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3.  Theoretische Grundlagen

3.1. Anatomie und Physiologie der Nase

Die Nase ist als Teil des Nasopharynx (Hals-Nasen-Rachenraum) Bestandteil der zuleitenden Atemwege. Der Nase kommt nicht nur die Aufgabe der Zu- und Ableitung der Atemluft zu, sondern sie erfüllt auch eine Reihe wichtiger Hilfsfunktionen. Hierzu gehören die Reinigung, Erwärmung und Befeuchtung der eingeatmeten Luft.

Die Reinigungsfunktion der Nase besteht hauptsächlich im Abfangen von kleineren Partikeln, von Staub und Bakterien durch die Nasenschleimhaut, die die zuleitenden Nasenwege überzieht [14]. Der von der Nasenschleimhaut sezernierte Schleim wird durch die Zilien des Respirationsepithels rachenwärts befördert und schließlich verschluckt. Bestimmte mechanische oder chemische Reize lösen reflektorisch das Niesen aus und bewirken damit das Herausschleudern von Fremdkörpern [15]. Erwärmung und Befeuchtung der Atemluft kommen durch die große Oberfläche, die leistungsfähigen Schleimdrüsen und die gute Durchblutung der Nasenschleimhaut zustande. Neben diesen Funktionen als Bestandteil der Atemwege ist die menschliche Nase auch der Sitz des Geruchssinns und ist als Resonanzorgan für Stimme und Sprache anzusehen [14].

Störungen in der Funktion der Nasenatmung und daraus resultierende Mundatmung verhindern die effektive Anfeuchtung, Erwärmung und Filterung der eingeatmeten Luft. Chronisch entzündliche Erkrankungen der Rachenschleimhaut, des Kehlkopfes und der tieferen Atemwege können die Folge sein. Zudem werden die Klangbildung der Stimme und der Geruchssinn beeinträchtigt [14].

3.1.1. Makroskopischer Aufbau

Der Nasenraum setzt sich aus der äußeren Nase und der Nasenhöhle zusammen. Die äußere Nase besteht aus dem knöchernen Gerüst des Nasenbeines und den sich daran lückenlos nach vorn aneinanderreihenden knorpeligen Anteilen, die zusammen Nasenwurzel, Nasenrücken, Nasenspitze und Nasenflügel bilden. Die beiden paarigen Nasenlöcher bilden den Naseneingang. Am Übergang des Naseneinganges zur Nasenhöhle befindet sich der Nasenvorhof (Vestibulum nasi). Dieser trägt lange reusenartige Haare (Vibrissae), die dem Abfangen gröberer Verunreinigungen der Atemluft dienen.

Die knöcherne Nasenhöhle (Carvum nasi) ist ein paarig angelegter Hohlraum, der zwei frontal gestellte innere Öffnungen zum Rachen, die Choanen, besitzt und mit Schleimhaut ausgekleidet ist. Die Nasenhöhle wird durch die Nasenscheidewand (Septum nasi) in zwei Hohlräume unterteilt. Die Nasenmuscheln (Conchae nasales) sind aus der seitlichen [Seite 4↓]Knochenwand herausragende Knochenspangen, die der Oberflächenvergrößerung dienen und die Nase in je drei Nasengänge gliedern. Mit der Nasenhöhle stehen paarige Hohlräume, die Nasennebenhöhlen, und die Öffnung des Tränennasenganges in Verbindung (Abb. 1) [7, 17].

Abbildung 1:Lateraler Schnitt durch die menschliche Nasenhöhle; nach [14]

3.1.2. Mikroskopischer Aufbau

Die Nasenschleimhaut, die die knöcherne Nasenhöhle auskleidet, lässt sich in zwei Abschnitte unterteilen: die respiratorische Schleimhaut (Regio respiratoria) und die Riechschleimhaut (Regio olfactoria).

Die eigentliche Nasenhöhle ist größtenteils von der respiratorischen Schleimhaut ausgekleidet. Die Regio respiratoria mit einer Fläche von 120 cm2 ist ein mehrreihiges Flimmerepithel mit Becherzellen und seromukösen Drüsen im angrenzenden Bindegewebe. Vor allem im Bereich der unteren Nasenmuscheln und des Septums ist ein umfangreiches Venengeflecht ausgebildet. Dieses dient vor allem dem Vorwärmen der Luft und kann durch Hemmen des Blutabflusses ein schnelles Anschwellen der Schleimhaut bewirken.

Die Riechregion liegt auf der oberen Nasenmuschel. Das ca. 2 x 2,5 cm2 große Riechepithel wird aus drei Zelltypen gebildet, den Sinneszellen, den Stützzellen und den Basalzellen. Die über das Niveau der Stützzellen hinausragenden, kolbenartigen Auftreibungen der Riechzellen sind mit von Schleim überzogenden Zilien besetzt. Die effektorischen Nervenfortsätze durchziehen die Siebplatte und verlaufen zum vorderen Teil des Riechhirns [14].

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3.1.3.  Mukoziliäre Clearance

Unter der mukoziliären Clearance (MCC) wird das äußerst effektive Zusammenspiel des von der respiratorischen Nasenschleimhaut sezernierten Schleims und der Bewegung der Zilien des Flimmerepithels verstanden. Dabei spielen Anzahl, Struktur und Aktivität der Zilien sowie ihre koordinierte Bewegung eine ebenso große Rolle wie die Menge und die biochemischen, physikalischen und rheologischen Eigenschaften des Mukus. Die MCC ist ein wichtiger Schutzmechanismus des Respirationstraktes, stellt aber gleichzeitig den begrenzenden Faktor für die Verweildauer nasal applizierter Substanzen dar [16, 17].

3.2. Allergische Erkrankungen der Nasenschleimhaut

3.2.1. Genese

Die allergische Erkrankung der Nasenschleimhaut durch inhalative Allergene, die allergische Rhinitis (AR), ist als Entzündungsreaktion aufzufassen [1].

Die inhalativen Allergene werden grob in saisonale (vor allem Baum-, Gras- und Kräuter­pollen), perenniale (insbesondere Hausstaubmilden und Tierhaare) und berufliche Allergene unterteilt. Allergische Reaktionen der Nasenschleimhaut können daneben aber auch auf perkutanem, peroralem oder intrakutanem Weg hervorgerufen werden [1].

Die allergische Rhinitis gehört zur Gruppe der allergischen Sofortreaktionen, der Typ I­Reaktionen. Allergische Reaktionen vom Typ I werden durch IgE-Antikörper vermittelt, die sich hauptsächlich auf der Zellmembran von Mastzellen befinden. Mastzellen sind basophile Granulozyten, die in Blut- und Bindegewebsmastzellen unterschieden werden. Die Mastzellen stellen die Effektorzellen der allergischen Sofortreaktion dar und sind nach ihrer Aktivierung auch an anderen Entzündungsreaktionen beteiligt, da sie neben Histamin auch Entzündungs­mediatoren enthalten. Die Bindung von inhalierten IgE-Antigenen auf der Oberfläche der Bindegewebsmastzellen bringt diese zur Ausschüttung von hauptsächlich Histamin, das der bedeutendste Mediator der allergischen Sofortphase ist, an die sich eine Spätphasenreaktion anschließt. Diese ist durch die Ausschüttung von Zytokinen, die Expression von Adhäsions­rezeptoren und die Aktivierung von T-Lymphozyten gekennzeichnet und führt zur Einwande­rung von Entzündungszellen, sodass die allergischen Charakteristika einer viralen oder bakteriellen Entzündung ähneln. Die nasale Allergenexposition führt zu einer spezifischen oder unspezifischen Hyperreagibilität der Schleimhaut, die auch auf andere Organe Auswirkungen haben kann [18, 19].


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3.2.2.  Therapie

Die Erkenntnis über die allergische Entzündungsreaktion hat in den letzten Jahren wesentlich dazu beigetragen, dass ein Wechsel von der symptomatischen zur antientzündlichen Therapie erfolgte [1].

Einen Überblick über die eingesetzten Arzneistoffe und deren Wirkungsmechanismen gibt Tabelle 1 [1, 10, 11, 18, 19].

Tabelle 1: Übersicht über die Arzneistoffe1 zur Therapie der allergischen Rhinitis

Mastzellstabilisatoren (sl: Natriumcromoglicat; l: Nedrocromil-Natrium)

Wirkung:

mastzellstabilisierend und antientzündlich

Vorteil:

kaum lokale Nebenwirkungen, keine Gefahr systemischer Neben-

oderWechselwirkungen, prophylaktische Therapie

Nachteil:

mäßige Wirksamkeit, schlechte Patientencompliance durch häufiges

Applizieren und die unmittelbar fehlende Linderung der Symptomatik

Applikation:

lokal oder systemisch2

Antihistaminika (sl: Loratidin, Azelastin; l: Levocabastin; s: Terfenadin u. a.)

 

Wirkung:

mastzellstabilisierend und antientzündlich

Vorteil:

kaum lokale Nebenwirkungen, keine Gefahr systemischer Neben- oder

Wechselwirkungen, prophylaktische Therapie

Nachteil:

mäßige Wirksamkeit, schlechte Patientencompliance durch häufiges

Applizieren und die unmittelbar fehlende Linderung der Symptomatik

Applikation:

lokal oder systemisch3

Corticosteroide (l: Fluticason, Flunisolid u. a; s: Dexamethason, Prednisolon u. a.)

 

Wirkung:

potent antiallergisch und antientzündlich

Vorteil:

hohe Wirksamkeit bei zumeist geringer systemischer Resorption nach lokaler

Gabe

Nachteil:

schlechte Patientencompliance durch Corticoidphobie der Bevölkerung, zur

problematische Dosierung bei gleichzeitiger Anwendung von Corticoiden

Asthmatherapie

Applikation

lokal oder systemisch4

alpha-Sympathomimetika (l: Oxymetazolinhydrochlorid, Xylometazolinhydrochlorid)

 

Wirkung:

schleimhautabschwellend

Vorteil:

schnelle Behebung der Symptomatik

Nachteil:

Gefahr systemischer Nebenwirkungen, Entwicklung einer Abhängigkeit und

daraus resultierend die Schädigung der Nasenschleimhaut

Applikation:

lokal


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Für die antientzündliche medikamentöse Therapie stehen die Mastzellstabilisatoren, systemische und topische Antihistaminika sowie topische Glucocorticoide zur Verfügung. Im Akutfall ist die kurzzeitige Anwendung lokaler alpha-Sympathomimetika möglich [1].

Natriumcromoglicat wird in Therapierichtlinien zur Behandlung der allergischen Rhinitis als sicheres und fast nebenwirkungsfreies Antiallergikum beschrieben [10, 11]. Obwohl klinische Tests eine Wirksamkeit der Mastzellstabilisatoren in der Therapie der AR belegen [20], unterliegen sie in Hinblick auf die Effektivität den Antihistaminika und Glucocorticoiden. Da die Therapie mit dem Mastzellstabilisator die prophylaktische Applikation mit 2- bis 4maliger Anwendung erfordert, ist mangelnde Patientencompliance ein ursächlicher Grund [10].

Die Reduzierung der Dosierungshäufigkeit, z. B. durch Viskositätserhöhung der Zubereitung und einer damit längeren Verweildauer auf der Nasenschleimhaut, ist ein mögliches, bisher für diese Substanz noch nicht beschriebenes Optimierungskonzept. Die Kombination mit einem Mukoadhäsivum eröffnet dabei die Möglichkeit der verlängerten Wirkung bei „kontrollierter“ Freigabe [7].

3.3. Nasale Verfügbarkeit von Arzneistoffen

3.3.1. Allgemeines

Die nasale Absorption von Arzneistoffen ist Objekt zahlreicher Forschungen [5]. Das Hauptaugenmerk wurde dabei bisher auf die systemische Verfügbarkeit von Proteinen und Peptiden nach nasaler Applikation gerichtet, die z. B. im Falle endogener Peptidhormone durch gentechnologische Herstellungsmöglichkeiten vermehrt als Therapeutika zur Verfügung stehen [21]. Die nichtinvasive Applikation über die gut durchblutete Nasenschleimhaut bietet

eine Reihe von Vorteilen und somit eine Alternative zur zumeist notwendigen intravenösen Applikation. Als Nachteil der nasalen Verabreichung sind große individuelle Schwankungen und die oft geringe Absorption, verglichen mit der intravenösen Applikation, zu nennen [22].

Obwohl die nasale Mukosa für eine Vielzahl hydrophiler und lipophiler Substanzen gut permeabel ist [23, 24], stellt sie infolge der mukoziliären Clearance [16], der aufgelagerten Mukusschicht [25] und der vergleichsweise hohen Enzymaktivität dennoch eine Barriere dar [22]. Vielfältige Untersuchungen zielen auf die Entwicklung moderner Arzneiformen, die die Verweildauer auf der Nasenschleimhaut erhöhen (z. B. nasale Pulverformulierungen [26], mukoadhäsive Mikrosphären [27, 28] sowie andere mukoadhäsive Arzneiformen [29]) und [Seite 8↓]die Absorption verbessern (ggf. durch Zusatz absorptionsfördernder [30] und/oder enzymhemmender Substanzen [31]), ohne dabei die wichtigen physiologischen Schutzmechanismen der Nasenschleimhaut zu beeinträchtigen. So ist zum Beispiel die nasale Applikation von Insulin in Form bioadhäsiver Mikrosphären denkbar [32], da aus der Kombination mit dem mukoadhäsiven Polymer Carbopol® Insulinplasmaspiegel resultierten, die denen einer dreimal so hohen Dosis nach s.c. Gabe entsprachen [33]. Auch die aktive Immunisierung scheint über den nasalen Applikationsweg möglich zu sein, da nach einem Antigenkontakt sowohl eine lokale als auch eine systemische Immunreaktion ausgelöst wird [34, 35].

Es ist bekannt, dass die physikochemischen Eigenschaften eines Arzneistoffes und die Formulierungsparameter der Arzneiform Einfluss auf die nasale Verfügbarkeit nehmen [36, 37]. Im Zuge der wachsenden Bedeutung des nasalen Applikationsweges für die systemische Verfügbarkeit von Arzneistoffen und umgekehrt zum Verständnis systemischer Neben­wirkungen bei angestrebter lediglich lokaler Wirksamkeit ist die exakte Kenntnis der Beeinflussung des transmukosalen Transportes elementar. Die Komponenten der Arznei­formulierung können sowohl die Verfügbarkeit als auch die Integrität und Funktionalität der mukosalen Barriere beeinflussen. Sie nehmen somit in mehrfacher Hinsicht Einfluss auf das nasale Absorptionsgeschehen. Abbildung 2 gibt einen Überblick über Einfluss nehmende Parameter.

Eine Vielzahl von Modellen zur Durchführung nasaler Verfügbarkeitsstudien ist in der Literatur beschrieben worden. Neben In-vivo-Modellen [38, 39] und In-situ-Perfusions­modellen [40] seien an dieser Stelle hauptsächlich die In-vitro-Modelle aufgeführt [13, 41, 42, 43]. Der Vorteil der In-vitro-Permeationstechnik liegt in der weniger aufwendigen Analytik, der schnelleren Durchführbarkeit und infolge reduzierter pre- und postmukosaler Faktoren in einer besseren Standardisierbarkeit [41]. Neben exzidierten tierischen nasalen Geweben von Rind, Schwein, Kaninchen, Affe und Hund, ggf. auch synthetischen Membranen, rücken zunehmend Zellkulturen menschlichen nasalen Gewebes in den Vordergrund [44, 45].

Das In-vitro-Modell wird immer dann Mittel der ersten Wahl sein, wenn lediglich ein Screening verschiedener Einflüsse oder die vergleichende Untersuchung zu einfluss­nehmenden Parametern durchgeführt werden soll [42]. Der Nachteil der In-vitro­Versuchsanordnung liegt darin, dass der Einfluss der mukoziliären Clearance auf das nasale Absorptionsgeschehen nicht erfasst wird. Die MCC hat auf die Absorptionsprofile nasal applizierter Substanzen jedoch entscheidenen Einfluß. Die Untersuchung des Einflusses der im In-vitro-Permeationsversuch getesteten Formulierung auf die Zilienschlagfrequenz und die rheologischen, biochemischen und physikalischen Eigenschaften des nasalen Mukus stellt daher eine sinnvolle Ergänzung der In-vitro-Permeationstechnik dar. Ein nachfolgender In­vivo-Versuch diente in der vorliegenden Arbeit dazu, die in vitro gewonnenen Daten auf ihre Korrelierbarkeit mit physiologischen Gegebenheiten zu überprüfen.


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Abbildung 2:Einfluss nehmende Parameter auf die nasale Verfügbarkeit eines Arzneistoffes aus der
Arzneiform „Nasentropfen“; erstellt nach [5, 21, 36, 37]

[Seite 10↓]Im Folgenden werden die theoretischen Grundlagen zur In-vitro-Permeationstechnik an exzidiertem tierischem Gewebe (Rindernasenmukosa) dargelegt. Darüber hinaus wird das Phänomen „ Mukoadhäsion “ erläutert, wobei die mukoadhäsiven Wechselwirkungen von Nasalia mit dem nasalen Mukus im Vordergrund stehen.

3.3.2. In-vitro-Permeation und -Penetration

Im In-vitro-Permeationsversuch wird die Durchlässigkeit einer biologischen oder synthetischen Membran unter konkreten Versuchsbedingungen untersucht. Dabei wird die Verteilung eines Arzneistoffes an der semipermeablen Membran zwischen einem Donator­(arzneistoffhaltig) und einem Akzeptorkompartiment (arzneistofffrei) bestimmt. Die In-vitro­Penetration dagegen betrachtet die Aufnahme eines Arzneistoffes in eine Membran.

Da nasal applizierte Formulierungen vorwiegend die mit respiratorischer Schleimhaut ausgekleidete Nasenhöhle erreichen [46], wird für nasale Permeationsstudien mit exzidiertem tierischem Gewebe bevorzugt das Respirationsepithel verwendet. Wadell et al. [41] zeigten anhand verschiedener nasaler Gewebe, dass das tierische Respirationsepithel in seinen morphologischen, histologischen und physiologischen Eigenschaften mit denen der humanen nasalen respiratorischen Schleimhaut vergleichbar ist. Die für die folgenden Permeations- und Penetrationsstudien eingesetzte exzidierte Rindermukosa ist ein gut untersuchtes und charakterisiertes Gewebe [42].

Abbildung 3 zeigt ein humanes Respirationsepithel. Die zilienlosen und zilientragenden Epithelzellen besitzen eine hohe Anzahl von Mikrovilli (siehe Abb. 4), die zusammen mit der guten Gefäßversorgung [22] die Voraussetzung für hohe Absorptionsraten sind. Zilien mit einer Länge von 4 bis 6 µm befinden sich auf etwa 20 % der Epithelzellen. Weiterhin befinden sich im Respirationsepithel die schleimsezernierenden Becherzellen und die tief in das Bindegewebe eingelagerten submukosalen Schleimdrüsen. Benachbarte Zellen sitzen auf der Basalmembran, die das Epithel vom unterliegenden Bindegewebe abtrennt. Neben diesen differenzierten Zellen befinden sich auf der Basalmembran sogenannte Basalzellen, die zu jedem der genannten Zelltypen differenzieren können [16, 22, 47, 48].

Obwohl die Nasenschleimhaut einen Schutz gegenüber äußeren Faktoren darstellt, ist sie für hydrophile und lipophile Arzneistoffe mit Molekülmassen unter 1000 Da relativ gut durchlässig [7, 24]. Als Transportwege stehen dabei in erster Linie der passive transzelluläre und parazelluläre Mechanismus zur Verfügung (Abb. 4).

Der transzelluläre Transportmechanismus, d. h. der Transport durch die Zellmembran und damit durch die Zelle, steht insbesondere lipophilen Substanzen zur Verfügung, während geladene, hydrophile Stoffe vorwiegend parazellulär transportiert werden [22]. Der parazelluläre Transport zwischen den Zellen hindurch erfolgt durch die Tight-junctions (TJ)


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Abbildung 3:Mikroskopischer Schnitt durch das humane Respirationsepithel; nach [15]

oder auch Zonula occludens (ZO), den Verbindungsstellen zwischen benachbarten Epithelzellen (Abb. 4). Im Bereich der sogenannten „Kisses“ ist der Kontakt zwischen benachbarten Zellen so dicht, dass die Zellmembranen zu verschmelzen scheinen [50]. Sie stellen die am stärksten permeabilitätseinschränkende strukturelle Komponente der TJ dar. Aus biochemischer Sicht sind die TJ komplexe Multiproteinstrukturen, die mit den Aktinfilamenten des perijunctionalen Aktin-Myosin-Rings (Abb. 4) der epithelialen Zellen in direkter Verbindung stehen. Zwischen dem Zytoskeleton der epithelialen Zellen und ihren okkludierenden TJ besteht also eine funktionelle Assoziation [49]. Die Regulation des Öffnungszustandes der TJ erfolgt über die Kontraktion des Aktin-Myosin-Rings. Die Kontraktion wird über die Phosphorylierung der TJ-Proteine gesteuert [51]. Calciumab­hängige Proteinkinasen und Phosphatasen sind die an diesen Vorgängen beteiligten Enyzme. Auch intrazelluläre Prozesse sind an der Regulation der TJ beteiligt [52].

Abbildung 4:Transportmechanismen durch die nasale Mukosa; modifiziert nach [50]
ZO = Zonula occludens (siehe Text)

Die „Porengröße“ der nasalen Membran beträgt ungefähr 3,9 bis 8,4 Å. Die Verbindungen zwischen den Becherzellen bzw. Becherzellen und zilientragenden Zellen sind relativ locker [Seite 12↓][22, 53, 54]. Der Verteilungs- und Öffnungszustand der Tight-junctions variiert selbst im intakten biologischen Gewebe stark [51, 55]. Die TJ stellen dynamische Strukturen dar, die ihre Permeabilität entsprechend den physiologischen und pathophysiologischen Gegeben­heiten ändern.

Entzündliche Prozesse der Nasenschleimhaut behindern die Steuerung der Permeabilität des parazellulären Transportweges und vermindern dadurch die physikalische Barrierefunktion des Respirationsepithels [22, 54].

Bei Transportstudien an biologischen Membranen ist es wichtig, die Integrität und Vitalität des verwendeten Gewebes zu sichern [41]. Eine Vielzahl von Möglichkeiten steht dabei zur Verfügung. Genannt seien hier:

Für die in der vorliegenden Arbeit verwendete Modell „exzidierte Rindernasenschleimhaut“ ist die Vitalität unter den jeweiligen Versuchsbedingungen vielfach nachgewiesen worden [41, 42]. In der verwendeten Apparatur erwies sich das Gewebe nach einer Equilibrie­rungsphase von 20 bis 30 Minuten über eine Versuchsdauer von zwei bis zu acht Stunden als vital [41, 42]. Studien an Kaninchen- und Schweinemukosa bestätigten diese Aussage [13, 58, 59, 60, 61, 62, 63]. Die Vitalität des nichtpräparierten Gewebes wurde mit bis zu 24 Stunden angegeben [59].

Abbildung 5 zeigt eine Side-Bi-SideTM-Apparatur mit dem nötigen Equipment, um die elektrophysiologischen Parameter eines isolierten biologischen Gewebes, die Potential­differenz (PD) und den Kurzschlussstrom (I SC), zu erfassen. Erforderlich ist dazu ein 4­Elektrodensystem. Ein Paar Silber/Silberchlorid-Elektroden wird zur Erfassung der sich aufbauenden Potentialdifferenz (Spannung) infolge aktiver Ionentransportmechanismen benötigt, das andere, um den Kurzschlussstrom zu messen, der fließt, um die entstandene Potentialdifferenz auszugleichen. Aus beiden Daten kann dann der transepitheliale Widerstand (TEER) nach dem Ohmschen Gesetz berechnet werden.

Die elektrophysiologischen Parameter der Rindermukosa wurden von Schmidt et al. [42] mit TEER: (42 ± 12) Ω cm2, PD: 0,9 bis 2,9 mV und I SC:36 bis 66 µA/cm2 angegeben. Im Vergleich dazu wurden für menschliche Mukosa folgende Werte ermittelt: TEER: ca. 100 Ω cm2, PD: ca. 6 mV und I SC: ca. 58 µA/cm2 [64]. Bechgaard et al. [65] weisen darauf hin, dass ein Abfall des elektrophysiologischen Parameters TEER in vitro nicht immer zwangsläufig mangelnde Verträglichkeit in vivo bedeuten muss, da bei der In-vitro-Anord­[Seite 13↓]nung die Verdünnung durch das nasale Sekret und Selbstregenerierungsmechanismen durch die Mukosa nicht erfasst werden.

Abbildung 5:Side-Bi-SideTM-Apparatur; nach [66]

Der geringe Widerstand dieser biologischen Membran ist ein Indiz für die schwache strukturelle Barrierefunktion der nasalen Mukosa und damit für ihre relativ hohe parazelluläre Permeabilität [22]. Die nasale Mukosa stellt ein „leaky“ Epithel dar [22, 67].

3.3.3. Mucinwechselwirkungen – Mukoadhäsion

Die mukoziliäre Clearance stellt eine effektive Barriere für die Permeation nasal applizierter Arzneistoffe dar. Ursache dafür ist die kurze Verweildauer auf der Nasenschleimhaut, die lediglich 20 bis 30 Minuten beträgt [13, 39]. Der rachenwärts gerichtete Transport kommt durch das effektive Zusammenspiel von Zilienbewegung und Mukus zustande. Neben der Integrität des Ziliarapparates spielen Viskosität und Elastizität des nasalen Mukus in Hinblick auf eine optimale mukoziliäre Clearance eine entscheidende Rolle [16, 68].

Der nasale Mukus ist aus zwei Schichten aufgebaut. Die untere Schicht, die Solphase oder periziliäre Schicht, dient der Rückbewegung der Zilien und schützt das Epithel vor dem Austrocknen. Die obere, viskosere Gelphase dient dem Transport und dem Fixieren inhalierter Partikel [69]. Die Zilien schlagen mit einer Frequenz von 10 bis 20 Hz in einer synchro­nisierten, metasynchronen Bewegung, aus der eine rachenwärts gerichtete Wellenbewegung resultiert. Für den effektiven Schlag berühren die Zilien die obere, viskose Schicht. Die Rückbewegung erfolgt in der unteren Schicht. Letztlich resultiert eine Scherrate von 1 bis 3 Hz (12 1/s) [16, 68]. Abbildung 6 veranschaulicht diese Bewegungen.


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Abbildung 6:Zilientätigkeit und Mukusschicht; modifiziert nach [22]

Der Mukus besteht hauptsächlich aus Wasser, Elektrolyten, verschiedenen Enzymen, Proteinen, Immunglobulinen (vor allem IgA) und zu 5 % aus einer Glykoproteinkomponente (Mucin5). Er wird von den Becherzellen und seromukösen Drüsen des Bindegewebes synthetisiert. Die Glykoproteinkomponente bestimmt die viskoelastischen, adhäsiven und kohäsiven Eigenschaften des nasalen Mukus [68].

Die Glykoproteine bestehen aus einem Proteingrundgerüst und kovalent gebundenen Oligosaccharidseitenketten (Abb. 7). Die Molekülmasse eines Glykoproteins beträgt ca. 200 kDa. Die negative Ladung kommt hauptsächlich durch die endständige Sialinsäure (pK a = 2,8) der Seitenketten zustande [70].

Der Mukus stellt ein schwaches, dreidimensionales, flexibles Netzwerk aus linearen, gewundenen, hydratisierten Mucinmolekülen dar, das durch quervernetzende Disulfid­brücken, physikalische Verwicklungen und sekundäre chemische, ionische Bindungen zwischen den einzelnen Molekülen oder innerhalb eines Moleküls entsteht [68, 70, 71]. Die isotone Mukusschicht besitzt eine Pufferfunktion und erhält an der Epithelschicht ein leicht saures Mikromilieu mit einem pH-Wert von etwa 6,0 aufrecht [70].

Durch

ist der Mukus in der Lage, unspezifische Sekundärbindungen einzugehen [70].


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Abbildung 7:Schematische Darstellung der Struktur der Mukusglykoproteine;
modifiziert nach [71]

Unter Bioadhäsion versteht man allgemein die Wechselwirkung zwischen verschiedenartigen Makromolekülen einander sich eng berührender Körper, d. h. an der Grenzfläche zweier Phasen, wobei der eine Körper eine biologische Matrix darstellt. Handelt es sich bei dem biologischen Material um eine mit Mukus bedeckte Schleimhaut, spricht man von Mukoadhäsion [77]. Damit trifft der Terminus „ mukoadhäsiv “ streng genommen nur für Polymere zu.

Das Ziel mukoadhäsiver Arzneiformen ist eine Verlängerung der Arzneistoffwirkung durch einen verlängerten, intensivierten Kontakt mit dem Absorptionsort Mukosa [72]. Voraussetzung für eine Mukoadhäsion und damit eine längere Verweildauer auf der Nasenschleimhaut und/oder eines engeren Kontaktes mit der Nasenschleimhaut ist eine Penetration in die Mukusschicht und eine Adhäsion an die nasale Membran [73]. Häufig wird durch mukoadhäsive Arzneiformen auch eine verzögerte, kontrollierte Wirkstofffreigabe angestrebt (Bioadhäsive Freigabesysteme) [68, 74]. Eine gezielte Adhäsion spezifischer mukoadhäsiver Moleküle an bestimmte Gewebe ist denkbar [75, 76].


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Bioadhäsive Kräfte können physikalische und/oder mechanische Kräfte sowie primäre oder sekundäre chemische Bindungskräfte sein. Sekundäre chemische Bindungen, d. h.

sowie elektrostatische Kräfte (Coulombsche Kräfte) zwischen entgegengesetzt geladenen Teilchen und die Interpenetration mit nachfolgender Verknäulung der Polymerketten sind attraktive Kräfte für die Entwicklung einer mukoadhäsiven Bindung [70, 75, 77, 78]. Aus den möglichen Bindungskräften ergeben sich für potentielle Mukoadhäsiva folgende notwendigen Grundeigenschaften [70]:

In einer Reihe theoretischer Ansätze wird versucht, das Phänomen Bioadhäsion sowie wirkende Einflussparameter zu definieren. Von besonderer Bedeutung für das Zustandekommen einer mukoadhäsiven Bindung sind dabei in der ersten Phase des Entstehens Oberflächenphänomene, insbesondere die Spreitung [77, 79], und elektrostatische Wechselwirkungen. Nachdem ein enger Kontakt zwischen den Grenzflächen der Reaktanden erfolgt ist, kann eine bioadhäsive Bindung durch die bereits genannten sekundären Bindungskräfte und/oder durch Interpenetration [77, 80, 81] von Polymerketten entstehen bzw. manifestiert werden. Zumeist ist eine Bioadhäsion Resultat aus einer Vielzahl physikochemischer Interaktionen [74, 75]. Da beinahe alle Polymere die Fähigkeit besitzen, in Pulverform auf einer feuchten Schleimhaut zu haften, wird das längere Verweilen von nichthydratisierten Polymeren, nur durch Quellung bedingt, im Allgemeinen nicht als Mukoadhäsion bezeichnet [72].

In der Literatur sind verschiedene Methoden zur Erfassung bioadhäsiver Eigenschaften und des Einflusses auf die Zilientätigkeit von Arznei- und/oder Hilfsstoffen sowie deren Zubereitungen beschrieben worden. Neben der Ermittlung der direkten mukoziliären Transportzeit radioaktiv markierter oder gefärbter Partikel in vivo [16, 46], ist die In-vitro­Technik gut geeignet, um die an der Bioadhäsion beteiligten Mechanismen zu charak­terisieren [82]. Duchêne et al. [71], Peppas et al. [77] und Ahuja et al. [83] geben darüber umfassende Überblicke. Mukoadhäsive Fähigkeiten werden hauptsächlich im Zusammenhang mit polymerhaltigen Formulierungen überprüft. Dabei wird in vitro häufig die Haftkraft eines Polymerfilms oder einer Polymerlösung auf biologischem (Schleimhaut, Mukus) oder synthetischem Material ermittelt [84, 85, 86, 87]. Diese Untersuchungen basieren auf der [Seite 17↓]Tatsache, dass eine mukoadhäsive Bindung in erster Linie an der Grenzfläche Mukus/Polymer entsteht.

Eine Möglichkeit zur direkten Erfassung von „adhäsiven“ Wechselwirkungen nichtpolymerer Arzneistofflösungen mit dem Mukus stellen rotations- und oszillationsrheologische Untersuchungen dar. Während bei rotationsrheologischen Methoden der Messkörper in der mukushaltigen Messprobe rotiert, wird in der Ozillationsrheologie ein harmonisch schwingender Messkörper benutzt. Oszillationsrheologische Untersuchungen können dabei sowohl die Stärke als auch die Art der Wechselwirkungen mit den Glykoproteinkomponenten des Mukus erfassen.

Die Scherviskosität einer Mucinmodelldispersion ist das Resultat aller physikochemischen Wechselwirkungen (Verwicklungen der Molekülketten, sekundäre Bindungskräfte usw.). Eine mukoadhäsive Bindung, d. h. z. B. zusätzliche Verwicklungen oder sekundäre Bin­dungen, äußert sich in der Regel in einer überproportionalen Viskositätszunahme [73, 8288]. Ausdruck findet diese in einem positiven Mukoadhäsionsindex (M-Ix). Damit ist gemeint, dass bei der rotationsrheologischen Bestimmung der Viskosität eines Mucin/Formulierungs­Gemisches diese höher ist als die additive Viskosität der beiden Einzelkomponenten. Der Anstieg der Viskosität, relativiert gegen die vorgegebene Scher-belastung (↑ 5.2.5.2), wird als Maß für mukoadhäsive Bindungskräfte (Mukoadhäsionsindex) und als Indiz für eine Mucinwechselwirkung betrachtet [88, 89, 90].

Während die Rotationsrheologie nur die Erfassung der Viskosität, d. h. der viskosen Anteile der Mucindispersion ermöglicht, können mittels oszillationsrheologischen Untersuchungen sowohl die viskosen (Verlustmodul (G´´)) als auch die elastischen (Speichermodul (G´)) Anteile der Messprobe bestimmt werden. Die Erfassung der Veränderung der oszillations­rheologischen Kenngrößen Verlustmodul, Speichermodul und Komplexe Viskosität () über den Frequenzbereich des schwingenden Messkörpers (Frequenzsweep) gibt zudem Einblick in die molekulare Struktur der Messprobe.

Veränderungen im rheologischen Verhalten, insbesondere der Viskoelastizität, reduzieren den mukoziliären Transport [68]. Dabei führen sowohl Unterschreitung als auch Überschreitung eines optimalen Bereiches der rheologischen Kenngrößen zur Abnahme mukoziliärer Transportprozesse. Für verschiedene Polymere bestätigte sich die in vitro festgestellte Mukoadhäsivität (Erhöhung von Viskosität und Viskoelastizität einer Mucinmodelldisperion nach Zusatz der Polymerlösungen) auch in vivo, denn nach nasaler Applikation dieser Polymerlösungen war die mukoziliären Transportleistung deutlich vermindert [91, 92, 94]. Ree et al. [93] fanden für rekonstituierten nasalen Mukus die gleichen viskoelastischen Eigenschaften wie für humanen Mukus.


[Seite 18↓]

3.4.  Untersuchungen

3.4.1. Arzneistoffe

3.4.1.1. Natriumcromoglicat (DSCG)

Ph. Eur. 2002:

Dinatrium-5,5´-[(2-hydroxypropan-1,3-diyl)bis(oxy)]bis(4-oxo-

4H-1-benzopyran-2-carboxylat)

 

 

 

 

C23H14Na2O11

Mr 512,3

Abbildung 8:Natriumcromoglicat

Die in Wasser leicht lösliche Substanz ist ein weißes kristallines Pulver, das in Abhängigkeit von der Luftfeuchte reversibel pro Mol bis zu 9 Mol Wasser aufnehmen kann. Natriumcromoglicat ist zur Bildung lyotroper Mesophasen befähigt [95, 96]. Die in Wasser unlösliche Dicarbonsäure besitzt einen pKa-Wert von 2,3. Natriumcromoglicat unterliegt in alkalischen Lösungen einer raschen Hydrolyse. In konzentrierten wässrigen Lösungen liegen die beiden Chromonringe in einem Winkel von 53° zueinander vor. In verdünnten wässrigen Lösungen dagegen zeigen die beiden Ringe Coplanarität [95, 96]. Die UV-Maxima von DSCG in wässriger Lösung sind mit l = 238 nm ( ca. 600) und l = 326 nm ( ca. 160) angegeben [96]. DSCG wird in der Literatur als Stoff mit eigenartigen chemischen und physikalischen Eigenschaften beschrieben [97].

Der Mastzellstabilisator Natriumcromoglicat wurde bereits 1965 durch die Fisons corporation synthetisiert. 1973 erhielt die Substanz die Zulassung für die Behandlung des Asthma bronchiale [97]. Seit Anfang der achtziger Jahre ist DSCG in Form intranasaler Lösungen zur Therapie der ganzjährigen und saisonalen allergischen Rhinitis verfügbar [98].

Strukturell leitet sich Natriumcromoglicat von Khellin, dem Inhaltsstoff der Pflanze Ammi visnaga ab, die schon von den Ägyptern als Heilpflanze eingesetzt wurde [97].


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Der Wirkungsmechanismus für die Substanz ist komplex und bis ins letzte Detail nicht bekannt [98]. Natriumcromoglicat wirkt in der frühen allergischen Phase durch seine mastzellstabilisierenden Eigenschaften. Diskutiert werden für diesen Effekt folgende Mechanismen:

gefolgt von der Phosphorylierung eines terminalen Proteins und damit der Unterbrechung der allergischen Reaktionskette [99, 100, 101].

Zudem weist die Substanz eine antientzündliche Wirkkomponente auf, da sie den Effekt der Entzündungsmediatoren, vor allem von Neutrophilen und Eosinophilen, in der allergischen Spätphase unterdrückt [10, 11, 97, 98]. DSCG besitzt einen positiven Langzeiteffekt auf die bronchiale Hyperreagibilität beim Asthma bronchiale [97] und wird daher hauptsächlich zur Behandlung des Asthma bronchiale eingesetzt. Die mastzellstabilisierenden Eigenschaften werden jedoch auch zur Behandlung von allergischer Rhinitis und Konjunktivitis erfolgreich genutzt [10, 102].

Die klinische Wirksamkeit bei AR ergibt sich aus der prophylaktischen Anwendung, vor allem bei IgE-verbundener allergischer Rhinitis [11, 102]. Die übliche Dosierung zur Therapie der allergischen Rhinitis beträgt bis zu vier Sprühstöße (20 mg/ml) täglich.

Die Substanz wird nach peroraler Gabe am Menschen kaum resorbiert und unverändert, hauptsächlich über die Fäzes, ausgeschieden. Nach Inhalation hingegen können über das Bronchialepithel bis zu 10 % des DSCG resorbiert werden und in die Blutbahn gelangen. Die Elimination erfolgt durch Ausscheidung des unveränderten DSCG über den Urin sowie die Galle [103]. Es treten infolge der geringen systemischen Verfügbarkeit und der spezifischen Eigenschaften von Natriumcromoglicat kaum systemische Nebenwirkungen auf [10, 11]. DSCG ist aufgrund seiner Hydrophilie und Ladung nicht in der Lage, die Lipiddoppelschicht biologischer Zellmembranen zu überwinden [98, 103]. Die systemische Verfügbarkeit von DSCG resultiert ausschließlich aus parazellulären Transportmechanismen.

Über die Resorption von DSCG am Menschen nach nasaler Gabe liegen keine Angaben vor. Die höhere Permeabilität der nasalen Mukosa, verglichen mit intestinalem Gewebe lässt jedoch eine bessere Resorption von DSCG nach nasaler Applikation vermuten. Die folgenden In-vitro-Permeationsstudien an exzidierter Rindermukosa und In-vivo-Versuche am Kanin­chen sollen die nasale Verfügbarkeit von DSCG erfassen und darauf Einfluss nehmende Parameter charakterisieren.


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3.4.1.2.  Xylometazolinhydrochlorid und Oxymetazolinhydrochlorid

Ph. Eur. 2002:

Ph. Eur. 2002:

2-[4-(1,1-Dimethylethyl)-2,6-

3-[(4,5-Dihydro-1H-imidazol-2-yl) methyl]-

dimethylbenzyl]-4,5-dihydro-1H-imidazol-

6-(1,1-dimethylethyl)-2-4-dimethylphenol-

Hydrochlorid

hydrochlorid

 

 

C16H25ClN2

Mr 280,8

C16H25ClN2O

Mr 296,8

Abbildung 9:Xylometazolinhydrochlorid und Oxymetazolinhydrochlorid

Die beiden α-Sympathomimetika sind mittelstarke Basen, die wie alle Imidazole in alkalischer Lösung der Hydrolyse unterliegen. Das substituierte Imidazolin stellt ein cyclisches Amidin und somit ein Carbonsäure-Derivat dar, das unter dem Einfluss von Hydroxid-Ionen hydrolysierbar ist. Als Produkte der hydrolytischen Spaltung entstehen Ethylendiamin und die entsprechende substituierte Carbonsäure. In ihren wässrigen Lösungen mit einem pH-Wert um 6,0 sind die beiden Arzneistoffe stabil.

Oxymetazolinhydrochlorid ist ein weißes kristallines Pulver, das in mindestens zwei verschie­denen Kristallstrukturen kristallisieren kann. Die Umwandlung der stark hygroskopischen Modifikation in eine stabile, nichthygroskopische ist durch Erhitzen möglich. Daneben ist ein stabiles Monohydrat der Substanz bekannt. Oxymetazolinhydrochlorid und Xylometa­zolinhydrochlorid sind in Wasser leicht löslich. In unpolaren Lösungsmitteln sind beide Substanzen praktisch unlöslich [104, 105, 106].

Die beiden Arzneistoffe sind Sympathomimetika mit α2-agonistischen Wirkungen, die nur lokal appliziert therapeutische Verwendung finden. Nach Applikation auf der nasalen Schleimhaut kommt es innerhalb weniger Minuten zu einem vasokonstriktorischen Effekt, der auf der Aktivierung postsynaptischer α2-Rezeptoren beruht. Die Vasokonstriktion führt zu einem Abschwellen der Nasenschleimhaut. Dieser Effekt hält bis zu sechs Stunden an. Die [Seite 21↓]Substanzen werden infolge der schnell einsetzenden Vasokonstriktion im Allgemeinen über die Nasenschleimhaut in im Blut nichtnachweisbaren und systemisch nichtrelevanten Mengen resorbiert. Jedoch können die Substanzen bei unsachgemäßer Anwendung durch Verschlucken über den Magen-Darm-Kanal resorbiert werden und infolgedessen systemische Reaktionen auslösen. Diese betreffen in erster Linie das Herz-Kreislauf-System. Vorsicht ist insbesondere bei Säuglingen und Kleinkindern geboten, da schwere resorptive Vergiftungs­erscheinungen auftreten können [104, 106].

Die Anwendungsdauer ist auf drei bis fünf Tage beschränkt, da bei längerer Anwendung mit einer Schleimhautatrophie, der Rhinitis medicamentosa (RM) [107], zu rechnen ist und die Substanzen zilientoxische Eigenschaften zeigen [16, 108]. Insbesondere die Kombination mit dem Konservierungsmittel Benzalkoniumchlorid wird dabei kritisch bewertet [107] und als wichtiger Faktor bei der Entwicklung einer RM angesehen [109, 110].

Während die übliche Dosierung bei Xylometazolinhydrochlorid 0,1 % (m/V) beträgt, wird Oxymetazolinhydrochlorid in Dosen von 0,05 % (m/V) angewendet.

3.4.2. Verwendete Hilfsstoffe

3.4.2.1.  Konservierungsmittel/Synergist

In den nachgestellten Rhinitika-Rezepturen wurde Benzalkoniumchlorid (BAC) (Abb. 10) als Konservierungsmittel und Dinatrium-Ethylendiamintetraacetat (EDTA) (Abb. 11) als Syner­gist (Enhancer) eingesetzt.

Benzalkoniumchlorid (Abb. 10) ist eine in Wasser schwer lösliche, quartäre Ammonium­verbindung, die oberflächenaktive Eigenschaften aufweist. Die Hauptwirkung der Substanz besteht in einer reversiblen Wachstumshemmung von vor allem grampositiven Kokken [111]. Zur Erweiterung des Wirkungsspektrums wird die Substanz häufig mit EDTA (verbesserte Penetration) kombiniert und zur Konservierung nasaler und okularer Zubereitungen eingesetzt [112].

Ph. Eur. 2002:

Benzalkoniumchlorid ist ein Gemisch von Alkylbenzyldimethyl-

 

ammoniumchloriden, deren Alkylteil aus C 8 - bis C 18 -Ketten besteht

Abbildung 10:Benzalkoniumchlorid


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EDTA (Abb. 11) oder vielmehr Na2-EDTA ist das Natriumsalz der Editinsäure und hat die Eigenschaft, mit Erdalkalien und anderen zweiwertigen Metallionen wasserlösliche, nichtionisierte Komplexe zu bilden []. Durch diese chelatbildenen Eigenschaften (vor allem Komplexe mit Calciumionen) wird EDTA häufig als Stabilisator in Kombination mit einem Konservierungsmittel [] eingesetzt und fungiert gleichzeitig als Enhancer [].

Ph. Eur. 2002:

Dinatrium-dihydrogen-(ethylendinitrilo)tetraacetat-Dihydrat

 

 

 

 

 

 

 

C10H14N2Na 2O

2 H2O

Mr 372,2

Abbildung 11:Natriumedetat

3.4.2.2. Isotonisierungsmittel

Isotonisierungsmittel werden Zubereitungen zur nasalen Anwendung zugesetzt, um eine Angleichung der osmotischen Druckverhältnisse an physiologische Bedingungen zu erreichen. Nichtisotonisierte Lösungen, hypotonische Lösungen führen nach nasaler Applikation durch das osmotische Gefälle zu einem vorübergehenden Flüssigkeitseinstrom in die Zilienzellen und sind damit physiologisch nicht gut verträglich [56]. Nasal applizierte hypertone Lösungen reizen die Nasenschleimhaut ebenso, da sie zu einem osmotisch induzierten Schrumpfen der Zilienzellen führen.

Die Angleichung der Tonizität an physiologische Verhältnisse kann mit Hilfe von Puffersystemen (in der Regel Phosphatpuffersysteme) und/oder Isotonisierungsmitteln, wie Natriumchlorid, Sorbitol und Glukose, erfolgen. Im Allgemeinen ist eine Isotonisierung mit letzteren anzustreben, da Puffersysteme infolge ihrer Pufferkapazität nicht reizlos vertragen werden.


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3.4.2.3.  Natriumhyaluronat

Makromoleküle wie Natriumhyaluronat in wässrigen Nasentropfen dienen in der Regel der Viskositätserhöhung, verbunden mit längerer Verweildauer der Formulierung auf der Schleimhaut und besserer Akzeptanz durch den Patienten.

Ph. Eur. 2002:

Natriumhyaluronat ist das Natriumsalz der Hyaluronsäure, einem

Glucosaminoglucan, bestehend aus Disaccharid-Einheiten aus D-

Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin

Abbildung 12:Disaccharidbaustein des Natriumhyaluronat

Natriumhyaluronat ist das Natriumsalz der Hyaluronsäure, einem natürlichen Glucosaminoglucan aus alternierenden (1,3)-verknüpften N-Acetyl-ß-D-glucosamin- und (1,4)-verknüpften ß-D-Glucuronsäureeinheiten mit sehr hoher Molekülmasse.

Natriumhyaluronat ist unter anderem Bestandteil der interzellulären Matrix des menschlichen Gelenkknorpels und bewirkt dort als viskoelastische Gelenkflüssigkeit den Druckausgleich bei Belastung. Aus dieser Eigenschaft ergibt sich das hauptsächliche Einsatzgebiet des Natriumhyaluronats bei degenerativen Gelenkerkrankungen. Daneben findet die Substanz zur lokalen Behandlung schlecht heilender Wunden und in der Augenchirurgie Einsatz [114].

In jüngerer Zeit ist die biotechnologische Herstellung von Hyaluronsäure, die bisher bevorzugt aus Hahnenkämmen gewonnen wurde, möglich [115], sodass ihre mukoadhäsiven Eigenschaften vielfältig genutzt werden können. Als physiologisches, nichttoxisches Makromolekül gelangt sie in der Ophthalmologie als Tränenflüssigkeitsersatz zur Anwendung [116] und ist als potentielles Mukoadhäsivum in nasalen Zubereitungen Objekt vielfältiger Forschung [27, 117].


Fußnoten und Endnoten

1 Applikation: s: systemisch, l: lokal, sl : systemisch oder lokal

2 Die systemische Gabe von Natriumcromoglicat ist lediglich bei durch Nahrungsmittel hervorgerufener AR indiziert.

3 Die systemische Gabe von Natriumcromoglicat ist lediglich bei durch Nahrungsmittel hervorgerufener AR indiziert.

4 Nur kurzzeitige systemische Gabe zur Anstoßtherapie bei schwerer Rhinitis.

5 Im Folgenden wird der Begriff Mucin , der streng genommen nur die Glykoproteinkomponente des Mukus bezeichnet, für die aus dem kommerziell erwerbbaren Mukus hergestellte Modelldispersion verwendet. Der „rohe“ Mukus wird durch Abkratzen der Schleimhaut, grobe Reinigung und nachfolgende Gefriertrocknung gewonnen. Er enthält neben den Mucinmolekülen auch alle anderen Bestandteile des Mukus.



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17.02.2004