Die Entwicklung von Immunoproteomics-Methoden am Beispiel der Identifizierung Magenkarzinom-assoziierter Helicobacter pylori Antigene

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
( Dr. rer. nat. )

im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von

Dipl. Biophys. Alexander Krah

geboren am 05. November 1973 in Erfurt

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter-Michael Kloetzel
2. Prof. Dr. Thomas F. Meyer
3. Prof. Dr. Wolfgang Lockau

Tag der mündlichen Prüfung: 17.12.2004

Zusammenfassung

Das magenbesiedelnde Bakterium Helicobacter pylori gehört zu den am weitesten verbreiteten Infektionserregern. Obwohl die Infektion meist lebenslang symptomlos verläuft, kann H. pylori bei einigen Menschen schwere Erkrankungen bis hin zum Magenkarzinom verursachen. Ziele dieser Arbeit waren Magenkarzinom-assoziierte Antigene für einen diagnostischen Test zu finden und Methoden zur Untersuchung von Spotkompositionen mittels MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie zu entwickeln.

Im ersten Teil der Promotion wurden die Antigenerkennungsmuster von 30 Magenadeno­karzinom- mit 30 Ulkus duodeni-Patienten mithilfe hochauflösender zwei­dimensionaler Immunoblots von H. pylori Lysat verglichen. Diese fokussierte Gegenüberstellung eignet sich gut für diese Fragestellung, da beide Erkrankungen von diesem Bakterium verursacht werden, aber nur sehr selten gemeinsam auftreten. Durch univariate statistische Analysen wurden 14 Magenkarzinom korrelierte Spots gefunden (p<0,01), die mit MALDI-TOF Massen­spektrometrie als folgende Proteine identifiziert wurden: GroES, GroEL und HyuA. Diese drei ORFs kodieren für hochkonservierte Antigene, die keine evidente Rolle in der Virulenz spielen und deshalb als Surrogatmarker der Erkrankung angesehen werden können.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die genaue Zusammensetzung mittels zweidimensionaler Gel­elektrophorese separierter Spots untersucht. Diese können mehr als eine Komponente enthalten, so dass nicht immer eindeutig entschieden werden kann, welche von Antikörpern erkannt wurde. Für die Analyse von Spotkompositionen gibt es bisher keine Standard­vorgehensweise. Aus diesem Grunde wurden hier Methoden entwickelt, mit denen Neben­komponenten von Spots detektiert werden können. Dies geschah durch Anwendung der hierarchischen Clusteranalyse und der Weiterentwicklung der Korrespondenz­analyse für MALDI-TOF Massenspektren. Für die o.g. Magenkarzinom-korrelierten Spots konnten damit entsprechend der Empfindlichkeit unserer Methode Nebenkomponenten ausgeschlossen werden.

Als alternativer Ansatz zur Detektion von H. pylori Antigenen sollte im dritten Teil dieser Doktorarbeit eine Immunopräzipitation mit Patientenseren etabliert werden. Da nur ein geringer Anteil der Serumantikörper gegen H. pylori gerichtet ist, wurde mittels Affinitätsreinigung versucht, die spezifischen Antikörper anzureichern. Aufgrund der knappen Serenmenge und der letztlich nicht ausreichenden Ausbeute der Affinitätsreinigung konnte dieses Verfahren jedoch nicht realisiert werden.

Abstract

The stomach-colonizing bacterium Helicobacter pylori is one of the most widespread infectious agents. Although infection mostly persists unnoticed, it may cause serious diseases like gastric carcinoma. Aims of this project were to find gastric carcinoma-associated antigens for a diagnostic test and to develop methods to analyze spot compositions using MALDI-TOF/TOF mass spectrometry.

In the first part of this project antigen recognition patterns of 30 gastric carcinoma- and 30 duodenal ulcer- patients were compared using high-resolution two-dimensional immunoblots of H. pylori lysate. This focused comparison lent itself to this question because both diseases are caused by the bacterium but rarely occur conjointly. Utilizing univariate statistical tests 14 gastric carcinoma-associated spots were found (p<0.01) which were identified by MALDI-TOF mass spectrometry to contain the following proteins: GroES, GroEL and HyuA. These ORFs code for highly conserved antigens that do not play any evident role in virulence and may therefore be considered as surrogate markers for this condition.

In the second part of this doctorate compositions of spots separated by two-dimensional gel electrophoresis were analyzed. Such spots may contain more than one component and it therefore cannot easily be decided which of them was recognized by antibodies. So far there is no standard approach towards this problem. Therefore, methods were developed to detect minor components of spots in an automatic manner. For this purpose hierarchical clustering was applied and correspondence analysis advanced for MALDI-TOF mass spectra. For the above mentioned gastric carcinoma-associated spots minor components could be ruled out according to the sensitivity of our method.

As an alternative approach to detect H. pylori antigens an immunoprecipitation using patient sera ought to be established in the third part of this project. Since only a small portion of antibodies in the serum is directed against H. pylori an affinity purification was to be established to enrich specific antibodies. Due to the poor amount of patient serum and the insufficient yield of the affinity purification this procedure could not be realized.

Eigene Schlagwörter: Helicobacter pylori , Immunoproteomics, Magenkarzinom, Ulkus duodeni, Antigen, Antikörper, Patientenserum, Immunoblot, Proteinidentifizierung, MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie, Immunopräzipitation, Affinitätsreinigung

Keywords: Helicobacter pylori , Immunoproteomics, gastric carcinoma, duodenal ulcer, antigen, antibody, patient serum, immunoblot, protein identification, MALDI-TOF/TOF mass spectrometry, Immunoprecipitation, affinity purification

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08.02.2005