Materialien

Reagenz

Hersteller

AB Serum

Biotest

Amphotecerin B

Biochrom KG

Basal–Iscove Medium

Biochrom KG

Bovines Serum Albumin

Sigma // Serra

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)

Merck

Fetal Calf Serum (FCS)

Biochrom AG

Humanes Serum Albumin

Sigma

L–Glutamin

Biochrom KG

PBS Ca/Mg

Biochrom KG

PBS w/o Ca/Mg

PAA Laboratories GmbH

Toluidinblau (0,1% in 0,5 N HCl–Lösung)

Sigma

Tryptanblaulösung (0,18% in PBS w/o)

Seromed

Tabelle 5: Reagenzien für die Zellkultur

Reagenz

Hersteller

Perchlorsäure (HCLO₄)

Merck

Pipes

Sigma

o–Phthaldialdehyd (OPDA)

Sigma

8–Methoxypsoralen (Meladinine 0,3%)

Galderma

Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) für FGF–2

R&D Systems

Magermilchpulver

Kaisers

Kaisers Glycerine

Merck

Tabelle 6: Weitere Reagenzien

Enzym

Hersteller

Collagenase Typ I

Worthington Biochemical Corporation

Dispase 1

Roche Molecular Biochemicals

DNase 1

Boeringer Mannheim

Hyaluronidase Type I–S

Sigma

Tabelle 7: Enzyme

Antikörper / Stimulans

Hersteller

YB₅B₈ (mouse.IgG₁–anti–human–CD117)

L. Ashman, Adelaide, Australien

Microbeads (goat–anti–mouse IgG)

Miltenyi Biotech

mouse–IgM–anti–human–IgE FC Fragment (anti–IgE)

Calbiochem

Anti–FGF–2

R&D Systems

Ca–Ionophore (23187)

Calbiochem

Interleukin 4

Tebu–Peprotec

Interleukin 6

Tebu–Peprotec

Interleukin 8

Calbiochem

PMA

Sigma

Staphylococcus aureus Enterotoxin B (SEB)

Sigma

Substanz P

Sigma

Stem Cell Factor (SCF)

Tebu–Peprotec

Tabelle 8: Antikörper zur Aufreinigung und Stimulierung der Mastzellen

Die Verbrauchsmaterialien wie zum Beispiel Reaktionsgefäße und Pippetenspitzen stammen von den Firmen Falcon, Eppendorf, Sarstedt und Greiner.

Reagenzien

Hersteller

β–Mercaptoethanol

SIGMA

RNeasy Mini Kit

QIAGEN GmbH

abs. Ethanol

MERCK

Distilled Water (DNAse–free, RNAse–free)

GIBCO BRL

RNase–Free DNAse Set (50)

QIAGEN

1 Strand cDNA Synthesis Kit for RT–PCR

Roche

PCR Master

Roche

100bp DNA–Leiter

GIBCO BRL

Glycerol (87%)

MERCK

Bromphenol Blue Na–salt

SERVA Feinbiochemica GmbH & Co

Agarose ultrapur (Electrophoresis Grade)

GIBCO BRL

Ethidium Bromide Solution

GIBCO BRL

Tabelle 9: Reagenzien für die Polymerase–Kettenreaktion (PCR)

Gerät

Hersteller

Histaminautoanalyser

Borgwaldt Technik

MACS Separation Columns

Miltenyi Biotech

Metallfilter (300, 70, 40 μm)

Sigma

Neubauer Zählkammer

Neolab

Nylongasefilter (30 μm)

Miltenyi Biotech

Petrischalen

Greiner

UVA₁–Lichtquelle

Konstruiert vom „Krankenhaus Technik Service“ der Charité

UV 800 (UVB–Lichtquelle)

Waldmann

MRX Microplate Reader

Dynatech Laboratories

Microtome

Bright

Gel–Elektrophoresekammer

Bio–Rad Laboratories GmbH

Tabelle 10: Geräte

Bereich

UVB

(in mJ / cmxs)

UVA ₁

(in mJ / cmxs)

UVA

315–400 nm

0,6918

0,00538

UVA ₁

340–400 nm

0,1734

0,005378

UVB

280–315 nm

0,758

6 x 10

UVC

100–280 nm

0,0051

3,2 x 10

Tabelle 11: Leistungsbereich der UVB– und der UVA₁–Lichtquelle

Puffer Pipes–Stock–Puffer (10x)

Piperazine–N,N’–bis (2–ethanesulfonic–acid)
69,3 g NaCl (1,19 M), 76 g Pipes (Na–Salz) (250 mM) und 3,85 g KCl (49,98 mM) mit aqua dest. ad 1000 ml
pH–Wert mit NaOH auf 7,4 eingestellt

Pipes–Albumin–Glukose + Calcium + Magnesium (PAG–CM)

Pipes–Stock–Puffer (10x) mit Aqua dest. 1 :10 verdünnt
0,003% Humanes Serumalbumin
0,1% Glucose
3 mM CaCl₂, 3 mM MgCl₂

MACS–Puffer

PBS w/o Ca/Mg
0,5% Bovine Serum Albumin
2 mM EDTA

RLT–Puffer

1 ml RLT Buffer
10 μl β–Mercaptoethanol

Medien 24 h–Medium für die Mastzellkultur

Basal–Iscove–Medium (500 ml)
10% FCS ( hitze–inaktiviert)
1% Penicillin/Streptomycin, Amphotericin B (1,25 mg)
4 mM L–Glutamin
α–Monothioglycerol (10 μl)
3 mM Ca (750 μl 1M CaCl₂)
1,5 mM Mg (1100 μl 1M MgCl₂)

Stimulationsmedium

Basal–Iscove–Medium (500 ml)
0,1 % BSA (0,5 g)
1% Penicillin/Streptomycin, 2,5 μg Amphotericin B (1,25 mg)
4 mM L–Glutamin
α–Monothioglycerol (10 μl)
2,8 mM Ca (660 μl 1M CaCl₂)
1,3 mM Mg(200 μl 1M MgCl₂)

Transportmedium

Basal–Iscove–Medium (500 ml)
1 % FCS hitze–inaktiviert
1% Penicillin/Streptomycin, 2,5 μg Amphotecerin B (1,25 mg)

Dispergiermedium

500 ml PBS
1 % FCS hitze–inaktiviert
1% Penicillin/Streptomycin, 2,5 μg Amphotecerin B (1,25 mg)
5 mM MgSO₄(2,5 ml 1M MgSO₄)

Methoden

Abbildung 1: Zusammenfassung der verwendeten Methoden

Die Isolierung der Mastzellen

Die in den Versuchen verwendeten MC wurden aus der Dermis menschlicher Haut gewonnen. Diese Hautpräparate stammten in erster Linie von Mammareduktionsplastiken. Bei einigen Versuchen wurde auch Vorhaut verwendet. Die Isolierung der Mastzellen dauerte insgesamt drei Tage und ist im Folgenden dargestellt. Alle Verbrauchsmaterialien wie beispielsweise Falcons und Petrischalen waren vor Gebrauch steril verpackt. Arbeitsgeräte wie Pinzetten und Scheren wurden über Nacht hitzesterilisiert. Siebe, Gläser, Pipettenspitzen u.ä. wurden im Autoklaven sterilisiert.

Schneiden der Haut

Die Haut wurde in den kooperierenden Kliniken entnommen und am selben Tag in einem Transportmedium (siehe Medien) in das Labor gebracht. Dann wurde sie in kleine, etwa 1mm breite Streifen geschnitten. Diese wurden über Nacht im Kühlschrank bei 4°C in Dispase (0,5 g Dispase/ 1 ml PBS) eingelegt. Dadurch löste sich die Basalmembran zwischen Dermis und Epidermis. Die Epidermis wurde am Folgetag mechanisch von der Dermis getrennt. Das war notwendig, weil die MC später über den von MC exprimierte Rezeptor CD117 (c–Kit) aufgereinigt wurden. Dieser Oberflächenmarker ist auch bei Melanozyten vorhanden, welche ausschließlich in der Epidermis vorkommen und durch dieses Vorgehen eliminiert wurden.

Dispergieren der Haut

Zuerst wurde die Epidermis mit einer Pinzette von der Dermis gezupft. Die Dermis wurde dann mit einer Schere gründlich zerkleinert und anschließend in eine Flasche mit Dispergiermedium gegeben. Dann wurde das Gewebe in einem Schüttelwasserbad bei 37°C dispergiert. Durch die Enzymlösung lösten sich die Zellen aus dem Gewebeverband. Nach etwa einer Stunde wurde der Flascheninhalt durch zwei Siebe filtriert (200μm und 40μm). Die bis dahin aus dem Gewebeverband gelösten Zellen befanden sich nun in der Flüssigkeit und konnten durch zentrifugieren von dieser getrennt werden. Während die Enzymlösung zusammen mit der restlichen Haut zurück ins Wasserbad kam, erfolgte die Weiterverarbeitung der schon gewonnenen Zellen. Die Zellen wurden insgesamt dreimal mit PBS gewaschen. Danach wurden die Erythrozyten durch eine hypotonen Schock mit 0,2% NaCl–Lösung lysiert, mit anschließender Wiederherstellung der Isotonie durch Zugabe von 1,6% NaCl. Anschließend wurden die Zellen mit Toluidin und Tryptanblau angefärbt. Die basophilen Granula der MC färben sich mit Toluidinblau lila/violett so dass identifiziert und gezählt werden konnten. Mit Trypanblau wurde eine Vitalitätsfärbung gemacht, so konnte die Zahl der toten Zellen und die Gesamtzellzahl ermittelt werden. Über Nacht wurden ca. 5x10 Gesamtzellen in 50ml 24h–Medium im Brutschrank kultiviert . Nach weiteren 1,5 Stunden im Wasserbad wurde mit dem noch im Schüttelwasserbad befindlichen Rest der Dermis gleichermaßen verfahren.

Aufreinigung der Mastzellen

Am dritten Tag erfolgt die Aufreinigung der MC über den o.g. Rezeptor CD117. Die Zellen wurden möglichst gründlich aus den Kulturflaschen gespült und mit kaltem MACS–Puffer zweimal gewaschen. Nach erneuter Bestimmung der Gesamtzellzahl folgte die Inkubation mit dem Primärantikörper YB₅B₈. Die Menge der verwendeten Lösungen richtete sich nach der Gesamtzellzahl. Die Inkubation fand bei 4°C im Kühlschrank statt. YB₅B₈ist ein monoklonaler Mouse–Antikörper, welcher spezifisch an den von MC exprimierten Rezeptor CD117 bindet. Nach 20 bis 30 Minuten wurden die Zellen gewaschen, worauf die Inkubation mit dem Sekundärantikörper erfolgte. Hierbei handelte es sich um einen an magnetische Beads gekoppelten Goat–Anti–Mouse–Antikörper, der an den Primärantikörper bindet. So war es möglich, die Zellen in MACS–Trennsäulen, die sich in einem magnetischen Feld befinden, abzufangen und diese nach dem Entfernen der Säule aus dem Magnetfeld zu eluieren. Mit diesem Verfahren wurde eine Reinheit von 80–95% erreicht, die Ausbeute betrug 50–60%.

Histaminfreisetzung mit Histamin–Analyser

Um die gleichbleibende Reaktionsfähigkeit der MC zu kontrollieren, wurde stichprobenartig die spontane und stimulierte Histaminfreisetzung der MC gemessen. Ein Teil der Zellen wurde gewaschen, in 1800μl PAG–CM Puffer resuspensiert und in folgende Ansätze geteilt:

Zellzahl

Stimulans

Messung

(1) 6x 10MC

+ 200μl Perchlorsäure

Gesamthistamingehalt

(2) 4x 10MC

+ 200μl PAG–CM–Puffer

Spontane Histaminfreisetzung

(3) 4x 10MC

+ 200μl anti–IgE

Histaminfreisetzung nach a–IgE–Stimulation

(4) 4x 10MC

+ 200μl 30µM SP

Histaminfreisetzung nach SP Stimulation

Tabelle 12: Versuchsaufbau Histaminfreisetzung

Die Ansätze wurden anschließend im Schüttelwasserbad bei 37°C inkubiert. Nach 30 Minuten wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 600μl kaltem PAG–CM gestoppt. Danach wurden die Zellen vom Überstand durch zentrifugieren getrennt. Das Histamin im Überstand konnte mit dem Analyser gemessen werden. Für die Versuche wurden ausschließlich Zellen verwendet, die ein normales Verhalten hinsichtlich ihrer Histaminfreisetzung zeigten.

Die Stimulierung der MC mit klassischen MC–Liberatoren und proinflamatorischen Zytokinen

Um den Einfluss verschiedener Substanzen auf die Synthese und die Freisetzung von FGF–2 zu untersuchen, wurden Stimulationen der aufgereinigte MC mit verschiedenen Substanzen durchgeführt. Die MC wurden nach der Aufreinigung in einem speziellen Stimulationsmedium für eine Nacht im Brutschrank kultiviert. Am nächsten Tag wurde die Zellzahl neu bestimmt und die Zellen in frischem Stimulationsmedium aufgenommen. Die Zellmenge wurde auf 1x10MC/ml Medium eingestellt. Die Mindestreinheit der MC für Stimulationsversuche betrug 90%. Die Stimulation der Zellen erfolgte auf einer 96–well Platte. Es wurden Dublikatansätze mit je 200μl gebildet, die mit der entsprechenden Substanz inkubiert wurden. Für die Stimulation wurden folgende Substanzen gewählt:

Stimulation mit klassischen MC–Liberatoren und Substanz P:

Ca–Iono (A23187, Calcium–Ionophore): Hierbei handelt es sich um ein Antibiotikum, welches in der Konzentration von 0,2μM verwendet wurde. Eine beschriebene Wirkungsweise von Ca–Iono ist die Induktion der MC–Degranulation
Phorbol–12–Myristat–13–Azetat (PMA): PMA ist ein Wirkstoff der die Synthese verschiedenster Proteine in Zellen induziert. Es wurde in der Konzentration 20ng/ml verwendet.
anti–IgE: Dies ist ein physiologischer Botenstoff, der zum sogenannten Crosslinking des FcεRI Rezeptors auf der MC–Oberfläche führt und damit die Degranulation der MC einleitet. In Vorversuchen wurde die optimale Konzentration zur Stimulation austitriert (1:20 000).
Substanz P: es handelt sich um ein Neurokinin, dass zur Degranulierung von MC führt. Die Stimulation mit Substanz P erfolgte in den Konzentrationen 15, 30 und 60μM.

Stimulation mit proinflammatorischen Zytokinen und SEB:

Als proinflammatorische Zytokine wurden IL–4, IL–6, IL–8 und der Wachstumsfaktor TGFβ verwendet. Dies sind proinflamatorische Zytokine, die gewählt wurden, da sie beim Ablauf von Wundheilung und Entzündungsreaktionen eine Rolle spielen. Mit diesen Substanzen erfolgten getrennte Stimulationen. Die biologische Aktivität von IL–4 liegt zwischen 0,05–2ng/ml. Die Stimulationen in diesen Versuchen erfolgten bei 0,5, 5 und 50ng/ml. IL–6 wurde in Verdünnungen von 1, 10 und 20ng/ml verwendet. Die biologische Aktivität liegt bei 0,2–8ng/ml. IL–8 hat seine biologische Aktivität bei 0,15–3ng/ml und wurde in den Konzentrationen 100, 200 und 400ng/ml. Und TGFβ wurde in Konzentrationen von 150, 300 und 600pg/ml verwendet, wobei die biologische Aktivität mit 20–600pg/ml angegeben wird. Als letztes wurde mit SEB, einem Bakterientoxin vom Staphylococcus aureus stimuliert. Hier wurden die vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen von 20μg/ml und 100μg/ml verwendet.
Die Zellen wurden für 24 Stunden mit den Simulantien inkubiert und während dieser Zeit im Brutschrank kultiviert. Anschließend wurden die Überstände abzentrifugiert, und im Verhältnis 1:2 verdünnt. Die Zellen wurden in 100μl 2% Triton–Puffer lysiert. Die Pellets und Überstände wurden in Aliquots zu je 110μl bei –80°C gelagert. In den Überständen und den Pellets wurde die vorhandene Menge FGF–2 mit der ELISA–Technik ermittelt.

Die Stimulierung der MC für die PCR

Für die Versuche, bei denen m–RNA gewonnen wurde, wurden besonders reine MC–Fraktionen verwendet. Die Mindestreinheit betrug hierbei 95%. Die Zellen wurden mit SP (30μM) bzw. TGFβ (150pg/ml) stimuliert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet, in RLT–Puffer lysiert und bis Weiterverwendung eingefroren. Zusätzlich wurde jeweils eine nicht–stimulierte Kontrollprobe entnommen. Die Zeitdauer der Stimulation betrug bei SP 3, 6 und 8 Stunden, bei TGFβ 2, 4, 6, 8 und 10 Stunden

Zeitkinetik mit Substanz P

Um den zeitlichen Verlauf der FGF–2 Freisetzung zu beurteilen wurden Zeitkinetiken durchgeführt. Es wurde jeweils einer mit SP (30μM) stimulierten MC–Probe eine nicht stimulierte Kontrollprobe gegenübergestellt. Die Inkubation erfolgte zu gleichen Bedingungen wie in Abschnitt 3.2.3. Die Zellen wurden nach Zugabe von SP 30µM im Brutschrank kultiviert und nach 0, 4, 6, 8 und 24 Stunden geerntet. Das nach dieser Zeitdauer freigesetzte FGF–2 wurde durch die Analyse der Überstände durch ELISA ermittelt.

Präinkubation mit Interleukin 4

In diesem Versuch sollte der Einfluß einer Präinkubation mit IL–4 auf die FGF–2–Synthese und –Freisetzung von MC untersucht werden. Dazu wurden verschiedene Versuchsansätze gewählt. Ein Teil der MC wurde zu Versuchsbeginn mit IL–4 (Gruppe B) präinkubiert, die Kontrollgruppe (Gruppe A) dagegen nicht. Diese beiden Gruppen wurden später zu bestimmten Zeitpunkten (nach 6 bzw. 18 Stunden) mit a–IgE bzw. SP(30μg/ml) inkubiert. So ergeben sich verschiedene Versuchsansätze die in der Abb. 3 dargestellt werden.

Abbildung 2: Versuchsansätze für den Versuch 3.2.5

Die Gesamtdauer des Versuches betrug 24 Stunden. Nach diesem Zeitraum wurden die Überstände abgenommen und Ihr Gehalt an FGF–2 ermittelt. Hierfür wurde der in den Abschnitt 3.2.7 beschriebene ELISA verwendet.

Abbildung 3: Darstellung des Versuchsablaufes von Versuch 3.2.5. Links befindet sich eine Skala, die den zeitlichen Ablauf des Versuchs darstellt, die nicht farbig unterlegten Felder zeigen Proben, denen zum gezeigten Zeitpunkt keine weiteren Zusätze hinzugefügt wurden. In die anderen Feldern ist das zugegebene Reagenz eingetragen, nach insgesamt 24 Stunden wurden die Proben analysiert.

Bestrahlung der MC mit UVB, UVA₁ und PUVA₁

Für die Bestrahlung wurden 3x10MC in 600μl Stimulationsmedium aufgenommen. Diese MC wurden in offenen Petrischale unter die entsprechenden Lichtquellen gestellt. Die Lichtquelle für die UVB–Bestrahlung stammt von der Firma Waldmann, Villingen–Schwenningen (Typ UV 800) und ist mit 10 Leuchtstoff–Röhren Typ TL12 ausgestattet. Die UVA₁–Bestrahlung erfolgte mit einer Lichtquelle die vom Technik–Service der Klinik hergestellt wurde. Sie ist mit einer UVA₁ Leuchtstoff–Röhre (Typ TL–10) der Firma Philips Beleuchtung, Hamburg ausgerüstet. Die Bestrahlungsdosis betrug für UVB: 75 mJ /cm (entspricht 99s Bestrahlungsdauer), für UVA₁: 15 J/cm (entspricht 46min und 30s Bestrahlungsdauer) und für PUVA₁:5 J/cm (entspricht 15min und 30s Bestrahlungsdauer). Der Abstand zur Bestrahlungsquelle betrug bei der UVB–Bestrahlung 50cm, bei der UVA₁–und PUVA₁–Bestrahlung 5cm. Nach der Bestrahlung wurden die Zellen für weitere 24 Stunden im Brutschrank kultiviert. Anschließend wurde in den Überstände mittels ELISA–Technik der FGF–2 Gehalt bestimmt.

Enzymimmunoassay (ELISA)

Das Protein FGF–2 wurde in dieser Arbeit mit Immunoassays der Firma R&D Systems nachgewiesen und quantitativ bestimmt. Dieser ELISA funktioniert nach der herkömmlichen Sandwich Enzym Immunoassay Technik.

100µl der Reaktionsflüssigkeit und 100µl der Analyseproben bzw. der Standardproben wurden auf die im ELISA–Kit vorhandenen 96–well–Platte wie in der Anleitung beschrieben verteilt. Die nachzuweisende Substanz (in diesem Fall FGF–2) wird durch einen Antikörper gebunden, der am Boden der wells fixiert ist. Um bei der späteren Analyse eine genaue Zuordnung der Messwerte zu ermöglichen wird dieser Arbeitschritt durch ein sogenanntes Pipettierschema protokolliert.
Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden werden die Proben wieder aus den wells entfernt und die Platte mit dem im Kit enthaltenen Wasch–Puffer gewaschen. Anschließend werden 200µl einer weitere Reaktionsflüssigkeit auf der Platte verteilt. Diese enthält einen zweiten spezifischer Antikörper gegen FGF–2, der mit einem Enzym markiert ist. Es folgt eine nächste Inkubationsperiode von 2 Stunden.
Nach erneutem Waschen werden 200µl eines farblosen Substrates zugegeben, welches von dem gebundenen Enzym in ein farbiges Produkt umgewandelt wird. Die Reaktion wird nach 30min durch Zugabe von 50µl Säure (pH–Wert Verschiebung) abgebrochen. Je größer die Menge an Enzym, desto stärker wird die Lösung eingefärbt.
Im Photometer (MRX Microplate Reader/Dynatech Laboratories) wird anschließend die optische Dichte der Lösung ermittelt. Die Quantifizierung erfolgt durch den Vergleich mit einer Standardreihe.

Die Standardreihe des ELISA’s der Firma R&D Systems besteht aus Proben mit einem FGF–2–Gehalt von 640, 320, 160, 80, 49, 20, 10 und 0pg/ml. Aus diesen Standardproben berechnet der Computer eine Standardkurve, mit der die zu analysierenden Proben verglichen werden.

Abbildung 4: Schematische Darstellung eines Enzymimmunoassays
1. Das FGF–2 wird durch die am Boden der wells befindlichen Antikörper gebunden
2. Zugabe der mit dem Enzym markierten Antikörper
3. Darstellung der enzymatischen Farbreaktion nach Zugabe der Reaktionslösung

Semiquantitative Bestimmung von FGF–2 m–RNA durch die Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT–PCR)

Die PCR wurde erstmalig 1984/1985 durch Kary B. Mullis, Kalifornien, als Verfahren beschrieben. Sie beruht auf dem helikalen Prinzip der DNA und ermöglicht die Amplifizierung beliebiger DNA–Abschnitte und damit den Nachweis bestimmter Gensequenzen bzw. auch ganzer Gene. Heute ist die RT–PCR das meistverbreitete Verfahren zur Charakterisierung und zum quantitativen Nachweis von mRNA in verschiedenen Proben. Bei einer PCR oder RT–PCR werden selektiv DNA Sequenzen vervielfältigt. Vor der PCR muss die RNA aus dem vorhandenen Zellmaterial gewonnen werden. Zuerst wird die RNA aus den Zellen isoliert, dann von den Resten genomischer DNA gereinigt und abschließend in c–DNA überschrieben.
Im ersten Schritt der PCR wird der DNA–Doppelstrang auf 94°C erhitzt und so in Einzelstränge aufgespalten (Denaturierung). Nach Abkühlung auf 60°C binden an diese Einzelstränge die zugegebenen Primer (= synthetische Oligonukleotide für den Start der PCR) und verhindern damit eine Rückbildung der alten Doppelstrangstruktur. Dieser Schritt der PCR wird als Annealing bezeichnet. Durch die DNA–Polymerase (Taq–Polymerase aus dem hitzestabilen Bacterium Thermophilus aquaticus) erfolgt nun die Synthese einer Kopie der ursprünglichen DNA-Sequenz vom freien 3`–OH–Ende aus. Im weiteren Verlauf dienen sowohl die ursprüngliche DNA als auch die Kopie DNA als Template (= Matrize zur weiteren Kopie), so dass schließlich durch die Wiederholung obiger Schritte eine exponentielle Vermehrung der ursprünglich vorhandenen DNA-Sequenz erfolgt.

Abbildung 5: Schematische Darstellung einer PCR

RNA–Extraktion / DNase Verdau

Für die RT–PCR wurde zuerst die gesamte RNA der stimulierten und nicht–stimulierten MC extrahiert. Dafür wurde der RNeasy Kit der Firma Quiagen verwendet. Die Zellen wurden nach unterschiedlichen Inkubationszeiten sofort in 350µl Lysis Puffer aufgenommen und durch Zentrifugation über eine Shreddersäule homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit 350µl 70% Ethanol versetzt und auf Nucleinsäure bindende spezifischen Säulen beladen. Die Säulen wurden bei 10000 rpm 1 Minute zentrifugiert und mit 700µl RW-Puffer durch kurze Zentrifugation gewaschen. Nach dem ersten Waschvorgang wurden die RNA–Proben auf den Säulen mit 27 Unit DNAse bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert. Anschließend wieder mit 350µl RW1 Puffer gewaschen. Bei den weiteren Reinigungsschritten wurden die Säulen zweimal mit 500µl RPE Puffer gewaschen. Die Säulen wurden zu Entfernung der Restflüssigkeit 2 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Die RNA wurde aus den Säulen mit 50µl RNAse freien Wasser eluiert. Weitere Reinigung der RNA von der DNAse erfolgte durch eine Phenol–Chloroform-Isoamylalcohol Extraktion der Proben. Die Phenol–Phase wurde durch Zentrifugation der Proben über ein Phase–Lock System von der wässrigen Phase quantitativ getrennt. Anschließend wurde die RNA aus der wässrigen Phase durch Zugabe von 3 M K–Acetat und einem Co–präzipitation–System isoliert, nach Waschen mit Ethanol getrocknet und in 30µl Wasser aufgenommen. Gesamtmenge der RNA wurde spektrophotometrisch mit UV–Absorption bei 260 nm bestimmt. Auf einem mit Ethidiumbromid angefärbten 1,5 % ige-Agarosegel wurde die Qualität der RNA untersucht.

cDNA Synthese und PCR

Die Transkription der RNA in cDNA wurde mit dem 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Fa.Roche) für RT–PCR (AMV) wie folgt durchgeführt:
Es wurde ein Mix aus 2,0µl 10x Reaction Puffer, 4,0µl 25mM MgCl2, 2,0µl Desoxynucleotide–Mix, 2,0µl Random Primer, 1,0µl RNase Inhibitor, 0,8µl Reverse Transkriptase und abhängig von der RNA Konzentration ca. 5µl RNA Proben hergestellt und mit sterilem Wasser auf 20µl Gesamtvolumen aufgefüllt. Die Proben wurden zuerst für 10min bei Raumtemperatur und anschließend für eine Stunde bei 42°C inkubiert. Während der Inkubation bindet der Primer an das RNA–Template. Die reverse Transkription mit cDNA Bildung findet während der zweiten Inkubation statt. Die Synthese erfolgt an einem Primer in 5´ –3´ Richtung beginnend nach dem Prinzip der komplementären Basenpaarung. Die Denaturierung der AMV reverse Transkriptase wurde durch Erhitzen der Proben auf 95°C erreicht. Anschließend wurden die Proben auf 4°C gekühlt und bis Weiterverarbeitung bei –30°C aufbewahrt. Die einzelsträngige cDNA wurde mit PCR unter Benutzung von spezifischer Primer amplifiziert. Durch die RT–PCR kann man aus geringen Mengen cDNA eine 106–107 fache Ampflizierung der untersuchten Genes erreichen. Um eine relative Quantifizierung des Transkriptionsproduktes vornehmen zu können, wird von jeder Probe eine PCR mit einem Zielgen durchgeführt, das konstant, das heißt weitgehend unabhängig von äußeren Faktoren exprimiert wird. Diese Gene nennt man Haushalts–Gene (Housekeeping–Gen). In diesen Versuchen wurde mit den Genen GAPDH (Glycerinaldehyd–3–phosphatdehydrogenase) und β–Actin gearbeitet. Amplifiziert wurde das abgeschriebene Produkt durch PCR in einem Endvolumen von 50µl mit einem Master-Mix (Fa. Roche) 25µl und spezifischen Primern 2,5µl für Gene von ß-Actin, GAPDH und FGF–2.

Für die PCR von FGF–2 wurden folgende Primer benutzt:
Forward Primer: 5’ ACG AGT GTG TGC TAA CCG TTA 3, Reverse Primer:5’ GCA GAC ATT GGA AGA AAA AAG 3’: Die Grösse der PCR-Produkte betrug 234 bp

Für die PCR von GAPDH wurden folgende Primer benutzt:
Forward Primer: 5’ GAT GAC ATC AAG AAG GTG GTG 3’; Reverse Primer:5’ GCT GTA GCC AAA TTC GTT GTC 3’: Die Grösse der PCR-Produkte betrug 190 bp

Für die PCR von ß-Aktin wurden folgende Primer benutzt:Forward Primer: 5’ CCT TCC TGG TGG AGT CTT 3’. Reverse Primer:5’ AAT CTC ATC TTG TTT TCT GCG3’. Die Grösse der PCR-Produkte betrug 400 bp.

Die PCR wurde in einem PCR Gerät der Fa. MWG durchgeführt.
Die PCR von FGF–2 wurde nach folgendem PCR-Programm durchgeführt: 5 min 94°C, 39 Zyklen 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 65°C, 45 sec 72°C, anschließend 10 min bei 72°C.
Die PCR von GAPDH wurde nach folgendem PCR-Programm durchgeführt: 5 min 94°C, 25 Zyklen 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 58°C, 45 sec 72°C, anschließend 10 min bei 72°C.
Die PCR von ß-Actin wurde nach folgendem PCR-Programm durchgeführt: 5 min 94°C, 25 Zyklen 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 58°C, 45 sec 72°C, anschließend 10 min bei 72°C.

Gelelektrophorese und densitometrischen Analyse

Abschließend erfolgt die Auftrennung der PCR–Produkte durch Gel–Elektrophorese. Die DNA–Moleküle bewegen sich aufgrund ihrer elektrischen Ladung im elektrischen Gleichstromfeld. Dieses kann optisch dargestellt werden, indem dem Elektophorese–Gel Ethidiumbromid (EtBr) zugefügt wird. Dieses Agens lagert sich an die DNA so dass die Banden nach Bestrahlung mit UV–Licht fluoreszieren. Dieses wurde zur Dokumentation photografiert. Für die densitometrische Auswertung wurden die Photos eingescannt und mit einer speziellen Software hinsichtlich Ihrer optischen Dichte ausgewertet. Die DNA–Menge des Zielgens kann anhand der Menge des Housekeeping–Gens in den Proben berechnet werden, indem die Transkriptmenge des Ziel–Gens auf die Transkriptmenge des Haushalts–Gens normiert wird.