diesem Grund kann angenommen werden, dass der gesamte Gehalt an γ-Glutamyltranspeptidase in zwei Teile zerschnitten wurde.

3.2.6. Suche nach weiteren Spotkomponenten mittels Korrespondenzanalyse

Um Spotkomponenten in größeren Datensätzen zu finden wurde von uns die Software CorrAn weiterentwickelt, die es nun ermöglichte durch interaktives Setzen von Schwellen den Datensatz zu reduzieren und durch Wiederholen der KA schrittweise neue Zusammenhänge zwischen Spots zu finden. Die KA unter Verwendung des gesamten Datensatzes brachte u.a. eine Gruppe von fünf Spots zum Vorschein (Gruppe 1 in Abbildung 11oben), die von allen anderen Spots klar separiert lagen. Diese Spots waren auch im 2-DE Gel nahe beieinander liegend und enthielten alle das Protein Catalase. Im gesamten Gel gab es keinen weiteren Spot, der Catalase enthielt. Da es in der KA möglich ist, Objekte und Merkmale in denselben Faktorraum zu projizieren, konnten auch die acht charakteristischen Massen dieser Spotgruppe gefunden werden. Alle acht Massen konnten zu Catalase zugeordnet werden. Um weitere Spots mit Ähnlichkeiten in ihren PMFs zu finden, wurden die Massen des Datensatzes, die nur geringe Beiträge zum Clustern lieferten, durch manuelles Setzen von Schwellen gelöscht. Ein Beispiel für ein neu auftauchendes Spotcluster nach erneuter KA mit reduziertem Datensatz ist die Gruppe 2 in Abbildung 11unten. In beiden Spots wurden verschiedene Proteine identifiziert (Fumarase und Isocitrate Dehydrogenase). Der Grund, dass sie in einem Cluster gefunden wurden, war, dass beide Proteine im jeweils anderen Spot zusätzlich als Nebenkomponenten auftraten. Die iterative Variante der KA ermöglicht also das Finden von Nebenkomponenten in Spots ohne diese identifizieren zu müssen.


[Seite 66↓]

Abbildung 11 : Ergebnisse der Korrespondenzanalyse. Links sind die zweidimensionalen Faktorräume eines aus 284 PMF Spektren bestehenden Datensatzes dargestellt. Links oben: Faktorraum mit gesamter Datenmatrix (284 Spots x 1888 Massen). Links unten: Faktorraum nach dem Löschen der Massen mit kleinen Clusterbeiträgen aus der Datenmatrix (284 Spots x 94 Massen). Rechts: Gelsektor eines CBB G-250 gefärbten H. pylori Gels. Die Spotgruppen 1 und 2 sind jeweils im Faktorraum und im Gel markiert. Gefüllte Punkte – Spots, ungefüllte Vierecke – charakteristische Massen.

3.2.7. Vervollständigung des H. pylori Proteoms

Ein zusätzlicher Aspekt dieser Arbeit war die Vervollständigung unserer institutseigenen Proteomdatenbank von H. pylori 26695. Mit dieser Studie wurden insgesamt 298 Spots (78% aller gemessenen Spots) identifiziert, die insgesamt 183 verschiedene ORFs repräsentierten. Vierundzwanzig ORFs davon sind neu und wurden in die Datenbank übernommen. Bei vier Spots stehen die Identifizierungen im Widerspruch zu den manuellen Ergebnissen, auf denen die Datenbankeinträge bisher ausschließlich beruhten. Die Gründe hierfür wurden in Toleranzen beim Ausstechen der Spots in Regionen hoher Spotdichte oder in Spots, die Proteingemische enthalten, vermutet. Eine Liste dieser neuen Proteine findet sich in [87].

3.2.8. Identifizierung von in-vivo exprimierten Proteinen von S. enterica

Aus Blinddärmen infizierter Mäuse gewonnene und mittels FACS sortierte Salmonellen wurden [Seite 67↓]aufgearbeitet und deren Proteine mittels hochauflösender 2-DE aufgetrennt. Zur Untersuchung der Stoffwechselaktivitäten in-vivo und zur Suche von Virulenzfaktoren war die Zielstellung des Projektes möglichst viele Proteine schnell und zuverlässig zu identifizieren. Da im FACS fluoreszenzmarkierte Einzelzellen sortiert werden, ist die Probenmenge begrenzt. Aus diesem Grunde waren im CBB G-250 gefärbten Gel nur knapp 200 oft schwach gefärbte Spots zu sehen. Manuell ausgestochen und verdaut wurden 194 verschiedene Spots und mit dem MALDI-TOF/TOF gemessen. Für jeden Spot wurde ein PMF aufgenommen und jeweils für die drei intensivsten Peaks zusätzliche Sequenzinformationen mittels MS/MS gewonnen. Ein kritischer Punkt bei der Proben­aufarbeitung war das Auskristallisieren der Matrix mit den Probenmolekülen auf der MALDI-Platte. Hierfür ist das Verhältnis von Matrix zu Probe entscheidend, da nur gute Kristalle intensive Spektren liefern. Aus diesem Grund wurde ein Großteil der Proben in zwei verschiedenen Verhältnissen aufgetragen und dann jeweils das bessere Spektrum zur Analyse verwendet. Insgesamt konnten in diesem Datensatz 171 Spots (= 88%) identifiziert werden. Dieser hohe Anteil war nur durch die zu jedem PMF aufgenommenen MS/MS Spektren möglich. Selbst bei schwachen Spots gab es oft Peaks, deren Intensität für die MS/MS Analyse ausreichte. Bei einem Teil der Daten wurden die Identifizierungsergebnisse der PMF + MS/MS Spektren mit denen der reinen PMF Spektren verglichen, um die Bedeutung der MS/MS Spektren für die Spotidentifizierungen abzuschätzen. Von 56Spots konnten mittels PMF nur 19 (= 34%) identifiziert werden. Bei zusätzlicher Verwendung der MS/MS Spektren wurden 37 (= 68%), also fast doppelt so viele identifiziert. Die FACS Sortierung der GFP markierten S. enterica Proteine war sehr effizient, da im gesamten Datensatz nur ein Mausprotein und sieben Proteine, die vermutlich von E. coli stammen, gefunden wurden. Die eindeutige Unterscheidung zwischen Proteinen von S. enterica und E. coli war nicht immer möglich, da große Sequenzhomologien bestehen und mit PMFs immer nur ein Teil der Sequenz abgedeckt wird.

3.3. Immunopräzipitation von H. pylori Antigenen

3.3.1. Abschätzung der nötigen IgG Menge für die Immunopräzipitation

Den IP Versuchen sind durch die geringe Menge an wertvollen Patientenseren von 250-500 µl enge Grenzen gesetzt. Aus diesem Grunde wurde in Kapitel 1.3.2 eine Abschätzung vorgenommen, welche Menge an AK nötig sei, um eine ausreichend große Menge an Ag zu präzipitieren. Danach können mit 500 µl Serum bis zu 65 µg Ag präzipitiert werden. Dies ist wenig, aber vorausgesetzt die Ausbeute wäre groß genug, könnte diese Menge z.B. für die Auftrennung der Präzipitate mit kleinen 2-DE Gelen ausreichen.

Die methodische Entwicklung der IP erfolgte in zwei Schritten. Im ersten Schritt wurden H. [Seite 68↓]pylori spezifische AK angereichert, die dann an Protein-G Sepharose gebunden und kovalent gekoppelt wurden. Die eigentliche IP mit Bakterienlysat erfolgte im zweiten Schritt, wobei die präzipitierten Ag zur Optimierung der Methode vorerst mit 1-DE aufgetrennt wurden.

3.3.2. Affinitätsreinigung H. pylori spezifischer Antikörper

3.3.2.1. Affinitätsreinigung mittels Nitrocellulosepartikel

In diesem Ansatz wurden die H. pylori spezifischen AK aus dem Serum mittels an frisch hergestellten NC-Partikel gebundenem H. pylori Lysat aufgereinigt. Hierzu wurde in einer Reihe von Versuchen die Methode optimiert. Die Lyse der Bakterien erfolgte letztlich in PBS, da der RIPA Puffer (s. Kap. 2.3.1) die Bindung der Lysatproteine an die NC-Partikel verhinderte. Für die Lyse wurden die Volumina an PBS und die Ultraschallparameter optimiert. Nach der Bindung der Bakterienproteine an die NC-Partikel und dem Wegwaschen überschüssiger Proteine wurde eine Inkubation mit Testserum durchgeführt. Die AK banden in diesem Schritt an die Bakterien-Ag. Im nächsten Schritt wurde das Serum weggewaschen und die H. pylori spezifischen AK eluiert. Für diese Prozedur wurden die Lysatverdünnungen, Waschschritte, Inkubationszeiten und Serumverdünnungen optimiert. Die Elution der AK wurde mit sauren und basischen Puffern sowie solchen mit hoher und niedriger Ionenstärke getestet. Die besten Elutionsergebnisse konnten unter sauren Bedingungen erzielt werden (Elution Buffer aus dem SeizeX Kit). Da dieser Elutionspuffer durch den Gehalt an primären Aminen die kovalente Koppelung der IgG an die Protein-G Sepharose stört, mussten die Eluate umgepuffert werden. Hierzu wurden mit BSA abgesättigte Ultrafree Filter mit einem cut-off von 30 kD verwendet (die AK Menge im Durchlauf war sehr gering). Die als Alternative getestete TCA-Fällung hatte zu hohe Verluste, da die Proteinkonzentrationen sehr gering waren. Die Eluate wurden mit 1-DE Immunoblots auf das Vorhandensein von humanen AK in den Elutionsfraktionen getestet. Mittels ELISA wurden Anreicherungsfaktoren und Ausbeuten für die H. pylori spezifischen AK bestimmt (Abbildung 12). Bei der Inkubation mit der NC wurden ca. 80% der H. pylori spezifischen AK gebunden. An den gesamt-IgG OD-Werten fiel auf, dass sich die Konzentration an gesamt-IgG in den Seren mit der Inkubation kaum änderte – es wurde also nur ein geringer Teil der IgG an die H. pylori Proteine der NC-Partikeln gebunden. Die Gesamtmengen an IgG in den Eluaten 1 und 2 unterschied sich jedoch fast um Faktor zehn – genauso wie die H. pylori spezifischen IgG, d.h. ein Großteil der eluierten AK ist tatsächlich H. pylori spezifisch. Unter optimalen Bedingungen (1:40 verdünntes Serum und Inkubation über Nacht auf Eis) wurde ein Anreicherungsfaktor der spezifischen AK gegenüber dem Serum von 133 und eine Ausbeute von 7% erreicht.


[Seite 69↓]

Abbildung 12 : ELISA Ergebnisse zur Bestimmung der IgG Konzentrationen in den Eluaten. Es sind jeweils die OD Werte bei 450 nm für die verschiedenen Verdünnungen dargestellt. Zur Kontrolle wurde jeweils das Serum vor und nach der Inkubation mit den NC-Partikeln mitgemessen. Der obere Teil der Abbildung zeigt die OD für die H. pylori spezifischen IgG und unten werden die gesamt-IgG Werte gezeigt.

Ein quantitativer ELISA zur Bestimmung der IgG Konzentrationen ergab 2 ng/µl spezifische IgG im Eluat. Mit 500 µl Patientenserum könnten also nach der Affinitätsreinigung ca. 10 µg Ag präzipitiert werden.

3.3.2.2. Affinitätsreinigung mittels H. pylori

Im alternativen Ansatz sollten intakte Bakterienzellen zur Affinitätsreinigung der AK Verwendung finden. Patientenserum wurde mit den Zellen inkubiert, dann gewaschen und die AK wurden sauer eluiert. Dann wurden die AK mit Protein-G Sepharose aufgereinigt. Zusätzlich wurde auch statt der intakten Bakterien nur die ungereinigte Membranfraktion (Pellet nach der Lyse) getestet. Im ELISA wurde der H. pylori – spezifische Titer mit in den wells fixierten Bakterien getestet. Leider wurde mit beiden Varianten nur ein sehr geringer IgG Titer (0,2% Ausbeute an spezifischem IgG) in den Eluaten gefunden.


[Seite 70↓]

3.3.3.  Präzipitation der Antigene

Nach dem Binden der spezifischen AK an die Protein-G Sepharose erfolgte die kovalente Kopplung mit dem Ziel, die Sepharose mehrfach verwenden zu können und somit Patientenserum zu sparen. Hierzu wurde die Lysatverdünnung für die IP optimiert. Zum Aufkonzentrieren der IP-Eluate wurden Ultrafree Filter (s.o.) verwendet. Die dreimalige Verwendung der kovalent gekoppelten Sepharose führte zur Präzipitation einer für die MS Analyse ausreichenden Menge an Ag (Abbildung 13). Als Vergleich zur IP wurde auch H. pylori Lysat mit aufgetragen. Die eingesetzte Menge ist allerdings zu gering gewesen um in der CBB G-250 Färbung viele Banden sehen zu können. Auch die Durchläufe diverser Waschschritte wurden mit auf das Gel aufgetragen – sie enthielten Banden, die sich von denen der IP deutlich unterschieden. Der Durchlauf durch das Ultrafree Röhrchen enthielt nur eine sichtbare Bande – die der intensivsten Bande der IP – so dass davon ausgegangen werden konnte, dass das Aufkonzentrieren der Eluate weitgehend ohne Verluste verlief. Das gepoolte Eluat der drei aufeinanderfolgenden IPs enthielt zehn gut sichtbare Banden, die mittels PMF identifiziert wurden (Tabelle 7). Die Banden 1-7 enthielten vermutlich alle BSA, welches zum Absättigen der Ultrafree-Röhrchen verwendet wurde. Die große Anzahl an BSA Banden erklärt sich aus dem in diesem Experiment irrtümlich verwendeten nicht-reduzierenden Probenpuffer für die SDS-PAGE, so dass die große Anzahl an Cysteinen im BSA Disulfidbrücken zwischen unterschiedlichen Positionen eingehen konnten und somit dem Protein vermutlich verschiedene Konformationen gaben, die Einfluss auf das Laufverhalten hatten. Ebenso entstanden auf diesem Wege möglicherweise Multimere (Banden 1-3). Die Banden 8-10 enthielten H. pylori Proteine, von denen drei bisher nicht in unserer 2-DE Datenbank verzeichnet waren. Dieser Befund war vielversprechend, allerdings wurden bei diesem Experiment noch keine Kontrollen durchgeführt.


[Seite 71↓]

Abbildung 13 : CBB G-250 gefärbtes Gel der IP mit NC-Partikeln angereicherter H. pylori-spezifischer AK (nicht-reduzierende Bedingungen). M – MG-Marker (Angaben in kD); L – 0,5 µl H. pylori Lysat; D1-D3 – je 5 µl der Durchläufe der Waschschritte vor der Elution; IP – gesamte IP Elutionsfraktionen aus drei Wiederholungen gepoolt und aufkonzentriert (links und rechts davon befinden sich je eine leere Spur); DIP – Durchlauf durch Ultrafree Röhrchen beim Aufkonzentrieren. In der IP Spur sind zehn Banden eingezeichnet, deren Identifizierungsergebnisse in Tabelle 7 aufgelistet sind.

Tabelle 7 : PMF Identifizierungsergebnisse der IP Banden aus Abbildung 13.

Bande

NCBI Accession/

TIGR Locus

Protein

MG lt. Daten­bank

Mascot Score

S.C.

%

Peptide

1

-

Kein hit; 5 BSA Peaks

    

2

gi|30794280

Albumin (Bos Taurus)

69kD

106

29

19/51

3

gi|30794280

Albumin (Bos Taurus)

69kD

131

26

20/45

4

gi|30794280

Albumin (Bos Taurus)

69kD

137

30

21/49

5

gi|30794280

Albumin (Bos Taurus)

69kD

123

28

18/40

6

-

Kein hit; 8 BSA Peaks

    

7

gi|30794280

Albumin (Bos Taurus)

69kD

120

29

23/65

8

HP1316*

Ribosomal protein L2

30kD

63

41

10/56

 

(HP1571)*

(Rare lipoprotein A)

35kD

37§

16

7/46

9

HP0073#

Urease, alpha subunit

27kD

84

49

13/50

 

HP0507*

conserved hypothetical prot.

24kD

47

15

7/50

10

HP0073#

Urease, alpha subunit

27kD

85

63

17/52

S.C. – Sequenzabdeckung. Die Mascot Scores beziehen sich für Banden 1-7 auf die Suche gegen NCBI (Scores>74 signifikant) und für Banden 8-10 auf die Suche gegen die H. pylori 26695 Datenbank von TIGR (Scores>45 signifikant). Die letzte Spalte kennzeichnet die Anzahl zum Protein zuordenbarer Peptide / Anzahl aller Peptide im PMF. § - dieser Scorewert ist nicht signifikant, das Protein also nur ein Kandidat. * Protein bisher nicht in unserer 2-DE Datenbank. # bekanntes Ag.

Aus der quantitativen Bestimmung der affinitätsgereinigten IgG Menge (Eluat 1: 2,2 ng/µl) und [Seite 72↓]der bekannten Bindungskapazität der Protein-G Sepharose ( 11 mg IgG/ml) wurde berechnet, dass bei Einsatz der minimal handhabbaren Menge von 100 µl Sepharose (50% slurry) nur 0,5% der Bindungsstellen abgesättigt werden konnten. Um die unspezifische Bindung von Proteinen an Protein-G oder Sepharose zu verhindern, wurde das Lysat daher vor der IP mit Sepharose präinkubiert. Wie in Abbildung 14 links erkennbar ist, gab es große Unterschiede zwischen den Lysatbanden (leider sehr schwach) und den Banden des IP Eluats. Auffällig im Eluat war die intensive Bande, die vermutlich wieder von BSA stammte (diesmal unter reduzierenden Bedingungen). Leider wurde beim Vergleich von Eluat und Kontrolle (ohne AK) klar, dass die meisten Banden unspezifisch waren. Nur im unteren MG Bereich (<30 kD) gab es möglicherweise drei Banden, die nur im IP Eluat auftraten.

Am Ende wurde eine IP unter Verwendung aller IgG aus dem Testserum, also ohne jegliche Affinitätsreinigung, getestet, womit eine Sepharoseabsättigung mit IgG von ca. 20% erreicht werden konnte. Abbildung 14rechts zeigt das Ergebnis dieses Versuchs. Wieder unterschieden sich Lysatbanden und IP Eluatbanden stark voneinander und ebenso war eine starke BSA Bande zu sehen. In diesem Versuch wurden drei IPs parallel gemacht: einmal wurde ein H. pylori positives Serum verwendet (Spur +), als Vergleich wurde in Spur - das Serum eines H. pylori negativen Patienten verwendet und als Kontrolle fungierte eine IP ohne AK (Spur K). Beim Vergleich der drei Spuren wurden keinerlei spezifische Banden gefunden.

Abbildung 14 : Links: Silbergefärbtes Gel der IP mit NC-Partikeln angereicherter H. pylori-spezifischer AK und mit in Sepharose präinkubiertem H. pylori Lysat. M – MG Marker (in kD); L – H. pylori Lysat; E – Eluat der IP; K – Kontrolle ohne AK; Rechts: CBB G-250 gefärbtes Gel der IP mit allen Serum-AK. M – MG Marker (in kD); L – H. pylori Lysat; + Eluat der IP mit H. pylori positivem Patientenserum; – Eluat der IP mit H. pylori negativem Patientenserum, K – Kontrolle ohne AK.


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08.02.2005