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4.  Diskussion

4.1.  Identifizierung Magenkrebs-assoziierter Antigene mittels Immunoblots

H. pylori kann bei Menschen so unterschiedliche Erkrankungen wie das Magenkarzinom oder das Ulkus duodeni verursachen. Es ist bisher nicht geklärt, welche Faktoren den Ausgang dieser beiden divergierenden Erkrankungen determinieren. In dieser Studie wurde retrospektiv untersucht, ob Serummarker von diagnostischem Wert existieren, die den klinischen Status der Patienten reflektieren.

Die Ag-Erkennungsmuster von jeweils 30 Patientenseren pro Erkrankungsgruppe wurden mittels 2-DE Immunoblots von H. pylori Lysat verglichen. Dies war die erste Studie bei der hochauflösende Immunoblots (bis zu 5.000 Spots auftrennbar) eingesetzt und zusätzlich eine große Anzahl an Patientenseren verwendet wurde. Es wurde der komplett sequenzierte Stamm 26695 verwendet, der bekannte Virulenzfaktoren wie u.a. cagA und vacA in seinem variablen Genpool besitzt. Der Nachteil, dass die Patientenseren nicht mit den autologen Stämmen untersucht wurden, wird dadurch relativiert, dass diagnostische Marker konserviert sein müssen um ein Bevölkerungsscreening zu ermöglichen. Außerdem wurden bei einem Vergleich der Ag-Erkennungen verschiedener Patientenstämme nur geringe Unterschiede gefunden [35].

Da H. pylori die Magenschleimhaut besiedelt, wird vor Ort sekretorisches IgA gebildet, dessen Spezifität sich vermutlich von der des Serum IgA unterscheidet. Dieser Umstand musste hier allerdings nicht berücksichtigt werden, da das Ziel dieser Arbeit diagnostische Marker für einen nicht-invasiven Test sind – z.B. wäre eine einfache serologische Untersuchung ein geeignetes Format. Ein Vergleich der Reaktivitäten von Serum IgG und IgA fand keine qualitativen Unterschiede, jedoch zeigten IgG eine deutlich intensivere Reaktion [40]. Um trotzdem in diesem Experiment keine Ag zu verlieren, wurde ein sekundärer AK mit polyvalenter anti-humaner Spezifität verwendet, so dass Serum IgA, IgG und IgM erkannt wurden.

Die Erkennungsmuster der individuellen Seren waren sehr variabel, jedoch wurden in der Magenkrebsgruppe im Durchschnitt 49% mehr antigene Spots mit um 75% stärkeren Gesamtintensitäten gefunden. Eine Normierung der Daten konnte nicht durchgeführt werden, da es keine Grundlage für eine Auswahl nicht-variabler Ag gab, die als Normierungs­standards hätten genutzt werden können. Die hierarchische Clusteranalyse ermöglichte jedoch die Identifizierung von Patientengruppen mit klaren, charakteristischen Ag-Erkennungs­mustern (z.B. eine diagonale Spotserie oder eine typische Spotgruppe, s. Abbildung 6). Obwohl diese Gruppen nicht mit dem klinischen Status der Patienten übereinstimmten, könnten die Cluster Charakteristika der Patientenstämme, wie z.B. Unterschiede in der Genexpression des variablen Genpools reflektieren. Eine Gruppierung verschiedener Patientenstämme durch hierarchisches [Seite 74↓]Clustering wurde bereits beschrieben [88], jedoch konnten auch dort die Gruppen nicht genau erklärt werden. Bei der Analyse der Verteilung von Proteinspezies in 2-DE Gelen (Kap. 3.2.5.1) konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei der für die Patientencluster 2 und 5 typischen Spotgruppe (Spots 225, 226, 231, 232, 233, 234 aus Tabelle 6) vermutlich um C-terminal verkürzte GroEL Spezies handelt. In diesem Fall könnten auch überstandene Infektionen mit anderen stark GroEL exprimierenden bakteriellen Erregern zu der Gruppierung im Dendrogramm geführt haben, da GroEL bei Bakterien stark konserviert ist.

Die univariate statistische Analyse der einzelnen Spots ergab 14 signifikant mit Magenkrebs korrelierte Spots, die mindestens vier verschiedene ORFs repräsentieren (Abbildung 7, Tabelle 3). Die relative strikte Signifikanzschwelle von p<0,01 erschien aus den folgenden zwei Gründen gerechtfertigt: Erstens zeigten die Ag-Erkennungsmuster eine hohe Variabilität zwischen den individuellen Seren der gleichen Erkrankungsgruppe. Dieser Umstand wird dadurch illustriert, dass nur ein einziger Spot in allen 60 Blots vorkommt (der Hauptspot von GroEL). Zweitens korrelierte bei der gewählten Signifikanz kein Spot mit einem der anderen Patientenparameter (Alter, Kolonisierung, Geschlecht). Das Alter spielte hierbei eine besondere Rolle, da Magenkrebspatienten im Durchschnitt 19 Jahre älter waren als die Ulkuspatienten. Durch den Vergleich altersangepasster Subgruppen konnte für fünf eine Korrelation mit dem Alter nicht ausgeschlossen werden, die anderen neun jedoch wurden mit mindestens p<0,05 bestätigt. Das Resultat einer Studie [81], in der die GroES Erkennung mit dem Alter korrelierte, konnte nicht durch unsere Ergebnisse bestätigt werden. Der Vergleich von Seren bereits erkrankter Patienten zielte auf Korrelationen zwischen den Erkrankungen und der Ag-Erkennung. Die hier gefundenen Unterschiede können folglich entweder durch die Erkrankung selbst oder durch eine ihrer Ursachen hervorgerufen worden sein. Nur eine prospektive Studie, in der die „Erkrankungsgeschichten“ H. pylori positiver Menschen ohne derzeitigen Befund über Jahre verfolgt werden, kann klären, ob die Markerkandidaten auch prognostisches Potential besitzen und somit bereits vor Ausbruch einer Erkrankung als Risikomarker verwendet werden könnten.

Die zehn identifizierten Proteinspezies stammen überraschenderweise nur von vier verschiedenen ORFs: atpA, groEL, groES und hyuA. Alle kodieren für relativ konservierte Proteine des zentralen Stoffwechsels bzw. der Proteinfaltung. Expressionsprodukte dieser ORFs sind dafür bekannt, AK Antworten in infizierten Patienten zu induzieren. In einer Studie [37] wurden keine Korrelationen von GroEL und GroES mit Magenkrebs bzw. Ulkus ventriculi / Ulkus gefunden. Dieses Resultat kann vermutlich mit der kleinen Anzahl von untersuchten Seren (4 bzw. 5) und der ungenauen Definition der Ulkusgruppe erklärt werden. In einer 1-DE Immunoblot Analyse [81] wurde bei dem Vergleich von 28 Magenkrebs mit 30 Ulkus-Patientenseren eine stärkere Reaktion der Magenkrebsseren mit GroEL festgestellt, was von [Seite 75↓]unseren Ergebnissen bestätigt wird – allerdings ist die Aussagekraft von 1-DE Immunoblots mit solch komplexen Proben unsicher, da jede Bande mehrere Proteine enthalten kann. Eine Studie aus unserer Gruppe [38] zeigte bereits mit der „Kleingeltechnik“ eine Magenkrebskorrelation von HyuA und einer Spezies von GroEL beim Vergleich von Ulkus- und Krebspatienten, was jetzt mit dieser umfangreicheren Studie bestätigt werden konnte.

In einigen Fällen gab es Unterschiede zwischen der Ag-Erkennung einzelner Spezies ein und desselben Proteins, d.h. für einzelne Spots von GroEL und AtpA wurde eine differentielle AK Antwort von Magenkrebs- und Ulkuspatienten gefunden. Von 15 identifizierten GroEL Spezies (Tabelle 6) wurden nur drei von Magenkrebspatientenseren signifikant stärker detektiert (SSP 2505, 2509, 2508 Abbildung 7). Diese gehören zu den Spots mit geringstem Proteingehalt, wenn man die Intensitäten der Silberfärbung aller GroEL Spots vergleicht. Aus diesem Grunde könnte die differentielle Detektion dieser Spots ein quantitativer Effekt sein; für Färbeintensitäten nahe an der Detektionsschwelle kann ein kleiner quantitativer Unterschied eine Signifikanz vortäuschen, da alle Intensitäten unterhalb der Detektionsgrenze gleich null gesetzt werden. Dieser Fakt trifft allerdings nicht auf AtpA zu, das durch insgesamt mindestens neun antigene Spezies vertreten war. Der AtpA Spot mit vermuteter differentieller Ag-Erkennung (SSP 2412 (aus Abbildung 7) = Spot 154 (aus Tabelle 5)) hatte eine mittlere Färbeintensität im Silbergel. Wenn sich Proteinspezies an bestimmten Epitopen durch AS Austausche, PTMs oder partielle Degradation unterscheiden, könnte dies Einfluss auf die Immunogenität derselben haben. Ein solcher Effekt wurde bereits für eine bestimmte Region von GroEL beim Vergleich von H. pylori infizierten mit nicht infizierten Patienten gefunden [89]. Mit meiner Studie zur Untersuchung der Spotkompositionen von Ag (Kap. 3.2.4) konnte jedoch gezeigt werden, dass der o.g. AtpA Spot zusätzlich GroEL enthält. Mehrere Spots in dieser Region des 2-DE Gels liegen nahe beieinander und enthalten entweder AtpA, GroEL oder einen Mix aus beiden Proteinen. In einem solchen Falle ist die Identifizierung eines antigenen Spots zusätzlich dadurch erschwert, dass diese auch von der korrekten Zuordnung der Spots vom Blot zum präparativen Gel abhängt. Eine Differenzierung gegen welches der beiden Spotkomponenten (oder gar beide) die AK Reaktionen gerichtet ist, ist auf der Proteinspezies-Ebene nicht möglich. Der Verdacht auf differentielle Immunogenität verschiedener AtpA Spezies und die Antigenität von AtpA überhaupt konnte also in diesem Falle nicht bestätigt werden. Dieses Beispiel zeigt eindrücklich, wie wichtig die exakte Analyse der Spotkomposition ist, speziell wenn hochsensitive Detektionsverfahren eingesetzt werden (s. Kap. 4.2).

Aus den 14 signifikant stärker von Magenkrebsseren erkannten Spots wurde manuell eine Subgruppe gesucht, die eine möglichst gute Diskriminierung beider Erkrankungsgruppen erlaubte – es wurde also ein hypothetischer serologischer Test simuliert. Eine solche Subgruppe [Seite 76↓]bildeten die Spots SSP 2509, 4003, 4005, 5708 und 4706 (s. * in Tabelle 3). Bei der retrospektiven Verwendung dieser fünf Spots als hypothetische Marker für unser Datenset von 60 Immunoblots konnten 77% Sensitivität und 83% Spezifität erreicht werden. Obwohl dieses Ergebnis bei weitem noch nicht für den sofortigen Einsatz in der Klinik ausreicht, unterstreicht es doch die prinzipielle Erreichbarkeit eines solchen Tests.

In der Literatur wurden folgende Faktoren, die den Infektionsverlauf mit H. pylori beeinflussen könnten, diskutiert: Expression von Virulenzfaktoren, Alter und Dauer der Infektion, Reaktion des Immunsystems, Säuresekretion sowie Umweltfaktoren [52,46,49]. Deren wahre Beiträge sind allerdings bis heute weitgehend unklar. Beim Vergleich zwischen Magenkrebs- und Ulkus­patienten fanden wir keine Assoziation zu einem der bekannten Virulenzfaktoren, was mit der aktuellen Auffassung übereinstimmt, dass die Präsenz der entsprechenden Gene (z.B. vacA, cagA, iceA) in den H. pylori Patientenstämmen nicht mit dem klinischen Status korreliert [45]. Da das Vorhandensein bakterieller Faktoren immer vom Immunsystem des Patienten „interpretiert“ wird, ist Immunoproteomics letztlich nicht in der Lage, zwischen Wirts- und Bakterienfaktoren zu unterscheiden. Außerdem könnten die krankheitsverursachenden Proteine nicht immunogen, d.h. für unsere Analyse gar nicht zugänglich sein. Allgemein wurde in dieser Arbeit eine Zunahme der Serumreaktivität bei Magenkrebspatienten festgestellt. Dieses Resultat wird durch den Befund unterstützt, dass proinflammatorische Allele des IL-1β Locus mit erhöhtem Magenkrebsrisiko assoziiert sind [90] und eine verstärkte Entzündung vermutlich die AK Produktion fördert.

Im Gegensatz zur Untersuchung der Antigenität rekombinanter Proteine hat Immunoproteomics den Vorteil, dass die „in-vivo“ (hier in Zellkultur) vorhandene Proteinkomposition von H. pylori inklusive verschiedener posttranslationaler Modifikationen abgebildet wird. Es gibt zwar Unterschiede zur realen in-vivo Proteinkomposition der Bakterien im Patienten, es handelt sich dabei aber um ein realitätsnahes und durchführbares Modell. Ausreichende Mengen an H. pylori für die 2-DE können nicht direkt aus den Patienten, also ex-vivo, gewonnen werden. Die Unterschiede in der Abundanz der auf den Blots separierten Proteine könnten allerdings einen Nachteil darstellen. Der Befund, dass die intensiv erkannten Ag oft die in hoher Konzentration vorhandenen Proteine sind, könnte also ein systematischer Fehler der Methode sein. Im Gegensatz dazu könnte auch eine hohe Abundanz bedeuten, dass eine gute „Sichtbarkeit“ für das Immunsystem vorliegt und aus diesem Grunde viele AK mit hoher Avidität gebildet werden. Zur Unterscheidung dieser beiden Möglichkeiten könnte eine Expressionsbibliothek von H. pylori Proteinen, in der alle Proteine in ähnlicher Menge vorliegen, mit Patientenseren untersucht werden. Die Expressionsbibliothek könnte die verwendeten Immunoproteomics-Methoden somit ergänzen.


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4.2.  Detaillierte Analysen von Massenspektren

Methodische Entwicklungen zur Verbesserung von Spotidentifizierungen mittels PMFs, zur Bestätigung mittels Immunoproteomics entdeckter Ag und zur Erforschung der Verteilung von Proteinen in 2-DE Gelen wurden erstmalig mithilfe eines großen Datensatzes aus 384 Spots durchgeführt. Hierzu wurden alle sichtbaren Spots aus einem Sektor, der 2/3 eines H. pylori Gels umfasste, untersucht. Die 384 Spots wurden in dreifacher Wiederholung automatisch ausgestochen, verdaut und gemessen, so dass ein Datensatz von 960 auswertbaren Spektren entstand.

Im ersten Schritt wurden die Peakdetektions- und Suchparameter optimiert. Die automatische Detektion der Monoisotopen ist jedoch relativ fehleranfällig. Besonders im Massenbereich über m/z = 2000, wo die Monoisotopen von schwereren Isotopen überragt werden, ist eine gute Optimierung der Detektionsparameter mittels „Versuch und Irrtum“ nötig. Die Scorewerte für Datenbanksuchergebnisse, anhand derer die Sicherheit einer Identifizierung abgeschätzt werden kann, hängen auch von der Wahl der Suchparameter ab. Je mehr Peptidmodifikationen zugelassen werden, desto größer ist die Anzahl möglicher Peptide in der Datenbank und desto stärker sinkt der erreichbare Score. Es sollten also nur häufig im Datensatz auftretende Modifikationen verwendet werden, wie in diesem Falle nur die Oxidation von Methionin. Die Messung von mehrfachen Datensätzen kann die Identifizierungsquote deutlich erhöhen. In unserem Datensatz wurden durch die dreifache Wiederholung 75% aller Spots mindestens einmal eindeutig identifiziert.

Ein gutes Maß für die Verlässlichkeit der Identifizierungsergebnisse ist die Anzahl der Widersprüche in replizierten Datensätzen. Die folgenden Fehlerquellen können zu falsch-positiven Identifizierungen führen: Laufunterschiede zwischen verschiedenen 2-DE Gelen, Toleranzen beim Ausstechen der Spots, zufällige Unterschiede in der Verdauprozedur oder ungünstige Peakdetektions- bzw. Suchparameter. Im untersuchten Datensatz wurden nur bei 3% der Spots widersprüchliche Identifizierungen gefunden – dieser Fehler ist in der gleichen Größenordnung wie die angegebene Signifikanzschwelle der Mascotsuchergebnisse (p<0,05, d.h. 5% Irrtumswahrscheinlichkeit). Viele dieser Spots lagen in dicht mit Spots besetzten Gebieten, weshalb fehlerhafte Identifizierungen vermutlich eher durch das Ausstechen als durch die Datenbanksuche verursacht wurden. In solchen Gebieten können bereits kleinere Abweichungen beim Ausstechen der Spots zum Picken der „Ausläufer“ eines Nachbarspots und somit zu einer falschen Identifizierung führen. Außerdem kann für einen Spot, der mehrere Komponenten in ähnlichen Konzentrationen enthält, zufällig einmal nur die eine und einmal nur eine andere Komponente identifiziert werden. Nur bei einem einzigen Spot war vermutlich tatsächlich die Datenbanksuche die Fehlerquelle – das zeigt, dass die Identifizierungen mit [Seite 78↓]Mascot im allgemeinen sehr zuverlässig funktionierten. Die ausschließliche Verwendung eines signifikanten Scorewertes als Akzeptanzkriterium für eine Identifizierung erscheint somit als ausreichend. Die geringe Fehlerrate zeigt zusätzlich die hohe Reproduzierbarkeit der Spotmuster in unseren 2-DE Gelen, denn bei Laufunterschieden kann z.B. die Fokussierung von Spots verschieden ausfallen, womit Schmiereffekte und somit Nebenkomponenten in Nachbarspots beeinflusst wären.

Ein weiterer Aspekt dieses Teils der Studie war der Vergleich der automatischen mit der manuellen Identifizierungsprozedur. Zu diesem Zweck wurden 28 Spots zufällig ausgewählt und deren Identifizierungen durch PMFs verglichen. Dabei wurden nur für schwach gefärbte Spots deutliche Unterschiede gefunden. Manuell verdaute und gemessene Spektren von solchen Spots enthielten im Schnitt eine größere Anzahl Peaks von denen auch mehr dem identifizierten Protein zugeordnet werden konnten. Auch die Sequenzabdeckungen und Mascotscores waren höher. Dieses Ergebnis lässt sich vermutlich damit erklären, dass die manuelle Prozedur je nach Färbeintensität angepasst und somit letztlich eine höhere Sensitivität erreicht wurde. Es ist offensichtlich, dass automatische Prozeduren nicht für individuelle Spots angepasst werden können, insbesondere da sich der Proteingehalt von Spots in 2-DE Gelen um mehrere Größenordnungen unterscheiden kann. Eine solche Prozedur stellt also immer einen Kompromiss dar. Aus diesem Grunde ist speziell für sehr schwache Spots die manuelle Prozedur immer noch das Mittel der Wahl.

Zur Verbesserung der automatischen Identifizierungsergebnisse wurde die neu entwickelte Version des MS-Screener eingesetzt. Das Entfernen der Kontaminantenpeaks, also aller Peaks die häufiger als in 5% der Spektren vorkamen, resultierte in einer Erhöhung der Identifizierungsquote um 3% auf 78% der Spots. Dieser Effekt basiert auf der Tatsache, dass häufig in einem Datensatz auftauchende Massen keine spotspezifischen Informationen enthalten und somit nur das Rauschen vergrößern. Werden diese gelöscht, steigen im Allgemeinen die Scorewerte an und bei einigen Spots überschreiten diese dann die Signifikanzschwelle. Die 61 Kontaminantenmassen (Tabelle 4, Abbildung 8) wurden Matrixclustern, autolytischen Trypsinpeaks, HDPR Ausreißern oder Peptiden des abundantesten Proteins GroEL zugeordnet. Sieben Peaks waren fälschlicherweise detektierte Isotopenpeaks; bei schwachen Peaks höherer Massen markierte der Peakdetektionsalgorithmus den intensiveren zweiten Isotopenpeak anstelle des Monoisotopen. In solchen Fällen wurden in anderen Spektren auch die zugehörigen Monoisotopen gefunden, welche ebenfalls in der Kontaminantenliste zu finden sind. Obwohl die Quellen einer Reihe von Kontaminantenmassen unklar blieb, wurden jedenfalls keine Keratinpeaks gefunden. In einer früheren Studie [59], in der 480 manuell gemessene und analysierte PMFs untersucht wurden, konnten 69 Kontaminantenmassen im vergleichbaren [Seite 79↓]Bereich m/z = 900-3.500 gefunden werden – 47 davon waren Keratinpeptide. Eine weitere Studie [83] mit 118 Spektren fand 71 Massen öfter als in 5% der Spektren, wovon 53 Keratin zugeordnet wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass trotz ähnlicher Anzahl an Kontaminanten­peaks die automatische Prozedur vom Ausstechen der Spots über den Verdau bis zum Auftragen auf die MALDI Platten sehr effizient die Verunreinigung mit Keratinen verhindern kann. Keratine können nicht nur von Hautschüppchen und Haaren der Labormitarbeiter stammen, sondern auch in Form von Staub durch Lüftungen oder Klimaanlagen in die Proben gelangen und sind somit schwer zu verhindern. Die Festlegung der Schwelle, ab der Peptide als Kontaminanten definiert werden ist letztendlich willkürlich. Das Auftauchen von 3 GroEL Peaks zeigt, dass irrtümliche Zuordnungen nicht ausgeschlossen werden können. Die 5% Hürde stellte in unserem Datensatz einen guten Kompromiss dar, denn es sollten auf der einen Seite möglichst viele „informationslose“ Peaks entfernt werden, um die Identifizierungsquote zu erhöhen. Andererseits sollten allerdings möglichst wenige tatsächliche Peptidpeaks entfernt werden. Um die Identifizierungsquote zu verbessern, ist es ratsam in jedem größeren Datensatz die Kontaminanten vor der Datenbanksuche zu entfernen. Dabei gibt es meist für jedes Experiment typische Kontaminationen, so dass diese bei jedem Datensatz individuell bestimmt werden sollten – was ja mit unserer Software MS-Screener leicht möglich ist.

Von großem Interesse für diese Arbeit sind 2-DE separierte Spots, die mehrere Komponenten enthalten. Eine solche Komponente kann in ähnlicher Konzentration (Proteinmix oder zwei Hauptkomponenten), oder in deutlich geringerer Konzentration auftreten (Neben­komponente). Dabei können Nebenkomponenten andere Spezies desselben Proteins oder gänzlich andere Proteine sein. Letztere können durch gleiche pI und MG Werte, bisher nicht nachgewiesene Protein-Protein Wechselwirkungen während der Elektrophorese oder durch Nachbarspot­kontaminationen verursacht sein. In der Immunoproteomicsstudie (Kap. 4.1) wurden die Ag-Erkennungsmuster mittels 2-DE separierter H. pylori Proteine detektiert. Durch die hochspezifische und –sensitive Ag Erkennung der in den Patientenseren vorkommenden AK, kann nicht ausgeschlossen werden, dass Nebenkomponenten einiger Spots detektiert wurden. Aus diesem Grunde sollten möglichst alle Komponenten der interessierenden Spots identifiziert werden. In dieser Analyse wurden jetzt 24 bekannte antigene Spots von H. pylori mittels MS-Screener und hierarchischem Clustern untersucht (Tabelle 5). Neun Spots enthielten vermutlich Nebenkomponenten, in sechs wurden keine solchen gefunden und in weiteren neun waren unbekannte Peaks vorhanden. Von den neun erstgenannten enthielten sieben Spots Peptidmassen von bekannten H. pylori Ag. Bei genauerer Analyse durch den Vergleich der Ag-Erkennung der betreffenden Spots mit den jeweiligen Hauptspots der Nebenkomponenten, zeigten drei Spots immer eine simultane Ag-Erkennung. Für diese muss ein Einfluss der Nebenkomponente auf die Antigenität des Spots vermutet werden (* in Tabelle 5). Zwei dieser drei Spots enthielten [Seite 80↓]allerdings ein Ag, das auch in anderen „sauberen“ Spots auftrat und somit letztlich doch bestätigt wurde. Am Ende blieb nur ein Spot übrig (Spot 278, Protease PqqE), wo mit hoher Sicherheit fälschlicherweise die Hauptkomponente als Ag identifiziert wurde. Falls eine differentielle Antigenität verschiedener Spezies dieses Proteins vorliegt, ist der Vergleich der Ag-Erkennung verschiedener Spots eines Proteins allerdings irreführend. In Zukunft ermöglicht die bessere Zugänglichkeit von Sequenzinformationen durch das MALDI-TOF/TOF eine noch detailliertere Untersuchung von Spotkompositionen. Hierzu muss allerdings die Sensitivität der MS/MS Messungen noch verbessert werden, um möglichst viele der nicht zur Hauptkomponente gehörenden Peaks untersuchen zu können.

Die verwendeten Methoden zum Auffinden von Nebenkomponenten in Spots mussten neu entwickelt werden, da das Vorhandensein mehrerer Komponenten in 2-DE separierten Spots bisher wenig Beachtung fand. Die Notwendigkeit solcher Analysen wird klar, wenn man bedenkt, dass Spots oft mittels Färbungen quantifiziert werden oder hochspezifische Detektionsmethoden (AK oder radioaktive Markierungen) Verwendung finden. Geht man in solchen Fällen von der „1 Spot = 1 Protein“ Annahme aus, könnten in einigen Fällen falsche Schlüsse bzgl. quantitativer Änderungen bzw. Identifizierungen gefällt werden. Der MS-Screener bietet hier den Vorteil, dass große Sätze von Peaklisten schnell von Kontaminanten befreit, intervallisiert und in Form einer Matrix exportiert werden können. Dies schaffte die Vorraussetzung für weitere Analysen mit verschiedenen multivariaten statistischen Methoden, die in dieser Arbeit für PMFs angewendet bzw. weiterentwickelt wurden.

Ein 2-DE separierter Spot kann nicht nur mehrere Komponenten enthalten, sondern umgekehrt kann auch ein Protein in mehreren Spots eines Gels in Form verschiedener Spezies auftreten. Ein gutes Beispiel hierfür ist GroEL. Dieses Hitzeschockprotein wurde in 15 verschiedenen Spots identifiziert und war in weiteren neun Spots ein Kandidat (s. Kap. 3.2.5.1). Von diesen 24 vermutlichen GroEL Spots wurden in den Immunoblots immer 21 Sports gleichzeitig von den Patientenseren erkannt (Abbildung 9). Für diese Spots wurde somit kein Anhaltspunkt für eine differentielle Antigenität verschiedener Proteinspezies gefunden; die anderen drei Spots liegen weit entfernt von den anderen GroEL Spots im Gel und sind vermutlich Falschpositive. GroEL stellt sicher auch kein geeignetes Untersuchungsobjekt für eine Untersuchung differentieller Antigenitäten dar, da es hochkonserviert in vielen Bakterien vorkommt und die Immunsysteme der Patienten vermutlich bereits mit GroEL mehrerer Bakterienspezies in Berührung kamen.

Während im Durchschnitt 1,6 Spots pro ORF gefunden wurden, wurde das am häufigsten vorkommende Protein des Datensatzes, GroEL, in 15 Spots eindeutig identifiziert (Abbildung 9). In zwei dieser Spots wurden Hinweise gefunden, dass diese N-terminal verkürzte Formen des Proteins sind. Bei weiteren sechs handelt es sich vermutlich um C-terminal verkürzte Formen. [Seite 81↓]Die Gründe für die genauen Positionierungen der Spots innerhalb dieser Subgruppen konnte jedoch nicht gefunden werden. Mögliche Ursachen könnten unterschiedliche Modifikationen, verschiedene Längen oder konformationelle Differenzen sein. Zusätzlich waren im Datensatz neun Spots, bei denen drei der fünf intensivsten Peaks von GroEL gefunden wurden (Tabelle 6), die also möglicherweise dieses Hitzeschockproteins ebenfalls in geringen Konzentrationen enthielten. In sechs Spots war GroEL wahrscheinlich Nebenkomponente, da in diesen Spots jeweils ein anderes Protein als Hauptkomponente identifiziert wurde. In den anderen drei Spots könnte GroEL Haupt- oder Nebenkomponente gewesen sein, da kein Protein eindeutig identifiziert werden konnte. Wie oben erwähnt wurden diese in den Immunoblots nicht gleichzeitig mit den anderen GroEL Spots erkannt und könnten somit Falschpositive sein. Ein weiteres wichtiges Ergebnis war, dass die GroEL-Peptidverteilung in den drei replizierten Gelen nicht völlig reproduzierbar war. Gründe hierfür könnten im Laufunterschied der Gele zu suchen sein. Möglicherweise könnte die geringe Proteinkonzentration dafür gesorgt haben, dass die Peptide in einigen Spots unter das Detektionslimit fielen. Eine weitere Erklärung wäre, dass das „drei der fünf intensivsten Peaks“ Kriterium zu schwach war, so dass auch falschpositive Spots zugeordnet wurden. Dies könnte durch MS/MS Analysen der betreffenden Peaks genauer analysiert werden.

Die Tatsache, dass so viele GroEL Spots gefunden wurden, wirft die Frage auf, ob die verkürzten Formen des Proteins Aufarbeitungsartefakte sind oder ob sie die in-vivo Situation wiederspiegeln. Für erstere Vermutung spricht die starke Abundanz von GroEL; falls also viele andere Proteine auch eine größere Anzahl von Abbauartefakten aufwiesen, könnten diese möglicherweise unterhalb des Detektionslimits der Färbung liegen. Andererseits spricht die hohe Reproduzierbarkeit der Spotmuster gegen Aufarbeitungsartefakte, da ein unkontrollierter proteolytischer Abbau kaum exakt reproduzierbar sein dürfte. Möglicherweise liefern die 2-DE Gele hier ein Abbild tatsächlich in der Zelle vorhandener prozessierter Formen dieses Hitzeschockproteins. GroEL hilft als Chaperone bestimmten Proteinen bei der korrekten Faltung indem es vorübergehend einen Komplex mit diesen Proteinen bildet. Es gibt für E. coli Hinweise, dass GroEL auch die Funktion einer Qualitätskontrolle für die Faltung ausübt, d.h., dass GroEL bei nicht korrekt funktionierender Faltung den proteolytischen Abbau fördern kann [91]. Da das Chaperone einen Komplex mit dem betreffenden Protein formt, könnten dabei auch Teile des GroEL selbst prozessiert werden und so die oben beschriebenen N- bzw. C-terminal verkürzten Formen entstehen. Die Tatsache, dass dabei eine größere Anzahl prozessierter Spezies auftritt, könnte auch darauf hindeuten, dass an diesen GroEL Spezies noch Fragmente der abzubauenden Proteine hängen, welche die Unterschiede in MG und pI innerhalb der Spotgruppen erklären. Interessant wäre es, bei diesen Spots mit MS/MS gezielt nach Sequenzen anderer Proteine zu suchen und die genauen Schnittstellen in der GroEL Sequenz zu [Seite 82↓]identifizieren und zu überprüfen, ob diese typisch für H. pylori Proteasen sind.

Ein weiteres Beispiel für die Verteilung von Proteinspezies in Gelen war die Alkyl Hydroperoxid Reduktase, die in acht verschiedenen Spots identifiziert wurden. Ein Spot hatte nach der Gelposition ein etwa doppelt so großes MG wie der Hauptspot. Da zwei Cystein-haltige Peptide in diesem Spot nicht gefunden wurden, lag die Vermutung nahe, dass es sich um Dimere handelte (Abbildung 10). Hier stellt sich die Frage, ob die Dimerisierung in-vivo oder als Artefakt bei Probenaufarbeitung oder 2-DE auftrat. Eine Dimerisierung während des Laufs der zweiten Dimension kann dabei ausgeschlossen werden, da keine vertikalen Schmiereffekte auftraten. Da eine Dimerisierung nur einen kleinen Einfluss auf den pI hat, könnte diese während des Laufs der ersten Dimension stattgefunden haben. Das ist auch deshalb denkbar, weil die aktive Konzentration des Reduktionsmittels DTT während der IEF absinkt, so dass die Thiolgruppen zu Disulfidbrücken oxidiert werden könnten. Alternativ könnten die Dimere auch in-vivo geformt worden sein, falls die DTT Konzentration im Probenpuffer nicht für eine vollständige Reduktion ausreichte. Beim Vergleich der Färbeintensitäten der Spots fiel auf, dass nur ein geringer Anteil des Proteins dimerisiert vorlag. Der Umstand, dass keine weiteren Proteindimere im Gel gefunden wurden, unterstützt die Hypothese, dass es sich um in-vivo entstandene Dimere handeln könnte. Dies wird auch von der Tatsache gestützt, dass andere Mitglieder der Peroxiredoxin-Familie Homodimere oder sogar Dekamere formen [92].

Das Protein γ-Glutamyltranspeptidase wurde im Gel in zwei weit voneinander entfernten Spots identifiziert. Die von den PMFs abgedeckten Sequenzen zeigten keine Überlappung und die Summe der im Gel sichtbaren MG entsprach dem theoretischen Gesamtgewicht des ORFs. Aus diesen Gründen lag die Vermutung nahe, dass es sich um zwei Fragmente des Proteins handeln könnte. Unterstützt wird diese Hypothese durch die Literatur, nach der dieses Protein in Form zweier Fragmente auftritt [93,94]. Obwohl es sich um einen bekannten Virulenz- und Apoptose-induzierenden Faktor von H. pylori handelt, wurden beide Spots in den Immunoblots nur mit geringer Intensität erkannt. Zusätzlich wird in der Literatur vermutet, dass das Protein membranassoziiert ist [93], was sich mit der Beobachtung deckt, dass die ersten 36 AS nicht von den PMFs abgedeckt wurden und somit die Abspaltung einer Signalsequenz stattgefunden haben könnte.

Das in dieser Arbeit entwickelte Programm CorrAn wurde verwendet, um in großen Datensätzen mithilfe der wiederholten Anwendung der KA Spots zu finden, die Nebenkomponenten enthielten. Wenn ein Protein in verschiedenen Spots als Haupt- oder Nebenkomponente vorhanden ist, können Peptidmassen des Proteins zur Gruppierung dieser Spots führen. Die Voraussetzung dafür ist, dass zusätzlich vorhandene Komponenten der Spots das Clustern nicht stören. Mit der implementierten manuellen Schwellensetzung und der somit erfolgten [Seite 83↓]Datenreduktion konnten solche Gruppen gefunden und damit neue Nebenkomponenten entdeckt werden. Obwohl die Schwellensetzung manuell erfolgt, ermöglicht die intuitive und schnelle Anwendbarkeit der Software ein zügiges Testen vieler verschiedener Schwellen­werte. Da es derzeit keine Standardmethode zum Auffinden von Nebenkomponenten in 2-DE separierten Spots gibt, soll diese neue Methode noch mithilfe der Auswertung eines gesamten Datensatzes evaluiert und mit der Anwendung des von uns bereits verwendeten hierarchischen Clusterings [87,59] verglichen werden. Dabei besteht die Hoffnung, dass die Vorteile der KA gegenüber dem hierarchischen Clustern, wie z.B. die Bildung von Gruppen sehr unterschiedlicher Spotanzahlen sowie die automatische Darstellung der charakteristischen Massen einer jeden Spotgruppe, zum effektiveren Auffinden von Nebenkomponenten in Spots führt. Der Nachteil der KA, dass nur wenige Spotgruppen je Analyse differenziert werden können, konnte durch die neu implementierte schrittweise Datenreduktion überwunden werden. Langfristig sollte das Ziel solcher methodischen Entwicklungen ein weitgehend automatisch ablaufender Prozess sein, der bereits in die Datenbanksuchen integriert werden kann.

Für die automatische Identifizierung von 194 S. enterica Spots wurden mit dem institutseigenen MALDI-TOF/TOF je ein PMF und drei MS/MS Spektren aufgenommen. Wichtige Faktoren für die Identifizierung waren hierbei das Auskristallisieren der Matrix auf der Probenplatte, die Qualität der gewonnenen Sequenzinformationen und die Parameter für Peakdetektion und Datenbanksuche. Die Optimierung der letzteren wurde bereits oben diskutiert. Für das optimale Auskristallisieren der Probe-Matrix Mischung, dass eine wichtige Vorraussetzung für intensive Spektren darstellt, ist es günstig, Probe und Matrix in verschiedenen Verhältnissen aufzutragen, da die Probenkonzentration sehr unterschiedlich sind. Alle Proben wurden also in zwei verschiedenen Verhältnissen auf die MALDI-Platten aufgetragen. Da sowohl Messung als auch Datenbanksuche automatisch erfolgen, wurde im Anschluss das bessere der beiden Ergebnisse verwendet. Mit dieser Vorgehensweise wurde der manuelle Aufwand nur geringfügig erhöht. Die MS/MS Spektren trugen dabei ganz wesentlich zu einer hohen Identifizierungsquote bei. Im S. enterica Projekt wurden 88% aller Spots mit einem einzigen Datensatz identifiziert, wohingegen im H. pylori Projekt, wo nur PMFs gemessen wurden, in einem ähnlich großen Datensatz nur 57% der Spektren identifiziert werden konnten. Selbst durch die dreifache Wiederholung dieser PMF Messungen und das Abziehen der Kontaminantenpeaks wurde die Quote „nur“ auf 78% erhöht und liegt damit immer noch deutlich unter dem Wert des S. enterica Projekts. Aufgrund der Unterschiede zwischen den Proben können die Quoten zwar nicht direkt verglichen werden, jedoch wird deutlich, dass auf zusätzliche Sequenz­informationen auch bei der reinen Proteinidentifizierung nicht verzichtet werden sollte.


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4.3.  Immunopräzipitation von H. pylori Antigenen

Die IP kann als eine alternative hypothesefreie Methode zur Detektion von Ag verwendet werden. Sie hat den Vorteil, dass nicht nur sequenzielle sondern auch konformationelle Epitope von Ag detektiert werden können. Hierfür wurde der geringe Anteil H. pylori spezifischer AK im Patientenserum mittels verschiedener Methoden angereichert. Diese wurden dann an Protein-G Sepharose gebunden und kovalent quervernetzt, um mehrere IPs hintereinander zu ermöglichen und somit wertvolles Patientenserum zu sparen.

Die Herstellung des H. pylori Lysats erfolgte durch Ultraschallbehandlung in PBS Puffer. Die Verwendung von Detergenzien-haltigen Puffern scheiterte daran, dass diese die Bindung der Proteine an die NC-Partikel verhinderte. Schwer wasserlösliche Proteine sind dadurch im Lysat unterrepräsentiert bzw. gar nicht vorhanden. Dies ist ein Nachteil, da hydrophobe Proteine, die membranständig oder –assoziiert sind, durch die Oberflächenpräsentation dem Immunsystem leicht zugänglich sind und somit eine hohe Immunogenität besitzen können. Trotzdem ist der PBS-Lysepuffer verwendet worden, um die IP Methoden erst einmal zu etablieren.

Durch die Affinitätsreinigung mittels der NC-Partikel wurden die H. pylori-spezifischen IgG angereichert und dann an die Protein-G Sepharose gebunden. Dieser Schritt sollte die Crossreaktivitäten, die durch Homologien, zufällige Epitopähnlichkeiten oder gar Bindung außerhalb der Ag-Bindungsstelle zustande kommen können, minimieren. Durch ELISAs wurden sowohl Anreicherungsfaktoren als auch Ausbeuten für die verschiedenen getesteten experimentellen Bedingungen berechnet (Abbildung 12). Als maximale Anreicherung spezifischer IgG wurde ein Faktor von 133 erreicht. Dieser Wert demonstriert die Wirksamkeit der Affinitätsreinigung. Weniger zufriedenstellend war allerdings die Ausbeute. Mit 7% war diese viel zu gering, besonders da die Volumina der zur Verfügung stehenden Patientenseren sehr begrenzt waren. Hinzu kamen noch geringe Verluste durch das Umpuffern der AK Eluate mit den Ultrafree Filtern - einerseits durch Adsorption von AK an der Membran (trotz der Absättigung mit BSA) und andererseits durch eine geringe AK-Restdurchlässigkeit derselben.

Aus den o.g. Gründen wurden alternative Methoden zur Affinitätsreinigung getestet. Hierzu zählten die Verwendung von intakten Bakterienzellen und der ungereinigten Membran­fraktion. Beide Ansätze haben die Vorteile, dass AK gegen die oft hoch-immunogenen Oberflächen-Ag angereichert werden und zusätzlich keinerlei Crossreaktivitäten mit cytoplasmatischen Proteinen stattfinden. Sekretierte Ag würden allerdings mit diesem Schritt verloren gehen. Leider erreichte die Ausbeute mit diesen Methoden noch nicht einmal die 1% Marke, so dass dieser Ansatz als gescheitert betrachtet werden musste.

Die mittels NC-Partikel affinitätsgereinigten IgG wurden an Protein-G Sepharose gebunden und [Seite 85↓]kovalent gekoppelt. Zur Identifizierung der immunopräzipitierten Ag wurden mit der Protein-G Sepharose drei aufeinanderfolgende IP-Läufe durchgeführt und die Präzipitate gepoolt, um eine ausreichende Proteinmenge zu erhalten. Nach der Auftrennung mittels 1-DE waren in der IP-Spur zehn Banden sichtbar. Diese unterschieden sich deutlich von den Banden des H. pylori Lysats. Auch die Durchläufe der Waschschritte unmittelbar vor der IP zeigten ein anderes Bandenmuster als die IP, welches aber dem des Lysats sehr ähnelte. Diese Unterschiede deuteten auf eine hohe Spezifität der IP hin. Der Durchlauf der Ultrafree Röhrchen hatte nur eine Bande – die Verluste bei der Aufkonzentrierung der Eluate waren also gering. Alle zehn sichtbaren Banden wurden dann mittels MALDI-TOF MS identifiziert (Abbildung 13, Tabelle 7). Die Banden 1-7 enthielten höchstwahrscheinlich BSA, welches durch die irrtümlich verwendeten nicht-reduzierenden Bedingungen der Proben­aufarbeitung für die 1-DE in verschiedene Banden aufgetrennt wurde. Dies ist vermutlich durch unterschiedliche Konformationen zu erklären, die u.a. durch Disulfidbrücken zwischen einigen der 35 Cysteine des BSA stabilisiert wurden. Verschiedene Konformationen führen aufgrund der anderen räumlichen Strukturen zu Unterschieden im Laufverhalten. Viel interessanter war allerdings, dass die Banden 8-10 zwei bekannte H. pylori Ag und drei weitere H. pylori Proteine enthielten. Dieses Ergebnis zeigt, dass die IP prinzipiell funktionierte und dieser vielversprechende Befund noch durch Kontrollen abgesichert werden musste. Zur Beseitigung der störenden BSA Banden wurde ein Aufkonzentrieren der Eluate mittels Acetonfällung getestet, was aber aufgrund der sehr geringen Proteinkonzentrationen nicht gelang.

Aus der quantitativen Bestimmung der IgG Konzentrationen der AK Eluate konnte berechnet werden, dass damit maximal 1% der IgG Bindungsstellen der Protein-G Sepharose besetzt werden konnten. Um das unspezifische Binden von Proteinen an die Sepharose oder an das Protein-G zu verhindern, wurde das H. pylori Lysat vor der IP mit der Protein-G Sepharose präinkubiert. Die Ergebnisse der nun durchgeführten IP mit einer parallel durchgeführten Kontrolle ohne IgG (Abbildung 14: links) zeigt ein Bandenmuster, dass sich deutlich von dem des Lysats unterscheidet. Die große Bande bei ca. 60 kD stammt vermutlich wieder vom BSA, dass hier unter reduzierenden Bedingungen lief. Leider waren fast alle Banden auch in der Kontrolle zu finden – nur im unteren MG Bereich sind drei eventuell spezifische Banden sichtbar. Dieses Ergebnis war enttäuschend, da es offensichtlich eine Anreicherung bestimmter Proteine gab, diese jedoch unspezifisch war, also nicht von Ag-AK Bindungen stammten. Die anfängliche Abschätzung des Anteils H. pylori spezifischer IgG in den Seren (Kap. 1.3.2) erwies sich in den ELISA Versuchen als korrekt (Abbildung 12): durch die NC Inkubation sank die Konzentration H. pylori spezifischer IgG um 80%, was kaum Einfluss auf die gesamt-IgG Konzentration hatte – es war also tatsächlich nur ein kleiner Anteil der IgG gegen H. pylori spezifisch. Für den Fall des Vorhandenseins einer ausreichenden Menge an hochspezifischen [Seite 86↓]AK, wie z.B. monoklonaler AK, ist die IP eine Standardmethode. Die geringe Menge an H. pylori spezifischen AK in den Patientenseren im Zusammenhang mit der kleinen Ausbeute der Affinitätsreinigung reichte hier jedoch nicht aus, eine hinreichende Menge an H. pylori spezifischen Ag zu präzipitieren.

Als „letzter Versuch“ wurde eine IP ohne jegliche Affinitätsreinigung durchgeführt, indem alle IgG des Patientenserums an die Protein-G Sepharose gebunden wurden (Abbildung 14: rechts). Wieder unterschieden sich die Banden der IP stark von denen des H. pylori Lysats. Allerdings wurden keinerlei Unterschiede zwischen H. pylori positivem und negativem Serum gefunden. Auch zur Kontrolle ohne jegliche AK gab es keine Differenzen. Aus diesem Grunde musste dieser Ansatz wie erwartet als ungeeignet angesehen werden. Die Unterschiede der Lysatbanden zwischen der Abbildung 14 links und rechts erklären sich daraus, dass Silberfärbung (links) und CBB G-250 Färbung (rechts) verschiedene Proteine unterschiedlich intensiv anfärben. Humane Seren wurden zwar bereits ohne jegliche Affinitätsreinigung in einer IP Studie eingesetzt, in der seropositive mit seronegativen C. pneumoniae Patientenseren verglichen wurden [95]. Die Ergebnisse zeigten jedoch trotz der hochsensitiven 35S Detektion nur eine einzige angereicherte Bande, die zusätzlich keine besonders hohe Spezifität hatte, da sie auch von der Hälfte der negativen Seren erkannt wurde. Letztlich wurde damit bestätigt, dass der geringe Anteil Pathogen-spezifischer AK im humanen Serum eine IP sehr erschwert.


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08.02.2005