Erste Ergebnisse wurden anhand der Stimulation von MC mit PMA und Ca–Iono gewonnen. Nach Stimulation mit PMA enthielt die Probe 92% FGF–2 verglichen mit der Kontrollprobe. Nach Inkubation mit Ca–Iono stieg der intrazelluläre Gehalt geringfügig auf 105%. Bei der mit beiden Stimulantien inkubierten Probe war dagegen ein auf 85% verringerter Gehalt an FGF–2 feststellbar. Bei der statistischen Überprüfung der Ergebnisse zeigten sich die Unterschiede als nicht signifikant.
Weiter wurden Versuche mit den physiologischen Stimuli a–IgE und SP durchgeführt. Die Stimulierung mit a–IgE hatte einen Anstieg des intrazellulären Gehalts auf 105% zur Folge. Bei SP war bei einer Wirkungskonzentration von 15μM ein Anstieg des Gehalts auf fast 140% zu beobachten, bei 30µM ein Abfall des Gehalts auf 76% (p<0,15)und bei 60µM SP wurde genauso viel FGF–2 nachgewiesen, wie in der Kontrollprobe. Es ist keine direkte Dosis–Wirkungskurve ersichtlich, da bei einer Konzentration von 60μM eine mittlere, bei 30μM die kleinste und bei 15μM die größte Menge an FGF–2 zu messen war. Auch hier waren die Unterschiede statistisch nicht signifikant.

Weiterhin wurde die Wirkung verschiedener Zytokine auf den intrazellulären FGF–2–Gehalt untersucht. Für die Stimulationen wurde IL–4, IL–6, IL–8 und TGFβ verwendet. Die in diesen Versuchen verwendeten Zytokine wurden zusammenfassend als proinflammatorisch beschrieben, da sie alle bei entzündlichen Veränderungen eine Rolle spielen. So ist IL–6 an der Produktion von Akut–Phase–Proteinen beteiligt und IL–8 chemotaktisch für neutrophile Granulozyten, die als erste Immunabwehrzellen den Ort einer Entzündung erreichen. TGFβ wirkt entzündungshemmend, was durch Versuche mit Knock–out–Mäusen gezeigt wurde.
Die mit Interleukin 4 stimulierten Proben zeigten einen deutlichen Anstieg des FGF–2–Gehalts auf bis zu 208%. Die vorliegenden Unterschiede sind nicht statistisch signifikant.

Weiterhin wurde die FGF–2 m–RNA Expression zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Stimulation mit SP 30µM bzw. TGFß 150pg/ml unersucht. Die relative Quantifizierung erfolgte durch den Vergleich des DNA–Produktes mit den Housekeeping–Genen GAPDH und ß–Actin.
Die Stimulation mit SP zeigte eine Hochregulation der mRNA–Expression schon nach 3 Stunden; auch nach 6 Stunden war diese noch erhöht. Nach 8 Stunden sank die Expression, es wurde weniger FGF–2 transkribiert als in der unstimulierten Kontrollprobe. Auch in den mit TGFβ inkubierten Proben konnte eine Hochregulierung der FGF–2–Expression beobachtet werden. Die maximale Expressionsrate vollzog sich nach 3–4 Stunden, sank dann langsam wieder und glich nach 10 Stunden wieder der Expressionsrate der Kontrollprobe.
Es handelt sich bei der Darstellung um einen exemplarischen Einzelversuch, aus diesem Grund konnte keine statistische Auswertung erfolgen.

Abbildung 14: PCR nach Stimulation mit SP, Gelelektrophoretische Auftrennung des GAPDH und FGF–2–PCR–Produktes nach Stimulation mit SP (30µM) in einem Agarosegel: 1 Kontrolle nach 3h, 2 SP nach 3h, 3 Kontrolle nach 6h, 4 SP nach 6h, 5 Kontrolle nach 8h, 6 SP nach 8h

Abbildung 15: Expressionsrate von FGF–2 nach Stimulation mit SP, Darstellung der Expression von FGF–2 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation mit SP (30µM) versus einer unstimulierten Kontrollprobe

Abbildung 16: Gelelektrophoretische Auftrennung des β–Actin und FGF–2–PCR–Produktes nach Stimulation mit TGFβ (150pg/ml) in einem Agarosegel: 1 Kontrolle nach 2h, 2 TGFβ nach 2h, 3 Kontrolle nach 4h, 4 TGFβ nach 4h, 5 Kontrolle nach 6h, 6 TGFβ nach 6h, 7 Kontrolle nach 8h, 8 TGFβ nach 8h, 9 Kontrolle nach 10h, 10 TGFβ nach 10h

Abbildung 17: Expressionsrate von FGF–2 nach Stimulation mit TGFβ, Darstellung der Expression von FGF–2 zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation mit TGFβ (150pg/ml) versus einer unstimulierten Kontrollprobe

Klassische MC–Liberatoren führen neben anderen Effekten zur Degranulation von MC. Diese Überlegung spielt eine wichtige Rolle bei der Interpretation der Daten. Nach der Inkubation der Zellen mit den unphysiologischen Stimulantien PMA, PMA + Ca–Iono und Ca–Iono war die Freisetzung von FGF–2 in allen drei Ansätzen im Vergleich zur Kontrollprobe erhöht. Die Stimulation mit PMA hatte eine Steigerung der Freisetzung auf 110% zu Folge, der Unterschied erwies sich statistisch als tendenziell signifikant (p<0,08), auch bei der Stimulierung mit Ca–Iono steigerte sich diese auf 110%. Die gleichzeitige Inkubierung mit beiden Stimulantien erhöhte die Freisetzung schließlich auf 125% (p<0,15). Auch bei den mit a–IgE und SP stimulierten Proben wurde im Überstand mehr FGF–2 gemessen als bei den Kontrollproben. (Abb. 20 und 21) Bei a–IgE betrug die Steigerung auf 115% (p<0,05), bei SP war die Wirkung dosisabhängig. Die höchste Freisetzung erfolgte bei einer Konzentration von 30μM mit einem Anstieg auf 125%. Die Konzentrationen von 60 und 15μM bewirkten einen Sekretionsanstieg auf 120%, wobei die Konzentration von 60μM tendenziell eine stärkere Wirkung zeigte. Die Unterschiede waren jedoch ohne statistische Signifikanz.
Die FGF–2–Freisetzung schien durch die Inkubation mit klassischen MC–Liberatoren und Substanz P beeinflusst zu werden, sie wurde gesteigert. Da die Substanzen wie oben erwähnt zur Aktivierung (Degranulation) der MC führen, ist es möglich, das die Freisetzung bei diesem zellulären Vorgang erfolgt. Diese Überlegung wurde in weiteren Versuchen (Teil 4.4.3 und 4.4.4) dieser Arbeit weiter verfolgt.

Abbildung 20: Darstellung der Freisetzung von FGF–2 nach Stimulation mit PMA und Ca–Iono, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, PMA 20ng/ml = tendentiell signifikant (p<0,08)

Abbildung 21: Darstellung der Freisetzung von FGF–2 nach Stimulation mit a–IgE und SP, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, a-IgE = p<0,05

Aus den Stimulationsversuchen mit den als proinflammatorisch beschriebenen Zytokinen ging hervor, dass nach der Stimulation mehr FGF–2 in den Zellen vorhanden war. Nun sollte auch die Freisetzung des Proteins betrachtet werden, indem die Überstände analysiert wurden. Die Analysen ergaben, dass sich nach den Stimulierungen mit den Zytokinen die Menge des freigesetzten Proteins verringerte.
Nach Inkubation mit Interleukin 4 verringerte sich die Freisetzung auf 70%. Es war eine Dosisabhängigkeit feststellbar. Diese zeigte, dass die größten Effekte durch geringe Konzentrationen von IL–4 hervorgerufen wurden. So wurde die FGF–2–Freisetzung am stärksten bei der Konzentration von 0,5ng/ml gehemmt. (50ng/ml = 85%, 5ng/ml = 80%, 0,5ng/ml = 70%). Die Unterschiede zeigten sich bei der statistischen Auswertung als signifikant.

Abbildung 22: Freigesetztes FGF–2 nach Stimulation mit Interleukin 4, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, Il4 (50, 5, 0.5 ng/ml) = p<0,05

Nach Inkubation mit Interleukin 6 wurde nur 70% FGF–2 freigesetzt, verglichen mit den nicht stimulierten Kontrollzellen. Dieser Unterschied war statistisch signifikant. Auch nach Inkubation mit IL–8 verringerte sich die FGF–2–Freisetzung. Die verschiedenen Konzentrationen von IL–8 hatten kaum Einfluss auf das Ausmaß der Hemmung. Die Freisetzung verringerte sich statistisch signifikant auf 80–70% verglichen mit der FGF–2 Freisetzung der nicht stimulierten Kontrollzellen.

Abbildung 23: Freigesetztes FGF–2 nach Stimulation mit Interleukin 6, n=6, Mittelwert+/-SEM,Ctrl.=100%, Il6 10ng/ml = p<0,05

Abbildung 24: Freigesetztes FGF–2 nach Stimulation mit Interleukin 8, =6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, Il8 = p<0,05

Auch die Inkubation mit TGFβ bewirkte eine Verringerung der FGF–2–Freisetzung. Diese war verglichen mit den Interleukinen etwas weniger stark ausgeprägt und schwankte um Werte zwischen 80% und 90%. Je höher die eingesetzte Konzentration, mit der die Zellen stimuliert wurden, desto stärker wurde die Freisetzung des Proteins beeinflusst. So hemmten 600pg/ml die Sekretion auf 80%, 300pg/ml auf 90% und 150pg/ml schließlich nur auf 92% verglichen mit der unstimulierten Freisetzung der Zellen.

Abbildung 25: Freigesetztes FGF–2 nach Stimulation mit Transforming Growth Factor β, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, TGFbeta 600pg/ml = p<0,05

Die Wirkung von SEB auf die Freisetzung von FGF–2

Auch die mit SEB stimulierten Proben hatten weniger FGF–2 im Überstand als die Kontrollproben. Die Ergebnisse ähnelte den Proben, die mit den Zytokinen stimuliert worden waren. Nach Inkubation mit SEB in einer Verdünnung von 100µg/ml verringerte sich die Freisetzung auf 85%, bei einer Verdünnung von 20µg/ml verringerte sich die Freisetzung auf 80%.

Abbildung 26: Freigesetztes FGF–2 nach Stimulation mit SEB, =6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, SEB 20µg/ml = p<0,05

In diesem Teil der Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, ob MC bei der Degranulation FGF–2 freisetzen. Es wurde eine Zeitkinetik mit stimulierten und nicht stimulierten MC durchgeführt. Die Stimulierung erfolgte mit SP in einer Konzentration von 30µg/ml. Anschließend wurde der FGF–2–Gehalt der Überstände analysiert, um den Verlauf der FGF–2–Freisetzung zu beobachten. Der FGF–2–Gehalt stieg in allen Proben kontinuierlich an. Die Unterschiede waren tendentiell signifikant, bzw. nach 8h signifikant. Dieses zeigte, dass MC permanent FGF–2 sezernieren. Beim Vergleich der beiden Versuchsgruppen zeigte sich, dass die FGF–2 nach der Stimulierung stärker war, als ohne Stimulierung. Dieses Ergebnis bestätigt die Annahme, das MC bei der Degranulation FGF–2 freisetzen. Dies sollte in weiteren Versuchen bestätigt werden.

Abbildung 27: Zeitliche Darstellung der FGF–2–Sekretion von humanen MC mit/ohne SP Stimulation, n=5, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.(Zellen ohne SP/0h)=100%, 8h = p<0,05; 4h, 6h und 24h = tendentiell signifikant (p<0,08) beim Vergleich der stimulierten Probe mit der unstimulierten Probe

Um den Zusammenhang zwischen Degranulation und FGF–2–Freisetzung weiter zu untersuchen erfolgte folgender Versuch. Ihm lagen zwei Hypothesen zu Grunde:
Die FGF–2–Synthese von MC wird durch Stimulation mit IL–4 angeregt.
Die FGF–2–Freisetzung von MC ist nach Stimulation mit a–IgE und SP verstärkt.
Die Versuchsanordnung ist in Abschnitt 3.2.5 dieser Arbeit beschrieben. Es gab insgesamt 10 Versuchgruppen mit unterschiedlichen Stimulierungsprofilen, deren Überstände auf Ihren Gehalt an FGF–2 analysiert wurden, um die Freisetzung zu untersuchen. In den Überständen von den mit a–IgE bzw. SP stimulierten Zellen befand sich mehr FGF–2 als in den Überständen der Kontrollzellen; damit konnten die Ergebnisse aus den vorangegangenen Versuchen bestätigt werden. Lediglich der 18h Wert der mit SP inkubierten Probe wich hiervon ab, da sich hier tendenziell eine leichte Inhibition der FGF–2–Freisetzung um 5% darstellte. Die alleine mit IL–4 inkubierte Probe setzte weniger FGF–2 frei, dies entsprach den Erwartungen. Bei der Betrachtung der FGF–2 Sekretion bei den mit IL–4 präinkubierten Proben zeigte sich, dass die Freisetzung gegenüber den Kontrollzellen erhöht war. Verglich man die Freisetzung der mit IL–4 präinkubierten Zellen mit den nicht präinkubierten Zellen, so bleibt die Freisetzung annähernd gleich. Für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend, jedoch zeigen die Daten für folgende eine signifikante Tendenz mit p<0,15, bzw. 3 positiven Rängen bei n=3: IL–4/a–IgE 6h, IL–4/SP 6h, a–IgE 6 und 18h, SP 6 und 18h

Abbildung 28: Überstände der mit IL–4 präinkubierten MC, n=3, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, Für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend, jedoch zeigen folgende Daten eine signifikante Tendenz mit p<0,15, bzw. 3 positiven Rängen bei n=3: IL–4/a–IgE 6h, IL–4/SP 6h, a–IgE 6 und 18h, SP 6 und 18h

Um den Einfluss von UV–Licht auf die Freisetzung von FGF–2 zu untersuchen, wurden aufgereinigte MC mit Licht verschiedener Wellenlängen und Intensität bestrahlt. Es wurden folgende Versuchsansätze gebildet: 75 mJ/cm UVB, 15 J/cm UVA–1 und 5 J/cm PUVA–1. Nach 24 Stunden Kultivierungszeit wurden die Überstände auf Ihren Gehalt an FGF–2 analysiert.
Die UVB Bestrahlung scheint keinen Einfluss auf die Freisetzung zu haben. Die Freisetzung entspricht der FGF–2–Sekretion der unstimulierten Kontrollgruppe. (100% versus 101,55%) Nach der Bestrahlung mit UVA₁–Licht sank die Freisetzung von FGF–2 dagegen signifikant von 100%l auf 54,55%. Auch die mit PUVA–1 bestrahlten Zellen setzten signifikant weniger FGF–2 frei. (PUVA–1 43,8%).

Abbildung 29: Darstellung des Einflusses von Licht verschiedener Wellenlängen (UVB: 75 mJ/cm, UVA–1: 15 J/cm, PUVA–1: 5 J/cm) auf die Freisetzung von FGF–2, n=6, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, UVA1 und PUVA1 = p<0,05

Anhand dieser Ergebnisse wurde für den folgenden Versuch eine möglichst geringe Konzentration von 1:400 gewählt. Der Versuchsaufbau ähnelt der Zeitkinetik von Abschnitt 4.2. Die Ergebnisse zeigten bei den mit Proteaseinhibitoren behandelten Zellen eine insgesamt verringerte FGF–2 Produktion und Freisetzung. Scheinbar wirkten die Inhibitoren inhibierend auf den gesamten Stoffwechsel der Zellen.

Abbildung 32: Zeitliche Darstellung der Überstände der unstimulierten MC mit bzw. ohne Proteaseinhibitoren, n=3, Mittelwert+/-SEM; Ctrl.=100%, für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend

Abbildung 33: Zeitliche Darstellung der Überstände der mit SP stimulierten MC mit bzw. ohne Proteaseinhibitoren, n=3, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend

Abbildung 34: Zeitliche Darstellung der Zelllysate der unstimulierten MC mit bzw. ohne Proteaseinhibitoren, n=3, Mittelwert+/-SEM, Ctrl.=100%, für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend

Abbildung 35: Zeitliche Darstellung der Zelllysate der mit SP stimulierten MC mit bzw. ohne Proteaseinhibitoren, n=3, Mittelwert+/-SEM, Ctrl=100%, für eine statistische Auswertung ist die Versuchanzahl von n=3 nicht ausreichend