5 Diskussion

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FGF–2 wird mit der Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen in Verbindung gebracht. Hierzu zählt die Polypenbildung in der Nase, die rheumatische Arthritis und die Sklerodermie. In diesen pathologisch veränderten Geweben gibt es mehr MC als im gesunden Gewebe. In der vorliegenden Arbeit wurde das Funktionsverhalten von MC hinsichtlich der FGF–2–Synthese und –Freisetzung untersucht, um dadurch Rückschlüsse auf deren Einfluss auf die Pathogenese der erwähnten Veränderungen ziehen zu können.
Viele gegenwärtige Erkenntnisse wurden durch Versuche an MC von Tieren oder an Mastzelllinien gewonnen. Obwohl diese Zellen menschlichen MC in vielerlei Hinsicht ähneln, können größtmögliche Rückschlüsse auf das Funktionsverhalten von MC im menschlichen Organismus doch nur an reifen humanen MC gewonnen werden. Die in dieser Arbeit erarbeiteten Ergebnisse stammen ausschließlich aus Versuchen an humanen MC, die aus Gewebeproben gesunder Probanden gewonnen wurden.
Ein Teil der Versuche konzentrierte sich auf die FGF–2–Synthese in menschlichen MC. Es wurde durch Stimulierung mit immunologischen Substanzen ein physiologisch verändertes Milieu geschaffen und anschließend die Synthesemenge von FGF–2 ermittelt. Durch die Ergebnisse konnten Rückschlüsse auf das Verhalten von MC hinsichtlich ihrer FGF–2–Synthese unter bestimmten physiologischen und pathologischen Bedingungen geben, um eventuell bestehende Zusammenhänge zu evaluieren. Ein anderer Teil der Versuche galt dem Freisetzungsmechanismus von FGF–2 aus menschlichen MC. Dieser ist weitgehend unbekannt und wirft einige Fragen auf. In dieser Arbeit wurde die Freisetzung von FGF–2 durch die Degranulation von MC untersucht. Des weiteren wurde die Wirkung von Licht auf die FGF–2–Freisetzung von MC untersucht.

5.1 Die FGF–2–Synthese und Freisetzung von humanen MC

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Die vorliegenden Daten haben gezeigt, dass sich die FGF–2–Synthese und –Freisetzung von MC durch Inkubation mit unterschiedlichen Wirkstoffen modulieren lässt. Da FGF–2 mit der Pathogenese vieler unterschiedlicher Erkrankungen assoziiert ist, kann auch den MC beim Verlauf dieser Erkrankungen eine tragende Rolle zugeschrieben werden.

5.1.1 Die FGF–2–Synthese und –Freisetzung durch MC nach Inkubation mit verschiedenen Stimulantien

MC beinhalten eine Vielzahl von Mediatoren. Ein Teil dieser Stoffe wird in den Sekretionsgranula der MC gespeichert. Einer der wichtigsten Vertreter dieser präformierten Mediatoren ist Histamin. Die anderen Mediatoren werden von de novo synthetisiert, wenn es zur Aktivierung der Zelle in Folge verschiedener Reize kommt. Bei der Degranulation der Zelle werden die Mediatoren in den Extrazellularraum sezerniert und entfalten dort ihre biologische Aktivität. FGF–2 gehört zu den Mediatoren, die von MC synthetisiert werden. Der Wachstumsfaktor ist in den Sekretionsgranula von MC lokalisiert, wie histologische Untersuchungen zeigten[75, 101].
In den in dieser Arbeit beschriebenen Versuchen wurde die Regulation der FGF–2–Synthese und die Freisetzung des Proteins untersucht. Dafür wurden MC mit verschiedenen Substanzen stimuliert und anschließend die FGF–2–Synthese und –Freisetzung durch herkömmliche ELISA ermittelt. Die erste Gruppe dieser Stimulantien fällt unter den Begriff „klassische MC Liberatoren“. Es handelt sich um nicht physiologische und physiologische Substanzen, bei denen die Reaktion der MC teilweise bekannt und damit vorhersagbar ist. Zu diesen bekannten Reaktionen gehört die Degranulation der MC in Folge der Inkubation. Zu den nicht physiologischen Stimuli dieser Gruppe gehören PMA und Ca–Iono. Ein Teil der Zellen wurde nur mit PMA, ein Teil nur mit Ca–Iono und ein Teil mit beiden Stimulantien inkubiert. Intrazellulär stieg die Konzentration von FGF–2 bei der mit PMA ebenso wie bei der mit Ca–Iono stimulierten Probe an. Bei den mit beiden Stimulantien inkubierten Proben waren die intrazellulären FGF–2–Werte verringert. Extrazellulär ergaben die Messwerte in allen drei Versuchsgruppen erhöhte FGF–2 Konzentrationen. Der deutlichste Effekt trat nach Stimulation mit beiden Stoffen auf, es resultierte eine um 25% verstärkte Freisetzung. Die gesamte FGF–2–Synthese war nach Stimulation mit den Substanzen verstärkt, dieses Ergebniss erwies sich aber nur bei der Stimulation mit beiden Substanzen als signifikant. Ca–Iono ist eine Substanz, welche die Degranulation von MC induziert[102]. Da die extrazellulären FGF–2–Werte nach der Stimulation erhöht waren, kann vermutet werden, dass bei der Degranulation von MC FGF–2 sezerniert wurde. Bei der mit beiden Stoffen inkubierten Probe war der Anstieg der FGF–2 Sekretion besonders deutlich. PMA und Ca–Iono schienen hier einen synergetischen Effekt auszuüben. Bei PMA handelt es sich um einen Stoff, der die Proteinsynthese in vielen verschiedenen Zellen anregt[103, 104]. PMA scheint auch die Synthese von FGF–2 zu beeinflussen, da die intrazellulären Werte von FGF–2 in der mit PMA stimuliertem Probe erhöht waren. Gleichzeitig führte die Stimulation zu einer verstärkten FGF–2–Freisetzung, was durch die erhöhten extrazellulären Werte präsentiert wurde.
Die physiologischen Stimulantien dieser Gruppe waren a–IgE und Substanz P. Die MC reagierten in ähnlicher Weise auf die Inkubation, sie scheinen sowohl die FGF–2–Synthese als auch die Freisetzung anzuregen. SP und a–IgE kommen sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen im menschlichen Organismus vor. Sie führen zur Aktivierung und damit Degranulation der MC[46, 53].
In einer 2001 veröffentlichten Studie konnte immunhistochemisch nachgewiesen werden, dass FGF–2 bei Lungenmastzellen in den Sekretionsgranula lokalisiert ist[101]. Bei der Lokalisation von FGF–2 in den Sekretionsgranula scheint die Fähigkeit mit Heparin und Chondroitinsulfat Komplexe zu bilden, eine Rolle zu spielen. Da bekannt ist, dass diese Mediatoren in den Granula der MC gespeichert werden, kann so auch die Lokalisation von FGF–2 in den Granula erklärt werden[66, 68, 70]. Somit liegt nahe, dass FGF–2 wie andere Mediatoren auch nach Aktivierung der Zellen über Exozytose in den Extrazellulärraum gelangt. Auch die hier präsentierten Ergebnisse deuten auf diesen Zusammenhang hin.
In weiteren Versuchen wurden die MC mit verschiedenen Zytokinen inkubiert, die anhand Ihres Einflusses bei bestimmten immunologischen Reaktionen ausgewählt wurden. Interleukin 4 wird eine wichtige regulatorische Rolle bei der Pathogenese allergischer Erkrankungen zugeschrieben. Es regt die Differenzierung von B–Zellen zu Plasmazellen an und damit die Freisetzung spezifischer Antikörper. Während der MC–Reifung in vitro führt die Stimulierung mit IgE und/oder IL–4 zur verstärkten Expression vom FcεRI Rezeptor auf der MC Oberfläche, wodurch diese auf anti–IgE Reize stärker reagieren.[105]. Humane MC setzen mehr Histamin, Leukotriene C4 und IL–5 frei, wenn sie vor der Aktivierung mit IL–4 präinkubiert wurden[106]. Die Stimulationen die in dieser Arbeit durchgeführt wurden, zeigten eine verringerte Freisetzung von FGF–2, dagegen aber deutlich erhöhte intrazelluläre Werte. Nach Stimulierung mit einer Konzentration von 50ng/ml erhöhte sich die FGF–2–Synthese auf im Vergleich zu den Kontrollproben signifikant auf 117%. Kann hierdurch die Pathogenese von Polypen in der Nase begünstigt werden? Es ist bekannt, dass sich in der Mucosa von Patienten mit allergischer Rhinitis mehr MC befinden als bei gesunden Patienten. Diese MC synthetisieren verstärkt IL–4[10]. Die Versuchsergebnisse deuten darauf hin, das durch IL–4 die FGF–2–Synthese in MC gefördert wird, da nach der Stimulierung mehr FGF–2 in den Zellen nachgewiesen wurde. FGF–2 wiederum begünstigt die Proliferation von Fibroblasten. Das könnte bedeuten, dass bei Patienten mit allergischen Vorerkrankungen die Entwicklung von Polypen in der Nase und den Nasennebenhöhlen begünstig ist, weil durch die oben erläuterten Zusammenhänge in der Mucosa mehr FGF–2 vorhanden ist und davon die Proliferation von Fibroblasten angeregt wird. Bei diesem Pathomechanismus spielt jedoch die Freisetzung von FGF–2 eine tragende Rolle, da es erst extrazellulär seine proliferative Wirkung auf Fibroblasten entfalten kann. Die Ergebnisse präsentieren dagegen verringerte extrazelluläre Werte nach Stimulation mit IL–4. Nun muss bedacht werden, dass unter natürlichen Bedingungen IL–4 zusammen mit einer Vielzahl anderer Faktoren wirkt. So haben Patienten mit allergischen Erkrankungen erhöhte a–IgE–Titer. Es müssen also weitere Untersuchungen hinsichtlich des Freisetzungsmechanismus durchgeführt werden, um herauszufinden, welche inter– und intrazellulären Mechanismen die MC zur Sekretion des FGF–2 anregen.
Weiter wurde mit Interleukin 6 stimuliert. Die Ergebnisse zeigten ähnlich zu IL–4 erhöhte intrazelluläre Werte bei einer verringerten Konzentration von FGF–2 im Überstand. Das bedeutet, das die MC mehr FGF – 2 synthetisierten, dieses jedoch nicht freisetzten. Bei IL–6 handelt es sich um ein Zytokin, das Differenzierung und Wachstum von T– und B–Zellen anregt und an der Produktion von Akute–Phase–Proteinen beteiligt ist und von MC exprimiert wird[26]. Dadurch spielt IL–6 bei der frühen Entzündungsphase eine Rolle. Da viele MC– und FGF–2–assoziierte Erkrankungen chronisch, entzündliche Veränderungen sind (Sklerodermie, rheumatische Arthritis, Asthma bronchiale), kann deren Verhalten im Hinblick auf die FGF–2–Synthese im entzündlich veränderten Milieu untersucht werden. Unter ähnlichen Gesichtspunkten wurden zwei weitere Stimulantien für die nächsten Versuche ausgewählt. Interleukin 8 ist ein für neutrophile Granulozyten chemotatisches Zytokin und spielt dadurch eine maßgeblich Rolle bei der Aktivierung entzündlicher Prozesse. IL–8 wird von Makrophagen, Monozyten, Endothel –und Epithelzellen exprimiert, aber nicht von MC[26]. Nach Stimulierung mit IL–8 wurde im Zelllysat vermehrt FGF–2 gemessen, wohingegen sich die extrazellulären Werte verringerten. Die statistische Auswertung der gesamt FGF–2–Synthese zeigte, das diese nicht signifikant war, und die erhöhten intrazellulären Werte wahrscheinlich nicht durch eine Synthesesteigerung, sondern durch die signifikant verringerte Freisetzung von FGF–2 bedingt waren. Diese Transforming Growth Factor β ist ein Zytokin, das den Gewebeumbau reguliert. Es unterstützt die Formation von Matrixproteinen zu denen Kollagen Typ I und III gehören. Die Stimulation renaler Fibroblasten mit TGFβ bewirkt eine vermehrte Synthese und Freisetzung von FGF–2 in renalen Fibroblasten, wodurch diese zur Proliferation angeregt werden[79]. Auch die Stimulation von MC mit TGFβ bewirkte eine gesteigerte FGF–2 Synthese, dagegen sank die Freisetzung nach der Inkubation in unseren Versuchen.
Die FGF–2–Synthese oder –Freisetzung wurde durch die Stimulantien beeinflusst. Dies zeigt, dass das Milieu in dem die MC sich befinden einen regulatorischen Einfluss auf deren FGF–2–Stoffwechsel hat. Die biologische Aktivität von FGF–2 wird mit 100 bis 3000pg/ml angeben. Die MC setzten in diesen Versuchen bis zu 2000pg/ml frei. Nach Stimulierung mit a–IgE schwankte die Freisetzung zwischen 140 und 2000pg/ml, mit einem Mittelwert von 546pg/ml +/- 172. Die FGF–2–Freisetzung liegt im biologisch wirksamen Bereich des Proteins. Zum Vergleich setzten renale Fibroblasten 24 Stunden nach Stimulation mit TGFβ 43pg/ml frei[79]. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass MC modulierend auf die schon genannten Krankheitsprozesse wirken können.

5.1.2 Untersuchungen zur m–RNA Expression von FGF–2

Die Ergebnisse der ELISA–Tests deuteten auf eine gesteigerte FGF–2–Synthese in den MC hin, da diese intrazellulär mehr FGF–2 enthielten als die unstimulierten Kontrollzellen. Die Synthese eines Proteins innerhalb einer Zelle verläuft an verschiedenen Zellorganellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten ab. Sie beginnt mit der Bildung von mRNA (messenger RNA) im Zellkern, welche die Information für die AS–Sequenz des Proteins enthält. Die Produktion und der Nachweis solcher spezifischen mRNA bildet eine wichtige Quelle, um Informationen über die Regulation der Synthese eines Gens zu gewinnen. Kritisch muss in diesem Zusammenhang angemerkt werden, dass der Nachweis von mRNA alleine kein Beweis für die Synthese eines Proteins innerhalb einer Zelle ist. Auch die dann kommenden Syntheseschritte müssen erfolgen. Die vollständige Fertigstellung eines Proteins ist ein komplizierter Prozess und kann an verschiedenen Stellen gestört sein. Aus diesem Grund kommt es vor, dass die mRNA für ein Protein nachweisbar ist, ohne dass es von der Zelle synthetisiert wird. Der Nachweis von mRNA gemeinsam mit dem Nachweis des vollständigen Proteins durch Methoden wie ELISA ist jedoch ein deutlicher Hinweis für die Synthese eines Proteins von einer Zelle.
Aus diesen Gründen sollten die aus den vorangegangenen Versuchen gewonnenen Hinweise auf die Hochregulierung der FGF–2–Expression durch die verwendeten Stimulantien mit einer PCR verifiziert werden. Da für diese Versuche viele Zellen (mRNA) benötigt wurden und diese nur begrenzt zur Verfügung standen, wurden die Versuche nur einmal exemplarisch durchgeführt. Die Zellen wurden mit SP als Vertreter von klassischen MC–Liberatoren und TGFβ als Vertreter der proinflamatorischen Zytokine stimuliert. Es wurde die Expression von FGF–2–mRNA in Abhängigkeit zur Dauer der Stimulierung untersucht. Die Transkriptmenge dieser Gene wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt.
Die relativen Quantifizierungen der mRNA wurden durch Vergleich der einzelnen PCR–Ansätze mit einem Housekeeping–Gen erreicht. Die Ergebnisse deuteten auf einen regulierenden Einfluss der verwendeten Stimulantien auf die mRNA–Synthese von FGF–2 hin. Es zeigt sich bei beiden Stimulantien eine maximale Induktion der FGF–2–Synthese nach 4–6 Stunden. Nach 8–10 Stunden fällt sie ab auf Werte, die auf oder unterhalb der Syntheseleistung der nicht stimulierten Kontrollzellen liegen.
Die Daten zeigten, dass durch die verwendeten Stimulantien die FGF–2–Synthese von MC beeinflussbar ist. Somit könnte deren Anwesenheit, beispielsweise in chronisch entzündlich veränderten Geweben, langfristig die Erhöhung der FGF–2–Synthese in MC zur Folge haben. Diese Veränderung kann wiederum bestimmt Krankheitsverläufe negativ beeinflussen.

5.2 Die Freisetzung von FGF–2 durch die Degranulation

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Während im ersten Teil dieser Arbeit die Regulation der FGF–2–Synthese im Vordergrund stand, konzentrierten sich die folgenden Versuche auf die Freisetzung des Proteins aus den Zellen. MC haben die besondere Eigenschaft, nach immunologischen, physikalischen und chemischen Reizen zu degranulieren. Dann verschmelzen die Membranen der Sekretionsgranula mit der Zellmembran und der Granulainhalt wird in den Extrazellulärraum sezerniert. Dieser Prozess dauert etwa 30 Minuten. Auch FGF–2 befindet sich in diesen Sekretionsgranula[75, 101], so dass es eine logische Konsequenz wäre, dass es durch die Degranulation der MC in den Extrazellulärraum gelangt. Dieser Zusammenhang sollte in den folgenden Versuchen näher betrachtet werden.

5.2.1 Der zeitliche Verlauf der FGF–2–Sekretion durch humane MC

A–IgE und SP sind Substanzen, die MC aktivieren[46, 53]. Die im ersten Teil diskutierten Versuche zeigten, dass MC hinsichtlich ihrer FGF–2–Synthese und –Freisetzung ähnlich auf diese Substanzen reagieren. Sowohl der intrazellulär gemessene FGF–2–Titer als auch die FGF–2–Freisetzung stiegen in diesen Versuchen an. Da die Gewinnung der MC sehr langwierig war und diese nur begrenzt zur Verfügung standen wurden die folgenden Versuche nur an mit SP stimulierten MC durchgeführt.

Die MC wurden nach der Stimulierung kultiviert. Zu gegebenen Zeitpunkten wurde die FGF–2–Konzentration im Überstand gemessen. Die Zeitkinetik zeigte, das zu allen Zeitpunkten mehr FGF–2 im Überstand nachweisbar war als in den Kontrollproben. Die stimuierten MC hatten folglich mehr FGF–2 freigesetzt. Dies deutet auf die Freisetzung von FGF–2 durch die von SP ausgelöste Degranulation der MC. Schon früher wurde Zusammenhang zwischen der Degranulation und der Freisetzung von FGF–2 vermutet, da immunhistochemisch gezeigt wurde das FGF–2 sowohl in den Granula als auch in der Umgebung degranulierter MC nachweisbar ist[75]. Offensichtlich wird das in den Granula gespeicherte FGF–2 durch die Aktivierung der Zelle freigesetzt. Die Freisetzung scheint gleichmäßig zu erfolgen. Es fällt kein deutlicher Unterschied in der Intensität bei einzelnen Zeitpunkten auf. Die de novo–Synthese eines Proteins innerhalb einer Zelle dauert je nach Proteingrösse unterschiedlich lange, in jedem Fall einige Stunden. Die Degranulation erfolgt dagegen sehr schnell und ist nach etwa 30 min beendet. Da das SP gleich zu Beginn den Zellen zugeführt wurde, konnte folglich nur das schon vorher in der Zelle beziehungsweise in den Granula gespeicherte FGF–2 freigesetzt worden sein. Das durch die Stimulation neu–synthetisierte FGF–2 konnte nicht durch die Deganulation aus der Zelle gelangen, da diese vor der Fertigstellung des Proteins erfolgte. Auch kann zumindestens bei dem 4 und 6h–Wert davon ausgegangen werden, dass die Synthese noch nicht abgeschlossen war. Die Versuche bestätigen die Annahme, dass das in den Granula gespeicherte FGF–2 bei der Degranulation der Zelle aus der Zelle geschleust wird.

5.2.2 Stimulierte FGF–2–Sekretion

Im ersten Teil wurde gezeigt, dass bestimmte Zytokine die Synthese von FGF–2 in humanen MC anregen. Weiterhin wird davon ausgegangen, dass FGF–2 bei der Degranulierung von MC in den Extrazellulärraum gelangt. Folglich müssten MC, die mit einem dieser Zytokin präinkubiert werden und denen dann später ein aktivierender Stoff zugegeben wurde, mehr FGF–2 freisetzen als eine nicht präinkubierte Kontrollgruppe. Die aktivierten MC setzten erwartungsgemäß mehr FGF–2 frei als die Kontrollzellen. Es war aber kein Zusammenhang zwischen der Präinkubation und der FGF–2–Freisetzung erkennbar. Das heißt die präinkubierten Zellen setzten nicht mehr FGF–2 frei als die nicht präinkubierten Zellen. Offenbar steht die Synthese von FGF–2 und dessen Freisetzung über die Degranulation nicht in direkter Beziehung. Die voran gegangenen Versuche zeigten, dass durch die Degranulation das in den Granula der Zelle gespeicherte FGF–2 freigesetzt wurde. Eine gesteigerte FGF–2–Synthese in den MC führte jedoch nicht zu einer gesteigerten Freisetzung durch die Degranulation. Beim 6–Stunden–Wert kann davon ausgegangen das die IL–4 induzierte Neusynthese von FGF–2 zum Zeitpunkt der Degranulation der Zellen noch nicht abgeschlossen war. So kann es sich bei dem freigesetzten FGF–2 nur um schon gespeichertes handeln. Auch nach 16 Stunden setzten die präinkubierten MC nicht mehr FGF–2 frei, als die nicht präinkubierten Zellen. Vielleicht wird das neu–synthetisierte FGF–2 nicht sofort in die Sekretionsgranula der MC transportiert und verlässt die Zelle aus diesem Grund bei der Degranulation nicht. Weiterhin ist denkbar, das FGF–2 nur teilweise über die schon diskutierte Komplexbildung in den Sekretionsgranula gebunden wird und dass daneben ein Weg existiert, durch einen nicht bekannten molekularen Mechanismus das Protein in den klassischen Sekretions–Pathway der Zelle zu schleusen[75]. Diese Interpretation scheint schon aus dem Grund naheliegend, dass FGF–2 von einer Vielzahl von Zelltypen synthetisiert und freigesetzt wird, die nicht die Fähigkeit zur Degranulation besitzen. Zu diesen Zellen gehören beispielsweise Fibroblasten und die Endothelzellen von Gefäße[7]. Offenbar existiert auch bei diesen Zellen eine Möglichkeit, die Sekretion des Proteins zu veranlassen. So könnte man die vorliegenden widersprüchlichen Ergebnisse auch so interpretieren, dass FGF–2 zwar bei der Degranulation der MC freigesetzt wird, die Sekretion aber gleichzeitig auf einem anderen intrazellulären Weg erfolgt. Somit führt die durch Stimulantien veränderte Syntheseleistung nicht zu einer vermehrten Freisetzung durch die Degranulation. Hinweise auf einen solchen Mechanismus geben die Forschungsergebnisse von LaVallee et al. Sie konnten zeigen, da FGF–1 einen Komplex mit einem Protein bildet, das strukturell eine große Homologität zu Synaptotagmin–1 aufweist. Synaptotagmin–1 ist ein Vesikel–Protein, das in die Exocytose und Aufnahme von Transmittern im synaptischen Spalt involviert ist, indem es Vesikeln bei der Zielerkennung und der Fusion mit der präsynaptischen Membran hilft. Das mit FGF–2 Komplexe bildende Protein könnte eine ähnliche Funktion haben und beispielsweise den Wachstumsfaktor oder das den Wachstumsfaktor synthetisierende Ribosom zum Endoplasmatische Retikulum steuern und dort eine Fusion vermitteln[107, 108].

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Abbildung 36: Klassischer Sekretionspathway eukarionter Zellen modifiziert nach B. Alberts[109],
1. Bildung der mRNA im Zellkern 2. am Ribosom wird die mRNA in die AS–Sequenz translatiert, durch die Signalsequenz erkennt das Ribosom den Bestimmungsort Endoplasmatisches Retikulum und bindet dort, die Proteine gelangen so vom Cytosol in das ER 3. die Proteine wandern vom ER in den Golgi–Apparat 4. durch Membranabschnürungen bilden sich Transportvesikel 4. In diesen werden die Proteine in Richtung Zellmembran transportiert 5. die Vesikel verschmelzen mit der Zellmembran und ihr Inhalt wird in den Extrazellulärraum sezerniert

Nicht zu vernachlässigen ist die Veränderung der Zellen durch die Kulturbedingungen. Obwohl bei dieser Art von in vitro–Versuchen physiologische Bedingungen sehr gut nachgeahmt werden können, sind sie doch verändert. Besonders Zell–Zell–Kontakte haben für MC großen Einfluss auf deren Funktion. Dies zeigt auch die Entwicklung und Reifung der Zellen im Gewebe. Diese Art der Interaktionen fehlten in den durchgeführten Versuchen vollständig und sind vielleicht von Bedeutung.

5.2.3 Der Einfluss von UV–Licht auf die FGF–2–Freisetzung

Die Einflüsse von Licht auf menschliche Zellen stellen sich sehr vielfältig dar und sind sowohl von dessen Wellenlänge als auch von dessen Intensität abhängig. Schon früh hat man die positiven Effekte von Licht bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen erkannt. Zu diesen Erkrankungen gehören die Psoriasis, die Sklerodermie und die atopische Dermatitis. Deren Symptomatik verbessert sich bei Sonnenlichtexposition und lenkte so das medizinische Interesse auf die zugrunde liegenden Mechanismen. Erst in den letzten Jahren sind wesentliche neue Erkenntnisse zur Veränderung der Histaminfreisetzung von MC unter UV–Bestrahlung und zum apoptotischen Verhalten der Zellen nach Bestrahlung gewonnen worden.
Der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Versuch evaluierte die Veränderung der Freisetzung von FGF–2 aus humanen MC nach Bestrahlung. Humane MC wurden mit Licht verschiedener Wellenlänge bestrahlt und anschließend kultiviert. Zu einem späteren Zeitpunkt wurde die Menge an freigesetzten FGF–2 ermittelt, um so auf mögliche Einflüsse durch die Bestrahlung mit UV–Licht schließen zu können. Nach Bestrahlung mit UVA1–Licht sank die Freisetzung von FGF–2 auf bis zu 50%, PUVA1.verstärkte diesen Effekt noch. UVB–Licht hatte dagegen keinen Einfluss.
Als Ursachen für diese reduzierte Freisetzung kommen unterschiedliche Mechanismen in Betracht. UVA1–Licht führt zum oxidativen Stress von Zellen. Dieser kann Schäden der DNA hervorrufen, die Transkription und Replikation unterbrechen und Proteine in Ihrer Struktur zu verändern[99, 110, 111]. So wird der gesamte Stoffwechsel der Zelle negativ beeinflusst. PUVA1–Bestrahlung schädigt den DNA–Doppelstrang, durch die Bildung bestimmter Photoaddukte aus Psoralen und den Pyrimidinbasen der DNA führt[100]. Diese Veränderungen könnten das Ablesen der genetischen Erbinformation stören, was dann zu einer verminderten mRNA Bildung und damit auch zu einer verminderten Synthese des Wachstumsfaktors führt. So kann die verringerte Freisetzung sowohl aus der verringerten Syntheseleistung der Zellen, aber auch durch einen gestörten Freisetzungsmechanismus oder der Schädigung der Proteine resultieren. Beide Wirkungsweisen kommen als mögliche Begründung für die verminderte Sekretion in Betracht. Die Schädigung der Proteine durch UVA1 in der Zelle geschieht innerhalb kürzester Zeit und ihre Auswirkungen sind unmittelbar nachweisbar. Schäden auf DNA–Ebene sind langfristiger und greifen nachhaltiger in den Stoffwechsel der Zelle ein. Sie werden auch durch UVB–Strahlen verursacht. Da aus der Bestrahlung mit UVB–Licht in diesen Versuchen kaum eine Veränderung resultierte, ist die verringerte Freisetzung des Wachstumsfaktors wahrscheinlich nicht primär durch DNA Schäden bedingt.

5.3 Der Einfluss von Proteaseinhibitoren auf FGF–2 und MC

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Die MC enthält eine Fülle verschiedener Mediatoren. Zu diesen Substanzen gehören auch die Tryptase und Chymase. Sie aktivieren und inaktivieren Entzündungsmediatoren und werden zum Teil für den bei chronischen Erkrankungen erforderlichen Gewebeumbau verantwortlich gemacht. Sie gehören zu der Stoffgruppe der Proteinasen und bauen Proteine enzymatisch ab. Deshalb ist denkbar, dass auch FGF–2 durch sie verdaut wird und damit die Versuchsergebnisse verändert werden. Um auszuschließen, dass die Messwerte durch solche enzymatischen Prozesse beeinflusst werden, wurden MC mit Proteaseinhibitoren inkubiert, stimuliert und anschließend die FGF–2–Synthese und –Freisetzung gemessen. Die Vorversuche zum Verhalten der Zellen auf die Proteaseinhibitoren wurden mit HMC–1–Zellen, einer Mastzelllinie, durchgeführt. Es wurde die Proliferation und die Zellgröße der Zellen beurteilt mit dem Ergebnis, dass die Inhibitoren in Abhängigkeit von der Konzentration beides verringern. Erst bei einer Verdünnung von 1:400 blieben Zahl und Größe der Zellen nahezu unbeeinflusst. Daher wurde mit dieser Konzentrationen in den weiteren Versuchen gearbeitet. Die Ergebnisse zeigen bei allen mit Proteaseinhibitoren inkubierten Proben (sowohl bei den mit SP stimulierten als auch bei den unstimulierten Proben) deutlich verringerte FGF–2–Konzentrationen im Überstand und in den Zelllysaten. Die zelleigenen Proteasen scheinen also das FGF–2 nicht wieder abzubauen. Dabei ist wahrscheinlich von Bedeutung, dass FGF–2 als Komplex an Heparin und Chondroitinsulfat gebunden vorliegt, wodurch es vor dem enzymatischen Abbau geschützt wird. Zu diesem Ergebnis muss aber kritisch angemerkt werden, dass durch die Proteaseinhibitoren scheinbar der gesamte Stoffwechsel der Zelle verändert wird (verringerte FGF–2–Synthese), und damit nur bedingt von einem physiologischen Verhalten der MC ausgegangen werden kann.


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27.07.2006