Aus der Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Die Regulation der Synthese und Freisetzung von FGF-2 aus humanen dermalen Mastzellen

Zur Erlangung des akademischen Grades doctorum medicinae dentariae (Dr. med. dent.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Anna Christina Krajewski
aus Kiel

Dekan: Dekan:Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. T. Zuberbier
2. Prof. Dr. med. M. Ollert
3. PD. Dr. med. B. Wedi

eingereicht: 19. November 2004

Datum der Promotion: 30. Oktober 2005

Die Synthese und Freisetzung von FGF-2 aus humanen dermalen Mastzellen

Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) ist ein Mitglied einer großen Familie von Wachstumsfaktoren. FGF-2 fördert das Wachstum und die Entwicklung von Blutgefäßen (Angiogenese) und nimmt somit Einfluss auf Wundheilungsprozesse, Gewebeentwicklung, als auch verschiedene pathologische Vorgänge im Organismus. Mastzellen wurden lange Zeit allein als Effektorzellen der Typ I Allergiereaktion betrachtet. Mittlerweile betrachten man sie auch als wichtige Zellen für die Gewebe Homöostase und Wundheilung. In der vorliegenden Arbeit wurden MC aus humenen dermalen Gewebe isoliert, um deren FGF-2 Synthese und –Freisetzung zu untersuchen. Die Zellen wurden mit verschiedenen proinflammatorischen Mediatoren stimuliert. FGF-2 wurde mit ELISA und PCR Methoden bestimmt. Durch Stimulationen mit a–IgE, SP, IL–4, IL–6 und IL–8 wurde eine gesteigerte FGF–2–Synthese induziert. Weiterhin zeigten die vorliegenden Ergebnisse, dass bei der Degranulation der MC FGF-2 freigesetzt wird, auch wenn der zugrunde liegende Mechanismus für die Freisetzung weiterhin unklar bleibt. UVA₁–und PUVA₁–Bestrahlung hatten einen inhibieren Effekt auf die Sekretion des Proteins.

Eigene Schlagworte: Mastzelle, Fibroblast growth factor-2, Wundheilung, Degranulation, Stimulation, Proinflammatorische Mediatoren

Synthesis and release of FGF-2 from human dermal mast cells

Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) is a member of a large family of proteins. FGF-2 stimulates the growth and development of new blood vessels (angiogenesis) that contribute to the pathogenesis of several diseases (i.e. atherosclerosis), normal wound healing and tissue development. Mast cells (MC) are traditionally viewed as effector cells of immediate type hypersensitivity reactions. There is, however, a growing body of evidence that the cells might play an important role in the maintenance of tissue homeostasis and repair. In this present investigation, we isolated MC from human tissue to investigate their FGF-2 synthesis and release after stimulation with different proinflammatory mediators. To detect FGF-2 we used ELISA and PCR techniques. We could show the up-regulation of FGF-2 synthesis after stimulation with a-IgE, SP, IL-4, IL-6 and IL-8. Within the degranulation of MC there was a release of FGF-2 even though the mode of release still remains unclear. Through UV-light radiation we could show a downregulation of FGF-2 release.

Keywords: mast cell, fibroblast growth factor-2, wound healing, degranulation, stimulation, proinflammatory Mediators, inflammation

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1 Vorkommen und Entwicklung von Mastzellen
  • 1.2 Heterogenität und Funktion von Mastzellen
    • 1.2.1 Heterogentität von MC
    • 1.2.2 Funktion von MC und ihre klinische Bedeutung
  • 1.3 Mediatorengehalt und Aktivierung von Mastzellen
    • 1.3.1 Mediatoren der Mastzelle
    • 1.3.2 Die Aktivierung der Mastzelle
  • 1.4 Fibroblast Growth Factor 2 (FGF–2)
  • 1.5 Stimulantien
    • 1.5.1 Substanz P (SP)
    • 1.5.2 Zytokine
    • 1.5.3 Transforming Growth Factor β (TGFβ)
    • 1.5.4 Staphyolococcus aureus Enterotoxin B (SEB)
  • 1.6 Wirkungsmechanismen von UV–Licht
• 2 Zielsetzung
• 3 Material und Methoden
  • 3.1 Materialien
    • 3.1.1 Puffer
      • 3.1.1.1 Pipes–Stock–Puffer (10x)
      • 3.1.1.2 Pipes–Albumin–Glukose + Calcium + Magnesium (PAG–CM)
      • 3.1.1.3 MACS–Puffer
      • 3.1.1.4 RLT–Puffer
    • 3.1.2 Medien
      • 3.1.2.1 24 h–Medium für die Mastzellkultur
      • 3.1.2.2 Stimulationsmedium
      • 3.1.2.3 Transportmedium
      • 3.1.2.4 Dispergiermedium
  • 3.2 Methoden
    • 3.2.1 Die Isolierung der Mastzellen
      • 3.2.1.1 Schneiden der Haut
      • 3.2.1.2 Dispergieren der Haut
      • 3.2.1.3 Aufreinigung der Mastzellen
    • 3.2.2 Histaminfreisetzung mit Histamin–Analyser
    • 3.2.3 Die Stimulierung der MC mit klassischen MC–Liberatoren und proinflamatorischen Zytokinen
      • 3.2.3.1 Stimulation mit klassischen MC–Liberatoren und Substanz P:
      • 3.2.3.2 Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen und SEB:
    • 3.2.4 Die Stimulierung der MC für die PCR
    • 3.2.5 Zeitkinetik mit Substanz P
    • 3.2.6 Präinkubation mit Interleukin 4
    • 3.2.7 Bestrahlung der MC mit UVB, UVA₁ und PUVA₁
    • 3.2.8 Enzymimmunoassay (ELISA)
    • 3.2.9 Semiquantitative Bestimmung von FGF–2 m–RNA durch die Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT–PCR)
      • 3.2.9.1  RNA–Extraktion / DNase Verdau
      • 3.2.9.2 cDNA Synthese und PCR
      • 3.2.9.3  Gelelektrophorese und densitometrischen Analyse
  • 3.3 Statistik
• 4 Ergebnisse
  • 4.1 Die basale Freisetzung von FGF–2
  • 4.2 Die FGF–2–Synthese in humanen MC
    • 4.2.1 Der intrazelluläre FGF–2–Gehalt von MC nach Stimulation mit klassischen Liberatoren und mit Substanz P
      • 4.2.1.1 Der intrazelluläre FGF–2–Gehalt nach Stimulation mit PMA und Ca–Iono
      • 4.2.1.2 Der intrazelluläre FGF–2–Gehalt nach Stimulation mit a–IgE und SP
    • 4.2.2 Der intrazelluläre FGF–2–Gehalt von MC nach Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen und SEB
      • 4.2.2.1 Der intrazelluläre FGF–2–Gehalt nach Stimulation mit Interleukin 4
      • 4.2.2.2 Der intrazelluläre FGF–2–Gehalt nach Stimulation mit Interleukin 6
      • 4.2.2.3 Der intrazelluläre FGF–2–Gehalt nach Stimulation mit Interleukin 8
      • 4.2.2.4 Der intrazelluläre FGF–2–Gehalt nach Stimulation mit Transforming Growth Factor β
      • 4.2.2.5 Der intrazelluläre FGF–2–Gehalt nach Stimulation mit SEB
    • 4.2.3 Untersuchungen zur m–RNA Expression von FGF–2
  • 4.3 Der Gesamt–FGF–2–Gehalt von MC nach Stimulation mit verschiedenen Substanzen
  • 4.4 Die Freisetzung von FGF–2 aus humanen MC
    • 4.4.1 Die Wirkung klassischer MC–Liberatoren und Substanz P auf die FGF–2–Freisetzung
    • 4.4.2 Die Wirkung proinflammatorischer Zytokine und SEB auf die Freisetzung von FGF–2 in MC
    • 4.4.3 Der zeitliche Verlauf der FGF–2–Sekretion durch humane MC
    • 4.4.4 Stimulierte FGF–2–Sekretion durch Präinkubation mit IL–4
    • 4.4.5 Der Einfluss von UV–Licht auf die FGF–2–Freisetzung
  • 4.5 Der Einfluss von Proteaseinhibitoren auf FGF–2 und MC
    • 4.5.1 Synthese und Freisetzung von FGF–2 humaner MC nach Zugabe von Proteaseinhibitoren
  • 4.6 Zusammenfassung der Ergebnisse
• 5 Diskussion
  • 5.1 Die FGF–2–Synthese und Freisetzung von humanen MC
    • 5.1.1 Die FGF–2–Synthese und –Freisetzung durch MC nach Inkubation mit verschiedenen Stimulantien
    • 5.1.2 Untersuchungen zur m–RNA Expression von FGF–2
  • 5.2 Die Freisetzung von FGF–2 durch die Degranulation
    • 5.2.1 Der zeitliche Verlauf der FGF–2–Sekretion durch humane MC
    • 5.2.2 Stimulierte FGF–2–Sekretion
    • 5.2.3 Der Einfluss von UV–Licht auf die FGF–2–Freisetzung
  • 5.3 Der Einfluss von Proteaseinhibitoren auf FGF–2 und MC
• 6 Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tabelle 1: Die Entwicklung von MC[1, 5, 7, 8, 9, 10, 11]
• Tabelle 2: Präformierte Mediatoren und Enzyme
• Tabelle 3: Lipidmediatoren
• Tabelle 4: Zytokine
• Tabelle 5: Reagenzien für die Zellkultur
• Tabelle 6: Weitere Reagenzien
• Tabelle 7: Enzyme
• Tabelle 8: Antikörper zur Aufreinigung und Stimulierung der Mastzellen
• Tabelle 9: Reagenzien für die Polymerase–Kettenreaktion (PCR)
• Tabelle 10: Geräte
• Tabelle 11: Leistungsbereich der UVB– und der UVA₁–Lichtquelle
• Tabelle 12: Versuchsaufbau Histaminfreisetzung

Bilder

• Abbildung 1: Zusammenfassung der verwendeten Methoden
• Abbildung 2: Versuchsansätze für den Versuch 3.2.5 
• Abbildung 3: Darstellung des Versuchsablaufes von Versuch 3.2.5. Links befindet sich eine Skala, die den zeitlichen Ablauf des Versuchs darstellt, die nicht farbig unterlegten Felder zeigen Proben, denen zum gezeigten Zeitpunkt keine weiteren Zusätze hinzugefügt wurden. In die anderen Feldern ist das zugegebene Reagenz eingetragen, nach insgesamt 24 Stunden wurden die Proben analysiert. 
• Abbildung 4: Schematische Darstellung eines Enzymimmunoassays 1. Das FGF–2 wird durch die am Boden der wells befindlichen Antikörper gebunden 2. Zugabe der mit dem Enzym markierten Antikörper 3. Darstellung der enzymatischen Farbreaktion nach Zugabe der Reaktionslösung 
• Abbildung 5: Schematische Darstellung einer PCR
• Abbildung 6: Darstellung der basalen Freisetzung von FGF–2 nach 24 Stunden; n=16
• Abbildung 7: Darstellung des FGF–2–Gehalt in den Zelllysaten dermaler MC nach Stimulation mit PMA, PMA + Ca–Iono und Ca–Iono, 24h, n=6, Mittelwert+/- SEM, Ctrl.=100%, die Unterschiede sind nicht statistisch signifikant 
• Abbildung 8: Darstellung des FGF–2–Gehalts in den Zelllysaten dermaler MC nach Stimulation mit a–IgE und SP, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, die Unterschiede sind nicht statistisch signifikant 
• Abbildung 9: Darstellung der Zelllysate nach 24 Stunden Stimulation mit Interleukin 4, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, die Unterschiede sind nicht statistisch signifikant 
• Abbildung 10: Darstellung der Zelllysate nach 24 Stunden Stimulation mit Interleukin 6, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, Il6 20ng/ml = p<0,05 
• Abbildung 11: Darstellung der Zelllysate nach 24 Stunden Stimulation mit Interleukin 8, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, die Unterschiede sind nicht statistisch signifikant 
• Abbildung 12: Darstellung der Zelllysate nach 24 Stunden Stimulation mit TGFβ, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, die Unterschiede sind nicht statistisch signifikant 
• Abbildung 13: Darstellung der Zelllysate nach 24 Stunden Stimulation mit SEB, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, SEB = p<0,05 
• Abbildung 14: PCR nach Stimulation mit SP, Gelelektrophoretische Auftrennung des GAPDH und FGF–2–PCR–Produktes nach Stimulation mit SP (30µM) in einem Agarosegel: 1 Kontrolle nach 3h, 2 SP nach 3h, 3 Kontrolle nach 6h, 4 SP nach 6h, 5 Kontrolle nach 8h, 6 SP nach 8h 
• Abbildung 15: Expressionsrate von FGF–2 nach Stimulation mit SP, Darstellung der Expression von FGF–2 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation mit SP (30µM) versus einer unstimulierten Kontrollprobe 
• Abbildung 16: Gelelektrophoretische Auftrennung des β–Actin und FGF–2–PCR–Produktes nach Stimulation mit TGFβ (150pg/ml) in einem Agarosegel: 1 Kontrolle nach 2h, 2 TGFβ nach 2h, 3 Kontrolle nach 4h, 4 TGFβ nach 4h, 5 Kontrolle nach 6h, 6 TGFβ nach 6h, 7 Kontrolle nach 8h, 8 TGFβ nach 8h, 9 Kontrolle nach 10h, 10 TGFβ nach 10h 
• Abbildung 17: Expressionsrate von FGF–2 nach Stimulation mit TGFβ, Darstellung der Expression von FGF–2 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation mit TGFβ (150pg/ml) versus einer unstimulierten Kontrollprobe 
• Abbildung 18: Der Gesamt–FGF–2–Gehalt von MC nach Stimulation mit PMA, Iono, a–IgE und SP, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, PMA+Iono = p<0,05
• Abbildung 19: Der Gesamt–FGF–2–Gehalt von MC nach Stimulation mit IL–4, IL–6, IL–8, TGFß und SEB, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, Il4 0,5 ng/ml = p<0,05
• Abbildung 20: Darstellung der Freisetzung von FGF–2 nach Stimulation mit PMA und Ca–Iono, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, PMA 20ng/ml = tendentiell signifikant (p<0,08)
• Abbildung 21: Darstellung der Freisetzung von FGF–2 nach Stimulation mit a–IgE und SP, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, a-IgE = p<0,05
• Abbildung 22: Freigesetztes FGF–2 nach Stimulation mit Interleukin 4, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, Il4 (50, 5, 0.5 ng/ml) = p<0,05
• Abbildung 23: Freigesetztes FGF–2 nach Stimulation mit Interleukin 6, n=6, Mittelwert+/-SEM,Ctrl.=100%, Il6 10ng/ml = p<0,05
• Abbildung 24: Freigesetztes FGF–2 nach Stimulation mit Interleukin 8, =6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, Il8 = p<0,05
• Abbildung 25: Freigesetztes FGF–2 nach Stimulation mit Transforming Growth Factor β, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, TGFbeta 600pg/ml = p<0,05
• Abbildung 26: Freigesetztes FGF–2 nach Stimulation mit SEB, =6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, SEB 20µg/ml = p<0,05
• Abbildung 27: Zeitliche Darstellung der FGF–2–Sekretion von humanen MC mit/ohne SP Stimulation, n=5, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.(Zellen ohne SP/0h)=100%, 8h = p<0,05; 4h, 6h und 24h = tendentiell signifikant (p<0,08) beim Vergleich der stimulierten Probe mit der unstimulierten Probe
• Abbildung 28: Überstände der mit IL–4 präinkubierten MC, n=3, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, Für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend, jedoch zeigen folgende Daten eine signifikante Tendenz mit p<0,15, bzw. 3 positiven Rängen bei n=3: IL–4/a–IgE 6h, IL–4/SP 6h, a–IgE 6 und 18h, SP 6 und 18h
• Abbildung 29: Darstellung des Einflusses von Licht verschiedener Wellenlängen (UVB: 75 mJ/cm, UVA–1: 15 J/cm, PUVA–1: 5 J/cm) auf die Freisetzung von FGF–2, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, UVA1 und PUVA1 = p<0,05
• Abbildung 30: Einfluss von Proteaseinhibitoren auf die Proliferation von HMC–1 Zellen, Proliferation der HMC–1 Zellen nach Zugabe von Proteaseinhibitoren; n=4, Mittelwert+/-SEM 
• Abbildung 31: Einfluss von Proteaseinhibitoren auf die Größe von HMC–1 Zellen, Größe der HMC–1 Zellen nach Zugabe von Proteaseinhibitoren, n=4, Mittelwert+/-SEM 
• Abbildung 32: Zeitliche Darstellung der Überstände der unstimulierten MC mit bzw. ohne Proteaseinhibitoren, n=3, Mittelwert+/-SEM; Ctrl.=100%, für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend
• Abbildung 33: Zeitliche Darstellung der Überstände der mit SP stimulierten MC mit bzw. ohne Proteaseinhibitoren, n=3, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend
• Abbildung 34: Zeitliche Darstellung der Zelllysate der unstimulierten MC mit bzw. ohne Proteaseinhibitoren, n=3, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend
• Abbildung 35: Zeitliche Darstellung der Zelllysate der mit SP stimulierten MC mit bzw. ohne Proteaseinhibitoren, n=3, Mittelwert+/-SEM, Ctrl=100%, für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend
• Abbildung 36: Klassischer Sekretionspathway eukarionter Zellen modifiziert nach B. Alberts[109], 1. Bildung der mRNA im Zellkern 2. am Ribosom wird die mRNA in die AS–Sequenz translatiert, durch die Signalsequenz erkennt das Ribosom den Bestimmungsort Endoplasmatisches Retikulum und bindet dort, die Proteine gelangen so vom Cytosol in das ER 3. die Proteine wandern vom ER in den Golgi–Apparat 4. durch Membranabschnürungen bilden sich Transportvesikel 4. In diesen werden die Proteine in Richtung Zellmembran transportiert 5. die Vesikel verschmelzen mit der Zellmembran und ihr Inhalt wird in den Extrazellulärraum sezerniert