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4.  Ergebnisse und Diskussion

4.1. Entwicklung und Validierung der Analysenverfahren (HPLC)

4.1.1. Allgemeines

Vergleichende quantitative Aussagen, z. B. über die Verteilung eines Arzneistoffes zwischen zwei flüssigen Kompartimenten, die durch eine biologische oder synthetische Membran getrennt sind, erfordern die exakte Bestimmung des Arzneistoffgehaltes. Um eine Aussage darüber treffen zu können, ob aufgetretene Unterschiede im Verteilungsverhalten systembedingt sind, d. h. in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Kompartimente usw. auftreten, müssen analysebedingte Einflüsse (durch Matrix und analytische Methode) ausgeschlossen werden. Dazu bedarf es der Verwendung etablierter, validierter Analysenmethoden, d. h. der Verwendung von analytischen Methoden, die gleich bleibend zuverlässig richtige Ergebnisse für die Bestimmung des Analyten in der jeweiligen Matrix liefern [118]. Der Validierungsprozess umfasst die Entwicklung der Methode, die Validierung vor den Probenmessungen und die Qualitätssicherung während der Probenmessungen [119]. Die im Zuge der Validierung zu untersuchenden Eigenschaften und deren Umfang ergeben sich aus dem Anwendungsbereich der analytischen Methode [120].

Im Rahmen pharmakokinetischer Untersuchungen, wie sie unter 4.3.4 durchgeführt wurden, kommt der Validierung der bioanalytischen Analysenmethode eine besonders große Bedeutung zu, da der Matrixeinfluss meist sehr komplex ist [121].

Zur Bestimmung der Analyten OXY, XYLO und DSCG in der jeweiligen Matrix wurden Methoden der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit UV-Absorptions­detektion angewendet, die im Falle der bioanalytischen Methode für DSCG (↑ 5.2.2.3 und 5.2.6) mit einer Flüssig-flüssig-Extraktion gekoppelt war. Bei der HPLC kommt es durch Verteilung zwischen einer stationären und einer mobilen Phase zur Auftrennung der in der Probe enthaltenen Komponenten. Die entstehenden Chromatogramme sind qualitativ und quantitativ auswertbar [122]. Als stationäre Phase wurde das in der HPLC am häufigsten angewandte Säulenfüllmaterial, die durch Anknüpfung von C-18-Alkylketten an Silica-Gel gewonnenen Umkehr-Phasen (reversed phase), verwendet [118].

Die Validierung der entwickelten Analysenmethoden und die Qualitätssicherung während der Probenmessungen wurden entsprechend den aktuellen internationalen Anforderungen [120, 121] durchgeführt. Eine detaillierte Aufstellung dieser Richtlinien und Empfehlungen sowie der durchgeführten Untersuchungen im Einzelnen übersteigt jedoch den inhaltlichen Rahmen dieser Arbeit. Im Folgenden werden daher nur die wichtigsten, zur Validierung der analytischen Methoden herangezogenen Eigenschaften erläutert.


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Die Spezifität ist die Fähigkeit der Methode, den Analyten ohne Verfälschung durch andere in der Probe vorhandene Komponenten zu erfassen. Die Überprüfung der Spezifität erfolgt z. B. bei chromatographischen Verfahren durch den Vergleich des Chromatogramms eines Standards mit dem einer Probe, die alle denkbaren Störsubstanzen inklusive der Matrix enthält. Als Schnellmethoden zur Überprüfung auf Überlagerung relevanter Peaks im Chromatogramm sei die Bestimmung von Peakbreite und Asymmetriefaktor im Verhältnis zur Retentionszeit genannt [119].

Die Richtigkeit ist das Maß für die Abweichung zwischen dem mittels der betreffenden Methode ermittelten Wert und einem als richtig angesehenen Wert und damit für den systematischen Fehler der Methode. Als quantitatives Maß für die Richtigkeit gilt die systematische Ergebnisabweichung [119]. Die Bestimmung der Richtigkeit kann unter anderem durch Vergleich der ermittelten Messwerte mit denen einer Methode mit nachgewiesener Richtigkeit (z. B. Gehaltsbestimmung nach einer Pharmakopöe) [120], durch Verwendung von Referenzsubstanzen oder bei nachgewiesener Spezifität und Linearität der Methode durch Plausibilitätserklärung [119] erfolgen.

Neben der Abweichung des Analysenergebnisses vom wahren Wert (Lageparameter) kommt der Bestimmung der Präzision als Maß für die Streuung von Analysenergebnissen (Streuparameter) infolge von zufälligen Fehlern große Bedeutung zu. Es wird zwischen der Wiederholpräzision (Schwankung der Analysenergebnisse derselben Probe unter gleichen Bedingungen innerhalb einer Serie oder verschiedener Serien) und der Vergleichspräzision (Schwankung der Analysenergebnisse derselben Probe unter verschiedenen Bedingungen) unterschieden, die sich aus der methodischen und der gerätebedingten Streuung der Messwerte ergibt [119].

Dient eine Methode ausschließlich der quantitativen Bestimmung eines Analyten, ist lediglich die Bestimmungsgrenze , d. h. die Konzentration von Interesse, bis zu der der Analyt mit genügender Präzision und Richtigkeit bestimmbar ist [119]. Bei chromatographischen Verfahren, als Verfahren mit einem Grundrauschen des Detektors, kann dazu das Signal­Rausch-Verhältnis dienen. Neben dieser Möglichkeit kann die Bestimmungsgrenze auch anhand der Standardabweichung des Signals und der Steigung der Kalibriergeraden berechnet werden [120].

Die Kalibrierfunktion beschreibt den Zusammenhang zwischen dem gemessenen Signal und der Konzentration. Der Arbeitsbereich ist der Konzentrationsbereich der Kalibrierfunktion für den, bei einem linearen Zusammenhang zwischen Signal und Konzentration, die Methode mit ausreichender Präzision, Richtigkeit und gegebener Linearität dem beabsichtigten Zweck genügt. Genügende Präzision und Richtigkeit heißt z. B. < 1 % für die Messpräzision, 1-2 % für die Methodenpräzision. Bei komplexer Matrix liegen die Grenzen höher [119].


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Die Robustheit ist ein Parameter, der eigentlich in der Phase der Methodenentwicklung überprüft und erfasst wird. Eine robuste Methode zeichnet sich durch hohe Reproduzierbarkeit bei Veränderung der analytischen Bedingungen aus. Unterschieden wird zwischen der Methodenrobustheit (Einfluss von Temperatur, pH-Änderung der mobilen Phase, Proben- und Matrixkonzentration), der Verfahrensstabilität (Stabilität der Lösungen) und der Anwendbarkeit (Wechsel von Anwender, Labor oder Gerät) [120].

Für die im Folgenden aufgeführten entwickelten HPLC-Methoden konnten ausreichende Präzision und Richtigkeit bei gegebener Linearität über den Arbeitsbereich der Kalibrierfunktion ermittelt werden [119]. Die Verfahrensstabilität über den Zeitraum der Probenmessungen war gegeben. Die Richtigkeit der Qualitätskontrollproben, die Systemeignung (chromatographische Bedingungen) und die Charakteristika der Kalibrier­geraden im Rahmen der Routineanalytik lagen innerhalb der in der Validierung ermittelten 95 % Vertrauensintervalle; Trends waren dabei nicht zu erkennen.

4.1.2. Xylometazolinhydrochlorid und Oxymetazolinhydrochlorid

Ziel war bei diesen beiden Substanzen, die Entwicklung einer HPLC-Methode zu sichern, die eine einfache und zeitsparende Analyse im Rahmen der Permeations- und Liberationsstudien erlaubte. Während die Gehaltsbestimmung in wässrigen Lösungen von XYLO und OXY mittels der UV/Vis-Spektroskopie bei einer Wellenlänge von 217 bis 220 nm ohne weiteres möglich war, zeigten die Akzeptoren (die Matrix) bei den Permeationsstudien hohe, nichtreproduzierbare Eigenabsorptionen bei diesen Wellenlängen. Auf eine Darstellung dieser Untersuchungen und der Parameter der UV-metrischen Methode (↑ 5.2.2.5) wird verzichtet.

Die zum Zeitpunkt der durchgeführten Permeationsstudien in der verfügbaren Literatur be­schriebenen Methoden (z. B. [123, 124, 125]) erwiesen sich für die gegebenen Bedingungen und Anforderungen als unpraktikabel oder nicht übertragbar.

Im Rahmen der Entwicklung der HPLC-Methode wurden Wasser/Methanol- oder Wasser/Acetonitril-Gemische verschiedener Zusammensetzung mit und ohne Ionenpaar­reagenz1 (Pentansulfonsäure) bei verschiedenen pH-Werten und Fließgeschwindigkeiten getestet. Triethylamin wurde der wässrigen Phase in verschiedenen Prozenten zugesetzt. Die chromatographischen Bedingungen (↑ 5.2.2.3), die für die Validierung ausgewählt wurden, erzielten hinsichtlich Retentionszeit und Tailingfaktor akzeptable Ergebnisse [, ].


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Der Vergleich der Chromatogramme der Standards von OXY und XYLO mit denen der substanzfreien und substanzhaltigen Matrix zeigte, dass keine störenden Interferenzen durch die Matrix auftraten (Daten nicht dargestellt). Die Steigungen und Achsenabschnitte der Kalibriergeraden der matrixhaltigen und matrixfreien Systeme unterschieden sich nicht signifikant voneinander (t-Test). Daher wurden für die Kalibrierung und die Qualitätskontrollproben in diesem Fall matrixfreie Standards verwendet (↑ 5.2.2.2).

Abbildung 13 gibt die typischen Chromatogramme von OXY und XYLO wieder. In Tabelle 2 sind die Hauptvalidierungsparameter aufgeführt.

Abbildung 13:Chromatogramme von OXY und XYLO

Tabelle 2: Validierungsparameter der entwickelten HPLC-Methoden für XYLO und OXY2

 

XYLO

OXY

Präzision 3 , 4 [%]

1,38

1,50

Richtigkeit 3 [%]

1,99

2,10

Kalibrierfunktion

  

Arbeitsbereich

2 … 15 µg/ml

2 … 15 µg/ml

Steigung [µg/ml]

(5,95 ± 0,044) x 10-5

(6,44 ± 0,074) x 10-5

Achsenabschnitt [µg]

0,01 ± 0,0033

0,03 ± 0,0019

Korrelationskoeffizient

0,998

0,997

Bestimmungsgrenze [µg/ml]

0,08

0,114

Retentionszeit [min]

2,15 ± 0,15

2,17 ± 0,11

Tailingfaktor

1,34

1,42


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4.1.3.  Natriumcromoglicat

Bei Natriumcromoglicat stand die Entwicklung einer HPLC-Methode im Vordergrund, die geeignet war, bei Bedarf eine schnelle Routineanalytik zu erlauben und gleichzeitig die Gehaltsbestimmung im Rahmen der In-vivo-Versuche und Penetrationsstudien zu realisieren.

Die in der Literatur beschriebenen Verfahren erwiesen sich als wenig geeignet für eine Routineanalytik [128, 129, 130], was vor allem damit zu begründen war, dass bei einem pH­Wert der mobilen Phase von 2,3 eluiert wurde und DSCG bei diesem pH-Wert zum Teil noch als ionische Substanz vorlag, die vermutlich mit den freien Silanolgruppen der Säulenmatrix reagierte. Die zitierten Methoden erwiesen sich zudem als wenig geeignet hinsichtlich Methodenrobustheit und Verfahrensstabilität.

Deswegen erfolgte die Umstellung auf eine Elution mit Ionenpaarreagenz5. Zugleich wurde die Methode so gestaltet, dass bei Bedarf durch Variation der Fließmittelzusammensetzung der mobilen Phase eine Verschiebung zu späteren Retentionszeiten ohne Einbuße der Qualität möglich war. Im Zuge der Entwicklung der Methode wurden verschiedene pH-Werte bei variierender Zusammensetzung des Acetonitril/Puffer- und Acetonitril/Wasser-Gemisches getestet.

Die chromatographischen Bedingungen (↑ 5.2.2.3), die für die Validierung ausgewählt wurden, erzielten hinsichtlich Retentionszeit und Tailingfaktor akzeptable Ergebnisse [126, 127].

Im Rahmen der bioanalytischen Methode wurde kein interner Standard mitextrahiert. Für die Herstellung der Qualitätskontrollproben wurde Schweineplasma verwendet, da die Art des Plasmas keinen Einfluss auf die Kalibrierfunktion ausübte (↑ 5.2.6).

Abbildung 14 zeigt das Chromatogramm von DSCG im Rahmen der „Routineanalytik“ und der Plasmaanalytik (↑5.2.2.3 und 5.2.6). Tabelle 3 stellt die während der Validierung ermittelten Charakteristika für die entwickelte Methode dar.

Die entwickelte Methode erwies sich hinsichtlich der Variation der Fließmittel­zusammensetzung als ein sehr robustes Verfahren. Auch der Wechsel des Gerätes hatte auf die Messergebnisse keinen Einfluss (Differenzentest, Daten nicht dargestellt).


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Abbildung 14:Chromatogramme DSCG: Plasmaanalytik und Routineanalytik

Tabelle 3: Validierungsparameter der entwickelten HPLC-Methoden für DSCG6

 

Routineanalytik

Plasmaanalytik

 

Fließmittelzusammensetzung der mobilen Phase

 

(Puffer:Acetonitril)

 
 

75:25

80:20

80:20

Präzision 7 , 8 [%]

2,60

1,53

5,12

Richtigkeit 3 [%]

1,44

1,30

14,40

Kalibrierfunktion

   

Arbeitsbereich

0,5 … 10 µg/ml

0,5 … 10 µg/ml

0,1 … 3,0 µg/ml

Steigung [µg/ml]

(3,76 ± 0,040) x 10-5

(3,74 ± 0,058) x 10-5

(3, 25 ± 0,21) x 10-5

Achsenabschnitt [µg]

(-0,014 ± 0,006)

(-0,005 ± 0,002)

(-0,003 ± 0,002)

Korrelationskoeffizient

0,999

0,998

0,992

Bestimmungsgrenze [µg/ml]

0,100

0,154

0,115

Wiederfindung [%]

n.b.

n.b.

85,6

Retentionszeit [min]

(2,59 ± 0,09)

(7,05 ± 0,05)

(7,08 ± 0,09)

Tailingfaktor

1,12

1,10

1,12


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4.2.  Vergleichende Untersuchungen von Natriumcromoglicat, Xylometazolinhydrochlorid und Oxymetazolinhydrochlorid

XYLO und OXY wurden für die vergleichenden Untersuchungen als Strukturanaloge mit unterschiedlicher Lipophilie bei annähernd gleicher Molekülgröße gewählt (Tab. 4 und 5). Natriumcromoglicat ist ein hydrophiler Modellarzneistoff mit einer relativ hohen Molekülmasse (Tab. 4 und 5). Tabelle 4 zeigt die Wirkstoffparameter der drei Arzneistoffe in isotonem Phosphatpuffer pH 6,0 (PBS).

Die wässrigen Lösungen der drei Arzneistoffe (0,0039 M) zeigten sich hinsichtlich pH-Wert, Gefrierpunktserniedrigung, dynamischer Oberflächenspannung und Dichte kaum von Wasser verschieden. Auch bei der Verwendung des isotonischen Phosphatpuffers als Lösungsmittel bewirkte der Zusatz der Arzneistoffe keine wesentliche Veränderung der bereits genannten physikalisch-chemischen Eigenschaften (Daten in 7.3 dokumentiert).

Tabelle 4: Wirkstoffparameter von DSCG, XYLO, OXY in PBS pH 6,0

 

VK

pKa

α

DSCG

(Mr 512)

0,128 ± 0,008

2,3

>99 %

XYLO

(Mr 281)

0,440 ± 0,038

10,6

>99 %

OXY

(Mr 297)

0,198 ± 0,070

9,87

>99 %

Der Phosphatpuffer selbst zeigt jedoch mit seiner Ionenstärke µ einen deutlichen Effekt auf die Verteilungskoeffizienten der Arzneistoffe. So ist z. B. der VK von DSCG in PBS 6,0 (µ 0,201) um das Vierfache größer als in dem des Phosphatpuffersystems nach List [131] (µ 0,088) (siehe Tab. 5).

Tabelle 5: Verteilungskoeffizienten der Arzneistoffe in verschiedenen Puffern

 

Phosphatpuffersystem nach List [131] (0,067 M)

PBS (0,162 M)

 

pH 5,5

pH 6,0

pH 7,4

pH 6,0

DSCG

0,042 ± 0,006

0,038 ± 0,005

0,052 ± 0,004

0,128 ± 0,008

XYLO

0,335 ± 0,073

0,815 ± 0,159

1,267 ± 0,159

0,440 ± 0,038

OXY

0,168 ± 0,035

0,211 ± 0,159

0,471 ± 0,038

0,198 ± 0,07


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4.2.1.  Fertigarzneimittel

4.2.1.1. Zusammensetzung und Charakterisierung der Fertigarzneimittel

Die Fertigarzneimittel (FAM), die die drei Arzneistoffe zur nasalen Anwendung enthalten, wurden unter der Vorgabe ausgewählt, dass ein möglichst großes Spektrum variierender Zusammensetzung erfasst wird (Tab. 6).

Tabelle 6: Zusammensetzung der Fertigarzneimittel9

Präparat

EDTA

BAC

weitere Hilfsstoffe der wässrigen Lösungen laut

Hersteller

Natriumcromoglicat (20 mg/ml)

   

Cromo pur von ct®

x

 

Glukose

Cromohexal®

x

x

Natriumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat,

Natriummonohydrogenphosphat, Sorbitol

Cromohexal sanft®

x

 

Sorbitol

Cromo ratiopharm®

x

  

Vividrin®

x

x

Polysorbat 80, Sorbitol, Natriumhydroxid

Xylometazolinhydrochlorid (1 mg/ml)

   

Nasan®

x

x

Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat,

Natriumhydroxid, Polyvidon

Xylo comod®

x

 

Natriumdihydrogenphosphat,

Natriummonohydrogenphosphat, Sorbitol

Nasentropfen E

 

x

 

ratiopharm®

Xylo von ct®

 

x

Glycerol, Zitronensäure, Natriumcitrat

Oxymetazolinhydrochlorid (0,5 mg/ml)

   

Nasivin®

x

x

Natriumdihydrogenphosphat,

Natriummonohydrogenphosphat, Natriumhydroxid


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Die Europäische Pharmakopöe (2002) fordert in der Monographie Nasalia, dass bei der Herstellung, Verpackung, Lagerung und dem Inverkehrbringen von Zubereitungen zur nasalen Anwendung Maßnahmen zur Gewährleistung ihrer mikrobiologischen Qualität zu ergreifen sind. Dazu enthalten wässrige Nasentropfen laut Arzneibuch im Mehrdosenbehältnis ein geeignetes Konservierungsmittel. Die als Standardkonservierungsmittel für Nasalia eingesetzte Verbindung Benzalkoniumchlorid ist wiederholt wegen ihrer zilientoxischen Eigenschaften bei Langzeitanwendungen kritisiert worden (↓ 3.4.2.1) [, ].

Als zunehmend eingesetzte, moderne Applikationssysteme, die einer Konservierung der enthaltenen Arzneistofflösung nicht bedürfen, seien die COMOD®-Systeme genannt [132]. Hierbei handelt es sich um ein doppelwandiges Mehrdosenbehältnis mit flexiblem Innenbeu­tel, ausgerüstet mit einem Pumpdosiersystem (Airless-Pumpe), bei dem keine kontaminierte Luft oder Flüssigkeit in das Arzneimittel zurückströmen kann, was zusätzlich durch den oligodynamischen Effekt der versilberten Ventilteile unterstützt wird.

Die Erkenntnisse über die negativen Eigenschaften von BAC führten z. B. dazu, dass die Nasentropfen E ratiopharm® jetzt als konservierungsmittelfreies Präparat im Handel sind. XYLO und OXY enthaltende Fertigarzneimittel werden zunehmend mit Dexpanthenol als pflegender Komponente vertrieben, denn auch für diese Wirkstoffe sind zilientoxische Eigenschaften seit langem bekannt (↓ 3.4.1.2) [16108]. Während bei letzteren die Anwendungsdauer der Fertigarzneimittel bereits auf wenige Tage beschränkt ist, beabsichtigt das BfArM erst jetzt, für BAC enthaltende Nasalia die Anwendungsdauer ähnlich zu begrenzen und die Packungsbeilage mit einem entsprechenden Warnhinweis zu versehen [3].

Die Eigenschaften der charakterisierten Fertigarzneimittel (Tab. 7) zeigen, dass es sich um annähernd isotonische, nichtviskositätserhöhte, zum Teil gepufferte Lösungen mit einem pH­Wert von 5,5 bis 6,0 handelt. Lediglich Cromo ratiopharm® weicht mit einer Tonizität von 69 mOsmol/kg deutlich ab.

Sind die Arzneistofflösungen mit Benzalkoniumchlorid konserviert (vgl. Tab. 6), ist eine deutliche Verminderung der Oberflächenspannung gegenüber Wasser (ca. 72,8 mN/m) zu registrieren, die durch den tensidischen Charakter von BAC bedingt ist.

Auffallend ist, dass die Routineüberprüfung auf Wechselwirkungen mit einer Mucindispersion (↑ 5.2.5.2) für die natriumcromoglicathaltigen Fertigarzneimittel einen positiven Mukoadhäsionsindex (↓3.3.3) ergab. Für XYLO und OXY wurden dagegen keine messbaren Effekte festgestellt.


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Tabelle 7 dokumentiert die ermittelten physikalisch-chemischen Parameter der Fertigarz­neimittel. Auf die Angabe der Standardabweichung der Messergebnisse wird verzichtet, da diese, mit Ausnahme der des Mukoadhäsionsindexes, unter 1 % lag. Eine Angabe der Standardabweichung für den Mukoadhäsionsindex ist, durch die Vielzahl der Standard­abweichungen, die in die Berechnung eingehen, nicht mehr sinnvoll.

Tabelle 7: Physikalisch-chemische Parameter der Fertigarzneimittel

Präparat

pH

Osmolalität

DV

OFS

Dichte

M-Ix

[mOsmol/kg]

[mPas]

[mN/m]

[g/cm3]

[Pa]

Natriumcromoglicat

      

Cromo pur von ct®

6,08

261

0,793

63,93

1,017

2,17

Cromohexal®

6,82

299

0,735

43,85

1,020

2,21

Cromohexal sanft®

5,89

286

0,701

61,36

1,022

2,27

Cromo ratiopharm®

5,59

69

0,779

66,43

1,007

2,45

Vividrin®

5,53

272

0,836

37,15

1,022

1,81

Xylometazolinhydrochlorid

      

Nasan®

6,07

281

0,772

37,61

1,010

0

Xylo comod®

6,04

260

0,751

58,08

1,014

0,39

Nasentropfen E

5,75

265

0,720

37,16

1,005

0

ratiopharm®

Xylo von ct®

5,86

257

0,716

31,18

1,000

0

Oxymetazolinhydrochlorid

      

Nasivin®

5,96

288

0,731

37,89

1,015

0

Die für DSCG, mit einer durch den Probenansatz determinierten Konzentration von 5 mg je Gramm Probengemisch, ermittelten Mukoadhäsionsindizes liegen in der Größenordnung der Werte, die für mukoadhäsive Polymere in zum Teil höheren Konzentrationen durch Oechsner [] ermittelt wurden. Beispielhaft sei der Mukoadhäsionsindex für Polyacrylsäure 2 mg/ml, einem klassischen Mukoadhäsivum, mit 1,62 Pa angeführt.

Die für die einzelnen Schergeschwindigkeiten (25, 50, 75, 100 1/s) ermittelten Viskositäten (↑ 5.2.5.2) der natriumcromoglicathaltigen FAM/Mucin-Gemische unterschieden sich signifikant von denen des Mucin/Puffer-Gemisches (t-Test).


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4.2.1.2.  In-vitro-Permeation

Die Verteilung eines gelösten Stoffes zwischen zwei flüssigen Kompartimenten, die durch eine Membran getrennt sind, kann als Diffusion durch eine, in eine oder aus einer Schicht betrachtet werden. Die dem Verteilungsverhalten zugrunde liegenden Gesetze sind in jedem Fall die Fick’schen Diffusionsgesetze. Sie werden bei einzuhaltenden Versuchsbedingungen entsprechend der jeweiligen Fragestellung aufgelöst [78].

Ist lediglich der Durchtritt durch eine Barriere (biologische oder synthetische Membran) von Interesse, wird folgende Ableitung benutzt und der Permeabilitätskoeffizient bestimmt:

(Gl. 11)

Der apparente Permeabilitätskoeffizient P app [cm/s] stellt dabei die Geschwindigkeit des Stoffdurchtrittes durch die Membran dar und ergibt sich aus der gesamten permeierten Wirkstoffmenge ΔQ [µg] zur Zeit t [min], der Permeationsfläche A [cm2], der Ausgangskonzentration c 0 [µg] und dem Umrechnungsfaktor von Minuten in Sekunden. Der Quotient ΔQ/Δt [µg/min] stellt dabei die nach Erreichen des „steady-state“ konstante Permeabilitätsrate (Flux) dar und kann der graphischen Darstellung „permeierte Arznei­stoffmenge gegen Zeit“ als Steigung der resultierenden Geraden entnommen werden [133].

Im „quasi-stationären“ Zustand (steady-state) sind zwar die Konzentrationen im Donator- und Akzeptorkompartiment verschieden, ihr Verhältnis zueinander ist aber durch den konstanten Konzentrationsgradienten in der Barriere zeitunabhängig. Voraussetzung für die Gültigkeit dieser Beziehung ist eine ausschließlich membrangesteuerte Diffusion. Diese liegt vor, wenn

Der auf diese Weise ermittelte P app charakterisiert das Transportvermögen eines zellulär hoch differenzierten Gewebes für einen Arzneistoff und ist eine zusammengesetzte Größe aus dem Diffusionskoeffizienten D app und den Verteilungskoeffizienten VK (Membran, Flüssigkeit) des Arzneistoffes [78, 134].

Der absolute Permeabilitätskoeffizient P wird durch den Bezug auf die Membrandicke erhalten [135]. Da jedoch für die durchgeführten Permeationsstudien stets die gleiche[Seite 35↓] biologische oder synthetische Membran verwendet wurde, werden die ermittelten apparenten Permeabilitätskoeffizienten zur Auswertung herangezogen.

Jeder der im Folgenden aufgeführten Permeationsversuche wurde sowohl mit exzidierter Rin­dernasenschleimhaut als biologischer Membran als auch mit dem synthetischen Nephrophan® (regenerierte Cellulose) als Permeationsbarriere durchgeführt. Der Nephrophan®-Versuch stellt dabei eine sinnvolle Ergänzung der Permeationsstudien mit dem biologischen Material dar, da er nur den Einfluss der Formulierung auf das Permeationsverhalten des Arzneistoffes erfasst.

Beide Barrieren sind hinsichtlich ihrer Porengröße und ihrer Dicke durchaus vergleichbar. Für Moleküle mit Radien über 1 nm sind die „Poren“ der biologischen Membran nicht mehr per­meabel [51], während für Nephrophan® ca. 2,4 nm als Porengröße angegeben werden [136]. Die Dicke der gequollenen synthetischen Membran kann auf 40 bis 55 µm geschätzt werden (↑ 4.2.2.3), während Corbo et al. [23] für Rindernasenschleimhaut ca. 53 µm angeben. Die „Durchlässigkeit“ der Nephrophan®-Membran für die drei Arzneistoffe wurde überprüft: nach entsprechender Zeit lag eine Gleichverteilung der Substanzen in beiden Kompartimenten vor (Daten nicht dargestellt).

Permeation durch Rindernasenschleimhaut

Die Permeabilitätskoeffizienten der drei Arzneistoffe aus ihren Fertigarzneimitteln liegen in der für solche als „leaky“ bezeichneten Gewebe beschriebenen Größenordnung von 10-5 cm/s [13, 23, 42, 137]. Ein linearer Zusammenhang der Auftragung „permeierte Menge gegen Zeit“ lag vor.

Prozentual betrachtet, permeierte aus den XYLO enthaltenden Fertigarzneimitteln die quantitativ größte Arzneistoffmenge in der Versuchszeit. Während die Formulierungspara­meter mit Ausnahme von Xylo comod®, dem konservierungsmittelfreien Präparat mit Sorbitol als Isotonisierungsmittel, weder tendenziell noch signifikant einen Einfluss auf das Permeationsverhalten von XYLO zeigen, sind bei DSCG deutliche Unterschiede in der permeierten Arzneistoffmenge in Abhängigkeit von der Formulierung festzustellen.

Im Falle von Vividrin® ist zu postulieren, dass das enthaltene Polysorbat 80 einen Membraneinfluss ausübt [36]. Dieser für Vividrin® gefundene Effekt erwies sich als signifikant beim Vergleich der Permeabilitätskoeffizienten mittels ANOVA. Bei Cromo ratiopharm® nimmt vermutlich die niedrige Tonizität des Fertigarzneimittels Einfluss. Anhand der unter 4.2.2 bzw. 4.3.1 untersuchten Eigenrezepturen soll der Einfluss einzelner Formulierungsparameter bestätigt bzw. näher charakterisiert und zugeordnet werden.

Tabelle 8 zeigt die Permeationsdaten der Arzneistoffe aus ihren Fertigarzneimitteln für Rindernasenschleimhaut.


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Tabelle 8: Permeation der Arzneistoffe aus den Fertigarzneimitteln durch Rindernasen­
schleimhaut

Präparat

P app x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

Natriumcromoglicat (20 mg/ml)

   

Cromohexal®

1,08 ± 0,23

1523,48 ± 619,33

2,54

Cromohexal sanft®

1,11 ± 0,19

1501,04 ± 742,68

2,50

Cromo pur von ct®

1,27 ± 0,13

1578,65 ± 419,45

2,63

Cromo ratiopharm®

0,49 ± 0,19

758,14 ± 529,33

1,26

Vividrin®

2,68 ± 0,36*

3810,86 ± 1187,54

6,04

Xylometazolinhydrochlorid (1 mg/ml)

   

Nasentropfen E ratiopharm®

1,85 ± 0,31

127,35 ± 44,29

3,88

Xylo comod®

2,86 ± 0,78

213,42 ± 147,18

6,50

Nasan®

1,74 ± 0,60

135,33 ± 113,78

4,12

Xylo von ct®

1,99 ± 0,35

144,15 ± 54,39

4,39

Oxymetazolinhydrochlorid (0,5 mg/ml)

   

Nasivin®

0,92 ± 0,051

25,19 ± 0,47

1,68

Permeation durch Nephrophan®

Das Permeationsverhalten der Arzneistoffe aus ihren FAM durch Nephrophan® charakterisieren die Daten in Tabelle 9.

Die Permeabilitätskoeffizienten von OXY und XYLO für die synthetische Membran unterscheiden sich nicht voneinander; auch nicht in Hinblick auf die Formulierungsparameter (ANOVA). Die Permeabilitätskoeffizienten von DSCG hingegen sind kleiner als die von OXY und XYLO. Ein signifikanter Formulierungseinfluss im Falle von Vividrin® und Cromo ratiopharm® ist festzustellen (ANOVA).

Vergleichende Betrachtung

Folgendes kann bei der vergleichenden Betrachtung der Permeationsdaten durch natürliches und synthetisches Gewebe festgestellt werden:

Tabelle 9: Permeation der Arzneistoffe aus den Fertigarzneimitteln durch Nephrophan®

Präparat

P app x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

Natriumcromoglicat (20 mg/ml)

   

Cromohexal®

1,77 ± 0,051

2405,05 ± 122,58

4,01

Cromohexal sanft®

1,83 ± 0,037

2527,52 ± 101,35

4,21

Cromo pur von ct®

2,01 ± 0,050

2787,91 ± 118,61

4,65

Cromo ratiopharm®

1,46 ± 0,11*

2156,66 ± 284,17

3,59

Vividrin®

1,41 ± 0,069*

1925,75 ± 165,59

3,38

Xylometazolinhydrochlorid (1 mg/ml)

   

Nasentropfen E ratiopharm®

2,89 ± 0,052

218,82 ± 7,39

6,66

Xylo comod®

2,52 ± 0,12

192,26 ± 15,45

5,85

Nasan®

2,66 ± 0,18

203,60 ± 6,20

6,20

Xylo von ct®

2,88 ± 0,070

216,28 ± 14,32

6,58

Oxymetazolinhydrochlorid (0,5 mg/ml)

   

Nasivin®

2,70 ± 0,090

217,14 ± 13,90

6,25

4.2.1.3. Mucinwechselwirkungen

Ein Nachteil der In-vitro-Permeationsstudien an isoliertem nasalem Gewebe liegt darin, dass die mukoziliäre Clearance als ein auf das nasale Absorptionsgeschehen stark Einfluss nehmender Parameter nicht erfasst wird [43]. Die hier durchgeführten Wechselwirkungs­studien mit einer Mukusmodelldispersion (Mucin) sollen diese Lücke ansatzweise schließen; denn sie geben Aufschluss über den Einfluss der Arzneistoffformulierung auf die [Seite 38↓]rheologischen (physikalischen) Parameter der Mucinmodelldispersion (Viskosität und Elastizität), die für eine optimale mukoziliäre Clearance von großer Bedeutung sind.

Wie bereits bei den methodischen Grundlagen erwähnt (↓ 3.3.3), ist die Messung der Scherviskosität eine Möglichkeit, die Wechselwirkungen von Arzneistoffzubereitungen mit dem Mukus oder stellvertretend mit seiner Modelldispersion (Mucin) zu quantifizieren. Eine mukoadhäsive Wechselwirkung der untersuchten Formulierung mit dem Mukus äußert sich in einer Scherviskosität des Gemisches, die größer ist als der Wert, der sich aus der Addition der Einzelviskositäten von Mucindispersion und Zubereitung ergibt. Der Mukoadhäsionsindex bringt diese überadditive Viskositätszunahme, die gegen die vorgegebene Scherbelastung relativiert wurde, zum Ausdruck.

Da die elastischen Eigenschaften der Mucindispersion bei der Bestimmung der Scher­viskosität nicht gesondert erfasst werden, ist durch die einfache Viskositätsbestimmung kein Rückschluss auf die Art der vorliegenden Wechselwirkungen zwischen Mucinglykoproteinen und Formulierung möglich. Es kann somit keine Aussage zur Veränderung des entscheidendsten rheologischen Parameters des Mukus, der Elastizität, in Hinblick auf eine Veränderung der MCC getroffen werden [138].

Der Einfluss der FAM auf die rheologischen Parameter einer Modelldispersion wurde daher in der vorliegenden Arbeit mittels einer oszillationsrheologischen Methode untersucht, die das gleichzeitige Erfassen viskoser (Verlustmodul) und elastischer Anteile (Speichermodul) ermöglicht. Um den theoretischen Hintergrund der oszillationsrheologischen Untersuchungen, die ausführlich im Abschnitt 4.3.3.1 behandelt werden, nicht vorweg nehmen zu müssen, wurden hier die bei einer bestimmten Frequenz (ω = 16,9 1/s) ermittelten Beträge der Komplexen Viskositäten auf den Mukoadhäsionsindex (↓ 4.2.1.1) umgerechnet. Abbildung 15 zeigt die auf diese Weise ermittelten Mukoadhäsionsindizes M-Ix der untersuchten Fertigarzneimittel.

Die oszillationsrheologischen Untersuchungen (↑ 5.2.5.1) erhärteten die bereits bestehende Vermutung, dass die natriumcromoglicathaltigen FAM mit der Mucindispersion signifikant wechselwirken. Der Vergleich von den für DSCG (5 mg/g)10 bei Verwendung der Handels­präparate ermittelten Mukoadhäsionsindizes (ω = 16,9 1/s) mit denen von Oechnser et al. [] angegebenen (z. B. Na-Carboxymethylcellulose (10 mg/ml): M-Ix = 8,22 Pa, Polyacrylsäure (2 mg/ml): M-Ix = 1,62 Pa (D = 25, 50, 75, 100 1/s)) verdeutlicht, dass das nichtmakro-molekulare DSCG deutliche „adhäsive“ Eigenschaften besitzt. Eine Beeinflussung der MCC nach nasaler Applikation natriumcromoglicathaltiger Zubereitungen ist aufgrund der ermittelten Wechselwirkung mit den Mucinglykoproteinen nicht auszuschließen. Der beobachtete viskositätserhöhende Effekt von DSCG unterscheidet sich mit Ausnahme der [Seite 39↓]tendenziellen Erniedrigung im Falle von Cromohexal® für die einzelnen FAM nicht voneinander (ANOVA). XYLO und OXY enthaltende FAM zeigten wiederum keinen Effekt auf die untersuchten rheologischen Parameter der Mucindispersion.

Abbildung 15:Mukoadhäsionsindizes der FAM (ω = 16,9 1/s)

Die Mucinwechselwirkung von DSCG ist mit Hilfe der durchgeführten oszillations­rheologischen Untersuchungen bestätigt worden. Da die angegebenen Mukoadhäsionsindizes (Abb. 15) lediglich die „Adhäsivität“ der Substanz bei einer Frequenz (ω = 16,9 1/s) des aufgenommenen Frequenzsweeps anhand der rheologischen Größe „Komplexe Viskosität“ belegen, ist an dieser Stelle keine Aussage zur Einflussnahme der Formulierungsparameter möglich. Weitere oszillationsrheologische Untersuchungen mit den arzneistoffhaltigen und arzneistofffreien Zubereitungen sollen zeigen, ob und in welchem Maße der „adhäsive“ Effekt von DSCG durch Formulierungsparameter beeinflusst wird und ob diese selbst die rheologischen Parameter der Mucindispersion verändern. Dabei werden die aussagefähigeren oszillationsrheologischen Größen des gesamten Frequenzsweeps zur Auswertung gelangen.


[Seite 40↓]

4.2.2.  Eigenrezepturen

Im Folgenden wurde das Permeationsverhalten der Arzneistoffe aus den Eigenrezepturen unter Veränderung der Tonizität, des Isotonisierungsmittels und des Einflusses der Hilfsstoffe EDTA und/oder BAC untersucht. Weiterhin sollten oszillationsrheologische Studien den Hilfsstoffeinfluss auf die rheologischen Parameter der Modelldispersion selbst sowie die Wechselwirkungen von DSCG mit der Mucindispersion charakterisieren.

4.2.2.1. In-vitro-Permeation

Für die durchgeführten Permeationsstudien wurde als Donatormedium generell Phosphatpuffer pH 6,0 (PBS) verwendet, der, soweit nicht anders ausgewiesen, isoton war (ca. 280 mOsmol/kg). Akzeptorseitig und für die Equilibierung des Gewebes wurde physiologischer Puffer pH 7,4 (EBS) verwendet. Die molare Konzentration der verwendeten Arzneistoffe betrug stets 0,0039, um eine Vergleichbarkeit zu ermöglichen und Konzentrationseinflüsse zu eliminieren11. Der statistische Vergleich (t-Test) der P app für die einzelnen Arzneistoffe bezieht sich immer auf das isotone System PBS 6,0 mit 0,0039 M Arzneistoff ( Referenz ).

Bei Verwendung der biologischen Membran traten relativ hohe Variationskoeffizienten für P app auf, was aber ähnlich auch für parazelluläre Markersubstanzen an diesem Gewebe beschrieben wurde [23, 137]. Das Finden statistischer Signifikanzen wird jedoch dadurch eingeschränkt. Histologische Untersuchungen an exzidiertem nasalem Gewebe ergaben, dass bereits unbehandeltes Gewebe große Unterschiede im Öffnungs- und Verteilungsverhalten der Tight-junctions aufweist [55]. Schmidt et al. [42] geben bei der Bestimmung des parazellulären Permeationsverhaltens von Peptiden an Rindernasenschleimhaut Variations­koeffizienten von bis zu 30 % als gut reproduzierbar an.

Reardon et al. [139] konnten nach dem Einspannen von nasaler Mukosa in Side-Bi-SideTM­Diffusionszellen über den Versuchszeitraum keine drastischen morphologischen Verände­rungen der Mukosa finden. Zilien und Mikrovilli des Epithels waren intakt, der junctionale Komplex zeigte keine Veränderung. Nach einer Vorinkubationszeit und während einer Versuchsdauer von 90 min veränderten sich die elektrophysiologischen Parameter des Epithels nicht.

Anderberg et al. [140] geben an, dass das Entfernen des physiologischen Puffers (EBS pH 7,4) nach der Equilibrierungsphase keinen Einfluss auf die Vitalität und die [Seite 41↓]parazellulären Transportmechanismen der biologischen Membran nimmt. Der physiologische Puffer akzeptorseitig genügt, um z. B. die physiologischen Ca2+-Konzentrationen in der Membran aufrecht zu erhalten. Phosphatgepufferte Systeme werden für Studien mit exzidiertem tierischem Gewebe empfohlen [13].

Permeation aus isotonem Phosphatpuffer

Tabelle 10 zeigt die gewonnenen Daten nach Permeation der Arzneistoffe aus PBS durch die beiden Membranen Rindernasenschleimhaut und Nephrophan®. In Abbildung 16 ist der Permeationsverlauf für die biologische Membran graphisch dargestellt.

Zusätzlich zu den Permeationscharakteristika der drei Arzneistoffe sind im Falle der Rindermukosa die von Fluorescein-Natrium (FLU), einer parazellulären Markersubstanz [141, 142], angegeben, die im Rahmen der Vorinkubationsversuche mit Natriumcromoglicat unter 4.3.1.2 ermittelt wurden. Als eine solche Substanz ist Fluorescein-Natrium eine Verbindung, die einerseits ausschließlich parazellulär permeiert und andererseits nicht mit den Bestandteilen der biologischen Membran wechselwirkt. Der Vergleich der Permeationsdaten der Arzneistoffe mit denen eines Markers erlaubt eine Aussage darüber, ob neben der Molekülmasse arzneistoffspezifische Faktoren das Permeationsverhalten beeinflussen. Allerdings muss der Vergleich bei den im Folgenden durchgeführten Untersuchungen unter der Einschränkung erfolgen, dass FLU in einer Konzentration von 100 µM in EBS pH 7,4, anstelle des isotonischen Phosphatpuffers pH 6,0, für die Untersuchung des Permeations­verhaltens verwendet wurde, was sich aus der Fragestellung der Versuche unter 4.3.1.2 ergab.

Tabelle 10: Permeation der Arzneistoffe und Fluorescein-Natrium (c = 100 µM) durch
Rindernasenschleimhaut und Nephrophan®

Arzneistoff

Papp x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

Rindernasenschleimhaut

   

DSCG

* *1,41 ± 0,23

185,09 ± 74,42

3,08

XYLO

1,69 ± 0,18

117,78 ± 35,88

3,59

OXY

0,78 ± 0,11

88,12 ± 11,30

2,54

FLU12

1,08 ± 0,02

2,52 ± 0,62

2,25

Nephrophan ®

   

DSCG

2,68 ± 0,13

379,65 ± 24,03

6,35

XYLO

2,76 ± 0,16

210,28 ± 13,41

6,40

OXY

2,72 ± 0,17

214,65 ± 13,08

6,19


[Seite 42↓]

Abbildung 16:Permeation der Arzneistoffe (0,0039 M) durch Rindernasenschleimhaut

Permeation durch Rindernasenschleimhaut

Die drei Arzneistoffe (Abb. 16) sowie der parazelluläre Marker FLU (nicht dargestellt) sind nach Versuchsbeginn ohne nennenswerte zeitliche Verzögerung (Lag-time) im Akzeptorkompartiment detektierbar. Für die Substanzen ist daher der parazelluläre Transportmechanismus durch die biologische Membran als dominierend anzusehen, wofür auch ihre Hydrophilie und ionische Ladung bei einem pH-Wert von 6,0 (siehe Tab. 4) sprechen. Da transzelluläre Transportmechanismen durch die Lipiddoppelschicht der Zellmembran deutlich langsamer vonstatten gehen [], erscheinen transzellulär transportierte Substanzen häufig mit einer deutlichen zeitlichen Verzögerung im Akzeptorkompartiment und sind zudem zumeist lipophile und nichtionische Verbindungen.

Für die Permeation homologer Reihen von Substanzen (z. B. fluoreszenzmarkierte Dextrane mit verschiedenen Molekülmassen [61, 63] und Babitursäurederivate mit verschiedener Lipophilie [143]) konnte in Hinblick auf die Permeabilität der nasalen Mukosa festgestellt werden, dass im Allgemeinen die Permeabilität mit steigender Lipophilie der permeierenden Substanz zunimmt und mit steigender Molekülmasse sinkt.

Bei den zwei Strukturanalogen OXY und XYLO lässt sich die signifikante Zunahme (t-Test) der permeierten Menge von XYLO, verglichen mit OXY, auf dessen höhere Lipophilie bei geringfügig kleinerer Molekülmasse zurückführen. In Analogie dazu wurde die nasale Bioverfügbarkeit eines Monohydroxyderivates von Progesteron deutlich kleiner gefunden als die von Progesteron [144]. Es ist anzunehmen, dass XYLO neben dem parazellulären auch dem transzellulären Transportprozess folgen kann. Hussain et al. [145] postulieren, dass bei relativen Molekülmassen < 300 die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substanz in Hinblick auf deren Permeabilität weniger Einfluss nehmen als die Größe des Moleküls.


[Seite 43↓]

Obwohl DSCG eine deutlich größere Molekülmasse bei geringerer Lipophilie z. B. verglichen mit OXY besitzt (Tab. 4) und die negativ geladene nasale Mukosa13 eine gewisse „Perm­selektivität“ für positiv geladene Substanzen aufweist [22, 146], permeiert DSCG in einem signifikant (t-Test) größeren Anteil als OXY. Der von Grass et al. [147] vermutete selbstenhancende Effekt von DSCG könnte dafür die Ursache sein. Der Vergleich mit dem P app der parazellulären Markersubstanz FLU unterstützt diese Vermutung. FLU (Mr 354) besitzt ebenso wie OXY eine kleinere Molekülmasse als DSCG und mit einem VK in EBS von 0,720 ± 0,161 einen größeren Anteil unpolarer Strukturen im Molekül, verglichen mit OXY und DSCG. Während der P app von FLU, verglichen mit dem von OXY, die allgemeinen Zusammenhänge zwischen Lipophilie bzw. Molekülmasse und parazellulärem Permeations­verhalten widerspiegelt, weist der tendenziell höhere P app von DSCG auf ein von diesen Zusammenhängen abweichendes Permeationsverhalten hin. Allerdings muss bei der vergleichenden Betrachtung der Werte von P app aller drei Arzneistoffe und des P app von FLU beachtet werden, dass es sich bei den aufgezeigten Unterschieden lediglich um Tendenzen handelt (ANOVA).

Permeation durch Nephrophan®

Durch die synthetische Membran konnten für die drei Arzneistoffe nahezu die gleichen P app ermittelt werden. Sie unterscheiden sich weder tendenziell noch signifikant voneinander (ANOVA). Die zunehmenden Verteilungskoeffizienten VK (vgl. Tab. 5) der beiden basischen Verbindungen OXY und XYLO mit steigendem pH (donatorseitig: PBS pH 6,0, akzeptor­seitig: EBS pH 7,4) beeinflussen die Permeation durch die Mukosa nicht.

Während für die Permeation von DSCG (20 mg/ml = 0,039 M) durch Nephrophan® aus den Fertigarzneimitteln verglichen mit OXY und XYLO (0,05 bzw. 0,1 % (m/V)) deutlich kleinere Permeabilitätsraten ermittelt wurden (Tab. 9), zeigt sich dieser Effekt bei den Permeationsstudien mit den Eigenrezepturen (0,0039 M Arzneistoff) an der synthetischen Membran nicht und ist somit offensichtlich konzentrationsabhängig. Neben den konzentra­tionsabhängigen Effekten auf die Permeation von DSCG ist eine Einflussnahme der Formulierungsparameter bei den FAM zu vermuten.

Die Ergebnisse der folgenden Permeationsversuche durch Nephrophan® werden im Ergebnis­und Diskussionsteil dieser Arbeit nur noch dann zahlenmäßig dargestellt, wenn ein signifikanter Unterschied zur jeweiligen Referenz auftrat. Im Anhang 7.4 sind die Permeationsdaten aller Nephrophan®-Versuche dokumentiert.


[Seite 44↓]

Einfluss von Benzalkoniumchlorid und EDTA

EDTA ist ein klassischer Enhancer für parazelluläre Transportprozesse [51]. Die Enhancerfunktion beruht auf der Fähigkeit zur Komplexierung der extrazellulären Ca2+-Ionen, die an der Regulation und Integrität der TJ ursächlich beteiligt sind [148]. Auf dieser Eigenschaft basiert letztlich auch die häufige Anwendung der Kombination mit dem oberflächenaktiven BAC, wodurch die Penetrationsfähigkeit des Konservierungsmittels in den Mikroorganismus erhöht werden soll. Außerdem werden intrazelluläre Proteine und calciumabhängige Enzyme, die mit dem junctionalen Komplex in Verbindung stehen, durch die Ca2+/EDTA-Chelatbildung in ihrer Aktivität bzw. Funktion beeinträchtigt, woraus darüber hinaus eine bessere transzelluläre Permeabilität resultiert [52, 149].

Durch EDTA (0,1 %) ist eine Erhöhung der parazellulären Permeabilität der Mukosa, z. B. für FITC-Dextran um das Sechsfache, ermittelt worden [150], wobei die schädigende Wirkung auf die epitheliale Membran vergleichsweise gering war [61, 150]. BAC zeigt als tensidische Substanz membranaktive Potentiale [151], die durch Schädigung der epithelialen Membran hauptsächlich transzelluläre Transportprozesse betreffen.

Tabelle 11 gibt die ermittelten Daten der Permeationsstudie mit DSCG, XYLO und OXY durch Rindernasenschleimhaut unter Einfluss der Formulierungsparameter EDTA (0,1 % (m/V)) und BAC (0,01 % (m/V)) sowie deren Kombination wieder.

Einfluss von EDTA

Der Zusatz von EDTA führt bei allen drei Arzneistoffen erwartungsgemäß zu einer größeren permeierten Arzneistoffmenge durch Rindermukosa , die im Falle von OXY und XYLO sogar signifikant erhöht ist. Neben der Abhängigkeit der EDTA-Enhancerwirkung von EDTA­Konzentration und der Zeit [57] spielen auch die Hydrophilie und die Molekülmasse des betreffenden Arzneistoffes eine Rolle [150, 152]. Demzufolge kann die signifikant
(t-Test) größere Effektivität von EDTA auf den P app von OXY, verglichen mit XYLO, mit dem stärker hydrophilen Charakter dieses Arzneistoffes zusammenhängen.

Für den weniger deutlichen enhancenden EDTA-Effekt auf die Permeabilität der biologischen Membran im Falle von DSCG lassen sich zwei Ursachen diskutieren. Zum einen kann die beschriebene Selektivität der Enhancerwirkung bezüglich einer Molekülmasse des Arzneistoffes innerhalb enger Grenzen [139, 153] eine Rolle spielen, zum anderen schränken möglicherweise die selbstenhancenden Effekte von DSCG [147] die Permeabilitäts­verbesserung durch EDTA ein. Die permeabilitätsverbessernde Wirkung oder auch die Effektivität eines Enhancers steigt mit der Erhöhung der Enhancerkonzentration nur bis zu einem Plateau [150], das möglichweise durch die Kombination von EDTA mit dem [Seite 45↓]selbstenhancenden DSCG bei den für die Permeationsstudien verwendeten Konzentrationen beider Substanzen bereits erreicht ist.

Einfluss von BAC

Der Zusatz von BAC verändert die P app von OXY und XYLO, verglichen mit der jeweiligen Referenz, kaum, da die membranaktiven Eigenschaften der Substanz hauptsächlich auf transzelluläre Transportprozesse Einfluss nehmen, die für die hydrophilen, geladenen Arzneistoffe eine untergeordnete Rolle spielen. Bei dem ebenfalls stark hydrophilen DSCG könnte für die signifikante Abnahme von P app die Bildung eines Ionenpaares [154] die Ursache sein, das sowohl aufgrund seiner Größe als auch aufgrund der Behinderung der selbstenhancenden Fähigkeiten von DSCG dessen Permeation einschränkt.

Tabelle 11: Einfluss von EDTA und BAC sowie deren Kombination auf die Permeation durch
Rindernasenschleimhaut

Zusatz

Papp x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

Natriumcromoglicat

   

Referenz (ohne)

1,41 ± 0,23

185,09 ± 74,42

3,08

EDTA

2,17 ± 0,42

274,75 ± 168,26

4,58

BAC

0,50 ± 0,09*

53,16 ± 18,73

0,89

EDTA/BAC

1,76 ± 0,50

215,38 ± 123,22

3,59

Xylometazolinhydrochlorid

   

Referenz (ohne)

1,69 ± 0,18

117,78 ± 35,88

3,59

EDTA

3,43 ± 0,64*

35,97 ± 46,74

7,73

BAC

1,38 ± 0,07

100,86 ± 14,38

3,07

EDTA/BAC

1,54 ± 0,28

129,74 ± 50,50

3,95

Oxymetazolinhydrochlorid

   

Referenz (ohne)

0,78 ± 0,11

88,12 ± 11,30

2,54

EDTA

4,91 ± 1,14*

492,77 ± 192,77

14,18

BAC

0,93 ± 0,24

99,89 ± 47,98

2,88

EDTA/BAC

2,21 ± 0,5*

185,64 ± 75,23

5,34

[Seite 46↓]Kombination

Während die membranaktiven Eigenschaften von BAC das Permeationsverhalten von OXY und XYLO kaum beeinflussen, nehmen sie auf die Effektivität der enhancenden Wirkung von EDTA für diese beiden Arzneistoffe offensichtlich einen deutlich permeabilitätsreduzierenden Einfluss (Papp OXY/XYLO EDTA signifikant > P app OXY/XYLO EDTA/BAC (t-Test)). Die Schädigung der Integrität der Mukosa mit Störung junctionaler Regulationsprozesse ist dafür eine mögliche Erklärung.

Die Tatsache, dass im Falle von DSCG hingegen trotz des entstehenden Ionenpaares mit BAC bei Verwendung der Kombination BAC/EDTA eine signifikante Zunahme (t-Test) des P app im Vergleich mit dem Zusatz von BAC allein auftritt, stützt die Vermutung, dass eine Behinderung der selbstenhancenden Fähigkeit von DSCG durch die Bildung dieses Ionenpaares vorliegt. Die membranschädigende Wirkung von BAC hingegen ist durch das gebildete Ionenpaar vermutlich in diesem Fall weniger stark ausgeprägt. Die permeabilitätsfördernden Eigenschaften des Enhancers EDTA treten ohne den selbst­enhancenden DSCG-Anteil mehr in den Vordergrund.

Die ergänzenden Versuche mit der synthetischen Membran zeigten weder signifikant noch tendenziell eine Einflussnahme der beiden Hilfsstoffe auf das Permeationsverhalten der Arzneistoffe (Daten in 7.4 dokumentiert). Für alle Effekte, die an der biologischen Membran auftreten, sind somit die Wechselwirkungen der Arzneistoffe und/oder Hilfsstoffe mit derselben verantwortlich.

Einfluss der Tonizität

Der Formulierungsparameter Tonizität nimmt vor allem über die Integrität der biologischen Membran auf das Permeationsgeschehen Einfluss. Eine hypotonische Lösung wird durch den angestrebten Ausgleich der osmotischen Druckverhältnisse mit dem umgebenen Milieu zum Schwellen der epithelialen Zellen, eine hypertonische dagegen zu deren Schrumpfen führen [155, 156]. Dabei reagiert die nasale Mukosa im Bereich von 0 bis 200 mOsmol/kg empfindlich auf nichtisotonische hypotone Verhältnisse. Pujara et al. [56] demonstrierten das anhand der Freisetzung von intrazellulären Markersubstanzen.

Für die folgenden Permeationsstudien wurde donatorseitig Phosphatpuffer pH 6,0 mit verschiedenen Tonizitäten verwendet. Der Akzeptor hingegen wurde wiederum mit isotonischem EBS pH 7,4 befüllt. Es wurde der Einfluss eines stark hypotonischen (70 mOsmol/kg), eines schwach hypotonischen (170 mOsmol/kg) und eines schwach hypertonischen (350 mOsmol/kg) Systems untersucht. Tabelle 12 listet die gewonnenen Permeationsdaten für Rindernasenschleimhaut auf.


[Seite 47↓]

Tabelle 12: Einfluss der Tonizität auf die Permeation durch Rindernasenschleimhaut

Tonizität

Papp x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

Natriumcromoglicat

   

Referenz (isoton)

1,41 ± 0,23

185,09 ± 74,42

3,08

stark hypoton

1,33 ± 0,17

183,90 ± 54,78

3,06

schwach hypoton

0,53 ± 0,08*

70,67 ± 11,66

1,18

schwach hyperton

1,14 ± 0,19

187,30 ± 47,57

3,12

Xylometazolinhydrochlorid

   

Referenz (isoton)

1,69 ± 0,18

117,78 ± 35,88

3,59

stark hypoton

1,97 ± 0,66

155,69 ± 36,93

4,74

schwach hypoton

0,93 ± 0,19

85,59 ± 27,65

2,61

schwach hyperton

1,52 ± 0,38

119,14 ± 69,04

3,63

Oxymetazolinhydrochlorid

   

Referenz (isoton)

0,78 ± 0,11

88,12 ± 11,30

2,54

stark hypoton

1,06 ± 0,41

87,74 ± 59,86

2,53

schwach hypoton

0,94 ± 0,10

77,94 ± 25,30

2,24

schwach hyperton

0,89 ± 0,30

83,97 ± 47,78

2,42

Auf die Permeabilität der Mukosa erwies sich die Tonizität der Arzneistofflösungen in den geprüften Varianten als ein wenig Einfluss nehmender Parameter. Die schwach hypertonische Lösung nahm in keinem Fall Einfluss auf die Permeabilität. Hypotonische Lösungen übten dagegen einen Effekt auf das Permeationsverhalten der Arzneistoffe aus. Insbesondere führte die schwach hypotone Formulierung mit DSCG zur signifikanten Erniedrigung von P app.

Eine mögliche Erklärung für diesen Befund sind die im biologischen Gewebe auftretenden Veränderungen im Zellvolumen. Die stark hypotonische Lösung verursacht anfangs eine Zunahme des Zellvolumens, um das osmotische Druckgefälle auszugleichen. Danach erfolgt eine gegenregulatorische Abnahme des Zellvolumens durch einen Ausstrom von Elektrolyten und Wasser („aktive Transportprozesse“) aus dem Zellinneren. Für die In-vitro-Permeations­anordnung kommt neben diesem Effekt ein Volumenstrom von der hypotonischen zur isotonischen Seite zustande, der als „solvent drag“ bekannt ist [155, 156]. Von diesem Flüssigkeitsstrom werden auch die Arzneistoffe erfasst. Salomon et al. [157] geben an, dass die initiale Tonizität auf diese osmotischen Volumenregulationsvorgänge Einfluss nimmt. So lässt die schwach hypotonische Lösung die epithelialen Zellen vermutlich nur anschwellen, ohne dass dabei im gleichen Maße ein Flüssigkeitsstrom vom Donator- zum Akzeptor­[Seite 48↓]kompartiment erfolgt und eine Regulation des Zellvolumens auftritt. Die Größe der „Poren“ der auf diese Weise gequollenen Membran nimmt möglicherweise ab. Das könnte einerseits erklären, warum die Rindernasenschleimhaut für das größere Molekül DSCG aus der schwach hypotonen Lösung signifikant weniger permeabel (P app Referenz > P app schwach hypoton) ist und für OXY dagegen die Permeabilität nicht beeinträchtigt wird. Andererseits könnte die behinderte Permeation der drei Arzneistoffe (P app stark hypoton > P app schwach hypoton) aus dem schwach hypotonen System, verglichen mit dem stark hypotonen System, ihre Ursache in den möglicherweise auftretenden, in Abhängigkeit von der initialen Tonizität des Donatormediums unterschiedlich stark ausgeprägten volumenregulatorischen Vorgängen der epithelialen Zellen haben. Diese Permeationsbehinderung erwies sich im Falle des größeren Moleküls DSCG wiederum als signifikant (t-Test).

Der Vergleich der Permeationdaten von OXY und XYLO zeigt, dass neben der Molekülgröße der permeierenden Substanz auch die Lipophilie das Ausmaß des Tonizitätseffektes auf die biologische Membran zu beeinflussen scheint. Eine mögliche Erklärung dafür könnte sein, dass die osmotisch bedingten Veränderungen des Volumens der epithelialen Zellen auch auf transzelluläre Transportprozesse Einfluss nehmen. Auch eine Beeinflussung der Polarität der epithelialen Zellmembran und ihrer Oberflächeneigenschaften ist denkbar [62].

Das permeabilitätsmindernde Phänomen für DSCG aus dem stark hypotonen Cromo ratiopharm® (Tab. 7) an beiden Membranen können diese Versuche jedoch nicht erklären. Die höhere Konzentration der Substanz in dem FAM scheint für diesen Effekt verantwortlich zu sein.

Der Formulierungsparameter Tonizität nahm auf das Permeationsverhalten der Arzneistoffe durch die synthetische Membran keinen signifikanten Einfluss (Daten in 7.4 dokumentiert). Alle Effekte, die durch Variation der Tonizität im Permeationsverhalten an der Rindernasenschleimhaut auftreten, sind somit durch eine Wechselwirkung mit der biologischen Membran bedingt.

Einfluss des Isotonisierungsmittels

Nicht nur die Tonizität beeinflusst das Permeationsverhalten an biologischen Membranen, sondern auch die Art des verwendeten Isotonisierungsmittels [37]. Für verschiedene Isotonisierungsmittel sind in Abhängigkeit von der Tonizität zwar gleiche Effekte auf die Permeabilität von intestinalem Gewebe beschrieben worden, doch das Ausmaß der Effekte unterschied sich zwischen den einzelnen osmotisch wirksamen Zusätzen jedoch deutlich [158].


[Seite 49↓]

Die in dieser Arbeit durchgeführten Permeationsstudien untersuchen den Einfluss der Isotonisierungsmittel Sorbitol , Glukose und Natriumchlorid , die einem hypotonen Phosphatpuffermedium (70 mOsmol/kg) zugeführt werden, auf die Permeabilität der Mukosa für die Modellarzneistoffe. In Tabelle 13 sind die ermittelten Daten der Permeationen durch Rindernasenschleimhaut wiedergegeben.

Tabelle 13: Einfluss des Isotonisierungsmittels auf die Permeation durch Rindernasen­schleimhaut

Isotonisierungsmittel

Papp x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

Natriumcromoglicat

   

Referenz 14

1,41 ± 0,23

185,09 ± 74,42

3,08

Sorbitol

0,81 ± 0,17*

115,09 ± 51,15

1,92

Glukose

0,80 ± 0,22*

140,23 ± 70,46

2,34

Natriumchlorid

0,72 ± 0,07*

113,87 ± 22,61

1,90

Xylometazolinhydrochlorid

   

Referenz 20

1,69 ± 0,18

117,78 ± 35,88

3,59

Sorbitol

4,12 ± 0,91

306,44 ± 195,10

9,33

Glukose

1,19 ± 0,47

101,24 ± 79,48

3,08

Natriumchlorid

1,52 ± 0,65

118,91 ± 50,37

3,62

Oxymetazolinhydrochlorid

   

Referenz 20

0,78 ± 0,11

88,12 ± 11,30

2,54

Sorbitol

1,43 ± 0,49

104,14 ± 50,31

2,99

Glukose

1,39 ± 0,24

103,59 ± 42,91

2,98

Natriumchlorid

2,19 ± 0,62

162,04 ± 79,23

4,66

Bei den Arzneistoffen OXY und XYLO nahm der Formulierungsparameter Isotonisierungsmittel auf deren permeierte Menge durch Nephrophan ® keinen Einfluss (Daten in 7.4 dokumentiert). Bei DSCG hingegen verringerte die Isotonisierung mit jeder der Testsubstanzen den P app signifikant (t-Test) gegenüber der Referenz (Daten unter ↑ 4.3.1.5 dargestellt). Für Natriumcromoglicat liegt also ein Einfluss des Isotonisierungsmittels als Formulierungsparameter vor, der folglich auch die Permeabilitätswerte der biologischen Membran determinieren wird. Dabei sind sowohl die Veränderung der Lösungseigenschaften des Wassers durch Hydrotropierungs- (Glukose, Sorbitol) [78] oder Aussalzeffekte (Natriumchlorid) [159] als auch Veränderungen im Dissoziationsverhalten der Substanz selbst in freie Ionen denkbar.


[Seite 50↓]

In der Tat dominierte für DSCG auch an der biologischen Membran (Tab. 13) der bei der Verwendung der synthetischen Barriere festgestellte Formulierungseinfluss. Alle drei Isotonisierungsmittel führten zur signifikanten Erniedrigung von P app. Da die Effekte für OXY und XYLO in dieser Form nicht feststellbar waren, scheinen für DSCG substanzspezifische Komponenten das Permeationsverhalten zusätzlich zu beeinflussen.

Im Falle von OXY und XYLO führte die Isotonisierung des Phosphatpuffers durch die getesteten Isotonisierungsmittel zu einer eher erhöhten Permeabilität. Der Sorbitolzusatz zeigte für XYLO eine markante Erhöhung der permeierten Menge. Romejin et al. [160] stellten bei der Überprüfung des Einflusses von Formulierungsparametern auf die Zilientätigkeit in vitro fest, dass ein Zusatz von Sorbitol die bekannten negativen Effekte von BAC und XYLO deutlich verschlechterte. Als verantwortlich angesehen wird dafür die verbesserte Penetrationsfähigkeit der Substanzen in die Zilienzellen. Diese Überlegung ist auch für den hier beobachteten Effekt diskutabel und bestätigt gleichzeitig die Vermutung, dass für XYLO transzelluläre Transportprozesse eine Rolle spielen können.

Der für OXY als wahrscheinlich anzunehmende parazelluläre Transportweg dient hauptsächlich dem Transport von geladenen, hydrophilen Substanzen und ist damit ein Maß für die Ionenpermeabilität des Gewebes. Es ist denkbar, dass ionische Zusätze diesen Transportmechanismus stärker beeinflussen als den transzellulären. Dafür würde die gefundene gesteigerte Permeabilität durch Natriumchlorid sprechen (Tab. 13).

Ein Flüssigkeitsstrom durch ein osmotisches Druckgefälle ist bei dieser Versuchsanordnung auszuschließen, da in beiden Kompartimenten isoosmotische Lösungen verwendet wurden. Dennoch werden durch die Ungleichverteilung der enthaltenen Ionen Konzentrations­gradienten und damit gegebenenfalls ein dem der Transportrichtung der Arzneistoffmoleküle entgegengesetzter Diffusionsfluss induziert. Daneben können ionische Zusätze, z. B. Natriumchlorid, den Ladungszustand der biologischen Membran verändern [161]. Auch die geladenen Arzneistoffe selbst können in Abhängigkeit von der Ionenstärke des Puffers (siehe Tab. 23) möglicherweise auf die Oberflächen- und Dipoleigenschaften von Mukosa und epithelialen Membranen Einfluss nehmen [162].

Eine einheitliche Aussage für alle drei Arzneistoffe hinsichtlich des Isotonisierungs­mitteleinflusses gestaltet sich als schwierig. Deutlich gezeigt werden konnte jedoch, dass isotonisierende Zusätze über Wechselwirkungen mit der biologischen Membran und/oder den verwendeten Arzneistoffen und nicht zuletzt über Wasserstrukturphänomene das Permeationsverhalten beeinflussen können.


[Seite 51↓]

Resümee der Permeationsstudien

Die durchgeführten Permeationsstudien verdeutlichen für DSCG ein von XYLO und OXY abweichendes Permeationsverhalten. Die vergleichende Betrachtung der P app von DSCG, XYLO und OXY nach Permeation durch Rindermukosa und Nephrophan® lässt für die meisten der untersuchten Formulierungsparameter keinen eindeutigen Zusammenhang zwischen erfasstem Permeationsverhalten, molekularer Struktur und den physikalisch­chemischen Eigenschaften der drei Arzneistoffe erkennen.

Dagegen zeigt die vergleichende Betrachtung der Permeationsdaten der Strukturanaloga OXY und XYLO den erwarteten Zusammenhang zwischen Permeationsverhalten an der biologischen Membran und ihrer unterschiedlichen Lipophilie sowie Molekülgröße. So verhalten sich sowohl die VK der beiden Arzneistoffe als auch die P app nach Permeation mit ihrer Referenzlösung wie 1:2,2. Die Formulierungsparameter Tonizität, Isotonisierungsmittel, EDTA und BAC beeinflussen, in Abhängigkeit von den durch die Lipophilie bedingten Transporteigenschaften der Substanzen, dementsprechend die Permeabilität der Rindernasenschleimhaut mehr oder weniger ausgeprägt. So ist z. B. im Falle von XYLO, das die Voraussetzung zu transzellulärem Transport aufweist, die Wirkung des parazellulären Enhancers EDTA vergleichsweise gering.

Die In-vitro-Verfügbarkeit (Mukosa) von OXY und XYLO aus den FAM lässt sich durch die Summation der Einzeleffekte erklären. Die Vielzahl der sich überlagernden Einzeleffekte gestattet allerdings Verallgemeinerungen hinsichtlich der Einfluss nehmenden Formulierungs­parameter nur in begrenztem Umfang. So führt z. B. die Kombination von EDTA mit Sorbitol (Xylo comod®) zu einer erhöhten Permeabilität der biologischen Membran für XYLO
(P app Xylo comod P app Referenz) und bestätigt somit die aufgetretenen Einzeleffekte. Die Kombination der Konservierungsmittel BAC und EDTA in den FAM Nasentropfen E ratiopharm®, Nasan® und Xylo von ct® hingegen nivelliert die Enhancerwirkung von EDTA. (P app Xylo comod > P app Nasan = P app Nasentropfen E ratiopharm = P app Nasan).

Aus den Nephrophan®-Permeationsversuchen mit OXY und XYLO (P app OXY/XYLO für alle untersuchten Formulierungen ohne signifikanten Unterschied (ANOVA)), Daten dokumentiert in 7.4), bei denen eine direkte Membranbeeinflussung durch die Komponenten der Formulierung ausgeschlossen werden kann, ist abzuleiten, dass die Formulierungsparameter sehr wohl auf die biologische Membran einen Effekt ausüben, der entsprechend der Lipophilie und Molekülgröße der Arzneistoffe deren Permeationsverhalten verändert.

Im Falle von DSCG nehmen die Formulierungsparameter sowohl auf die Permeation der Substanz durch die biologische Membran als auch durch Nephrophan® Einfluss. Für die [Seite 52↓]getesteten Isotonisierungsmittel war an beiden Membranen der gleiche, statistisch signifikante (verglichen mit der Referenz) permeationsmindernde Effekt feststellbar. Der Zusatz der Isotonisierungsmittel zu DSCG-Lösungen zeigte damit einen Formulierungseinfluss auf DSCG selbst. Die Formulierungsparameter EDTA, BAC und Tonizität übten lediglich an der Rindermukosa Effekte auf das Permeationsverhalten von DSCG aus, die jedoch z. B. durch die Bildung des Ionenpaares mit BAC oder die selbstenhancenden Fähigkeiten von DSCG stark wirksubstanzspezifisch sind.

Verallgemeinerungen zu den erfassten einflussnehmenden Formulierungsparametern ( Eigenrezepturen ) auf das Permeationsverhalten von DSCG anhand der P app, die aus den DSCG-FAM resultierten, gestalten sich durch die Vielzahl und Komplexität der möglichen Effekte als schwierig. Das hat nicht zuletzt auch seine Ursache darin, dass DSCG konzentrationsabhängige Effekte im Permeationsverhalten sowohl an der biologischen (P app FAM (20 mg/ml) P app Eigenrezepturen (2 mg/ml)) als auch an der synthetischen Membran (P app 20 mg/ml < P app 2 mg/ml , siehe  4.3.3.1, Tab. 16 und 17) zeigt und die Konzentration von DSCG in den FAM 20 mg/ml in den Eigenrezepturen hingegen nur 2 mg/ml beträgt.

4.2.2.2. Mucinwechselwirkungsstudien

Der Einfluss der in den Permeationsstudien untersuchten Formulierungsparameter Isotonisierungsmittel, Tonizität, EDTA und BAC wurde auch in Hinblick auf eine Wechselwirkung mit dem nasalen Mukus untersucht. Dabei wurde überprüft, ob der Zusatz der verwendeten Hilfsstoffe und/oder Puffersysteme verschiedener Tonizität selbst, also der arzneistofffreien Formulierungen, die rheologischen Parameter der Mucinmodelldispersion verändert oder auf eine mögliche Wechselwirkung der Arzneistoffe mit den Mucinglykoproteinen Einfluss nimmt.

Die Mucinwechselwirkungsstudien zum Einfluss der Formulierungsparameter wurden unter Verwendung einer oszillationsrheologischen Methode durchgeführt (↑5.2.5.1). In Analogie zur Viskositätsbestimmung bei der Ermittlung des Mukoadhäsionsindex (↓ 4.2.1.3) wurden die bei einer mittleren Kreisfrequenz (ω = 16,9 1/s) dem Frequenzssweep des Oszillationsversuches entnommenen oszillationsrheologischen Größen Speichermodul , Verlustmodul G´´ und Komplexe Viskosität der Mucindisperion vor und nach dem Zusatz der zu untersuchenden Formulierungen verglichen. Dabei stellt die Komplexe Viskosität eine zusammengesetzte Größe aus den elastischen () und viskosen (G´´) Eigenschaften der Messproben dar. Darüber hinaus wurde auch der Frequenzabhängigkeit der oszillationsrheologischen Größen Rechnung getragen. Beispielhaft wurden der graphischen Darstellung „log gegen log ω (Kreisfrequenz)“, die die belastungsabhängige Elastizität der Messprobe beschreibt, die Steigungen (m) der resultierenden Geraden und ihr Schnittpunkt mit der y-Achse (yA) entnommen.


[Seite 53↓]

Als Kriterium für einen vorliegenden Formulierungseinfluss auf die rheologischen Parameter der Mucindispersion wurde die Lage der ermittelten Werte der arzneistofffreien und arzneistoffhaltigen Mucin/Formulierungs-Gemische außerhalb der 95 % Konfidenzintervalle der Werte der Mucindispersion (M) bzw. Mucin/Arzneistoff-Mischungen betrachtet, die in Tabelle 14 angegeben sind.

Tabelle 14: 95 % Konfidenzintervalle der oszillationsrheologischen Größen des Mucins bzw.
der Mucin/Arzneistoff-Mischungen

 

G´ [Pa]

G´´ [Pa]

[Pas]

m [Pa/s]

yA [Pa]

Mucindispersion

     

M

3,71 … 4,01

8,82 … 9,02

0,56 … 0,60

1,412 … 1,466

1,351 …1,270

Mucin/Arzneistoff-Mischungen

     

M/DSCG

5,84 … 7,32

10,46 … 12,64

0,72 … 0,88

1,059 … 1,188

0,542 … 0,765

M/OXY

3,86 … 4,18

8,51 … 9,01

0,57 … 0,59

1,413 … 1,462

1,271 … 1,349

M/XYLO

3,75 … 3,95

8,63 … 9,13

0,57 … 0,61

1,423 … 1,469

1,269 … 1,347

Von den ermittelten rheologischen Größen der untersuchten Formulierungen (wirkstofffreie Eigenrezepturen, s. Abschnitt 4.2.2) im Gemisch mit Mucin bzw. der Mucin/Arzneistoff­Kombination lag keine außerhalb des jeweiligen berechneten Konfidenzintervalls. Batts et al. [138] konnten bei Zusatz von BAC und EDTA zu einer Mucindispersion auch keine Veränderung der rheologischen Parameter im Oszillationsversuch finden. Oechsner et al. [89] ermitteltendagegen für BAC konzentrationsabhängig (0,1 mg/ml) mittels einer rotationsrheo­logischen Viskositätsbestimmung sogar negative Mukoadhäsionsindizes (M-Ix = - 0,83 Pa).

Die Eigenrezepturen (Referenz) der alpha-Sympathomimetika OXY und XYLO zeigten, wie schon ihre Fertigpräparate (4.2.1.3), keinen Effekt auf die erfassten oszillationsrheologischen Parameter der Mucindispersion. Selbst Versuche von OXY mit einer DSCG äquimolaren Konzentration in PBS führten zu keiner messbaren Veränderung (↑ 4.3.3.5).

Der „adhäsive“ Effekt von DSCG auf die oszillationsrheologischen Charakteristika der Mucindispersion (Tab. 14) wurde von keinem der getesteten Formulierungsparameter statistisch signifikant beeinflusst (ANOVA).


[Seite 54↓]

4.2.2.3. Vitalität und Integrität der Mukosa

Nach erfolgten Permeationen wurden Kontrolluntersuchungen zur Integrität und Vitalität der biologischen Membran durchgeführt.

Lactatdehydrogenase- und Proteinbestimmungen

Um eine Aussage darüber treffen zu können, ob die verwendeten Arzneistoffe, zugesetzte Hilfsstoffe und/oder verwendete Puffersysteme auf die Membran einen schädigenden Einfluss ausüben, wurde, wie wiederholt in der Literatur beschrieben [56, 163, 164], versucht, die Laktatdehydrogenase (LHD) als intrazelluläres Enzym und damit als direkten Marker für Membranschädigungen in den Donator- und Akzeptormedien der Permeationsversuche zu bestimmen. Darüber hinaus erfolgte als unspezifisches Verträglichkeitsmaß die Erfassung der Gesamtproteine in den Kompartimenten nach der Permeation. Im Gegensatz zu histologischen Untersuchungen kann ein schädigender Einfluss auf diese Weise quantitativ und ggf. einfacher ermittelt werden [165].

Die Bestimmung der LDH war in allen DSCG-haltigen Systemen nicht möglich, da die Wellenlänge, bei der das farbige Reaktionsprodukt unter Verwendung eines Testkits absorbiert, im Bereich der Absorptionswellenlänge von DSCG (λ = 326 nm) liegt. Eine Verdünnung war infolge der geringen Menge an LDH (Literaturwerte [163]) nicht durchführbar. Die Bestimmung zeigte sich zudem in starkem Maße vom verwendeten Puffersystem und/oder Hilfsstoffzusatz abhängig.

Die im Verlauf einer Permeation aus der Membran freigesetzten Mengen an Protein lassen sich zur einfachen Feststellung einer unspezifischen Membranschädigung heranziehen, denn sie können intrazelluläre Proteine und Membranproteine, aber auch Glykoproteine des nasalen Mukus [56, 166] erfassen. Die Bestimmung des Gesamtproteingehaltes in den Donatoren und Akzeptoren der Permeationsversuche (↑ 5.2.7) erfolgte nach der Bestimmungsmethode von Lowry [167], die auf einer Reaktion von Phosphormolybdänwolframsäure (Folin-Ciocalteau­Reagenz) und Kupfer(II)-Salzen (Lowry-Reagenz) mit den funktionellen Gruppen von Aminosäuren beruht. Die Lowry-Reaktion stellt zwar eine äußerst empfindliche Methode der Proteinbestimmung dar, weist aber nur geringe Selektivität auf. Eine Kalibrierung für jedes Puffersystem und jeden Hilfsstoff-/Arzneistoffzusatz ist daher erforderlich [168].

Die Ultrazentrifugation (↑ 5.2.7) zum „Entsalzen“ der Donatoren und Akzeptoren ist eine Möglichkeit, um den Einfluss störender Substanzen auf die Bestimmung auszuschalten. Dieser analytische Aufwand erschien jedoch weder im Falle der routinemäßigen Bestimmung der LDH noch bei der Erfassung der Gesamtproteine im Rahmen der Permeationsstudien als [Seite 55↓]gerechtfertigt, wurde aber beispielhaft für die Bestimmung der Proteingehalte in den Inkubationsflüssigkeiten und Permeationskompartimenten im Rahmen der Versuche der In­vitro-Penetration von DSCG in Rindernasenschleimhaut (↑ 4.3.2) unternommen.

Vorversuche zu den Proteinbestimmungen im Rahmen der Permeationsstudien mit DSCG ergaben folgende Ergebnisse:

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass für keines der verwendeten arzneistofffreien Systeme eine markante Erhöhung der freigesetzten Proteine, verglichen mit EBS als Positivkontrolle, gefunden wurde. Der größte Teil des Proteinverlustes ereignete sich während der Vorinkubation. Anzunehmen ist, dass akzeptorseitig Bindegewebsreste und donatorseitig ein großer Teil der Mukusschicht extrahiert wurden.


[Seite 56↓]

Leitfähigkeitsmessungen

Als weitere Methode zur Erfassung der Integrität der Rindernasenschleimhaut im Zusammenhang mit den Permeationsstudien wurden Leitfähigkeitsmessungen herangezogen.

Beim Anlegen einer Wechselspannung hoher Frequenz an platinierte Platinelektroden, die sich in einem Elektrolyten befinden, resultiert durch den Transport der enthaltenen Ladungsträger ein Stromfluss. Die spezifische Leitfähigkeit, als Kehrwert des spezifischen Widerstandes eines solchen Systems, ist durch Konzentration, Wertigkeit und Wanderungs­geschwindigkeit der Ionen (Ladungsträger) eindeutig festgelegt. Die den Leitfähigkeits­messungen zugrunde liegende Gesetzmäßigkeit, das Ohmsche Gesetz, erfordert, dass Vorgänge an den Elektroden, also Polarisationserscheinungen, Feldstärkeeffekte und frequenzabhängige Effekte unterdrückt werden. Das wird durch die Verwendung einer hochfrequenten Wechselspannung und platinierter Elektroden erreicht [169].

Sind die beiden Elektroden einer solchen Leitfähigkeitsmesszelle durch eine biologische Membran getrennt, kann der Strom theoretisch auf zweierlei Weise über die trennende Membran fließen:

Da biologische Zellmembranen durch ihren strukturellen Aufbau als ausgezeichnete Isolatoren [171] fungieren, werden sie kapazitiv überbrückt. Der Strom fließt zwischen den Zellen, d. h. durch den Interzellularraum. Der messbare transepitheliale Widerstand eines solchen Systems resultiert aus dem Widerstand des Elektrolyten und dem parazelluären Widerstand, der sich aus dem Widerstand des Interzellularraumes und dem der Tight ­junctions zusammensetzt. Da der Widerstand des Interzellularraumes lediglich einen marginalen Anteil am parazellulären Widerstand hat, ist letzterer Ausdruck für den Widerstand der Tight-junctions, resultierend aus ihrer Anzahl und ihrem Öffnungszustand im Sinne der Querschnittsfläche des elektrolytischen Leiters [50]. Der auf diese Weise ermittelte TEER-Wert ist ein Maß für die Ionenpermeabilität. Er ist somit ein hilfreiches Mittel zum Untersuchen der funktionellen Integrität einer biologischen Membran und deren Permeabilität für hydrophile, ionische Verbindungen, also parazelluläre Transportprozesse. Die unter 3.3.2 beschriebene Messanordnung zur Erfassung des TEER-Wertes bezieht sich letztlich auch auf die Erfassung der für den Stromfluss zur Verfügung stehenden Querschnittsfläche, jedoch werden aktive Ionentransportprozesse des Gewebes miterfasst.

Für Monolayer intestinaler Zellkulturen sind klare Zusammenhänge zwischen Integrität, Permeabilität und TEER ermittelt worden [148, 149]. Für das Modell Rindernasen­schleimhaut erweist sich diese Versuchsanordnung als grundsätzlich schwierig, da dieses [Seite 57↓]„leaky“ Epithel lediglich TEER-Werte von ca. 40 Ω cm2 aufweist [42]. Bei der verwendeten Apparatur mit einer Membranfläche von ca. 0,6 cm2 bedeutet das noch mal eine Reduktion um 40 %. Schmidt et al. [67] fanden, dass bei Rindermukosa, im Falle von Mannitol als Marker für parazelluläre Transportmechanismen, kein Zusammenhang zwischen TEER und erhöhter Permeabilität bestand. Wikman-Larhed et al. [53] und Borchardt et al. [52] bestätigen, dass der Transport parazellulärer Markersubstanzen sogar im Falle intestinaler Zellkulturen ein deutlich sensibleres Permeabilitätsmaß als der TEER-Wert darstellt, obwohl z. B. für die intestinale Zelllinie Caco-2 transepitheliale Widerstände von über 600 Ω cm2 charakteristisch sind.

Die Ergebnisse der nach 5.2.1.6 durchgeführten Leitfähigkeitsmessungen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

Equilibrierungsphase (30 min)

Hauptpermeationsversuch (60 min)


[Seite 58↓]

Abbildung 17: Veränderung der Leitfähigkeit über die Versuchsdauer mit Nephrophan®
(----) oder Rindernasenschleimhaut (—) als Membran
A: PBS 70 mOsmol/kg, isotonisiert mit:
(◆) Sorbitol, (■) Glukose, (▲) Natriumchlorid
B: PBS (◆) 70, (■) 170, (▲) 350 (mOsmol/kg)

Abschließend ist zu konstatieren, dass selbst eine Ja/Nein-Aussage hinsichtlich Vitalität, Integrität und Verträglichkeit der verwendeten Lösungen gegenüber der Membran aus den Versuchsdaten nur schwer möglich ist. Das verdeutlichen die prinzipiell für die Nephrophan® ­Membran und Rindermukosa gleichen Leitfähigkeitsänderungen. Die bei der verwendeten Messanordnung erfasste Leitfähigkeit über die Membran konnte nicht um die Leitfähigkeit des Elektrolyten korrigiert werden, da donator- und akzeptorseitig verschiedenartige Medien verwendet wurden. Der Hauptanteil der gemessenen Leitfähigkeit resultierte folglich aus der Leitfähigkeit des Elektrolyten. Weiterhin hatte die Drehbarkeit der Diffusionszellen (s. Abb. 5), die zu unterschiedlicher Positionierung der Elektroden führte, einen nachteiligen Einfluss auf die Reproduzierbarkeit und damit Vergleichbarkeit der Werte. Aus einer hypothetischen Abnahme des TEER-Wertes um 50 % würde eine Widerstandsabnahme von ca. 8 Ω resultieren. Zur Erfassung dieser Veränderung besaß jedoch die verwendete Messanordnung eine nichtausreichende Empfindlichkeit.

Die aufgetretene Veränderung der Leitfähigkeitswerte während der Vorinkubation bei der Verwendung von Rindernasenschleimhaut als Membran sprechen für vorhandene Vitalität. Durch Öffnungs- und Schließungsvorgänge der TJ im vitalen Gewebe verändert sich die Querschnittsfläche des Leiters im Sinne des Widerstandes für die Ionenbeweglichkeit und damit die Leitfähigkeit des gesamten Systems.

Gezeigt werden konnte durch die Leitfähigkeitsuntersuchungen in der Equilibrierungsphase, dass Nephrophan® die Diffusion der in den Puffersystemen enthaltenen Ionen nicht einschränkt. Der Strom kann ungehindert durch die Membran fließen. Zugleich kann daraus geschlussfolgert werden, dass sich der Quellungszustand der vorgequollen verwendeten [Seite 59↓]Membran nicht ändert. Quellungsversuche, deren Ergebnisse in Tabelle 15 dargestellt sind, bestätigen diese Schlussfolgerung.

Tabelle 15: Quellungsverhalten von Nephrophan® und Rindermukosa (Angabe in % (m/m)
vom Trockengewicht)

Vorinkub.

EBS

PBS

PBS/70

PBS/350

Wasser

Nephrophan ®

     

keine

n.b.

77,96 ± 17,41

78,39 ± 14,11

77,99 ± 15,75

78,57 ± 14,36

Rindernasenschleimhaut

     

keine

88,49 ± 25,70

86,54 ± 28,31*

84,99 ± 35,21*

86,73 ± 30,40

n.b.

EBS

92,98 ± 19,33

91,52 ± 23,04*

90,18 ± 23,99*

91,62 ± 14,13*

n.b.

Triton®

91,32 ± 28,45

90,65 ± 20,52

89,82 ± 28,53

90,56 ± 18,51

n.b.

Das Quellungsverhalten der Rindermukosa in den untersuchten Pufferlösungen verschiedener Zusammensetzung oder Tonizität, ggf. nach Vorinkubation mit der als nachgewiesen membranschädigenden Substanz Triton® [136],spiegeltdie in vitalem biologischem Gewebe auftretenden regulatorischen Veränderungen des Zellvolumens in nichtisotonischen Medien, die bereits unter 4.2.2 beschrieben wurden, wider. Dieses Ergebnis unterstützt daher zugleich die Behauptung einer vorhandenen Vitalität des verwendeten exzidierten Gewebes, denn nach Vorinkubation des Gewebes mit Triton® treten die volumenregulatorischen Vorgänge nicht auf (siehe Tab. 15). Gleichzeitig kann das ermittelte Quellungsverhalten der Rindermukosa die geringere Zunahme der Leitfähigkeit bzw. die kleineren P app der Permeationsstudien mit dem schwach hypotonischen System, verglichen mit dem stark hypotonen Phosphatpuffer, erklären. Das schwach hypotone System lässt die epithelialen Zellen nur anschwellen (Masse der inkubierten Membran nimmt zu); die Ionenbeweglichkeit durch die Membran (Leitfähigkeitszunahme über die Versuchsdauer, Permeabilität für die Arzneistoffe) nimmt ab. Das stark hypotone System bewirkt dagegen durch die gegenregulatorische Volumenveränderung weder eine signifikante Massenzunahme noch markante Permeabilitäts­veränderung der Membran.

Da bei den mit Glukose, Sorbitol und Natriumchlorid isotonisierten Systemen im Falle von Nephrophan® eine Quellung der Membran und ein osmotisch bedingter Flüssigkeitsstrom auszuschließen sind, kann die Zu- oder Abnahme der Leitfähigkeit (Abb. 17 A) nur durch eine Verschiebung von Ladungsträgern in beiden Kompartimenten zustande kommen. Versuche mit Leitfähigkeitsmessungen in den jeweiligen Einzelkompartimenten, d. h.


[Seite 60↓]

nicht über die Membran, zeigten z. B. im EBS-haltigen System eine Leitfähigkeitsabnahme über die Versuchsdauer von 60 min, im sorbitolhaltigen Kompartiment dagegen eine Zunahme (Daten nicht dargestellt). Diese Veränderung der Leitfähigkeit folgte jeweils keinem linearen Zusammenhang; sie ergibt sich aus der „Wanderungsgeschwindigkeit“ aller Ionen.

4.3. Spezielle Untersuchungen mit Natriumcromoglicat

Die vorausgehenden Untersuchungen ließen für Natriumcromoglicat eine Vielzahl von Variablen mit Einfluss auf das Permeationsverhalten erkennen. Da OXY und XYLO infolge der geringen zu erwartenden systemischen Verfügbarkeit nach nasaler Applikation und damit dem weitgehenden Ausschluss einer Einflussnahme durch Formulierungsparameter bei gleichzeitiger Gefahr schwerwiegender resorptiver Nebenwirkungen nach Verschlucken (↑ 3.4.1.2) nicht in die In-vivo-Untersuchungen dieser Arbeit einbezogen wurden, wurde auch das Schwergewicht weiterführender In-vitro-Studien auf DSCG gelegt.

Die Ausführungen unter 4.2.2 haben verdeutlicht, dass DSCG zum einen ein konzentrationsabhängiges Permeationsverhalten aufweist und zum anderen Wechsel­wirkungen mit den verwendeten Vehikeln und/oder Hilfsstoffen verursacht. Untersuchungen verschiedener physikalisch-chemischer Parameter, vertiefende Permeations-/Penetrations­studien sowie rheologische Untersuchungen sollen im Folgenden dieses Verhalten bzw. die Wechselwirkungen näher charakterisieren.

4.3.1. In-vitro-Permeation

4.3.1.1. Einfluss der Natriumcromoglicatkonzentration

Physikalisch-chemische Untersuchungen

Starke Elektrolyte liegen in wässrigen Lösungen zumeist vollständig ionisiert vor. Dennoch wird beobachtet, dass konzentrationsabhängige Eigenschaften, wie z. B. die Gefrierpunkts­erniedrigung, mit steigender Konzentration nicht im erwarteten Maße zunehmen. Mit Konzentrationszunahme treten nämlich, durch die „Atmosphäre“ aus entgegengesetzt geladenen Ionen, vermehrt elektrostatische Anziehungskräfte und Ionenassoziationen auf. So kann ein starker Elektrolyt vollkommen ionisiert, aber trotzdem unvollkommen in freie Ionen dissoziiert sein. Man kann also sagen, dass eine Lösung eine „effektive Konzentration“ oder eine Aktivität hat [134].


[Seite 61↓]

Für Natriumcromoglicat ist mit steigender Konzentration (2 bis 50 mg/ml, Daten in 7.3 dokumentiert) zu konstatieren, dass

Die Leitfähigkeit der wässrigen Lösungen von DSCG zeigt mit Zunahme der Arzneistoffkonzentration ein deutlich abweichendes Verhalten von dem eines starken Elektrolyten (Quadratwurzelgesetz nach Kohlrausch [78]). Diese „konstitutive physikalische Eigenschaft“ wird also in ausgeprägtem Maße durch die kolligativen Eigenschaften, diejenigen, die von der Anzahl der Moleküle in der Lösung abhängen, überlagert.

Die Gefrierpunktserniedrigung , als kolligative und damit konzentrationsabhängige Eigenschaft, zeigt eine unverhältnismäßige Konzentrationsabhängigkeit für DSCG.

Oberhalb einer Konzentration von 10 mg/ml DSCG sind sowohl für die Leitfähigkeit als auch für die dynamische Viskosität und Gefrierpunktserniedrigung der Lösungen deutliche Veränderungen zu erkennen. Diese Veränderungen treten besonders deutlich bei Verwendung von PBS als Lösungsmittel hervor. Besonders markant ist der sprunghafte Anstieg der dynamischen Viskosität der gepufferten Lösungen bei Konzentrationen > 10 mg/ml DSCG (Abb.18).

Die Oberflächenspannung der wässrigen und gepufferten DSCG-Lösungen wird im Vergleich zum Wasser nicht erniedrigt. Der pH-Wert der Lösungen liegt konstant zwischen 6,2 und 6,5.

Abbildung 18:Dynamische Viskosität [mPas] von DSCG steigender Konzentration in PBS


[Seite 62↓]

Die sprunghafte Änderung physikalischer Eigenschaften der Lösung eines Stoffes mit Erhöhung seiner Konzentration deutet auf eine Assoziation der gelösten Moleküle hin: eine kolloidale Lösung entsteht [134]. Kolloidale Lösungen durch Molekülassoziationen zeigen eine Vielzahl charakteristischer und nichtlinear zusammenhängender physikalischer Eigenschaften [172].

Für DSCG-Lösungen mit einer Konzentration über 10 mg/ml kann ein „kolloidaler“15 Lösungszustand angenommen werden. Insbesondere der überproportionale Anstieg der Viskosität dient als eindeutiges Indiz für die Entstehung von Molekülassoziaten [159]. Auch die zu beobachtende ausgeprägte Temperaturabhängigkeit der Viskosität (20°C verglichen mit < 10°C), die durch Zunahme von Wasserstoffbrückenbindungen mit abnehmender Temperatur bedingt ist [159], das Auftreten eines Klärungspunktes [173] sowie die Opaleszenz der DSCG-Lösungen (> 10 mg/ml) [174] deuten darauf hin. Durch Zusatz von Natriumchlorid kann bei Temperaturen < 10°C eine Koagulation der Assoziate, ein „Aussalzeffekt“, beobachtet werden. Die solvatisierten Kolloide lagern sich infolge von Entladungsvorgängen, unter Verlust ihrer Solvathülle, zusammen [159]. Dieser Vorgang ist beim Erwärmen reversibel. Alle diese für DSCG in Abhängigkeit von der Konzentration beobachteten physikochemischen Phänomene lassen auf Selbstassoziationen schließen.

Jedoch ist aufgrund der fehlenden Oberflächenaktivität der DSCG-Lösungen nicht von klassischen „Assoziationskolloiden“, die durch Konzentrationserhöhung gelöster, amphiphiler Substanzen entstehen, auszugehen. So konnte auch mit Eosin-Natrium, einem Farbstoff der sich in mizellare Strukturen einlagert, keine Veränderung in Intensität und Wellenlänge des Absorptionsmaximums dieses Farbstoffs registriert werden (Daten nicht dargestellt). Desweiteren beeinflussen Elektrolytzusätze und Temperaturveränderungen den Konzentrationsbereich der für Assoziationskolloide charakteristischen „Kritischen Mizellbildungskonzentration“ (CMC) im Falle von DSCG (ca. 10 mg/ml) nicht (Abb. 19); auf die CMC klassischer Assoziationskolloide nehmen sowohl Temperatur als auch zugesetzte Elektrolyte Einfluss [ 134 ].

Das gefundene idealviskose Fließverhalten einer Lösung von DSCG (50 mg/ml) in PBS über einen Schergeschwindigkeitsbereich von 10 bis 100 1/s, das für einen hohen Ordnungsgrad und starke intermolekulare Wechselwirkungen (Daten in Anhang 7.3 dokumentiert) spricht sowie die von Champion et al. [175] beschriebene Bildung lyotroper flüssig-kristalliner [Seite 63↓]Mesophasen in sehr hohen DSCG-Konzentrationen sprechen allerdings wiederum für Assoziationskolloide.

Die Bildung flüssig-kristalliner Phasen von DSCG wurde im Zusammenhang mit der Untersuchung der ungewöhnlichen Wasseraufnahmefähigkeit der Substanz studiert [175]. Nach diesen Untersuchungen assoziieren bis zu 260 Moleküle unter Einbeziehung von Wassermolekülen durch intra- und intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen [172]. Auch hydrophobe Wechselwirkungen im Inneren der Assoziate spielen dabei eine Rolle [176].

Abbildung 19: Photometrische Bestimmung der „CMC“ von DSCG

Das Vorliegen von assoziierten DSCG-Molekülen wurde für Konzentrationen über 10 mg/ml in der Literatur beschrieben [175]. Anzunehmen ist durch die vorliegenden Untersuchungen, dass in etwa 10 mg/ml der kritische Konzentrationsbereich ist, in dem die Assoziatbildung anhand der Veränderung der physikochemischen Eigenschaften der Lösungen eindeutig nachweisbar ist (Abb. 18, 19). Champion et al. [175] geben aber auch an, dass bereits ab 5 mg/ml starke intermolekulare Wechselwirkungen in den Lösungen einsetzen.

Sowohl die Assoziation einzelner Moleküle unterhalb der „CMC“ (< 10 mg/ml) als auch die Entstehung der kolloidalen Assoziate (> 10 mg/ml) können die konzentrationsabhängigen physikochemischen Eigenschaften der Lösungen und damit ihre Abweichung vom „normalen Verhalten“ eines starken Elektrolyten erklären.

Der strukturellen Aufklärung der entstehenden Assoziate konnte in dieser Arbeit kein Platz eingeräumt werden. Der Untersuchung des Einflusses der Formulierungsparameter auf relevante physikalisch-chemische Parameter der DSCG-Lösungen in Hinblick auf eine veränderte Permeabilität an der biologischen Membran kam ungleich mehr Bedeutung zu. Im [Seite 64↓]Folgenden wird vor allem der Einfluss der Konzentration auf das Permeationsverhalten von DSCG in PBS an der synthetischen und biologischen Membran untersucht.

In-vitro-Permeation

Diffusion beruht auf der Eigenbeweglichkeit der Teilchen durch Brownsche Molekular­bewegung unter der Triebkraft eines bestehenden Konzentrationsgradienten. Bei einem membrankontrollierten System sind, wie bereits erwähnt (↓ 4.2.1.2), im „quasi-stationären“ Zustand die Konzentrationen in Donator und Akzeptor verschieden; der Konzentrations­gradient in der Membran ist jedoch konstant. Mit zunehmendem Konzentrationsgradienten zwischen Donator und Akzeptor sollten die Permeabilitätsraten, d. h. der Stoffdurchdritt pro Zeiteinheit [µg/min] in dem Maße ansteigen wie sich die Konzentration der permeierenden Substanz im Donator erhöht. Tatsächlich folgt die Stärke des Diffusionsflusses aber der thermodynamischen Aktivität, der sogenannten „effektiven Konzentration“ eines Stoffes [134, 177], was dazu führen kann, dass sich die P app für verschiedene Konzentrationen einer Substanz unterscheiden.

Die Betrachtung der Permeationsdaten von DSCG durch Nephrophan® (Tab. 16) veranschaulicht diese Tatsache. Mit steigender Konzentration steigt der Flux und damit die effektive Konzentration im Akzeptor Q 60 [µg]. Da aber die Zunahme des Stoffdurchtrittes nicht der angenommenen, zur Berechnung genutzten Konzentration folgt, sondern der thermodynamischen Aktivität, sinken die prozentual permeierte Menge und der Permeabilitätskoeffizient [177]. Es besteht also ein Unterschied zwischen „effektiver“ und „absoluter“ Konzentration der DSCG-Lösungen.

Tabelle 16: Einfluss der Konzentration von DSCG auf die Permeation durch Nephrophan®

DSCG [mg/ml]

Papp x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

2

2,68 ± 0,13

379,65 ± 24,03

6,35 ± 0,38

4

2,49 ± 0,14

703,01 ± 36,93

5,86

6

2,27 ± 0,05*

1002,55 ± 8,25

5,57

8

2,24 ± 0,04*

1268,30 ± 17,12

5,28

10

2,26 ± 0,06*

1628,92 ± 89,35

5,43

20

1,88 ± 0,08*

2631,31 ± 142,93

4,39 ± 0,24

30

1,67 ± 0,05*

3851,73 ± 97,82

4,30

40

1,46 ± 0,05*

4350,08 ± 146,81

3,64


[Seite 65↓]

Der Einfluss der „effektiven“ Konzentration zeigt sich dabei bereits im Bereich der auftretenden intermolekularen Wechselwirkungen einzelner Moleküle (c > 4 mg/ml). Bei einer Konzentration oberhalb von 10 mg/ml kann erkannt werden, dass neben der thermodyna­mischen Aktivität auch die Beweglichkeit der Teilchen mitbestimmend für den kinetischen Ablauf der Diffusion ist [78]. Die Bildung der assoziierten Kolloide reduziert die „effektive“ Konzentration an DSCG deutlich und nimmt über deren Größe und daraus resultierend über die steigende Viskosität (Abb. 18) einen zusätzlich diffusionsmindernden Einfluss [134, 159].

Tabelle 17 und Abbildung 20 zeigen die Daten, die nach Permeation von DSCG in Abhängigkeit von der Konzentration durch Rindernasenschleimhaut gewonnen wurden.

Tabelle 17: Permeation von DSCG in Abhängigkeit von der Konzentration durch Rindernasen­schleimhaut

DSCG [mg/ml]

Papp x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

2

1,41 ± 0,23

185,09 ± 74,42

3,01

4

0,88 ± 0,096

256,16 ± 66,46

2,13

6

1,11 ± 0,15

484,96 ± 138,29

2,69

8

1,59 ± 0,24

889,44 ± 310,89

3,71

10

3,23 ± 063*

2268,65 ± 1023,19

7,56

20

1,19 ± 0,12

1490,99 ± 494,80

2,48

Abbildung 20: Einfluss der Konzentration auf die Permeation von DSCG durch Rindermukosa


[Seite 66↓]

Die P app für Rindernasenschleimhaut (Tab. 17) zeigen, dass DSCG permeabilitätsverändernde Effekte an der Membran ausübt. Während zuerst eine deutliche Abnahme bei 4 mg/ml (einsetzende Assoziation einzelner Moleküle) vorliegt, steigen die P app danach trotz sinkender thermodynamischer Aktivität (siehe Tab. 16) wieder an und erreichen bei 10 mg/ml ein Maximum, wobei allerdings lediglich dieser Maximalwert Signifikanz aufweist.

Ein selbstenhancender Effekt von DSCG an der Rindernasenschleimhaut scheint tatsächlich vorzuliegen [147], der jedoch eine deutliche Konzentrationsabhängigkeit zeigt. Denkbar ist, dass die bereits beschriebene Wechselwirkung mit Komponenten des nasalen Mukus eine Rolle spielt.

Das Studium der Wechselwirkung von Natriumcromoglicat mit der Mucindispersion im rheologischen Teil dieser Arbeit zeigt ebenfalls eine Konzentrationsabhängigkeit (↑ 4.3.3.3). Der Effekt von DSCG auf die rheologischen Parameter von Mucin ist erst ab einer Konzentration von 5 mg/ml eindeutig registrierbar und erfährt oberhalb 10 mg/ml keine weitere Zunahme (↑ 4.3.3.3).

So ist denkbar, dass die Wechselwirkung mit dem Mukus bei einer Konzentration von 4 mg/ml DSCG dominiert und dadurch die Möglichkeit der Wechselwirkung von DSCG mit Komponenten der Membran einschränkt. Mit weiterer Erhöhung der Konzentration erfährt die Mukuswechselwirkung eine „Sättigung“. Der Effekt auf die Permeabilität der Membran tritt stärker hervor. Oberhalb einer DSCG-Konzentration von 10 mg/ml behindern die entstehenden „kolloidalen“ Assoziate vermutlich weniger die Permeabilität der Membran, sondern vielmehr die Permeationsfähigkeit des assoziierten Arzneistoffes durch seine Größe. Während die verstärkten intermolekularen Wechselwirkungen von DSCG mit steigender Konzentration an der synthetischen Membran zu einer Abnahme der thermodynamischen Aktivität und damit der permeierten Menge DSCG führen (Tab. 16), scheinen sie hingegen an der Rindermukosa sowohl die „Membranaktivität“ der Substanz (Permeationssteigerung) als auch die Wechselwirkungen von DSCG mit den Mukuskomponenten der Membran zu begünstigen.

Ein möglicher Wirkungsmechanismus von DSCG zur Erklärung der In-vitro-Effekte an Rindermukosa lässt sich aus dem pharmakologischen Verhalten der Substanz ableiten, an dem sowohl indirekte calciumabhängige- als auch unabhängige Phosphorylierungsvorgänge beteiligt sind [101]. Die Erhöhung der Konzentration zyklischer Nukleotide fördert dabei Phosphorylierungsvorgänge von Proteinen, die die Plasmamembran mit dem Zytoskeleton der Zelle verbinden und die allergische Kaskade unterbrechen [100]. DSCG beeinflusst diesen Prozess durch Wechselwirkung mit den daran beteiligten Enzymen (Proteinkinase C, saure Phosphatase). Dabei wird die Substanz nicht an das aktive Zentrum der Enyzme gebunden. Viskositätsmessungen haben ergeben, dass der Effekt durch konformelle Änderungen in der Struktur der Enyzme hervorgerufen wird [99].


[Seite 67↓]

Es ist möglich, dass DSCG über unspezifische calciumabhängige und -unabhängige Mechanismen auf die Phosphorylierung junctionaler Proteine in gleicher Weise Einfluss nimmt. Die unspezifische Wirkung über konformelle Änderung der beteiligten Enzyme kann auch die Wechselwirkung mit der Mucinmodelldispersion erklären.

Zur Untermauerung dieser Hypothesen wurden Gleichgewichtsdialysen gegen eine äquimolare Menge Ca2+ sowie gegen einen Proteinstandard durchgeführt, die eine Gleichverteilung von Natriumcromoglicat in beiden Kompartimenten, entsprechend der halben Ausgangs­konzentration, ergaben (Daten nicht dargestellt). Demzufolge waren Wechselwirkungen sowohl mit den Calciumionen im Sinne einer Komplexierung und Ausfällung [178] als auch mit den Proteinen selbst, als ursächlicher Grund für die beobachtete Enhancerwirkung von DSCG auszuschließen. Für diese Tatsache spricht auch der Umstand, dass durch im Donator enthaltenes EDTA eine permeationsfördernde Wirkung auftrat (↓ 4.2.2.1, Tab. 11). Die tendenzielle Möglichkeit, in den Donatoren der Permeationsstudien zur Erfassung der In-vitro­Penetration von DSCG in Rindermukosa Proteine nachweisen zu können (↓ 4.2.2.3), zeigt, dass vermutlich eine Wechselwirkung mit den junctionalen Proteinkomponenten vorliegt [57]. Andererseits ist es denkbar, dass der Nachweis von Proteinen auf eine verstärkte Auswaschung von Mucinglykoproteinen durch Wechselwirkungen mit DSCG zurückzuführen ist (↑ 4.3.2, Tab. 26) [166].

Schmidt et al. [67] halten den hier postulierten Effekt von DSCG auch bei einigen immunmodulatorischen Proteinen für denkbar und stellten eine Erhöhung des Fluxes einer parazellulären Markersubstanz fest. Der TEER-Wert des biologischen Gewebes veränderte sich dabei nicht nachweisbar.

Da DSCG seinen eigenen parazellulären Transport verstärkt (↓ 4.2.2.1), ist anzunehmen, dass eine Vorinkubation mit dieser Substanz auf die Permeabilität der Membran Einfluss nimmt und z. B. den Transport der parazellulären Markersubstanz Fluorescein-Natrium (FLU) ebenfalls verstärkt. Dabei sollte eine Konzentrationsabhängigkeit der Enhancerwirkung zu beobachten sein.

Bei Permeationsstudien von zwei anderen Arbeitsgruppen mit DSCG als hydrophiler Modellsubstanz an tierischem exzidiertem nasalem Gewebe konnte keine Veränderung des TEER-Wertes durch DSCG-Zusatz festgestellt werden [63, 179]. Auch morphologische Veränderungen bei nachträglicher lichtmikroskopischer Untersuchung dieses Gewebes waren nicht feststellbar [63].

4.3.1.2. Vorinkubation der Mukosa mit Natriumcromoglicat

Nasale Enhancereffekte können allgemein durch Wechselwirkungen mit:


[Seite 68↓]

hervorgerufen werden [22]. Häufig ist eine Kombination mehrerer Effekte Ursache für den enhancenden Effekt einer Substanz. Im In-vitro-Permeationsmodell können aber lediglich arzneistoffbedingte Faktoren (Löslichkeit, Stabilität, Wechselwirkungen mit Formulierungs­komponenten), Effekte auf die Membran und mit Einschränkung Einflüsse auf den Mukus festgestellt werden [43].

Der Verträglichkeitsprüfung der Enhancer auf ihre lokale und systemische Toxizität kommt große Bedeutung zu. Für viele Enhancer konnte durch verschiedenartigste Methoden (morphologische Untersuchungen, CBF-Studien, Freisetzung von Markersubstanzen) eine Korrelation zwischen enhancender Wirkung und membranschädigenden Eigenschaften gezeigt werden [163]. Diese Tatsache ist jedoch im Umkehrschluss nicht immer richtig [150]. Zum anderen gilt es zu bedenken, dass eine erhöhte Permeabilität für Arzneistoffe zugleich auch eine erhöhte Permeabilität für Noxen (z. B. Allergene) [67] bedeuten kann.

Tabelle 18 und Abbildung 21 stellen die Ergebnisse der Vorinkubationsversuche mit Natriumcromoglicat dar.

Tabelle 18: Permeation von FLU (100 µM) aus EBS nach Vorinkubation der Mukosa mit
DSCG (mg/ml)

Vorinkubation

Papp x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

keine

1,08 ± 0,02

2,52 ± 0,82

2,25

10 min

DSCG/2

0,37 ± 0,01*

0,92 ± 0,58

0,82

 

DSCG/10

0,58 ± 0,02

1,64 ± 0,96

1,46

 

DSCG/20

0,34 ± 0,005

0,82 ± 0,06

0,73

20 min

DSCG/2

1,22 ± 0,02*

3,45 ± 0,87

3,07

 

DSCG/10

1,30 ± 0,56

4,29 ± 2,78

3,82

 

DSCG/20

0,02 ± 0,004

0,56 ± 0,17

0,50


[Seite 69↓]

[Seite 70↓]
Abbildung 21: Einfluss der Vorinkubation mit DSCG (PBS) auf die Permeation von FLU

Neben der bereits beschriebenen und erwarteten Konzentrationsabhängigkeit der Enhancer­wirkung ist eine zusätzliche Zeitabhängigkeit der DSCG-Einwirkung auf die Membran aus den erhaltenen Daten zu erkennen. Für viele klassische Enhancer sind solche konzentrations- und zeitabhängigen Effekte beschrieben worden [141, 148, 182].

Sowohl die Stärke des enhancenden Effektes auf die Permeation von FLU nach Vorinkubation mit 2 bzw. 10 mg/ml, als auch die mit 20 mg/ml auftretende deutliche Reduktion der Werte zeigen, dass der selbstenhancende Effekt eine für die Substanz mehr oder weniger spezifische Komponente aufweist. Die kolloidalen Assoziate treten wiederum als limitierender Faktor hinsichtlich Größe und/oder Möglichkeit zur Enhancerfunktion auf.

Die nach 10minütiger Vorinkubationszeit auftretende Abnahme der Permeabilität für FLU lässt sich durch die Zeitabhängigkeit der Enhancereinwirkung erklären [148]. Es ist denkbar, dass das Adhäsionspotential der Substanz DSCG zu einer vorübergehenden „Belegung“ der Absorptionsfläche führt.

Bei längerer Einwirkungsdauer kommen dann die Effekte auf die Membran zum Tragen. Dass DSCG die Permeabilität der Membran beeinflussen muss, lässt sich an den y-Achsen­abschnitten (yA) der Geraden der graphischen Darstellung des Permeationsverlaufes deutlich erkennen (Abb. 21, yA Flu (0,17 µg) signifikant (t-Test) < yA Flu DSCG 10 mg/ml 10 min (1,02 µg)). Obwohl die P app keine markante Veränderung (Tab. 18, P app Flu nicht signifikant (t-Test) < P app Flu DSCG 10 mg/ml 10 min) erfahren, erhöhte sich die prozentual permeierte Menge FLU deutlich. Daraus kann geschlussfolgert, dass die Geschwindigkeit des Stoffdurchtrittes von FLU durch die Membran mit und ohne DSCG-Vorinkubation nahezu gleich ist, während sich die für die Diffusion von FLU zur Verfügung stehende Querschnittsfläche („geöffnete Poren“) vergrößert.


[Seite 71↓]

Das Adhäsionspotential von DSCG scheint auch für die deutliche Abnahme der permeierten Menge FLU nach Vorinkubation mit 20 mg/ml DSCG verantwortlich zu sein. Während bei geringerer Konzentration von DSCG die permeabilitätserhöhende Wirkung nach DSCG­Vorinkubation der Membran auch für die Permeation von FLU relevant ist, blockiert das DSCG-Assoziat, bestehend aus bis zu 260 Molekülen, die Permeationsfläche nahezu vollständig. In der Literatur wurde z. B. für Ammoniumglycyrrhinat eine Abhängigkeit seiner Enhancerwirkung bis zu einer bestimmten Molekülmasse des Permeanten beschrieben [139]. Donovan et al. [183] geben an, dass innerhalb enger Grenzen aus einer Zunahme der Molekülmasse eine deutliche Reduzierung des Enhancereffektes resultiert.

Die im Komplex 4.3.1.1 aufgestellte Hypothese, dass die Mukuswechselwirkung von DSCG die Membranaktivität dominiert, bestätigt sich durch diese Versuche. Der hier besonders deutliche Effekt mag ursächlich damit zusammenhängen, dass während der verkürzten Vorinkubationsphase mit EBS weniger Mukuskomponenten von der Membran entfernt werden konnten.

Auf die Permeation von FLU durch Nephrophan® hatte die Vorinkubation mit DSCG erwartungsgemäß keinen Einfluss (t-Test) (Daten in 7.4 dokumentiert).

4.3.1.3. Einfluss von Polysorbat

Permeationsstudien mit dem FAM Vividrin® ergaben eine Abnahme des P app von DSCG unter Verwendung von Nephrophan® und eine Zunahme bei Rindernasenschleimhaut (↓4.2.1.2). Als Ausnahme unter den FAM enthält Vividrin® Polysorbat 80 (PS 80). Da außerdem auch EDTA enthalten ist, wurde zum Vergleich auch die Kombination Polysorbat 80 mit EDTA in die Modelluntersuchungen einbezogen.

Die Bestimmung der Kritischen Mizellbildungskonzentration (CMC) von Polysorbat 80 (Abb. 22) in PBS und Gereinigtem Wasser zeigte, dass die CMC dieses Tensides über 0,005 % (m/V) liegt. Sie wird durch das Lösungsmittel nicht beeinflusst. Die Ergebnisse der tensiometrischen CMC-Bestimmung wurden in die folgenden Betrachtungen nicht mit einbezogen (↑ 7.5). Durch den DSCG-Zusatz wird die Oberflächenaktivität der Lösungen kaum beeinflusst (Tab. 19).

Da die Konzentration an PS 80 weder der Packungsbeilage von Vividrin® noch der Fachinformation zu entnehmen war, wurde mittels Eosin-Natrium der Nachweis von Mizellen – Änderung des Absorptionsspektrums des Farbstoffs durch Einlagerung in die Mizellen – versucht. Während sich mit PBS, Gereinigtem Wasser und 20 mg/ml DSCG in PBS keine Absorptionsänderung zeigte, erfolgte bei Testung von Vividrin® eine bathochrome Verschiebung des Absorptionsmaximums (Daten nicht dargestellt). Somit ist davon auszugehen, dass die Polysorbat 80-Konzentration in Vividrin® oberhalb von 0,005 % (m/V) liegt.


[Seite 72↓]

Abbildung 22:Fluorimetrische CMC-Bestimmung von Polysorbat 80

Tabelle 19: Oberflächenspannungen [mN/m] von PS 80 mit und ohne Zusatz von DSCG
(mg/ml), VK von DSCG in Polysorbat 80-Lösungen verschiedener Konzentration

Polysorbat 80 [%] (m/V) in PBS

Oberflächenspannungen

VK DSCG

 

0,005

0,01

0,1

0,005

0,01

0,1

 

44,64

42,34

40,90

   

+ DSCG/2

n. b.

42,61

n. b.

≅ 0

≅ 0

≅ 0

+ DSCG/20

n. b.

40,45

n. b.

n. b.

0,064 ± 0,017

n. b.

Eine mögliche Veränderung der Lage der CMC des Tensides durch die Kombination mit DSCG konnte durch den fluoreszenzlöschenden Effekt von DSCG (> 0,0025 % (m/V)) bei der fluorimetrischen Bestimmung der CMC des Tensides mittels Pyren (↑ 5.2.1.8) nicht untersucht werden. Der Verteilungskoeffizient von DSCG betrug für eine Konzentration von 2 mg/ml bei allen drei untersuchten Tensidkonzentrationen Null (Tab. 19). Für 20 mg/ml in PBS wurde in Anwesenheit von PS 80 0,01 % (m/V) ein VK von 0,064 ± 0,017 ermittelt.

Tabelle 20 zeigt die Ergebnisse der DSCG-Permeationsversuche mit Polysorbat 80 (% (m/V)) und/oder EDTA unter Verwendung von Rindernasenschleimhaut.


[Seite 73↓]

Tabelle 20: Einfluss von Polysorbat 80 und EDTA auf die DSCG-Permeation durch­Rindernasenschleimhaut

Formulierung

Papp x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

DSCG (0,0039 M)

   

Referenz

1,41 ± 0,23

185,09 ± 74,42

3,01

+ 0,005 % PS

2,19 ± 0,52

331,62 ± 209,43

5,53

+ 0,01 % PS

0,85 ± 0,15

114,61 ± 71,94

1,91

+ 0,1 % PS

0,46 ± 0,15*

66,44 ± 42,82

1,11

+ 0,1 % EDTA

2,17 ± 0,42

274,75 ± 168,26

4,58

Vorinkubation EDTA 0,1 %

1,31 ± 0,20

190,29 ± 60,86

3,17

+ 0,01 % PS + 0,1 % EDTA

1,31 ± 0,25

180,44 ± 85,59

3,01

DSCG (0,039 M)

   

Referenz (20 mg/ml)

1,19 ± 0,12

1490,99 ± 494,80

2,48

+ EDTA 0,1 %

1,59 ± 0,27

2510,04 ± 630,50

4,18

+ PS 0,01 % + EDTA 0,1 %

2,11 ± 0,36

3004,14 ± 1024,88

5,01

Vividrin®

2,68 ± 0,36*

3810,86 ± 1187,54

6,04

Der Effekt von Polysorbat 80, ggf. in Kombination mit EDTA, auf das Permeationsverhalten von DSCG unterscheidet sich bei den zwei untersuchten DSCG-Konzentrationen deutlich. Für die nichtkolloidale Lösung ( DSCG 2 mg/ml in PBS) sind folgende Feststellungen zu treffen:

Die Kombination der kolloidalen Lösungen von DSCG (20 mg/ml) und Tensid, wie in Vividrin®,führt zu einer erhöhten Permeabilität der Membran. Eine Wechselwirkung beider Komponenten scheint die Assoziatbildungen der jeweiligen Einzelsubstanz zu beeinträchtigen, und dadurch gleichermaßen eine Membranaktivität beider Substanzen zu ermöglichen. Für Cyclodextrine wurde als z. B. ein möglicher Grund für ihre Enhancerwirkung auf den Insulintransport an der nasalen Membran eine solche Störung der Selbstassoziation des Arzneistoffes genannt [185].

Die durchgeführten Versuche können zwar erklären, warum Vividrin® die Permeabilität der biologischen Membran erhöht, nicht aber den permeationsmindernden Effekt an der synthetischen Membran (Tab. 7). Da die nachgestellten DSCG-Rezepturen mit mizellaren Konzentrationen von Polysorbat das Permeationsverhalten von DSCG (20 mg/ml) durch Nephrophan® nicht beeinflussten (Daten in 7.4 dokumentiert), können nur weitere Bestandteile des Fertigarzneimittels für die reduzierte In-vitro-Verfügbarkeit durch Nephrophan® verantwortlich sein. Neben der Arzneistoffkonzentration scheinen die Pufferbestandteile und/oder Isotonisierungsmittel die In-vitro-Verfügbarkeit von DSCG sowohl an der biologischen als auch an der synthetischen Membran deutlich zu beeinflussen.

4.3.1.4. Einfluss des Konservierungsmittels

In Komplex 4.2.2.1 wurde die permeationsmindernde Wirkung von BAC auf die Permeation von DSCG (2 mg/ml) durch Rindernasenschleimhaut (Tab. 11) bereits beschrieben. Durch die Bildung eines Ionenpaares zwischen DSCG und BAC tritt dabei vermutlich die membranschädigende Wirkung des Konservierungsmittels in den Hintergrund. Die folgenden Versuche mit Thiomersal als nachweislich membranschädigendes Konservierungsmittel [16, 160] und Phenylethanol als verträgliches konservierendes Agens sollen diese Hypothese untermauern.

Die CMC von BAC (Abb. 23) liegt deutlich über der in den Versuchen verwendeten Konzentration von 0,01 % (m/V), d. h. die Mizellbildung in den getesteten Versuchslösungen hat noch nicht nachweisbar eingesetzt. Ihre Lage zeigt im Gegensatz zu der des nichtionischen Tensides Polysorbat 80 eine Abhängigkeit vom verwendeten Lösungsmittel. Sie wird sogar durch den geringen Zusatz von DSCG (0,0025 % (m/V)) beeinflusst. Die Oberflächenspannung der DSCG-haltigen (2, 20 mg/ml) Lösung von BAC 0,01 % (m/V) in PBS (43,26 mN/m) – der in den Permeationsversuchen verwendeten Konzentration – verändert sich geringfügig (Daten [Seite 75↓]nicht dargestellt). Der Verteilungskoeffizient von DSCG (2 mg/ml) steigt im vorliegenden Konzentrationsverhältnis beider Substanzen auf das Doppelte des PBS-Wertes (VK PBS (0,128 ± 0,008) < VK PBS/BAC (0,210 ± 0,008)). Das spricht für die Bildung eines lipohilen Ionenpaares unter den suchsbedingungen.

Abbildung 23: Fluorimetrische CMC-Bestimmung von BAC

Tabelle 21 fasst die Ergebnisse der Permeationsversuche unter Einsatz der alternativen Konservierungsmittel an der biologischen Membran zusammen. Abbildung 24 stellt die Permeationsverläufe für Rindernasenschleimhaut graphisch dar.

Tabelle 21: Einfluss der Konservierungsmittel [% (m/V)] auf die DSCG-Permeation durch
Rindernasenschleimhaut

 

Papp x 10-5 [cm/s]

Q60 [µg]

Q60 [%]

Referenz

1,41 ± 0,23

185,09 ± 74,42

3,01

+ Phenylethanol 0,5 %

1,34 ± 0,27

206,22 ± 91,49

3,44

+ Thiomersal 0,01 %

1,78 ± 0,29

284,88 ± 68,29

4,75

+ BAC 0,01 %

0,50 ± 0,09*

53,16 ± 18,73

0,89

Vorinkubation Thiomersal 0,01%

2,47 ± 0,47

408,71 ± 142,51

6,81


[Seite 76↓]

Die Permeationsversuche unterstützen erneut die Vermutung, dass durch die Bildung des DSCG/BAC-Ionenpaares die potenziell schädigende Wirkung von BAC in den Hintergrund tritt, denn Thiomersal als ausgewiesene membranschädigende und zilientoxische Substanz führt insbesondere nach Vorinkubation der Membran zu einer erhöhten Permeabilität derselben Membran für DSCG. Der Vorinkubationsversuch unterstreicht dabei gleichzeitig die Bedeutung der Equilibrierungsphase vor dem eigentlichen Permeationsversuch für die Vitalität des Gewebes. Die Toxizität von Thiomersal ist in Anwesenheit von DSCG insofern deutlich höher als die von BAC. Phenylethanol scheint die Integrität der Mukosa nicht zu beeinträchtigen.

Da die beschriebenen Effekte unter Verwendung von Nephrophan® (Daten in 7.4 dokumentiert) nicht zu beobachten sind, kommen die Veränderungen im Permeationsverhalten an der biologischen Membran durch den direkten Einfluss der Zusätze auf diese Membran (Thiomersal) oder durch den indirekten Einfluss auf die permeiernde Substanz (BAC) zustande.

Abbildung 24:Einfluss verschiedener Konservierungsmittel auf die Permeation von DSCG durch Rindermukosa

4.3.1.5. Einfluss des Isotonisierungsmittels und Puffers

Kolloidale Lösungen assoziierter, ionischer Moleküle weisen zumeist eine ungewöhnliche Elektrolytempfindlichkeit auf [159], die sich im Falle der PBS-haltigen DSCG-Lösungen bereits bei den Messergebnissen der dynamischen Viskosität gezeigt hat (↓ 4.3.1.1). Es ist mithin nicht auszuschließen, dass sich durch Elektrolytzusatz auch physikalisch-chemische Eigenschaften der DSCG-Lösungen mit Relevanz auf die Permeabilität der biologischen Membran ebenfalls ändern.

Ein „Einsalzeffekt“ liegt vor, wenn die Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungs-Fehlstehlen zwischen den Wassermolekülen durch Elektrolytzusatz erhöht wird; die Fähigkeit zur [Seite 77↓]Solvatation kolloidaler Teilchen wird verbessert. Ersetzen extrem hydrophile, Wasserstoff­brücken ausbildende Substanzen selber bestehende Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Wasserstoffmolekülen, spricht man von Hydrotropierung [174]. Von einem „ Aussalzeffekt “ wird gesprochen, wenn das Wasser durch zugesetzte Elektrolyte hydrohober wird, d. h. der Anteil an Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Wassermolekülen wird erhöht [159]. Bei geladenen Substanzen können elektrolytbedingte Entladungsvorgänge der Kolloide eine zusätzliche Rolle spielen.

Bei dem Versuch, das Verhalten von DSCG-Lösungen in Abhängigkeit vom verwendeten Puffer zu erklären, muss wiederum zwischen der „kolloidalen“ Lösung (20 mg/ml DSCG) und der Lösung mit nichtkolloidal assoziierten Molekülen (2 mg/ml DSCG) unterschieden werden.

„Kolloidale“ Lösung

Wie bereits gezeigt (↓ 4.3.1.1), wird die Bildung der „kolloidalen“ Lösung von DSCG weder durch die Temperatur noch durch einen Elektrolytzusatz (PBS) beeinflusst. Ihre physikalisch­chemischen Eigenschaften ändern sich jedoch in Abhängigkeit von diesen beiden Parametern stark. Die Untersuchung der Viskosität (Tab. 22), Tonizität und Leitfähigkeit (Daten in 7.4 dokumentiert) der Lösungen von DSCG (20 mg/ml) in den Puffersystemen (mit und ohne Isotonisierungsmittel) der Permeationsstudien zeigte, dass

Entsprechend diesen Befunden lässt sich die Abnahme der permeierten Menge von DSCG aus den FAM Cromo ratiopharm® und Vividrin® durch Nephrophan® (Tab. 7) weniger auf einen Polysorbat- bzw. Tonizitätseffekt an sich zurückführen. So könnte z. B. der niedrige [Seite 78↓]Elektrolytgehalt in Cromo ratiopharm® eine verstärkte Wechselwirkung der kolloidalen Assoziate mit Wasser bewirken. Die Substanz selbst wird zum Hydrotropierungsmittel, ihre thermodynamische Aktivität sinkt und damit ihr P app für Nephrophan®. An der biologischen Membran nimmt durch mögliche Wechselwirkungen mit den Wassermolekülen die Fähigkeit zum Selbstenhancement ab.

Nichtkolloidale Lösungen

Bei den nichtkolloidalen Lösungen (2 mg/ml DSCG) können grundsätzlich die gleichen Feststellungen getroffen werden, nur mit der Einschränkung, dass eine starke Abhängigkeit der physikalisch-chemischen Eigenschaften der DSCG-Lösungen von den zugesetzten Ionen zusätzlich auftritt.

Tabelle 23 verdeutlicht den Zusammenhang zwischen Lipophilie, Ionenstärke und Permeationsverhalten an der biologischen und synthetischen Membran.

Tabelle 23: Zusammenhang zwischen der Permeabilität und dem VK von DSCG (2 mg/ml)
sowie der Art der enthaltenen Ionen

Testlösung

Papp x 10-5 [cm/s]

Papp x 10-5 [cm/s]

Gehalt Ionen16 [M]

Ionen-

VK

 

Nephrophan®

Mukosa

Cl-

(HxPO4)y-

K+/Na+

stärke22

 

Referenz

2,68 ± 0,13

1,41 ± 0,23

/

0,163

0,182

0,216

0,128

KBS

2,58 ± 0,062

2,84 ± 0,47*

0,110

0,050

0,160

0,166

0,145

List pH 6,0

n. b.

n. b.

/

0,066

0,077

0,088

0,038

PBS/70

2,58 ± 0,25

1,15 ± 0,19*

/

0,036

0,038

0,041

n. b.

+ Glukose

2,43 ± 0,07*

0,80 ± 0,22*

/

0,036

0,038

0,041

n. b.

+ NaCl

2,46 ± 0,04*

0,72 ± 0,07*

0,116

0,036

0,116

0,157

0,059

+ Sorbitol

2,36 ± 0,07*

0,82 ± 0,16*

/

0,036

0,038

0,055

0,033

Bei der Betrachtung der Daten in Tabelle 23 muss geschlussfolgert werden, dass mit zunehmender Ionenstärke (z. B. µ List pH 6,0 (0,088) < µ PBS pH 6,0 (0,216)) verstärkt hydrophobe intermolekulare Wechselwirkungen zwischen einzelnen DSCG-Molekülen im Sinne eines „Aussalzeffektes“ induziert werden. Die Verteilungskoeffizienten aus solchen Systemen sind höher (Tab. 9, 22; VK List pH 6,0 (0,038) < VK PBS pH 6,0 (0,128)); die Lipophilie der Substanz steigt also. Dabei nimmt nicht nur die Ionenstärke selbst einen Einfluss, sondern auch die Art der [Seite 79↓]Ionen. So scheinen das Phosphat- und Kaliumion die hydrophoben intermolekularen Wechselwirkungen zu begünstigen, das Chlorid- und Natriumion dagegen nicht (Tab. 23). Im Gegensatz dazu führt z. B. der Zusatz von Sorbitol erwartungsgemäß zu einer deutlich zunehmenden Hydrophilie, im Sinne einer Hydrotopierung. Die Wechselwirkung zwischen Wasser- und DSCG-Molekülen wird begünstigt.

Auf das Permeationsgeschehen an der biologischen und synthetischen Membran wirken sich die beschriebenen vehikelabhängigen Eigenschaften der DSCG-Lösungen gleich mehrfach aus. Tendenziell scheinen dabei die intermolekularen hydrophoben Wechselwirkungen die Wirkung der Substanz auf die Membran und auf die Mukuskomponenten (nur P app Mukosa steigt) zu fördern, zunehmende Hydrophilie und zunehmende Wechselwirkung mit Wasser schränken den Membraneffekt (P app Mukosa sinkt) und die thermodynamische Aktivität (P app Nephrophan ® sinkt) ein.

4.3.1.6. Resümee

Für das Permeationsverhalten von DSCG an Rindernasenschleimhaut wurden in ausgeprägter Weise Einflüsse von Formulierungsparametern erfasst. Dabei übt die Formulierung selbst weniger einen Einfluss auf die Permeabilität der biologischen Membran aus, sondern beeinflusst vielmehr die intra- und intermolekularen Wechselwirkungen in den DSCG­Lösungen, wobei eine dominante Abhängigkeit von der DSCG-Konzentration besteht.

So ist die Abweichung gegenüber dem von Kubo et al. [63] angegebenen P app für DSCG mit 0,343 x 10-5 cm/s an isolierter nasaler Kaninchenmukosa auf unterschiedliche Versuchs­bedingungen im Vergleich zur vorliegenden Arbeit zurückzuführen. DSCG wurde von Kubo et al. in einer Konzentration von 5,1 mg/ml in einem anderen komplexen Puffersystem eingesetzt. Vergleichbar damit ist die Konzentration von 4 mg/ml DSCG in PBS in den hier durchgeführten Permeationsstudien, die jedoch einen P app von 0,88 x 10-5 cm/sergab. Ebenso kann der abweichende P app von Lucifer Yellow (0,633 x 10-5 cm/s) [186], einer DSCG strukturell sehr ähnlich aufgebauten Substanz mit nahezu identischer Molekülmasse, mit der Vielzahl spezifischer Einflussparameter für DSCG auf den für eine Membran resultierenden Permeabilitätskoeffizienten erklärt werden.

Die Vergleichbarkeit der ermittelten Permeationsdaten von DSCG mit denen anderer Substanzen und solchen, die für DSCG nach Permeation unter anderen Versuchsbedingungen gewonnen wurden, ist kaum gegeben. Ursache dafür ist die starke Einflussnahme der Formulierungsparameter auf die physikalisch-chemischen Parameter von DSCG-Lösungen, die die Aktivität von DSCG an der Membran und seine thermodynamische Aktivität determinieren. Dabei muss berücksichtigt werden, dass DSCG aufgrund seiner Selbstassoziation nicht zu den „normalen“ Substanzen gehört.


[Seite 80↓]

4.3.2. In-vitro-Penetration

Es ist beschrieben worden, dass sich bei Patienten mit allergischer Rhinitis während der „Pollensaison“ eine vermehrte Anzahl Mastzellen, also der Effektorzellen der allergischen Reaktion, auch im Epithel der Nasenschleimhaut finden lässt [48]. Das aus diesen Mastzellen freigesetzte Histamin erhöht die Permeabilität der nasalen Schleimhaut für die Allergene und verstärkt somit die allergische Reaktion [14]. Die Frage nach der Menge DSCG, die nach der Applikation im Epithel zu finden ist, scheint somit berechtigt.

Als analytisch problematisch erwies sich die Durchführung von Penetrationsstudien dadurch, dass zum einen die verwendeten Membranen ein sehr geringes Trockengewicht besaßen und zum anderen die Menge des in die Membran penetrierten Arzneistoffes sehr gering war. Eine einfache Extraktion von DSCG aus den zerkleinerten Membranen nach Inkubation war ebenso ungeeignet, wie die Ermittlung der penetrierten DSCG-Menge anhand der Konzentrations­differenz zwischen Donator- und Akzeptorlösung bzw. der Konzentrationsabnahme in der Inkubationsflüssigkeit.

Als weitere Alternative zur Gehaltserfassung wurde der alkalische Aufschluss der Membran geprüft, der den Bezug der penetrierten Menge DSCG auf den Proteingehalt der Membran anstelle des Trockengewichtes ermöglicht. DSCG wurde dabei in das im Alkalischen entstehende Bisacetophenon überführt. Nach Kupplung mit diazotierter Sulfanilsäure konnte das entstandene farbige Produkt photometrisch vermessen werden. Die Kupplung des umgesetzten DSCG erwies sich als mögliches analytisches Verfahren, da ein linearer Zusammenhang (R2 = 0,995) gefunden wurde. Als deutlicher Nachteil stellten sich aber die geringe Spezifität und Robustheit heraus.

Weitere Versuche, das alkalische Produkt von DSCG nach Membranaufschluss bzw. das entstehende Enol nach Ansäuern des aufgeschlossenen Membrangemisches mittels Flüssig­flüssig-Extraktion zu gewinnen und anschließend mittels HPLC zu quantifizieren, scheiterten.

Schließlich wurde nach einem Ultraschallaufschluss der Membran das Extraktionsverfahren der Plasmaanalytik (↑5.2.6) angewendet. Allerdings konnten die so ermittelten DSCG-Gehalte nur auf das Trockengewicht der Membran bezogen werden.

Im Rahmen der durchgeführten Penetrationsstudien wurde der Gehalt von DSCG in der biologischen Membran sowohl nach erfolgter Permeation als auch nach Inkubation mit der entsprechenden Lösung bestimmt. Da bei der Inkubation der Membranen die Agitation der Inkubationsflüssigkeit gering war und die Membranen keiner Equilibrierungsphase unterworfen wurden, ist davon auszugehen, dass die Mukusschicht nicht entfernt wurde. Durch das reduzierte Volumen der Donator- und Akzeptorkompartimente bei der Permeationsstudie wurde die Bestimmung der Proteingehalte (↑ 5.2.7) möglich. Neben den Mengen DSCG in der [Seite 81↓]Membran wurden die Gehalte in der Spülflüssigkeit nach beendetem Versuch erfasst. In Analogie zu den Permeationsstudien wurde stets der isotone Phosphatpuffer verwendet. Die Konzentrationen der getesteten Arznei- und Hilfsstoffe entsprachen ebenfalls den Permeationsversuchen.

4.3.2.1. Einfluss von Benzalkoniumchlorid und EDTA

Grundsätzlich sollte sich die penetrierte Menge einer Substanz aus einer Lösung in eine Schicht (Membran) von der nach einer Permeation als Resultat des Durchtrittes durch eine Schicht unterscheiden [78].

Für die Penetration von DSCG (2 mg/ml) unter dem Einfluss von BAC und EDTA kann Folgendes festgestellt werden (Tab. 24):

Im Rahmen der durchgeführten Penetrationsstudien mit DSCG wurden die während der Inkubation oder Permeation freigesetzten Proteinmengen bestimmt (↓ 4.2.2.3). Tabelle 25 gibt über die Ergebnisse dieser Untersuchungen Auskunft.

Die bestimmten Gesamtproteine können Membranproteine, Enzyme oder dem Epithel anhaftende bzw. produzierte Mukusglykoproteine sein [164, 166]. Ihre Bestimmung am Ende des Versuches lässt keine Aussagen zum zeitlichen Verlauf ihrer Freisetzung zu. Häufig ist jedoch eine zeitlich lineare Freisetzung zu finden [165]. Zwischen der Menge freigesetzter [Seite 82↓]Proteine und der Membranpermeabilität für Testsubstanzen, d. h. indirekt der Enhancer­funktion, konnte, wie bereits festgestellt (↓ 4.3.1.2), eine Korrelation gefunden werden [164, 165]. Das heißt jedoch nicht, dass zwangsläufig jeder Enhancer ein membranschädigendes Potential besitzt [150] und umgekehrt freigesetzte Proteine immer auf eine Membran­schädigung hindeuten. Die Extrapolation auf die In-vivo-Verträglichkeit nach Erfassung eines einzelnen Effektes ist schwierig, denn sie ergibt sich aus dem Einfluss auf Zilienschlagfrequenz, Mukus und Membran in Abhängigkeit von der Verweildauer und der Häufigkeit der Applikation der jeweiligen Substanz.

Tabelle 24: Penetration von DSCG in Rindermukosa in Abhängigkeit vom Hilfsstoffzusatz

 

Gewebe nach Inkubation

Gewebe nach Permeation

Zusatz

cT x 10-3

cT

cSP x 10-3

cSP

cT x 10-3

cT

[mg/mg]

[%]

[mg/mg]

[%]

[mg/mg]

[%]

Referenz

5,61 ± 0,86

0,28

11,31 ± 2,83

0,57

1,04 ± 0,17

0,055

+ BAC/EDTA

5,08 ± 0,85

0,25

16,66 ± 3,56

0,83

2,30 ± 0,28

0,115

+ EDTA

5,35 ± 0,92

0,27

13,09 ± 3,30

0,65

1,84 ± 0,25

0,092

+ BAC

4,83 ± 0,79

0,24

8,16 ± 0,86

0,41

3,05 ± 0,35

0,153*

Tendenziell lassen die freigesetzten Proteinmengen (Tab. 25) einen Zusammenhang zwischen Enhancerfunktion des EDTA und der Erhöhung des P app von DSCG erkennen (↓ 4.2.2.1). Da jedoch EDTA in der hier verwendeten Konzentration entsprechend morphologischen Untersuchungen [61]die Integrität der Mukosa kaum beeinträchtigen sollte, kann anhand der gefundenen Proteinfreisetzungen aus der Membran nach Kontakt mit den DSCG-haltigen Lösungen auch für DSCG selbst zumindest ein geringer Effekt auf die Integrität der Mukosa angenommen werden. Die Untersuchungen bestätigen zudem die Aussage (↓ 4.2.2.1), dass die membranschädigenden Effekte des tensidischen BAC durch das gebildete Ionenpaar mit DSCG nicht zum Tragen kommen. Gleichzeitig werfen sie jedoch die Frage auf, ob BAC in der Kombination mit DSCG noch ausreichend konservierend wirkt.


[Seite 83↓]

Tabelle 25: Proteingehalte [mg] in den „Penetrationsflüssigkeiten“ (10-2 mg je mg Membran­(Trockengewicht))

 

Gewebe nach Inkubation

Gewebe nach Permeation

 

Schüttelflüssigkeit

Spüllösung

Donator

Akzeptor

Referenz

6,48 ± 1,15

1,43

1,94 ± 1,41

2,69

+ BAC/EDTA

13,01 ± 3,65

3,14

15,51 ± 6,34

3,09 ± 0,77

+ EDTA

13,10 ± 3,65

1,30

10,03 ± 2,46

1,12 ± 0,52

+ BAC

5,03 ± 0,91

1,43

3,44 ± 7,81

0,52 ± 0,44

4.3.2.2. Einfluss der Konzentration

Tabelle 26 dokumentiert die Ergebnisse der Untersuchungen des Konzentrationseinflusses von DSCG auf das Penetrationsverhalten.

Tabelle 26: Penetration von DSCG in Rindernasenschleimhaut in Abhängigkeit von seiner
Konzentration

 

Gewebe nach Inkubation

Gewebe nach Permeation

Konz.

cT x 10-3

cT

cSP x 10-3

cSP

cT x 10-3

cT

[mg/ml]

[mg/mg]

[%]

[mg/mg]

[%]

[mg/mg]

[%]

Referenz

5,61 ± 0,86

0,28

11,31 ± 2,83

0,57

1,04 ± 0,17

0,055

6

15,05 ± 1,90

0,25

29,92 ± 4,12

0,50

13,19 ± 3,52

0,220

10

19,20 ± 2,14

0,19*

56,95 ± 9,62

0,57

4,92 ± 0,98

0,049

20

33,75 ± 5,83

0,17*

109,23 ± 17,19

0,55

10,79 ± 1,62

0,054

Auch bei der Betrachtung des Konzentrationseinflusses von DSCG kann zwischen den Gewebespiegeln nach erfolgter Permeation und den für die Permeation erhaltenen P app (Tab. 17) ein Zusammenhang gesehen werden, in dem Sinne, dass mit abnehmender Permeabilität der Rindermukosa (P app sinkt) die Gewebespiegel (c T) steigen. Besonders markant ist dabei das Penetrationsverhalten von DSCG aus der Lösung mit einer Konzentration von 6 mg/ml. Der hohe Gewebespiegel von DSCG (c T 6 mg/ml = 13,19 x 10-3 mg/mg) und der verglichen mit der Referenz erniedrigte P app (P app 6 mg/ml = 1,11 x 10-5 cm/s) (Tab. 17) bestätigen die Vermutung, die für den „Membraneffekt“ der Substanz postuliert wurde (↓ 4.2.2.1). Die Wechselwirkung


[Seite 84↓]

mit den Komponenten der Mukosa (membranständige Mukusglykoproteine) scheint für diesen Konzentrationsbereich zu dominieren, die Gewebespiegel sind erhöht.

Eine Konzentration von 6 mg/ml entspricht ungefähr derjenigen, die nach der Applikation durch die Verdünnung mit nasalem Sekret aus den üblicherweise 20 mg/ml enthaltenden FAM resultiert.

Die Ergebnisse des Inkubationsversuches zeigen dagegen, dass die assoziierten DSCG-­Moleküle (c > 10 mg/ml) durch ihre Größe in ihrer Penetrationsfähigkeit eingeschränkt sind.

In Tabelle 27 sind die Ergebnisse der Proteinbestimmungen für diese Penetrationsversuche angegeben.

Insbesondere bei Betrachtung der im Rahmen der Permeationsversuche freigesetzten Proteinmengen kann für steigende DSCG-Konzentrationen eine verstärkte Freisetzung von Proteinen festgestellt werden. Ein konzentrationsabhängiger Membraneffekt scheint wiederum möglich.

Tabelle 27: Proteingehalte [mg] in den „Penetrationsflüssigkeiten“ je mg Membran (Trocken­gewicht) in Abhängigkeit von der DSCG-Konzentration

 

Gewebe nach Inkubation

Gewebe nach Permeation

Konz.

Schüttelflüssigkeit

Spüllösung

Donator

Akzeptor

[mg/ml]

Referenz

6,48 ± 1,15

1,43

1,94 ± 1,41

2,69

6

12,8 ± 5,55

3,34 ± 0,82

6,80 ± 2,29

2,26

10

7,66 ± 1,91

3,78 ± 1,43

4,05 ± 3,58

4,02 ± 1,25

20

7,63 ± 6,64

6,72 ± 1,55

6,44 ± 1,27

4,86 ± 3,04

Dabei können die Proteine sowohl durch die mögliche Interaktion von DSCG mit den Komponenten der Membran selbst als auch mit deren Mukusglykoproteinen freigesetzt werden. Für Chitosane konnte im Perfusionsmodell nachgewiesen werden, dass deren Komplexe mit dem Mukus durch die Wechselwirkung verstärkt ausgewaschen werden, wobei beim Auswaschprozess die Kettenlänge der Chitosane deutlich Einfluss nahm [166]. So könnte die vergleichsweise hohe Proteinfreisetzung bei einer Konzentration von 6 mg/ml auf eine besonders ausgeprägte Mucinwechselwirkung schließen lassen und gleichzeitig den erhöhten Gewebespiegel erklären.


[Seite 85↓]

4.3.3. Rheologische Untersuchungen – Mucinwechselwirkungen

4.3.3.1. Rheologie – Theoretische Grundlagen

Die Rheologie ist die Wissenschaft von der Deformation und vom Fließen der Stoffe unter der Einwirkung äußerer Kräfte. Als Deformation bezeichnet man die relative Verschiebung der Volumenelemente eines Körpers, bei der sein Zusammenhalt aber nicht zerstört wird [187].

In üblichen Rheometern werden die zu untersuchenden Substanzen einer Scherbelastung ausgesetzt. Dabei bleibt das Volumen der Probe unverändert. Die so ermittelte Viskosität ist die Scherviskosität, die für die meisten Prozesse in Technik und Naturwissenschaft relevant ist. Bei den mit dem MC 100 (↑ 5.2.5) gemessenen Viskositäten handelt es sich ausschließlich um Scherviskositäten [188].

Rheologische Größen

Zur Definition der Größen Schubspannung τ, Scherung γ und Schergeschwindigkeit sei ein Volumenelement zwischen zwei parallelen Platten betrachtet (Kartenblattmodell, Abb. 25). Die eine Platte sei fest eingespannt, die andere werde durch eine Tangentialkraft F T [N] belastet. Wirken sonst keine Kräfte, entsteht über dem Volumenelement mit der Berührungsfläche A [m2] über die Höhe h [m] des Plattenabstandes eine konstante Schubspannung τ [Pa] (Gl. 2).

(Gl. 2)

Die Schubspannung bewirkt eine Verformung des Volumenelementes. Man bezeichnet die Größe γ (Gl. 3) als Deformation oder Scherung.

(Gl. 3)

Für Flüssigkeiten nimmt die Strömungsgeschwindigkeit der Flüssigkeitselemente linear mit der Höhe h zu. Ganz allgemein bezeichnet man den Gradienten der Strömungsgeschwindigkeit als Schergeschwindigkeit oder D [1/s]. In diesem Fall gilt für in y-Richtung Gleichung 4, wobei v Platte die Geschwindigkeit der oberen Platte darstellt.

(Gl. 4)


[Seite 86↓]

Abbildung 25: Kartenblattmodell; modifiziert nach [187]

Die Schubspannung τ ist mit der Schergeschwindigkeit verknüpft. Es gilt

(Gl. 5)

mit als dynamischer Viskosität [Pas], υ als kinematischer Viskosität [m2/s] und ρ als Dichte [g/cm3] [187].

Rheologische Körper

Die Rheologie beschreibt, wie sich ein Körper17 bei Beanspruchung durch äußere Kräfte verformt. Sie bewegt sich zwischen den beiden Extremen: idealer Festkörper und ideale Flüssigkeit [78].

Ideale Festkörper verhalten sich rein elastisch, d. h. die Energie der Deformation kann vollständig zurückgewonnen werden. Wenn der Körper entlastet wird, kehrt er sofort wieder in den ursprünglichen Zustand zurück. Ideale Flüssigkeiten und Gase hingegen werden durch äußere Kräfte irreversibel verformt. Die Deformationsenergie wird dabei in Wärme umgewandelt und kann somit nicht zurückgewonnen werden.

Reale Körper sind weder ideale Festkörper noch ideale Fluide. Selbst ein realer Festkörper kann unter Anwendung genügend großer Kräfte irreversibel verformt werden. Reale Körper, deren rheologisches Verhalten zwischen dem von idealen Flüssigkeiten und Festkörpern eingestuft werden muss, weisen alle drei rheologischen Grundeigenschaften auf: Plastizität, Viskosität und Elastizität. Weist ein Körper gleichzeitig sowohl elastische als auch viskose Deformationsanteile auf, wird er als viskoelastisch bezeichnet. Die Verformung eines viskoelastischen Festkörpers stellt sich nach der Entlastung nahezu vollständig zurück, die der viskoelastischen Flüssigkeit nur um den elastischen Anteil.


[Seite 87↓]

Für ideale Flüssigkeiten ( Newton - Systeme ) ist die Viskosität eine Stoffkonstante und lediglich eine Funktion von Temperatur und Druck, nicht aber von Höhe und Dauer der äußeren Belastung. Bei den Nicht-Newton-Körpern ist die Viskosität zusätzlich abhängig von der einwirkenden äußeren Kraft. Nicht-Newton-Körper werden strukturviskos genannt, wenn mit zunehmender Belastung eine Abnahme der Viskosität zu beobachten ist. Die Charakterisierung solcher Systeme erfolgt durch die Aufzeichnung vieler Messwerte über einen Deformationsbereich.

Strukturviskose Substanzen, die unter einwirkender Scherbelastung eine Viskositätsernie­drigung erfahren, werden als pseudoplastische Systeme bezeichnet. Beginnen strukturviskose Fließkörper erst durch das Einwirken einer bestimmten Scherkraft zu fließen, d. h. es liegt eine Fließgrenze18 vor, wird der rheologische Körper plastisch genannt. Unterhalb ihrer Fließgrenze verhalten sich solche Systeme wie elastische Festkörper, oberhalb werden sie irreversibel verformt.

Besitzen strukturviskose Systeme neben der Belastungsabhängigkeit der Viskosität zusätzlich eine Zeitabhängigkeit, zeigen sie den Effekt der Thixotropie. Thixotrope Körper sind solche Systeme, die unter mechanischer Krafteinwirkung einer vollständig reversiblen Fließver­flüssigung unterliegen.

Die Rheologie bietet die Möglichkeit, strukturelle Veränderungen (Vernetzungsgrad), insbesondere von Polymeren, anhand ihres rheologischen Verhaltens zu erfassen und vor allem zu charakterisieren [78, 187, 189, 190, 191].

Rotationsrheologie

Rotationsuntersuchungen haben zum Ziel, das Verhalten eines Körpers unter einer Belastung zu untersuchen. Dabei wird der ursprüngliche Zustand der physikalischen Wechselwirkungen gestört. Das Fließverhalten wird im Rotationsmodus durch das Rotieren eines Messkörpers in der Probe erfasst. Dabei wird entweder die Schergeschwindigkeit vorgegeben und die notwendige Schubspannung gemessen oder die Schubspannung vorgegeben und die sich einstellende Schergeschwindigkeit gemessen. Es werden daher unterschieden: Versuche mit Schubspannungsvorgabe: CS-Modus (engl.: controlled stress) und Versuche mit Scherge­schwindigkeitsvorgabe: CR-Modus (engl.: controlled rate) [190].

Bei Rotationsuntersuchungen kann nicht nur die Veränderung der Viskosität einer Messprobe mit zunehmender Belastung ermittelt werden, sondern auch ihre zeitliche Viskositäts­änderung, d. h. ihr thixotropes Verhalten. Die Belastungsabhängigkeit wird durch eine [Seite 88↓]Aufwärtsrampe (Aufkurve) der Vorgabegröße ermittelt, die Zeitabhängigkeit durch eine anschließende Abwärtsrampe (Abkurve). Zusammen bilden sie die aufgenommene Fließkurve eines Systems. Versuche mit Vorgabe von Schergeschwindigkeitsrampen erlauben den Vergleich von Fließkurven von Nicht-Newton-Systemen.

Oszillationsrheologie

Im Oszillationsversuch wird die Probe harmonisch (sinusförmig im Zeitablauf) belastet: mit konstanter Frequenz wird entweder die Schubspannung harmonisch vorgegeben und die phasenverschobene harmonische Deformationsantwort gemessen oder die Deformation harmonisch vorgegeben und die dafür notwendige harmonische Schubspannung und deren Phasenverschiebung werden gemessen [189].

Dabei besteht wiederum die Möglichkeit, im CS-Modus die Schubspannungsamplitude τ 0 vorzugeben und die zugehörige Deformationsamplitude γ 0 zu erfassen oder im CR-Modus genau umgekehrt zu verfahren. Im Unterschied zur Rotationsmessung werden im Oszillationsversuch aber stets zwei Größen vorgegeben und zwei Größen erfasst. Die zweite Vorgabegröße ist die Kreisfrequenz ω [1/s] und die zweite Messgröße die Phasen­verschiebung δ [°] (Abb. 26) [188].

Aus den Vorgabe- und Messgrößen (γ 0, τ 0, ω, δ) werden folgende rheologische Größen berechnet:

Speichermodul [Pa]:

(Gl. 6)

Verlustmodul G´´ [Pa]:

(Gl. 7)

Verlustfaktor tan δ [1]:

(Gl. 8)

Betrag der Komplexen Viskosität |η*| [Pas]:

(Gl. 9)


[Seite 89↓]

Abbildung 26: Schematische Darstellung der Größen im Oszillationsversuch;
modifiziert nach [191]

Der Speichermodul (Gl. 6) charakterisiert das elastische Verhalten einer Substanz und stellt ein Maß für die reversible und rückgewinnbare Deformationsenergie dar. Der Verlust­modul G´´ (Gl. 7) hingegen beschreibt das viskose Verhalten der Testsubstanz. Sein Wert entspricht der irreversibel an die Umgebung abgegebenen und damit verlorenen Energie. Der Verlustfaktor tan δ (Gl. 8) beschreibt das Verhältnis zwischen elastischem und viskosem Anteil. Der Betrag der komplexen Viskosität |η*| beinhaltet sowohl elastische als auch viskose Eigenschaften der Messsubstanz [188, 190].

Um reproduzierbare Substanzparameter zu erhalten, darf die molekulare Struktur der Probe nicht zerstört werden. Darum wird die Probe im Oszillationsversuch nur innerhalb ihres linear-viskoelastischen Bereiches (LVB) belastet, für den gilt: .

Der LVB wird im CS-Modus durch Vorgabe einer konstanten Frequenz und größer werdender Schubspannungsamplitude, im Amplitudensweep , bestimmt. Aus dem bei verschiedenen Frequenzen des Amplitudensweeps ermittelten LVB ergibt sich der Messbereich des Frequenzsweeps , bei dem nun im CS-Modus eine größer werdende Frequenz bei konstanter Schubspannung vorgegeben wird [191].

Rheologische Auswertemodelle

Ostwald-, Herschel-Bulkley-Fit

Die vergleichende Betrachtung des Fließverhaltens strukturviskoser Körper ohne nennenswerte Thixotropie wird durch eine Kurvenanpassung möglich. Die Anpassung erfolgt unter der Annahme, dass die Viskosität der Zubereitung mit steigender Belastung abnimmt.


[Seite 90↓]

Die Auswertung nach Ostwald (Gl. 10) ist für strukturviskose Systeme mit pseudoplastischem Fließverhalten geeignet:

(Gl.10)

m

Ostwald-Konsistenz [Pas p ]

  

p

Ostwald-Fließindex [1]

  

D

Schergeschwindigkeit [1/s]

Für strukturviskose Systeme mit Fließgrenze erfolgt die Anpassung nach Herschel-Bulkley (Gl. 11) [188, 190, 192]:

(Gl. 11)

τ H

Fließgrenze ( τ 0 ) [Pa]

  

K

Herschel-Bulkley-Konsistenz [Pas]

  

p

Herschel-Bulkley-Index [1]

  

D

Schergeschwindigkeit [1/s]

Dabei gilt für beide Methoden:

p

Maß für die Strukturviskosität, d. h. die Krümmung der Kurve

 

(idealviskos: p = 1, strukturviskos: p < 1)

 

Wert der Schubspannung τ [Pa] bei D = 1 1/s und somit identisch mit dem

m

Zahlenwert der Viskosität η [Pas] bei 1 1/s (), Maß für die Konsistenz

 

der Zubereitung

K

Maß für die Konsistenz der Zubereitung

Zeitkonstante

Bei hinreichend kleinen Schergeschwindigkeiten kann auch für ein strukturviskoses System eine konstante Anfangsviskosität, die Nullviskosität, gemessen werden. Genauso kann bei sehr großen Belastungen für solche Systeme eine konstante Endviskosität erfasst werden. Dieses belastungsabhängige Verhalten wird z. B. durch das Cross- oder Carreau-Modell beschrieben. Bei der Aufnahme von Fließkurven mittels Schergeschwindigkeitsrampen soll die Belastungsabhängigkeit der Viskosität ermittelt werden. Besitzt die Substanz aber auch ein zeitabhängiges Fließverhalten, enthält die Fließkurve sowohl Informationen über die Belastungs- als auch die Zeitabhängigkeit. Eine Aufteilung in die beiden Anteile ist nicht möglich.

Werden dagegen zwei Fließkurven unmittelbar nacheinander gemessen, ist eine Aufteilung möglich, weil dann zu jeder Schergeschwindigkeit zwei Viskositäten zu unterschiedlichen Zeiten vorliegen. Mit einem einfachen Exponentialgesetz lassen sich die Startviskosität (Extrapolation der Zeit gegen 0) und eine Zeitkonstante berechnen. Die Zeitkonstante ist ein grobes Maß für die Dauer, die bis zum Erreichen der (unbekannten) Endviskosität benötigt würde. Diese Auswertung soll helfen, eine Aussage darüber zu treffen, welche Abhängigkeit biologisch signifikant ist: die zeitliche oder die belastungsabhängige [188].


[Seite 91↓]

4.3.3.2.  Untersuchungen

Die nachfolgenden Untersuchungen erfassen den Einfluss von DSCG und/oder der Polymere Natriumhyaluronat (HA) und Methylcellulose19 (MC) auf die rheologischen Parameter einer Mucindispersion (M). Dabei werden das Fließverhalten und das oszillationsrheologische Verhalten der biomakromolekularen Dispersion und der Polymere untersucht. Die Erfassung des Freigabeverhaltens von DSCG mit und ohne Polymerzusatz runden die Wechsel­wirkungsstudien ab.

Ziel der Untersuchungen waren die Charakterisierung des bereits in 4.2.1 festgestellten Effektes von DSCG auf die rheologischen Parameter der Mucindispersion sowie der Vergleich bzw. die Kombination mit den mukoadhäsiven Polymeren HA und MC. Die Polymerformulierungen sollten der Entwicklung einer geeigneten viskositätserhöhten und mukoadhäsiven Zubereitung zur nasalen Applikation für die nachfolgenden In-vivo­Verfügbarkeitsstudien am Kaninchen (↑ 4.3.4) dienen sowie generell in Richtung eines optimierten DSCG-Präparates zielen.

Aus der Herstellung des Probenansatzes mit den jeweiligen Zubereitungen resultierte für die im Weiteren als Mucin (M) bezeichnete Dispersion eine Konzentration von 15 % (m/m). Die Polymere lagen in den Probenmischungen in einer Konzentration von 0,25 % (HA) bzw. 0,68 % (MC) (m/m) vor. Die in den Abbildungen und Tabellen durch einen Schrägstrich nachgestellten Mengenangaben [mg] für DSCG (z. B. DSCG/5) beziehen sich auf Gramm Probengemisch. Die Verdünnung der Zubereitung während des Probenansatzes jeweils um den Faktor 4 entspricht in etwa der physiologisch auftretenden Verdünnung durch das nasale Sekret [160].

4.3.3.3. Rheologie – Mucinwechselwirkungen

Rotationsrheologie

Die gewählten Deformationsgeschwindigkeiten beziehen sich auf das Geschwindigkeits­gefälle, das sich über die mittlere Höhe der gesamten Mukusschicht (7,5 bis 15 µm) der Nasenschleimhaut ergibt (D = 0 bis 10 1/s) oder über die mittlere Höhe der oberen, viskosen Schicht (0,5 bis 5 µm) (D = 10 bis 100 1/s) [16, 68] und der Geschwindigkeit des rachenwärts gerichteten Transportes (5 bis 6 mm/min) durch die Zilientätigkeit. Die Dauer der Scherbean­spruchung wurde der Verweildauer nasal applizierter Substanzen unter physiologischen Bedingungen angepasst (20 min) [22].


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Abbildung 27 zeigt die Rheogramme20 der Mucindispersion nach Zusatz von DSCG und/oder HA in Abhängigkeit von der Natriumcromoglicatkonzentration über den Schergeschwin­digkeitsbereich von D=10bis1001/s. Tabelle 28 listet die aus den Aufkurven nach Ostwald-Fit21 gewonnenen rheologischen Kenngrößen (η D=1 und p) sowie die Thixotropie­flächen der Fließkurven auf.

Mucin zeigt im Rheogramm das Verhalten eines strukturviskosen, pseudoplastischen Körpers mit nur geringen thixotropen Eigenschaften, d. h. zusätzliche sekundäre chemische Bindungen zwischen den verknäulten Molekülketten spielen lediglich eine untergeordnete Rolle. Die Strukturviskosität dominiert eindeutig die Thixotropie bzw. die Belastungsabhängigkeit die Zeitabhängigkeit. Daher ist die Zeitkonstante, d. h. die Zeit in Sekunden, die die Viskosität zum Erreichen eines stationären Zustandes bei Belastung benötigt, mit einer Größenordnung von 105 bis 106 s sehr hoch (Daten nicht dargestellt) [188]. Damit besitzt die Modelldispersion die Fließcharakteristika des nasalen Mukus [68]. Mit zunehmender Belastung (Husten, Niesen) nimmt die Viskosität durch eine Orientierung und Entschlaufung der Makromoleküle ab. Die Dauer der Belastung spielt dabei keine Rolle. Eine Rückstellung auf die für den optimalen Transport nötige Viskosität ist gewährleistet.

Der Zusatz von DSCG zu Mucin bewirkt eine konzentrationsabhängige Zunahme der Strukturviskosität (p M/DSCG < p M), die sich in einer höheren Viskosität η D=1 äußert. Da zugleich die AUCs der Fließkurven, die Hysteresisflächen (ein hier relatives Maß für die Thixotropie, also für die Arbeit, die notwendig ist, um eine dreidimensionale Struktur zu zerstören [189]), mit der DSCG-Konzentration zunehmen, lässt sich schlussfolgern, dass zusätzliche sekundäre Bindungen entstehen. DSCG zeigt somit deutlich „adhäsive“ Fähigkeiten.

Natriumcromoglicat ist negativ geladen und besitzt durch seine Carboxyl- und Hydroxylgruppen die Möglichkeit zu Wasserstoffbrückenbindungen. Folgende Ursachen für die Zunahme der Strukturviskosität durch den DSCG-Zusatz wären denkbar:


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Je stärker die Entfaltung der Mucinmolekülketten bzw. die entstehende dreidimensionale Netzwerkstruktur ausgeprägt ist, umso stärker wird aber auch gleichzeitig die Beweglichkeit der Moleküle eingeschränkt; die Scherviskosität steigt [174].

Abbildung 27:Fließkurven von Mucin mit Zusatz von DSCG (5, 10 mg/g) und/oder HA im Bereich von
D = 10 bis 100 [1/s]

Tabelle 28: Rheologische Daten der Fließkurven aus Abb. 27

Kurve

 

Kurve

 

Hysteresis Fließkurve [Pa/s]

   

A

54,65

D

80,1

B

269,85

E

219,67

C

352,23

F

360,48

Ostwald-Fließindex p

   

A

0,787

D

0,567

B

0,662

E

0,515

C

0,585

F

0,475

Viskosität η D=1 [Pas]

   

A

1,20

D

6,14

B

2,63

E

7,83

C

4,78

F

10,62


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Der Zusatz von HA zum Mucin bewirkt eine deutliche Zunahme der Strukturviskosität. Die Viskosität des Gemisches aus beiden Polymeren als „Widerstand gegen das Fließen“ steigt. Die schwach thixotropen Eigenschaften der Mucindispersion nehmen durch den Zusatz von HA dagegen nicht in nennenswertem Maße zu (Tab. 28). Sekundäre chemische Bindungskräfte zwischen oder innerhalb der Molekülketten der beiden Makromoleküle, d. h. die Entstehung zusätzlicher dreidimensionaler Netzwerkkomponenten, spielen daher bei der Zunahme der Strukturviskosität keine Rolle. Sie ist somit hauptsächlich durch eine mechanische Verschlaufung der Ketten beider Makromoleküle (Interpenetration) bedingt.

HA in PBS pH 6,0 (0,25 % (m/m)) ist in guter Näherung ein Newton-System (p≈ 1) mit einer Viskosität η D=1 von ca. 19 mPas [193]. HA zeigt somit durch die starke Viskositätszunahme in Kombination mit der Mucindispersion deutlich mukoadhäsive Eigenschaften [194].

Der Zusatz der Kombination von HA und DSCG führt zu einer markanten Zunahme der Strukturviskosität der Mucindispersion (p M/DSCG/HA < p M/DSCG < p M), dabei treten gleichzeitig deutliche thixotrope Effekte auf. Die in Hinblick auf eine angestrebte Zubereitung mit längerer Verweildauer „positiven“ mukoadhäsiven Eigenschaften der Einzelkomponenten HA und DSCG scheinen sich nahezu zu addieren (η D=1 M/DSCG/HA η D=1 M/DSCG + η D=1 M/HA).

Abbildung 28 zeigt die Rheogramme, die über einen sehr kleinen Schergeschwindig­keitsbereich aufgenommen wurden.

Abbildung 28:Fließkurven von Mucin mit Zusatz von DSCG (5, 10 mg/g) und /oder HA im Bereich von
D = 0 bis 10 [1/s]


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Tabelle 29: Hysteresisflächen der Fließkurven aus Abb. 28

Hysteresis Fließkurve [Pa/s]

A

0,17

B

12,76

C

26,7

D

0,49

E

10,81

F

20,14

Es sind wiederum die bereits erläuterten rheologischen Effekte festzustellen. Darüber hinaus ist im Bereich sehr kleiner Scherraten (D < 1 1/s) im Rheogramm der DSCG-haltigen Proben (Abb. 28, B, C und E, F) die Tendenz einer Fließgrenze zu erkennen. Das heißt, dass im Ruhezustand ein inter- und/oder intramolekulares Netz von sekundären Bindungskräften aufgebaut wird, das dem System Feststoffcharakter verleiht. Zum Auslösen des Fließ­vorganges ist daher eine Mindestkraft erforderlich. Das Auftreten einer Fließgrenze kann somit auch als Maß für den Assoziationsgrad in der Probe interpretiert werden. Da jedoch kleine äußere Kräfte genügen, um die entstandenen Assoziationen zu zerstören, scheinen lediglich sekundäre chemische Bindungskräfte beteiligt zu sein. Bei der vergleichenden Betrachtung der Hysteresisflächen der Fließkurven (Tab. 28 und 29), die über die Schergeschwindigkeitsbereiche D = 0 bis 10 1/s (Abb. 28) und D = 10 bis 100 1/s (Abb. 27) aufgenommen wurden, wird das besonders deutlich. Während bei größerer Belastung (Abb. 27, Tab. 28) das Verhältnis der Hysteresisflächen von Mucin und dem Mucin/DSCG-Gemisch ungefähr 1:4 beträgt, ist im kleinen Schergeschwindigskeitsbereich die Hysteresisfläche der natriumcromoglicathaltigen Probe 70mal (Tab. 29) so groß.

Das Fließverhalten des Mucin/DSCG-Gemisches ist sogar in den Probengefäßen zu beobachten: unterhalb einer zum Auslösen des Fließvorgangs notwendigen Kraft reagiert das System elastisch auf die einwirkende Belastung. Die in der Aufwärtskurve der Probe M/DSCG/10 (Abb. 28, C) erkennbare „Nase“ im Bereich von D = 1 1/s deutet auf diese elastischen Anteile in der Probe hin. Nach deren „Überfahren“ werden nur noch die viskosen Anteile der Messprobe erfasst [191].

DSCG und HA zeigen in Kombination mit der Mucindispersion deutlich „adhäsive“ (DSCG) bzw. mukoadhäsive (HA) Eigenschaften, die sich in einer Zunahme der Strukturviskosität äußern. Der Zusatz von DSCG bewirkt dabei hauptsächlich das Entstehen einer drei­dimensionalen Netzwerkstruktur, d. h. einer zeitabhängigen, also thixotropen Komponente. Das tritt besonders deutlich im Bereich kleiner Schergeschwindigkeiten (D = 0 bis 10 1/s) hervor, also für das Geschwindigkeitsgefälle, dass sich über die obere, viskosere Mukusschicht der Nasenschleimhaut ergibt. Die Zunahme der Strukturviskosität nach Eintrag [Seite 96↓]des Polymeres HA ist auf die Verschlaufung der Molekülketten beider Makromoleküle zurückzuführen. Bei Zusatz der Kombination aus HA und DSCG zur Mucindispersion scheinen sich beide Effekte zu addieren.

Die folgenden oszillationsrheologischen Untersuchungen sollen die Art der Wechselwirkung von DSCG und HA mit der Mucindispersion charakterisieren.

Oszillationsrheologie

Die Elastizität des nasalen Mukus ist der entscheidendste Parameter seiner rheologischen Eigenschaften für eine optimale MCC. Die Ermittlung der Viskositätswerte ohne Kennzeich­nung der elastischen Eigenschaften führt zu einer unzureichenden Charakterisierung dieses Systems [68].

Ist eine Probe viskoelastisch, so wird ein Teil der Energie bei Belastung in einer elastischen Verformung der Molekularstruktur gespeichert. Die Erfassung der Viskoelastizität kann über Kriechversuche sowie über Versuche mit erzwungener Oszillation (dynamische Messung) erfolgen. Die Bestimmung der elastischen Eigenschaften ermöglicht einen Einblick in die Molekülstruktur der untersuchten Substanz [82], da es zu keiner Zerstörung der molekularen Struktur der Probe kommt. Ein weiterer Vorteil der Oszillationsmessungen liegt in der Möglichkeit, gleichzeitig die viskosen und elastischen Anteile der Messprobe zu bestimmen [78].

Abbildung 29: Frequenzsweep von Mucin: Speichermodul (▲), Verlustmodul G´´ (■),
Betrag der Komplexen Viskosität |η *| (◆)


[Seite 97↓]

Abbildung 29 zeigt den Frequenzsweep von Mucin. Die Viskoelastizität der Modellsubstanz ist deutlich an dem frequenzabhängigen, elastischen () und viskosen Modul (G´´) zu erkennen [16]. Die Probe verhält sich flüssigkeitsartig ( < G´´, tan δ > 1) und zeigt im Frequenzsweep das Verhalten linearer Makromoleküle mit relativ breiter Molekülmassen­verteilung, deren Netzwerk hauptsächlich aus sterischen Verschlaufungen der Molekülketten und in untergeordneter Dominanz durch Quervernetzungen innerhalb des Moleküls oder zwischen den Molekülketten die Elastizität bedingt [188, 187].

Die Frequenzabhängigkeit der Moduln erklärt sich wie folgt: Bei kleinen Frequenzen haben die Moleküle viel Zeit, sich zu entwirren und gleichzeitig zu entspannen; sie fließen aneinander vorbei und reagieren hauptsächlich viskos. Mit zunehmender Frequenz reagieren die Proben zuerst innerhalb des Netzverbandes mit Wider-stand gegen die Deformation und verhalten sich ähnlich wie Festkörper. Die Verbindungs-glieder strecken sich elastisch. Danach beginnen sich die Molekülglieder zu entschlaufen, zu orientieren und schließlich zu fließen [189].

Abbildung 30 zeigt, dass der Zusatz von DSCG zur Mucindispersion die Kurven des Frequenzsweeps gegenüber Abbildung 29 deutlich verändert. Mit zunehmender Konzen­tration an DSCG (5 → 10 mg/ml DSCG) erhöht sich der Betrag der komplexen Viskosität, weil sowohl der viskose Modul (G´´) als auch der Speichermodul () zunehmen. Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass der Anteil der temporären Quervernetzungen in der Probe konzentrationsabhängig markant ansteigt. Die miteinander verschlauften Molekülketten des Mucins verwickeln sich durch inter- und/oder intramolekulare Wechselwirkungen zusätzlich und erhalten durch die Bildung unbeständiger, temporärer Knotenpunkte (nichtkovalent) eine deutlich netzartige Struktur. Durch die Ausprägung der Netzwerkstruktur steigen sowohl der Widerstand gegen das viskose Fließen (Behinderung der Entschlaufung im Bereich kleiner Frequenzen) als auch der Widerstand gegen die elastische Verformung (Anzahl dehnbarer Kettenglieder des dreidimensionalen Netzwerkes wird erhöht) [189]. Dabei kann im Bereich hoher Deformationen (z. B. Abb. 30, ω > 10 1/s) sogar beobachtet werden, dass das elastische Verhalten das viskose Verhalten dominiert ( > G´´).


[Seite 98↓]

Abbildung 30:Frequenzsweeps von Mucin mit DSCG unterschiedlicher Konzentration (5, 10
mg/g):Speichermodul (▲), Verlustmodul G´´ (■), Betrag der Komplexen Viskosität
|η *|(◆)

Abbildung 31 zeigt die Frequenzsweeps der polymerhaltigen (HA und MC) Proben. MC wurde als nichtionisches, schwach mukoadhäsives Polymer [73] zum Vergleich ausgewählt.

Der Zusatz der Polymere HA bzw. MC zum Mucin (Abb. 31) lässt im Vergleich zur DSCG­Zugabe (Abb. 30) hauptsächlich eine Zunahme der absoluten Werte erkennen. Der Verlauf der Kurven im Frequenzsweep verändert sich kaum. Daraus ist zu schlussfolgern, dass vorrangig physikalische Verschlaufungen der Makromoleküle erfolgen, die sowohl zu einer Erhöhung der Elastizität (Anzahl dehnbarer Kettenglieder wird erhöht) als auch der Viskosität (Behinderung der Entschlaufung im Bereich kleiner Frequenzen) führen. Die Polymere selbst zeigen in den verwendeten Konzentrationen (0,25 % HA bzw. 0,68 % MC in PBS pH 6,0) keine viskoelastischen Eigenschaften (Daten nicht dargestellt). Ihre Eigenviskositäten sind vernachlässigbar klein.


[Seite 99↓]

Abbildung 31: Frequenzsweeps von Mucin unter Zugabe der Polymere HA (links) und MC (rechts):
Speichermodul (▲), Verlustmodul G´´ (■), Betrag der Komplexen Viskosität |η *|(◆)

Abbildung 32: Frequenzsweeps von Mucin unter Zugabe von MC und DSCG (5 mg/g):
Speichermodul (▲), Verlustmodul G´´ (■), Betrag der Komplexen Viskosität |η *|(◆)


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In Abbildung 32 und 33 sind die Frequenzsweeps von Mucin mit einem Zusatz aus der Kombination MC (Abb. 32) bzw. HA (Abb. 33) mit DSCG dargestellt. Die für die Einzelkomponenten gefun-denen Effekte spiegeln sich in den Frequenz-sweeps der Kombinationen wider.

Die Kombination M/HA/DSCG (Abb. 33) unter-scheidet sich in den Kurven der Frequenzsweeps deutlich von der Kombination M/MC/DSCG. Während im Bereich niedriger Frequenzen der viskose Modul von Mucin im Gemisch mit HA und DSCG überwiegt, dominiert im Bereich hoher Frequenzen wiederum das elastische das viskose Verhalten. Die Zubereitung verhält sich bei hohen Frequenzen festkörperartig (tan δ < 1) [190].

Abbildung 33:Frequenzsweeps von Mucin unter Zugabe von HA/DSCG/5 (links) und HA/DSCG/10
(rechts): Speichermodul G´(▲), Verlustmodul G´´ (■), Betrag der Komplexen Viskosität
|η *| (◆)

Tabelle 30 stellt die Ergebnisse der oszillationsrheologischen Untersuchungen aller Proben (Abb. 29 bis 33) zusammen. Es sind die Steigungen (m) aus der graphischen Auftragung von „log gegen log ω (Kreisfrequenz)“ sowie die rheologischen Charakteristika der Oszillationsmessungen (G´, G´´, tan δ ) dokumentiert. Die rheologischen Parameter , G´´, tan δ sind den Frequenzsweeps bei einer mittleren Kreisfrequenz (ω = 16,9 1/s) entnommen [73]. Sie ermöglichen einen einfachen Vergleich.

Die Steigung m kann als Maß für die Quervernetzung der Mucinglykoproteine betrachtet werden. Sie beträgt bei rein physikalischer Verschlaufung zwei (wobei die Anpassung an die [Seite 101↓]Gerade nur im Bereich kleiner und mittlerer Frequenzen gegeben ist, siehe Korrelations­koeffizient (K)) und bei einem permanenten, durchvernetzten Netzwerk (kovalente Bindungen) Null [187]. Eine abnehmende Steigung der Geraden verdeutlicht somit den Übergang zu einer Netzwerkstruktur durch temporäre Knotenpunkte, die nicht durch physikalische Verschlaufungen bedingt sind.

Der statistische Vergleich der ermittelten Daten erfolgte beispielhaft für . Dabei wurden sowohl die Werte für ω = 16,9 1/s als auch die Steigungen des gesamten Frequenzsweep gegeneinander verglichen (siehe Anhang 7.6).

Tabelle 30: Rheologische Kenngrößen der Frequenzsweeps (zur Statistik s. auch 7.6)

 

G´ [Pa]

G´´ [Pa]

tan δ

m [Pa/s]

K

Mucin

4,01(0,48)

8,88 (0,35)

2,33 (0,14)

1,43 (0,164)

0,981

+ DSCG/5

6,58 (1,00)

11,86 (1,18)

1,82 (0,17)

1,12 (0,069)

0,994

+ DSCG/7,522

11,56 (2,11)*

17,34 (2,39)

1,51 (0,09)

0,87 (0,035)

0,998

+ DSCG/10

13,78 (2,11)*

19,13 (2,36)

1,40 (0,08)

0,77 (0,030)

0,998

+ MC

8,94 (0,50)*

16,07 (0,60)

1,80 (0,04)

1,31 (0,139)

0,988

+ MC + DSCG/5

9,98 (1,14)*

18,60 (1,56)

1,87 (0,05)

1,19 (0,139)

0,992

+ HA

13,83 (1,00)*

18,27 (1,57)

1,32 (0,02)

1,01 (0,090)

0,992

+ HA + DSCG/5

20,70 (2,21)*

24,27 (2,08)

1,18 (0,02)

0,87 (0,051)

0,995

+ HA + DSCG/7,528

23,95 (3,18)*

27,40 (2,40)

1,15 (0,06)

0,74 (0,044)

0,996

+ HA + DSCG/10

30,05 (1,06)*

32,00 (2,55)

1,00 (0,11)

0,76 (0,036)

0,997

± SD bzw. SEM in Klammern

Werte für , G´´, tan δaller Zubereitungen signifikant vom Wert für Mucin verschieden (t-Test)

* signifikant vom Wert für M/DSCG/5

Der Zusatz aller Zubereitungen zur Mucindispersion führte zu einem signifikanten Anstieg von „Viskosität“ (´ bei ω = 16,9 1/s) und Elastizität (bei ω = 16,9 1/s), wobei letztere in ausgeprägterem Maße zunahm (Δ>ΔG´´).

Der Einfluss polymerer Zusätze zu einer Mucindispersion wurde auch durch Caramella et al. [82] und Madsen et al. [73] mit dieser Konsequenz beschrieben. Verantwortlich für das verstärkte temporäre Netzwerk durch zusätzliche Verschlaufungen und damit dehnbare Segmente ist dabei im Falle des Zusatzes von MC lediglich der Eintrag zusätzlicher Makromoleküle (m Mm M/MC, nicht signifikant (t-Test, s. 7.6)). Für HA scheint zudem das [Seite 102↓]Entstehen von Netzpunkten durch zusätzliche sekundäre Bindungen vorzuliegen (m m M/HA; signifikant (t-Test, s. 7.6)).

Das konzentrationsabhängige temporäre inter- und/oder intramolekulare Vernetzen der Mucinmoleküle durch DSCG findet in den Daten der Tabelle 30 deutlich Ausdruck (m M >> m M/DSCG, signifikant (t-Test, s. 7.6)). Eine weitere Erhöhung der DSCG-Konzentration auf 12,5 mg je Gramm Probengemisch verstärkte den Effekt nicht weiter. Für eine resultierende Konzentration von 2,5 mg DSCG je Gramm Gemisch veränderten sich die rheologischen Parameter der Mucindispersion kaum (Daten nicht dargestellt).

Die folgende Abbildung 34 veranschaulicht die Zunahme der Elastizität der Mucindispersion durch den Zusatz von DSCG, HA und MC. Dargestellt sind die rheologischen Synergismen Δ, die durch ΔG´= ( Mix - Mucin) ermittelt werden [73].

Abbildung 34: Rheologische Synergismen Δ[Pa]
(+) = zugefügter DSCG-Anteil zum jeweiligen Polymer

In Analogie zur Ermittlung der überadditiven Viskositätszunahme bei der Bestimmung des Mukoadhäsionsindexes (↓ 3.3.3, ↑ 5.2.5.2) bedeutet ein Δ [Pa] ein Auftreten mukoad­häsiver Wechselwirkungen [73, 87]. Die ermittelten Werte liegen für DSCG/10 im Bereich des als deutlich mukoadhäsiv beschriebenen HA [194] und übertreffen dabei signifikant
(t-Test, s. 7.6) den Effekt des leicht mukoadhäsiven Polymers MC [195] in den hier verwendeten Konzentrationen. DSCG zeigt also eine ausgeprägte Wechselwirkungstendenz mit den Komponenten der Mucindispersion. Mögliche Gründe dafür wurden bereits bei der Diskussion der Fließkurven angeführt (↓ 4.3.3.3, A). Die Oszillationsuntersuchungen bestätigen nunmehr die Vermutung, dass zusätzliche sekundäre chemische Bindungen entstehen.


[Seite 103↓]

Die Kombination aus HA und DSCG führte dabei zu einer Erhöhung von Δ über das Maß hinaus, das der Addition der Effekte beider Komponenten entspricht. Es liegt somit ein zusätzlicher Synergismus vor (schwarze Flächen in Abb. 34). Da die aus der Darstellung „log gegen log ω“ (Abb. 30 und 33) errechneten Steigungen sich nicht signifikant (t-Test,
s. 7.6)verändern (m M/DSCG/10  ≈ m M/MDSCG/HA/10) (Tab. 30), können zusätzliche inter- und/oder intramolekulare „Vernetzungen“ der Mucinmoleküle durch sekundäre chemische Bindungen infolge des kombinierten DSCG/HA-Zusatzes nicht die Ursache für die überadditive Elastizitätszunahme sein. Vielmehr scheint die Zubereitung aus HA und DSCG die Interpenetration des Polymers HA in das Netzwerk der Mucinmoleküle zu begünstigen.

Die folgenden rheologischen Untersuchungen sollen die Zubereitung DSCG/HA charakterisieren. Die Charakterisierung der Kombination DSCG/MC soll einen Vergleich ermöglichen.

4.3.3.4. Rheologische Untersuchungen der Polymerzubereitungen

Die überadditive Komponente der rheologischen Synergismen (Abb. 34) kann sich letztlich nur durch Folgendes ergeben:

In beiden Fällen ist die verbesserte Interpenetration der HA-Moleküle in das Netzwerk der Mucinmoleküle eine mögliche Ursache. Demnach müsste der Zusatz von DSCG zu einem HA-Gel auch einen Einfluss auf dessen rheologisches Verhalten ausüben. Die verbesserte Fähigkeit von HA zur Interpenetration in das Mucinnetzwerk durch dessen Kombination mit DSCG sollte sich im Sinne einer besseren Hydratation (Hydrotropierung durch DSCG) in einer größeren Beweglichkeit der Polymerketten äußern, die aus den verminderten Interaktionen zwischen den oder innerhalb der einzelnen HA-Ketten resultiert. Gleichzeitig könnte dadurch die Fähigkeit von HA, mit den Mucinmolekülen zu wechselwirken, verbessert werden. Da die größere Beweglichkeit der HA-Ketten in der Kombination mit DSCG zur einer Auffaltung der makromolekularen Struktur der HA-Moleküle führt, sollte für das Gemisch DSCG/HA eine Erhöhung der dynamischen Viskosität feststellbar sein.


[Seite 104↓]

Da eine 0,25%ige Lösung von HA – wie in den bisherigen Versuchen verwendet – keine detektierbaren viskoelastischen Anteile besitzt, wurde der Einfluss von DSCG (20, 40 mg/ml) auf eine 1%ige Zubereitung von HA in PBS (pH 6,0, µ = 0,201) untersucht. Diese konzentrierte Lösung von HA zeigte ein schwach pseudoplastisches Fließverhalten, ohne nennenswerte Thixotropie und ohne Fließgrenze (Daten in Anhang 7.3 dargestellt). Das kann folgendermaßen erklärt werden: die linearen Molekülketten sind zu einem flexiblen Netzwerk verwickelt, das die Grundlage für die viskoelastischen Eigenschaften bildet [193]. Die rheologischen Eigenschaften von HA-Lösungen werden in erster Linie durch die Konfiguration des HA, in zweiter Linie durch seine stark milieuabhängige Konformation bestimmt [196]. Vor allem Art und Menge der Fremdelektrolytzusätze beeinflussen die stofflichen (Verschlaufungen, Verhakungen) und energetischen Interaktionen in der Polyelektrolytlösung [197].

Aus den Daten der Tabelle 31 lassen sich folgende Aussagen ableiten:

Fließverhalten (Fließkurve, D = 10 bis 100 1/s, auf und ab) (Graphen in 7.3 dargestellt, Fit nach Ostwald)

Oszillation (Frequenzsweep, ω = 0,1 bis 10 Hz, M = 0,8 mNm) (Graphen in 7.3 dargestellt)

Die Anstiege m der Darstellung „log gegen log ω nehmen mit der DSCG-Konzentration zu (Tab. 31). Die HA-Moleküle liegen in einer weniger starren Konformation vor, werden beweglicher und können damit zwar stärker verschlaufen, aber unter Belastung auch schneller entschlaufen.

MC (0,68 %) in PBS zeigt generell das für Celluloseether typische pseudoplastische Fließverhalten. Bei hoher Konzentration (2,68 % (m/m)) tendiert das System zur Ausbildung einer Fließgrenze und zu thixotropem Fließen. Der DSCG-Zusatz verändert hier die rheologischen Eigenschaften kaum (Daten nicht dargestellt).


[Seite 105↓]

Zusammenfassend kann festgestellt werden: der Natriumcromoglicatzusatz bewirkt eine Veränderung der Konformation der HA-Moleküle, die vermutlich durch den zusätzlichen Eintrag negativer Ladungen im Sinne einer weniger starken elektrischen Abschirmung der HA-Moleküle gegeneinander entsteht. Die Polymerketten werden besser hydratisiert; durch die stärkere Verschlaufung steigen Viskosität und Elastizität der Mischung.

DSCG bildet folglich mit HA in PBS ein System, das durch seine Kombination Mucinwechselwirkungen im Sinne einer zusätzlich gesteigerten Mukoadhäsivität, beruhend auf besserer Möglichkeit zur Interpenetration, zeigt. Die Interpenetrationsfähigkeit makromolekularer Stoffe liefert einen entscheidenden Beitrag bei der Entstehung mukoadhäsiver Wechselwirkungen [73], wobei die Flexibilität der Polymerketten entscheidend ist für ihre gegenseitige Interpenetration und Verschlaufung [83].

Tabelle 31: Rheologische Kenngrößen der Kombination HA/DSCG

 

Fließkurve

Frequenzsweep

 

p

ηD=1 [Pas]

tan δ [1]

m23

HA

0,455

4,760

1,13

0,737

HA/DSCG/20

0,426

6,021

1,10

0,839

HA/DSCG/40

0,412

7,395

0,994

0,934

4.3.3.5. In-vitro-Liberation

Einleitung

Die mukoziliäre Clearance bedingt eine kurze Verweildauer auf der Nasenschleimhaut und wirkt damit der Permeation von Arzneistoffen prinzipiell entgegen. Darüber hinaus kann auch der Mukus selbst, ebenso wie das Epithel, eine Diffusionsbarriere darstellen [22, 75, 198]. Determinierend sind hierfür die physikochemischen Eigenschaften des Arzneistoffmoleküls (Molekülmasse, Ladung, Hydratationsradius, Fähigkeit zu Wasserstoffbrückenbindungen). Aber auch der Anteil von Glykoproteinen im nasalen Mukus, das Ausmaß der „Quervernetzungen“ der Mucinmoleküle und die Molekülmasse zwischen zwei Verbindungspunkten des Mucinnetzwerks nehmen Einfluss [71] (siehe Abb. 7). Bei Arzneistoffen, die in ausgeprägtem Maße mit den Glykoproteinen des nasalen Mukus wechselwirken, kann diese Interaktion unter Umständen sogar einen permeations­begrenzenden Faktor darstellen und die systemische oder lokale Verfügbarkeit dadurch [Seite 106↓]verringert sein [199]. Insbesondere geladene Partikeln mit der Fähigkeit zu Wasserstoff­brückenbindungen und lipophile Partikeln sind davon betroffen [76, 198].

Die Diffusion gelöster, sphärischer Partikeln wird nach dem Gesetz von Stokes-Einstein auch durch die Viskosität beeinflusst (Gl. 12).

(Gl. 12)

D

Diffusionskoeffizient

k B

Boltzmann-Konstante

η

Viskosität

T

Absolute Temperatur

r

Hydrodynamischer Teilchenradius

Bei wässrigen Systemen mit makromolekularem Zusatz muss zwischen der Viskosität der Zubereitung und der des Diffusionsmediums unterschieden werden. Die „Makroviskosität“ der Zubereitung steigt durch die verschlungenen, hydratisierten Molekülketten an. Sie stellt eine Diffusionsbehinderung dar. Die Viskosität des Diffusionsmediums Wasser erfährt dabei keine Veränderung [192]. Daher ist nicht in jedem Fall mit einer Korrelation von Diffusionsquotient und Viskosität zu rechnen [89].

Liegt die Matrix durch Verknäulungen und ggf. zusätzliche sekundäre chemische Bindungen als ein dreidimensionales Netzwerk vor und sind die diffundierenden Wirkstoffpartikeln in die Matrix inkorporiert, so wird ihre Freisetzung aus dem Gerüst, als Voraussetzung zur Diffusion, zum geschwindigkeitsbestimmenden Schritt. Eine solche matrixkontrollierte Diffusion ist durch einen zunehmenden Diffusionsweg der Partikeln gekennzeichnet, d. h. die Diffusionsgeschwindigkeit der gelösten Partikeln ist zeitlich nicht mehr konstant, sondern nimmt mit der Zeit ab [192]. Dagegen bleibt die Diffusionsgeschwindigkeit in einem diffusionskontrollierten System nach Erreichen eines Steady-state-Zustandes konstant (Diffusionsgeschwindigkeit zur Grenzfläche ist gleich der Diffusionsgeschwindigkeit in der Grenzfläche).

Während das Permeationsmodell (↓ 3.3.2 und 4.2.2.2) den Durchtritt eines gelösten Stoffes durch eine Schicht (Membran) erfasst, dient das Liberationsmodell der Erfassung des Diffusionsverhaltens von gelösten Arzneistoffen aus einer praktisch unendlich dicken Schicht. Dementsprechend ist die Versuchsanordnung aus zwei Halbzellen so gestaltet, dass bei Einhaltung von Sink-Bedingungen im Freigabekompartiment (das Akzeptorvolumen wird im Kreislauf an der ruhenden Freigabeschicht vorbeibewegt) die Liberationsmembran (Nephrophan® ) lediglich eine Trennfunktion für die Kompartimente erfüllt. Es gilt für die freigegebene Menge an gelöstem Arzneistoff:


[Seite 107↓]

(Gl. 13)

Q

Freigesetzte Arzneistoffmenge zur Zeit t [µg]

D app

Diffusionskoeffizient [cm 2 /s]

  

c 0

Ausgangskonzentration [µg/ml]

(Gl. 14)

A

Diffusionsfläche [cm 2 ]

t

Zeit [min]

Dieses entsprechend den Versuchsbedingungen aufgelöste Diffusionsgesetz, die Higuchi-Gleichung , beschreibt somit die matrixkontrollierte Diffusion. Charakteristisch für Daten solcher Freigabeuntersuchungen ist eine Wurzel/Zeit-Beziehung, die der Anfangs­konzentration proportional ist [78].

Nach Gleichung 12 spielt auch der hydrodynamische Radius der gelösten diffundierenden Teilchen eine Rolle. Der Diffusionskoeffizient bei konstanter Viskosität ist dabei in guter Näherung der dritten Wurzel der Molekülmasse (MM) proportional [198]. Im Folgenden sind die anhand der gewonnenen Liberationsdaten berechneten Diffusionskoeffizienten der Arzneistoffe mit dieser präziseren Gleichung ermittelt worden () [198].

Untersuchungen

Es wurde das Liberationsverhalten von DSCG, OXY und FLU aus der Mucindispersion, ggf. nach Zusatz von HA, bestimmt (Probenansätze der rheologischen Untersuchungen (↓ 4.3.3.2 und ↑ 5.2.5)). Die Untersuchung der Liberation von DSCG aus dem Gemisch mit Mucin sollte die direkte Wechselwirkung von DSCG mit den Mucinmolekülen bestätigen. Der Vergleich des Liberationsverhaltens von DSCG mit dem von OXY und FLU („Vergleichssubstanzen“), die nicht mit der Mucindispersion wechselwirken, diente dazu, den Einfluss der Wechselwirkung von DSCG mit Mucin auf dessen Freigabe und damit dessen nasale Verfügbarkeit zu ermitteln. Um den durch den DSCG-Zusatz zur Mucindispersion bedingten Viskositätsanstieg als Einflussparameter auf die Liberation (Gl. 12) der Vergleichsubstanzen zu eliminieren, wurde das Liberationsverhalten von OXY und FLU aus den natriumcromoglicathaltigen Mucinprobenansätzen erfasst. Die direkte Vergleichbarkeit der Liberationsdaten von DSCG mit denen von OXY und FLU war auf diese Weise gegeben.

Darüber hinaus wurde auch das Freigabeverhalten von DSCG aus dem HA-Gel bestimmt, um die Zubereitung in Hinblick auf eine für DSCG optimierte nasale Formulierung zu charakterisieren (↑ 4.3.4). Die Erfassung der Freigabe von DSCG aus dem isoviskosen Methylcellulosegel diente wiederum der Vergleichbarkeit (↓ 4.3.3.3).


[Seite 108↓]

Hypothesen:

Um eine negative Beeinflussung der rheologischen Parameter der Mucindispersion durch den Zusatz von OXY und FLU im Gemisch mit DSCG bzw. HA auszuschließen, wurden in Analogie zu 4.3.3.3 mit den Probenansätzen der Liberationsstudien Frequenzsweeps aufgenommen. Im Gegensatz zu OXY führte FLU in äquimolaren Konzentrationen zu DSCG zu einer deutlichen Abnahme von Viskosität und Elastizität des Mucin/DSCG-Gemisches. Daraus resultierend wurden die Liberationsstudien mit FLU lediglich mit einer Konzentration von 125 µg/ml durchgeführt. OXY wurde in DSCG äquimolarer Konzentration in den Liberationsstudien verwendet.


[Seite 109↓]

Ergebnisse und Diskussion

Freigabeuntersuchungen aus den mucinhaltigen Probenansätzen

Tabelle 32 stellt die ermittelten Liberationsdaten zusammen. PBS wurde in jedem Fall verwendet.

Die Freigabe von OXY aus dem Gemisch mit Mucin ist, verglichen mit der Liberation von OXY aus dem mucinfreien PBS, signifikant (t-Test, siehe 7.7) um ca. 50 % reduziert. Bhat et al. [199] beschrieben für die Freigabe eines Arzneistoffes aus einer Mucindispersion, der mit den Glykoproteinen des Mucins keinerlei Wechselwirkungen eingeht, ebenfalls eine solche Verringerung in der freigegebenen Arzneistoffmenge. Die Verringerung der Freigabe von OXY aus der Mucindispersion liegt in der erhöhten „Makroviskosität“ der biopolymeren Zubereitung (verglichen mit Wasser) begründet. Die dreidimensionale Netzwerkstruktur der verschlungenen Mucinglykoproteine behindert die freie Diffusion von OXY (D app OXY > D app M/Oxy bei: η D=1 OXY (1 mPas) << η D=1 M/OXY (1,20 Pas)). Obwohl sich die „Makroviskosität“ der Mucindispersion durch den Zusatz des Polymeres HA deutlich erhöht (↓ 4.3.3.3, Tab. 28) (η D=1 M/OXY (1,20 Pas) < η D=1 M/HA/OXY (6,14 Pas), erfährt der Diffusionskoeffizient von OXY keine signifikante Veränderung (t-Test, siehe 7.7) (D app M/OXY = D app M/HA/OXY). Es liegt durch den zusätzlichen Eintrag der HA-Molekülketten keine andere „Art“ der Diffusions­behinderung für den Arzneistoff OXY vor.

Hingegen führt der Zusatz von DSCG zur Mucindispersion zu einer signifikanten (t-Test, siehe 7.7) Abnahme der freigegebenen Menge OXY, deren Ursache nicht allein die Zunahme der „Makroviskosität“ durch den DSCG-Zusatz sein kann (D app M/OXY = D app M/HA/OXY < D app M/DSCG/OXY bei: η D=1 M/OXY (1,20 Pas) < η D=1 M/DSCG/10/OXY (4,78 Pas) < η D=1 M/HA/OXY (6,14 Pas)). Vielmehr scheinen die durch den DSCG-Zusatz entstehenden sekundären Bindungen in der dreidimensionalen Netzwerkstruktur des Mucins die Beweglichkeit des diffundierenden OXY nochmals deutlich einzuschränken. Dabei spielt wieder in Analogie zum HA-Zusatz zur Mucindispersion die „Art“ der Beweglichkeitseinschränkung infolge des DSCG-Zusatzes eine größere Rolle als ihre „Quantität“ (D app M/DSCG/5/OXY = D app M/DSCG/10/OXY (nicht signifikant, (t­Test, siehe 7.7)) bei: η D=1 M/DSCG/5/OXY (2,63 Pas) < η D=1 M/DSCG/10/OXY (4,78 Pas).


[Seite 110↓]

Tabelle 32: Liberation von DSCG und OXY aus verschiedenen Formulierungen mit Mucin24

DSCG (5, 10 mg/g)

 

[µg/s1/2]

Dapp x 10-5 [cm2/s]

pD

Q60 [µg]

DSCG/5

30,41

5,743 ± 0,015

4,241

1277,8 ± 118,65

DSCG/10

58,03

5,230 ± 0,008

4,281

2326,54 ± 40,62

+ M + DSCG/5

6,45

0,239 ± 0,001

5,622

246,90 ± 10,63

 

+ DSCG/10

7,54

0,076 ± 0,001

6,120

281,65 ± 21,94

 

+ DSCG/5 + HA

5,97

0,205 ± 0,0004

5,688

237,89 ± 6,94

 

+ DSCG/10 + HA

6,97

0,066 ± 0,006

6,184

293,97 ± 50,27

OXY (2,9 mg/g)

     
 

[µg/s1/2]

Dapp x 10-5 [cm2/s]

pD

Q60 [µg]

 

OXY

23,91

8,838 ± 0,028

4,054

1109,01 ± 66,7

 

+ M

9,18

1,081 ± 0,007

4,966

414,64 ± 7,44

 

+ M + DSCG/5

6,32

0,618 ± 0,055

5,209

295,14 ± 22,92

 
 

+ DSCG/10

6,15

0,585 ± 0,002

5,233

284,69 ± 4,028

 

+ HA

8,77

1,189 ± 0,002

4,925

381,61 ± 5,98

 

+ DSCG/5 + HA

6,02

0,560 ± 0,024

5,252

286,23 ± 17,54

 

+ DSCG/10 + HA

5,71

0,504 ± 0,004

5,298

269,52 ± 21,83

DSCG wird, verglichen mit OXY, aus der Mucindispersion signifikant (t-Test, siehe 7.7) schlechter freigesetzt (D app M/DSCG/5 < D app M/OXY bei gleicher η D=1 (2,63)). Da die erhöhte „Makroviskosität“ des Mucin/DSCG-Gemisches keinen Einfluss auf die Freigabe von OXY nahm, muß die verringerte Freigabe von DSCG eine andere Ursache haben. Die Vermutung wird auch durch die Tatsache verstärkt, dass die Erhöhung der Konzentration des DSCG­Zusatzes nur auf die Freigabe von DSCG aus der Mucindispersion einen signifikanten (t-Test, siehe 7.7) Einfluss nimmt. Diese konzentrationsabhängige Verringerung in der freigebenen Menge DSCG aus dem Gemisch mit Mucin schließt gleichzeitig den Unterschied in der Molekülmasse von DSCG und OXY als hauptsächlich Einfluss nehmenden Parameter aus. Letztlich scheint sich die Hypothese der rheologischen Untersuchungen, dass DSCG selbst an den zusätzlichen sekundären Bindungen zwischen oder innerhalb der Mucinmoleküle beteiligt ist, zu bestätigen. Das reduzierte Freigabeverhalten von DSCG aus Mucin spricht für eine „Fixierung“ der Substanz in der dreidimensionalen Gerüststruktur.


[Seite 111↓]

Diese reduzierte Freigabe von DSCG wird in Analogie zum Freigabeverhalten von OXY durch die Kombination von DSCG mit HA im Gemisch mit Mucin trotz deutlich erhöhter „Makroviskosität“ infolge des Polymerzusatzes nicht nennenswert weiter reduziert
(D app M/DSCG/5 = D app M/DSCG/5/HA bzw. D app M/DSCG/5/OXY = D app M/DSCG/5/HA/OXY (nicht signifikant, (t-Test, siehe 7.7) bei: η D=1 M/DSCG/5 (2,63 Pas) < η D=1 M/DSCG/5/HA (7,83 Pas)). Diese Tatsache spricht wiederum für eine direkte Fixierung des DSCG in der Netzwerkstruktur der Mucinglykoproteine. Gleichzeitig findet sich die Annahme der oszillationsrheologischen Untersuchungen bestätigt, dass die überadditive mukoadhäsive Komponente (↓ 4.3.3.3, Abb. 34) der Kombination HA/DSCG im Gemisch mit der Mucindispersion durch eine Verbesserung der Interpenetration der HA-Molekülketten in die Netzwerkstruktur des Mucins zustande kommt, da sich die Freigabe von DSCG aus dem Gemisch M/HA/DSCG nicht signifikant von der aus dem Gemisch M/DSCG unterscheidet. Eine Abnahme des DSCG­Effektes auf die Glykoproteinkomponenten des Mucins bei der Wechselwirkung beider Substanzen (mit der Mucindispersion) ist insofern ebenso auszuschließen. Die überadditive Komponente der rheologischen Synergismen (↓ 4.3.3.3, Abb. 34) scheint daher tatsächlich, wie die rheologischen Studien mit der mucinfreien Kombination DSCG/HA (↓ 4.3.3.4) vermuten lassen, durch die verbesserte Interpenetrationsfähigkeit der HA-Molekülketten in das Netzwerk der Mucinglykoproteine zu entstehen, die durch konformelle Änderungen des HA-Moleküls infolge des DSCG-Zusatzes bedingt ist.

Die dargestellten Ergebnisse der Liberationsversuche bestätigen die Behauptung, dass Freisetzungsstudien aus dem Mucin/Arzneistoff-Gemisch zur Untersuchung von Mucin/Arzneistoff-Wechselwirkungen herangezogen werden können [198]. Wikman-Larhed et al. [198] geben an, dass dabei die Verwendung von ungereinigtem, lyophilisiertem Mucin, wie es in den vorliegenden Untersuchungen genutzt wurde, den In-vivo-Gegebenheiten näher kommt als der Einsatz reiner Glykoproteinkomponenten.

Die Ergebnisse der Liberationsstudie für FLU (Tab. 33) sind kritisch zu bewerten. Die vergleichsweise niedrigen D app im Gegensatz zu OXY (Tab. 32) haben ihre Ursache in der geringen Ausgangskonzentration von FLU im Probenansatz. Die Auswertung der Daten mit der angewandten Gesetzmäßigkeit (Higuchi-Gleichung, Gl. 14) setzt praktisch konstante Ausgangskonzentrationen der freizugegebenen Substanz in der jeweiligen Matrix voraus. Die Konzentration von FLU im Gemisch mit Mucin über den Versuchszeitraum kann aufgrund der geringen Ausgangskonzentration nicht als konstant angenommen werden. Die Studien zeigen jedoch auch, dass die Ursache der Makroviskositätszunahme der Mucindispersion (zusätzliche sekundäre Bindungen im Mucinnetzwerk durch DSCG-Zusatz) einen größeren Einfluss hat als ihre Quantität (Anzahl zusätzlicher Bindungen durch DSCG in Abhängigkeit von dessen Konzentration).


[Seite 112↓]

Tabelle 33: Liberationsdaten FLU aus den mucinhaltigen Formulierungen

FLU (0,125 mg/g)

 

[µg/s1/2]

Dapp x 10-5 [cm2/s]

pD

Q60 [µg]

FLU

1,02

9,391 ± 0,009

4,027

42,77 ± 0,17

+ M

0,19

0,505 ± 0,003

5,296

8,31 ± 0,38

+ M + DSCG/5

0,17

0,372 ± 0,011

5,429

7,22 ± 0,30

 

+ DSCG/10

0,16

0,331 ± 0,001

5,481

6,58 ± 0,17

 

+ DSCG/5 + HA

0,16

0,360 ± 0,001

5,443

6,78 ± 0,51

 

+ DSCG/10 + HA

0,14

0,268 ± 0,003

5,572

6,09 ± 0,00

Freigabeuntersuchungen von DSCG aus den polymerhaltigen Zubereitungen

In Analogie zu den oszillationsrheologischen Untersuchungen (↓ 4.3.3.3) und in Hinblick auf die beabsichtigte Verwendung der Kombination HA/DSCG in der In-vivo-Studie (↑ 4.3.4) wurde die Freigabe von DSCG aus der HA-Zubereitung bestimmt. Die Untersuchung der freigegebenen Menge DSCG aus einer isoviskosen (für η D=10) MC-Zubereitung sollte den Vergleich der ermittelten Daten beider Freigabesysteme ermöglichen. Tabelle 34 stellt die gewonnenen Daten der Freisetzungsuntersuchungen dar.

DSCG (20 mg/ml) wird aus den polymerhaltigen Zubereitungen (MC und HA) – trotz deren höherer „Makroviskosität“ (η D=1) verglichen mit Mucin (η D=1 HA/DSCG/20 (6,02 Pas) > η D=1 MC/DSCG/20 (3,87 Pas) > η D=1 M (1,20 Pas) – um ein Vielfaches signifikant (t-Test)besser freigesetzt als aus der Mucindispersion (D app HA/DSCG/20 = D app MC/DSCG/20 > D app M/DSCG/5). Der Vergleich der Freigabe von DSCG (20 mg/ml) aus der MC-haltigen Zubereitung mit der aus dem HA-Gel zeigt (D app HA/DSCG/20 = D app MC/DSCG/20, nicht signifikant (t-Test)), wie schon bei den rheologischen Untersuchungen (↓ 4.3.3.4), dass eine direkte Wechselwirkung zwischen DSCG und HA nicht vorliegen kann, zwischen DSCG und den Mucinglykoproteinen dagegen vorliegen muss.

Die signifikant (t-Test) verringerte Freigabe von DSCG (40 mg/ml) aus der Zubereitung HA/DSCG/40 könnte durch den bereits bei den Permeationsstudien festgestellten Effekt der Konzentration auf die thermodynamische Aktivität von DSCG und damit auf sein Diffusionsverhalten verursacht werden. Letztlich könnte aber auch die stärkere Entfaltung der makromolekularen Struktur des Natriumhyaluronats durch den DSCG-Zusatz (↓ 4.3.3.4) eine zusätzliche Diffusionsbehinderung für die Diffusion von DSCG darstellen.


[Seite 113↓]

Tabelle 34: Liberation von DSCG (20 bzw. 40 mg/ml) aus den polymerhaltigen
Zubereitungen (HA (1 % (m/m)) und MC (1,34 % (m/m)) in PBS

 

[µg/s1/2]

Dapp x 10-5 [cm2/s]

pD

Q60 [µg]

HA + DSCG/20

64,34

1,68 ± 0,003

5,775

2599,93 ± 136,07

 

+ DSCG/40

84,36

0,77 ± 0,006*

6,114

3555,19 ± 376,83

MC + DSCG/20

64,11

1,88 ± 0,005

5,726

2514,34 ± 206,92

 
 

+ DSCG/40

105,39

1,49 ± 0,006**

5,827

4177,24 ± 239,10

 

4.3.3.6. Resümee der rheologischen Untersuchungen und Mucinwechselwirkungsstudien

Eine Quantifizierung der Bindung von DSCG an Mucin mittels Gleichgewichtsdialyse durch einfache Nephrophan®-Membran war aufgrund der hohen osmotischen Aktivität der Mucindispersion nicht aussagefähig. Der niedrige Verteilungskoeffizient von DSCG (↓ 4.2) ließ andererseits eine Verwendung von Sandwichmembranen, wie z. B. nach Fedder [200], nicht zu. Als nachteilig erwiesen sich zudem die langen Versuchszeiten, die für den Konzentrationsausgleich zwischen den Kompartimenten bei der Dialyse benötigt wurden. Im Ergebnis durchgeführter Dialysen mit angeglichenen osmotischen Verhältnissen (NaCl­Zusatz) lagen im Gleichwicht lediglich ca. 66,1 % der theoretischen Menge an DSCG, d. h. 33 % der absoluten Konzentration, im mucinfreien Kompartiment vor (Daten nicht dargestellt). Dieses Ergebnis ist jedoch kritisch zu betrachten, da sowohl der Einfluss der thermodynamischen Aktivität des Arzneistoffes als auch der des Donnaneffekts [89] das Ergebnis verfälschen können.

In vivo ist die optimale Viskoelastizität der Mukusschicht ausschlaggebend für einen effektiven mukoziliären Transport. Die Viskosität ermöglicht die Übernahme der von den Zilien übertragenen Energie und die Elastiziät die Rückkehr des Mukus zum ursprünglichen Zustand. Eine Überschreitung des Optimums dieser beiden Größen behindert gleichsam das Eindringen der Zilien in die Gelphase der Mukusschicht und durch die erhöhte Viskosität deren Fließen. Im In-vitro-Modell wurde bei einer Frequenz von 1 Hz bis hinauf oder hinab zu G´ = 10 Pa (elastischer Modul) eine Verbesserung der Transportrate gefunden. Viskositäten mit 15 Pas werden als optimal betrachtet [68]. Bei allergischer Rhinitis ist häufig eine Abnahme von Viskosität und Elastizität zu beobachten [16, 68, 201], die zu einer [Seite 114↓]Abnahme der MCC führt, da die periziliäre Schicht durch verstärkte Sekretion zu voluminös wird [201]. Das Ausmaß der Verschlaufungen der Mucinmolekülketten reguliert die rheologischen Eigenschaften dabei mehr als das Ausmaß an Quervernetzungen [22], die im Falle von Wasserstoffbrückenbindungen lediglich der Stabilisierung der physikalischen Verwicklungen dienen. Dabei bestimmt die Hydratation der Glykoproteinketten des Mucins, die wiederum selbst von der makromolekularen Zusammensetzung und dem Ionengehalt abhängig ist, das Ausmaß der Verschlaufungen der makromolekularen Struktur des Biopolymers [68].

DSCG wechselwirkt mit der Mucin-Modelldispersion in ausgeprägtem Maße. Wie die Liberationsstudien bestätigt haben, ist dieser Arzneistoff selbst an den entstehenden dreidimensionalen Netzwerkkomponenten durch vorrangig sekundäre Bindungskräfte beteiligt. Letzteres führt zu einer ausgeprägten Zunahme der Elastizität und Viskosität von Mucin. Dieser Effekt zeigte sich bei dem gewählten Mischungsverhältnis von Mucin und Zubereitung bei Herstellung des Probenansatzes als weitgehend unabhängig von den Formulierungsparametern (↓ 4.2.2.2). Da jedoch die Ionenstärke der Modelldispersion relativ hoch ist – die 15%ige Modelldispersion besitzt eine Osmolalität von ca. 600 mOsmol/kg – kann eine Beeinflussung durch den Elektrolytgehalt nicht ausgeschlossen werden.

In Analogie zu den konzentrationsabhängigen physikalisch-chemischen Parametern von DSCG in PBS (↓ 4.3.1.1) ist ab 10 mg/ml, mit einsetzender Selbstassoziation des Arzneistoffes zu „kolloidalen“ Strukturen, keine weitere Zunahme des DSCG-Effektes auf die rheologischen Parameter der Mucinmodelldispersion zu beobachten. Die Wechselwirkung von DSCG mit den Mucinglykoproteinen liegt oberhalb der Grenzkonzentration (10 mg/ml), bei der die sprunghafte Bildung der „kolloidalen“ DSCG-Assoziate nachweisbar ist, unverändert vor. Dieses Verhalten erklärt sich durch die Tatsache, dass oberhalb der „CMC“ (Kritische Mizell- bzw. Assoziatbildungskonzentration) die Anzahl der DSCG-„Monomeren“ mit weiterer Konzentrationserhöhung konstant bleibt und mit den Bestandteilen des Mucins uneingeschränkt wechselwirken kann [159].

Die gefundene Veränderung der rheologischen Parameter von Mucin durch den DSCG-Zusatz könnte sich in vivo, in Hinblick auf die Veränderungen der nasalen Sekretion bei AR, positiv auf die Verweildauer der Substanz und auf die MCC auswirken. Gleichzeitig ist jedoch mit Einschränkung der Permeation von DSCG durch die Nasenschleimhaut infolge der Wechselwirkungen mit dem Mukus zu rechnen.

Eine Kombination der DSCG-Zubereitung mit HA könnte sich dabei als günstig erweisen, da bei überadditiver Zunahme mukoadhäsiver Effekte (↓ 4.3.3.3) die Freigabe von DSCG aus der Mucinschicht kaum verändert wird (↓ 4.3.3.5). Es könnte durch die Kombination von DSCG mit HA die Verweildauer von DSCG auf der Nasenschleimhaut weiter verlängert werden. Gleichzeitig wäre durch die Wechselwirkung von DSCG mit den Mucinglyko­[Seite 115↓]proteinen in Abhängigkeit von der DSCG-Konzentration nach Applikation auf der Nasenschleimhaut ein „matrixkontrolliertes“ Freigabesystem denkbar (↓ 4.3.3.5).

Ursache für die in den durchgeführten Untersuchungen festgestellte Wechselwirkung von DSCG mit der Mucindispersion, also ihre „Adhäsivität“, könnte wie bereits in 4.3.1.1 beschrieben, die Fähigkeit von DSCG sein, auf die Konformation von phosphorylierenden Enzymen Einfluss zu nehmen. Um an den Mastzellen zu wirken, muss DSCG zudem ein gewisses Adhäsionspotential besitzen, denn ein membranständiger Rezeptor konnte bisher nicht isoliert werden.

Die rheologischen Untersuchungen erfassen lediglich die Mukuskomponente der MCC. Eine Aussage zur Wirkung der Arznei- oder Hilfsstoffe auf die Zilientätigkeit kann aufgrund dieser Studien nicht getroffen werden. Batt et al. [46, 202] konnten zeigen, dass in vitro die Konservierungsmittel BAC und EDTA die Zilientätigkeit deutlich beeinträchtigen; in vivo wurde dagegen, zumindest nach einmaliger Applikation, keine Beeinträchtigung der MCC festgestellt. Die in diesem In-vitro-Modell zur Bestimmung der CBF fehlende Mukusschicht ist jedoch als Ursache für die Abweichung vom Ergebnis der In-vivo-Studie anzusehen. Der Mukus der nasalen Schleimhaut leistet also auch in Hinblick auf die Zilienverträglichkeit nasal applizierter Substanzen und Formulierungen einen Beitrag zur optimalen MCC [203].

Für DSCG war in vitro kein Einfluss auf die Zilienschlagfrequenz zu beobachten [203]. Die alpha-Sympathomimetika OXY und XYLO besitzen dagegen eine mit zunehmender Lipophilie steigende Zilientoxizität [204]; eine nervale Stimulation der Zilien ist ebenfalls beobachtet worden [21, 205]. HA zeigte nach Literaturbefunden in vitro keinen Einfluss auf die CBF [206]. Hypotonische Lösungen wiesen dagegen ziliostatische Effekte auf [207, 208]. Isotonischer Phosphatpuffer pH 6,0 beeinträchtigt die CBF nicht [209]. Untersuchungen zur CBF stellen lediglich ein Indiz für eine Toxizität dar, sind jedoch auf In-vivo-Verhältnisse nicht direkt übertragbar [209].

Die Widersprüchlichkeit hinsichtlich der zilientoxischen Wirkung einer Substanz in der Literatur [210] lässt zum einen den Nachteil der In-vitro-Anordnung zur Messung der Zilienschlagfrequenz (fehlende Mukusschicht) erkennen, zum anderen verdeutlicht sie den Einfluss von Formulierungsparametern hinsichtlich potentiell schädigender Substanzen [160]. So konnten Romeijn et al. [160] feststellen, dass das Isotonisierungsmittel Sorbitol die zilientoxische Wirkung von XYLO verstärkt. Eine verbesserte XYLO-Penetrationsfähigkeit, wie sie nach Sorbitol-Zugabe in der vorliegenden In-vitro-Permeationsstudie mit der Substanz (↓ 4.2.2.1) gefunden wurde, könnte in die gleiche Richtung weisen.


[Seite 116↓]

4.3.4. In-vivo-Studien am Kaninchen

4.3.4.1. Einleitung

Natriumcromoglicat wird nach peroraler Gabe lediglich zu 0,1 % resorbiert [103, 211]. Die Substanz wird nach der Resorption unverändert über Urin und Galle ausgeschieden. 90 % der absorbierten Menge haben den Organismus bereits nach 6 h wieder verlassen [103]. Aswania et al. [212] ermittelten nach peroraler Gabe einer Dosis von 20 mg DSCG am Menschen nach 24 h eine Gesamtmenge von 83 µg DSCG im Urin. Nach Inhalation der gleichen Dosis konnten hingegen 305,6 µg wiedergefunden werden, wobei der Arzneistoff rasch im Systemikum anflutete. Nach peroraler Gabe war jedoch eine deutliche Lag-time zu beobachten [212]. Am Auge werden aus wässriger Lösung 2 % DSCG resorbiert [213].

Angaben zur nasalen Verfügbarkeit von DSCG liegen lediglich am In-vivo-surgical-Modell der Ratte vor. Verglichen mit intravenöser Gabe wurden hier 60 % der applizierten Menge im Plasma gefunden [214], jedoch ist eine direkte Vergleichbarkeit dieser Ergebnisse mit denen einer In-vivo-Studie nicht gegeben [39]. Als nachteilig am In-vivo-Rattenmodell erweist sich die kleine Nasenhöhle, die die Applikation von Nasensprays nicht zulässt [40]. Es ließen sich in der Literatur keine Angaben zur nasalen Absorption von Natriumcromoglicat am Kaninchen finden.

Die Übertragbarkeit von im Tierversuch gewonnenen pharmakokinetischen Daten auf den Menschen ist durch die stark differierenden physiologischen Gegebenheiten schwer möglich. Während beim erwachsenen Menschen das Verhältnis der Nasenhöhlenfläche [cm2] zur gesamten Körpermasse [kg] 2:1 beträgt, steht am Kaninchenmodell pro Kilogramm Körpergewicht 10mal soviel Resorptionsfläche zur Verfügung [38]. Zu bedenken ist ebenfalls, dass eine im Versuch durchgeführte Narkose nicht ohne Einfluss auf die Bioverfügbarkeit bleibt, da sie die mukoziliäre Clearance möglicherweise beeinflussen kann [16, 38, 215]. Dabei kann nicht nur die Art der Anästhesie [216], sondern auch das Anästhetikum selbst [217] Einfluss auf die MCC, den Atemstrom durch die Nase und den Blutstrom zur und weg von der Nasenschleimhaut nehmen [215]. Für das hier verwendete Anästhetikum Ketamin ist ein direkter Effekt auf die MCC auszuschließen, da es neurale Aktivitäten nicht beeinträchtigt [215].

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von ausgewählten Formulierungsparametern auf die In-vivo-Verfügbarkeit von Natriumcromoglicat nach nasaler Applikation am anästhesierten Kaninchen (Ketamin/Xylazin) untersucht. Die DSCG-Formulierungen wurden jeweils vier bis sechs Kaninchen mittels eines Pumpdosiersprays (45 µl) appliziert. Die Blutentnahme aus der Ohrvene erfolgte zu sechs Entnahmezeiten über einen Zeitraum von 60 Minuten.


[Seite 117↓]

Kritisch zu den eigenen durchgeführten Untersuchungen (↑ 5.2.6) ist anzumerken, dass mittels Plasmawerten, die lediglich über einen Zeitraum von 60 Minuten gewonnen wurden, eine vollständige Erfassung der pharmakokinetischen Parameter einer Substanz nicht möglich ist. Ein längerer Blutentnahmezeitraum hätte jedoch wiederholtes Narkotisieren der Tiere erfordert, und die in der Folgezeit nur noch minimalen im Plasma vorhandenen DSCG­Mengen wären mit der zur Verfügung stehenden analytischen Methodik nicht detektierbar gewesen. Durch die geringe Anzahl der gewonnenen Plasmaeinzelwerte pro Tier war nur eine grobe Abschätzung der pharmakokinetischen Kenngrößen von DSCG nach nasaler Applikation an dem jeweiligen Tier möglich. Daher wurden bei der Auswertung der durchgeführten Studien die Einzelplasmawerte aller Tiere zu einer resultierenden Kurve vereinigt. Die Ergebnisse der In-vivo-Studie zur nasalen Verfügbarkeit von Natrium­cromoglicat sind deshalb ohne Standardabweichungen angegeben; ein statistischer Vergleich war nicht möglich.

4.3.4.2. Einfluss der applizierten Konzentration von DSCG und von Natriumhyaluronat

Tabelle 35 stellt die Daten der pharmakokinetischen Analyse der Plasmawerte nach Applikation von DSCG verschiedener Konzentration in PBS dar. Auf diese Weise sollte die In-vivo-Relevanz der in vitro festgestellten „adhäsiven“ Eigenschaften und des konzen­trationsabhängigen Permeationsverhaltens überprüft werden. Eine Kombination von 20 mg/ml DSCG und HA 1 % (m/V) in PBS, die in vitro potenzierte mukoadhäsive Fähigkeiten (↓ 4.3.3.3) aufwies, gelangte dabei ebenfalls zur Testung und Auswertung.

Als Kriterium für die mögliche Berechnung der AUC anhand von pharmakokinetischen Kennzahlen unter Annahme eines Einkompartimentmodells (↑ 5.2.6) galt die gute Anpassung der Plasmawerte (R² > 0,9587) an die Gerade der halblogarithmischen Darstellung bei der Ermittlung der Eliminationskonstante (Abb. 35) [218].

Kato et al. [219] konnten nach Inhalation von 20 oder 40 mg/ml DSCG keinen Unterschied in der absorbierten Menge finden. Auch am Auge unterschied sich die Bioverfügbarkeit von DSCG nach Applikation verschiedener Konzentrationen nicht [213]. Diese Befunde korrelieren mit den hier ermittelten Daten, die ebenfalls für eine Wirkstoffkonzentration von 10 bzw. 50 mg/ml DSCG keine unterschiedlichen AUC-Werte im Plasma erbrachten. Als Grund könnte dafür die gefundene Interaktion von DSCG mit den Mukuskomponenten angesehen werden. So wird nach einer Gabe von 50 mg/ml DSCG die Anflutung des Wirkstoffs gegenüber 10 mg/ml DSCG verlangsamt (t max 50 > t max 10, K in 50 < K in 10). Gleichzeitig verdeutlicht der Vergleich der pharmakokinteischen Daten nach Applikation einer Dosis von 50 mg/ml DSCG mit denen der 20 mg/ml-Dosis, dass die Wirkstofffreisetzung von DSCG aus dem Mukus durch die Wechselwirkung mit den Mucin­glykoproteinen behindert ist (c max 50, AUC ∞ 50, t 1/2 50 < c max 20, AUC ∞ 20, t 1/2 20; K el 50 > K el 20), [Seite 118↓]wie auch die Befunde der Liberationsstudien bestätigen (↓ 4.3.3.5). Nach Gabe einer Dosis von 50 mg/ml DSCG erfolgt die Freigabe des Arzneistoffes DSCG aus dem Mukus im Sinne eines „Depots“, wobei die Anflutung des Wirkstoffs im Systemikum durch die Mukus­interaktion, verglichen mit der Dosis von 10 mg/ml beeinträchtigt wird (K in 50 < K in 10).

Tabelle 35: Pharmakokinetische Parameter25 zur DSCG-Verfügbarkeit nach nasaler
Applikation

Konzentration

AUC

tmax

cmax

Kin

Kel

t1/2

DSCG [mg/ml]

[µg min/ml]

[min]

[µg/ml]

[1/min]

[1/min]

[1/min]

10

126,03

6-10

0,37

27,66

0,23

176,17

20

160,94

6-10

0,67

25,14

0,22

187,55

50

124,37

14-22

0,55

13,17

0,51

81,51

20 + HA 1 %

288,69

6-10

0,24

27,36

0,05

910,89

Abbildung 35: Plasmaspiegelkurve nach nasaler Gabe von DSCG (50 mg/ml) in PBS
mit Darstellung der berechneten pharmakokinetischen Größen

Die pharmakokinetischen Daten von DSCG nach Applikation einer Dosis von 10 mg/ml unterscheiden sich von denen der Dosis mit einer Arzneistoffkonzentration von 20 mg/ml nur in der kleineren c max und der resultierenden AUC , wofür die geringere Ausgangs­konzentration als Ursache angesehen werden kann. Die AUC der DSCG-Dosen 10 und 50 mg/ml unterscheiden sich nicht. Borchardt et al. [52] geben an, dass die Kombination aus [Seite 119↓]enhancender Wirkung – DSCG kann hier vergleichsweise als Enhancer betrachtet werden – und Mukoadhäsivität nur insofern günstig ist, wenn sie die Freisetzung von Enhancer und Arzneistoff aus dem Mukus nicht behindert. Es existiert ein optimaler Bereich hinsichtlich der Kombination beider Eigenschaften. Das bestätigen die Ergebnisse dieser Untersuchung und lassen die Applikation einer Dosis von 20 mg/ml als geeignete Wirkstoffkonzentration erscheinen.

Die letzte Aussage betrifft in gleicher Weise das Konzentrationsoptimum für viskositätserhöhende, mukoadhäsive Zusätze [21] wie z. B. HA. Die Kombination mit dem Mukoadhäsivum verlängert die Verweildauer des Arzneistoffes in der durchgeführten Untersuchung auf der Nasenschleimhaut verglichen mit der Wirkstoffdosis von 20 mg/ml DSCG (t 1/2 20 < t 1/2 20/HA). Durch das gute Freigabeverhalten des HA-Gels [220] und die nur unwesentlich schlechtere Freigabe von DSCG aus dem Gemisch mit dem Mukus (↓ 4.3.3.5) wird die Anflutung des Wirkstoffes DSCG im Systemikum nicht beeinträchtigt (t max HA/20 = t max 20; K in 20 = K in HA/20). Die AUC wird jedoch durch die stärkere Wechselwirkung der Kombination HA/DSCG mit dem Mukus trotz sinkender maximaler Plasmakonzentration vergrößert. Das gebildete „Depot“ erhöht dabei die Wirkungsdauer (t 1/2) durch die verlängerte Freigabe (K el HA/20 << K el 20) sogar um das 5fache. Die in vitro festgestellte potenzierte Mukoadhäsivität (↓ 4.3.3.3) der Kombination HA/DSCG wirkt sich in einer verbesserten Verfügbarkeit in vivo aus.

Nasale In-situ-Verfügbarkeitsstudien (Ratte) eines Arzneistoffes in Kombination mit der als hervorragend mukoadhäsiv bekannten Polyacrylsäure [221] führten zu niedrigeren maximalen Plasmaspiegeln (c max) des Arzneistoffes, verglichen mit der polymerfreien Zubereitung [40]. Gleichzeitig war jedoch die systemische Verfügbarkeit des Arzneistoffes nach nasaler Applikation durch die verlängerte Verweildauer auf der Nasenschleimhaut über einen längeren Zeitraum gegeben. Dabei spielt die erhöhte Viskosität auf die Verweildauer der polymerhaltigen Zubereitung am Applikationsort eine nicht zu unterschätzende Rolle. Für ein HA-Gel wurde jedoch mittels Gammaszintigraphie die okulare Verweildauer um 50 % [222] gegenüber isoviskosen Lösungen anderer Polymere verlängert gefunden [223], was eindeutig für seine Mukoadhäsivität spricht. Für HA-Gele lassen sich somit, wie bereits erwähnt und durch die vorliegenden Untersuchungen bestätigt, sowohl in vitro als auch in vivo deutlich mukoadhäsive Fähigkeiten nachweisen [194, 224].


[Seite 120↓]

4.3.4.3. Einfluss der Formulierungsparameter (FAM)

Eine Berechung der AUC anhand pharmakokinetischer Daten war bei den getesteten Fertigarzneimitteln nicht möglich, da die Kurvenanpassung der resultierenden Plasma­spiegelkurven bei log-linearer Regression rein zufällig war (R2 < 0,9587, p < 0,05). Die Berechnung der AUC erfolgte über den Zeitraum von 0 bis 55 Minuten nach der Trapezregel [218]. Tabelle 36 gibt die Kenngrößen der Blutspiegelkurven wieder.

Tabelle 36: Einfluss der Formulierungsparameter auf die pharmakokinetischen Daten von DSCG (s. auch Abb. 35)

 

AUC 0-55 min [µg min/ml]

t max [min]

c max [µg/ml]

PBS/10

82,46

6-10

0,37

PBS/20

100,61

6-10

0,67

PBS/50

82,25

14-22

0,55

PBS/20+ HA 1 %

83,81

6-10

0,24

Vividrin®

53,81

6-10

0,14

Cromo ratiopharm®

59,79

14-20

0,42

Cromo pur von ct®

77,02

6-10

0,44

Kano et al. [225] stellten fest, dass eine isotonische Lösung von DSCG eine größere asthmaprotektive Wirkung besaß als eine hypotonische. Su et al. [226] fanden heraus, das hypotonische Lösungen die CBF stark reduzieren. Es ist daher anzunehmen, dass die deutlich verminderte Verfügbarkeit von DSCG nach Applikation der hypotonischen Zubereitung Cromo ratiopharm® gegenüber 20 mg/ml DSCG in PBS ihre Ursache in einer Reduzierung der mukoziliären Transportleistung durch die hypotonische Formulierung hat. Die nicht isotonisierte Zubereitung vermindert die Zilientätigkeit; die „adhäsive“ Wechselwirkung von DSCG mit dem nasalen Mukus wird durch die so fehlende „Scherung“ nicht beeinträchtigt. Die Freigabe des Arzneistoffes aus dem Mukus/DSCG-Gemisch ist stark verzögert
(t max 14-20 min); die Freigabecharakteristik ähnelt daher der 50 mg/ml-Dosis.

Auch die In-vivo-Verfügbarkeit (AUC0-55 min) des Arzneistoffes aus Vividrin® ist, verglichen mit der PBS-Lösung von 20 mg/ml DSCG, erniedrigt. Da der in vitro permeationsfördernde Effekt der Zubereitung für Rindernasenschleimhaut (↓ 4.3.1.1) in vivo nicht feststellbar ist und auch aus Cromo pur von ct® die Freigabe reduziert gegenüber 20 mg/ml DSCG ist, legt sich folgende Vermutung nahe: Die Formulierungsparameter der FAM beeinflussen mehr die Eigenschaften der Substanz selbst als dass sie einen direkten Effekt auf die Mukosa ausüben. Das isotone Phosphatpuffersystem der Referenzzubereitung (PBS/20) begünstigt dagegen, [Seite 121↓]wie bereits festgestellt (↓ 4.3.1.5), sowohl die Wechselwirkung der Substanz selbst mit der Membran, als auch mit den Mukuskomponenten.

Eine Korreleation zwischen In-vitro-Verfügbarkeit durch Rindernasenschleimhaut und In­vivo-Verfügbarkeit am Kaninchen ist anhand der in den durchgeführten Untersuchungen ermittelten Daten nicht möglich. Dazu ist die Anzahl der zum Einfluss der Formulierungs­parameter auf die In-vivo-Verfügbarkeit von DSCG durchgeführten Versuche einerseits nicht ausreichend und andererseits erfasst der In-vitro-Permeationsversuch weniger die für die Bioverfügbarkeit von DSCG bedeutende Mucinwechselwirkung als vielmehr ihre Wechselwirkung mit der Membran. Die Permeation durch Nephrophan® erweist sich hingegen als nahezu störungsfreie Variante, um den Einfluss der Formulierungsparameter auf die Substanz DSCG zu erfassen. Erst die Kombination der In-vitro-Permeationsversuche mit DSCG an der biologischen und synthetischen Membran mit einer In-vivo-Studie, die statistische Aussagen zulässt, ist in der Lage die Vielzahl der DSCG-spezifischen Effekte (Membran-, Mukusinteraktionen, Formulierungseinfluss auf physikalisch-chemische Parameter) hinsichtlich ihrer In-vivo-Relevanz zu wichten.

4.3.4.4. Charakterisierung der Lösung aus Natriumhyaluronat und DSCG

Die In-vivo-Studien am Kaninchen haben die in vitro festgestellte Mukoadhäsivität (↓ 4.3.3.3) der Kombination aus DSCG/HA bestätigt (Tab. 35) und bewiesen, dass sie sich günstig auf die Verweildauer des Arzneistoffes auswirkt. Gleichzeitig ist, wie die Liberationsstudien bereits vermuten ließen (↓ 4.3.3.5), die Anflutung und Verfügbarkeit von DSCG (20 mg/ml) im Systemikum nach Applikation der mukoadhäsiven, viskositätserhöhten Zubereitung (HA 1 % in PBS) nicht beeinträchtigt. Die viskositätserhöhte Formulierung weist im Vergleich mit der Lösung von DSCG in PBS (20 mg/ml) eine deutlich erhöhte Bioverfügbarkeit auf, ohne dass dabei der Zeitpunkt des maximalen Plasmaspiegels verschoben wird.

DSCG wird aus einem 1%igen Natriumhyaluronatgel in PBS mit einer Freigaberate von 64,34 µg/s½ freigesetzt. Das entspricht einem Diffusionsquotienten D app von
1,68 x 10-6 m2/s für DSCG (↓ 4.3.3.5). Die Viskosität η = D 100 der Formulierung liegt bei 419 mPas (Daten nicht dargestellt). Die durch den Phosphatpuffer isotonisierte Gelzubereitung besitzt einen pH-Wert von 6,0 und eine kaum erhöhte Dichte.

Die Dosierung aus dem Freigabesystem wurde gemäß der Prüfung auf Gleichförmigkeit der abgegebenen Dosis laut Ph. Eur. 2002 durchgeführt und mit 84,9 ± 9,1 % ermittelt. Die abgegebenen Dosen entsprachen der Prüfung, da keiner der ermittelten Einzelgehalte außerhalb der Grenzen von 75 bis 125% lag (Daten nicht dargestellt).

Insbesondere die Sprühbarkeit der viskositätserhöhten Zubereitung erweist sich dabei als vorteilhaft. Die Verweildauer für Arzneistoffe in den nicht zilientragenden Regionen [Seite 122↓](Vestibule) und den vorderen Nasenabschnitten wurde deutlich länger beschrieben [16, 17]. Da ein Nasenspray vorzugsweise auf diese vorderen Regionen trifft, z. B. im Vergleich mit Nasentropfen, werden per Spray applizierte Substanzen weniger schnell vom Absorptionsort entfernt [16, 227]. Zugleich wird die physiologische Schutzfunktion der MCC durch Applikation im vorderen Teil der Nase weniger stark beeintächtigt [16].

Die sprühbare, gut verträgliche Zubereitung [206] mit ihren potenten mukoadhäsiven Eigenschaften stellt somit eine gute Möglichkeit dar, die Dosierungshäufigkeit zu reduzieren und damit die Compliance durch den Patienten zu erhöhen.


[Seite 123↓]


Fußnoten und Endnoten

1 Die Trennung ionischer Verbindungen ist in der Reversed-phase-Chromatographie schwierig, da diese mit den noch nichtsilanisierten, hochpolaren OH-Gruppen des Säulenmaterials wechselwirken. Um dem abzuhelfen, wird der mobilen Phase ein organisches Salz, ein Ionenpaarreagenz , zugesetzt. Die geladenen ionischen Probensubstanzen bilden mit den organischen Ionen des Ionenpaarreagenzes ein Ionenpaar, welches sich ähnlich wie eine Neutralsubstanz auf einer Umkehrphase verzögern lässt.

2 Zur Durchführung der Validierung sowie Umfang und Sicherung der Qualität der analytischen Methode während der Probenmessungen siehe Experimenteller Teil (↑ 5.2.2.1 und 5.2.2.2).

3 interday

4 2, 8,15 µg/ml Arzneistoff

5 Als Ionenpaarreagenz kam Tetrabutylammoniumbromid zum Einsatz, das der mobilen Phase zugesetzt wurde.

6 

n.b. nicht bestimmt

Zur Durchführung der Validierung sowie Umfang und Sicherung der Qualität der analytischen Methode während der Probenmessungen siehe Experimenteller Teil (↑ 5.2.2.1 und 5.2.2.2).

7 interday

8 0,5, 5, 10 µg/ml Arzneistoff (Routineanalytik); 0,5, 1,5, 3 µg/ml Arzneistoff (Plasmaanalytik)

9 Exakte Angaben hinsichtlich der Konzentration sind lediglich für BAC (0,01 % (m/V)) und EDTA (0,1 % (m/V)) bekannt, nicht aber für isotonisierende und andere Zusätze.

10 Die Konzentration von 5 mg bezieht sich auf Gramm Probengemisch mit Mucin. Die Verdünnung der DSCG-Konzentration im Vergleich zu den Handelspräparaten um den Faktor 1:4 ergibt sich aus dem Probenansatz (↑ 5.2.5).

11 Die nachgestellten, zur Testung gelangten Eigenrezepturen sind mit Ausnahme der XYLO-haltigen Lösungen den FAM in Bezug auf die Arzneistoffkonzentration nur qualitativ nachempfunden. Im Vordergrund standen vergleichende Untersuchungen, für die es galt, den Konzentrationseinfluss auszuschalten.

12 

Permeation aus EBS

* Signifikanz t-Test, ** Signifikanz ANOVA

13 Die negative Ladung der Mukosa ergibt sich aus aktiven Transportmechanismen von Ionen, die zu einer Ungleichverteilung von vor allem Chloridionen zwischen serosaler und mukosaler Seite führen.

14 

Die Referenz ist ebenfalls isotonisch mittels PBS.

* Signifikanz

15 

Disperse Systeme , bestehend aus einer dispersen Komponente und einem Dispersionsmedium, werden nach der Größe (durchschnittlicher Teilchendurchmesser) des dispergierten Materials in molekular -, kolloid - und grobdisperse Systeme unterschieden, wobei die Klassengrenzen zum Teil willkürlich festgesetzt sind. Die kolloiden Systeme, die im Sinne der klassischen Phasenlehre weder als homogen noch heterogen anzusehen sind (Übergangssystem), lassen sich nach der Art der Wechselwirkung in Molekül -, Assoziations - und Dispersionskolloide unterteilen.

Die Zuordnung der DSCG-Lösungen (> 10 mg/ml) zu den „kolloidalen“ Systemen erfolgte anhand der für kolloidale Systeme charakteristischen makroskopischen Eigenschaften der DSCG-Lösungen. Die eindeutige Zuordnung durch eine Teilchengrößenbestimmung der dispersen Phase wurde nicht vorgenommen.

16 Angaben beziehen sich auf das verwendete Puffersystem.* signifikant verschieden von Referenz in PBS (t-Test)n . b.nicht bestimmtKBSisotonischer Kaliumphosphatpuffer pH 6,0ListPhosphatpuffersystem nach List

17 Körper können in diesem Zusammenhang Festkörper, Flüssigkeiten und Gase sein.

18 Die Fließgrenze charakterisiert diejenige Kraft, die nötig ist, um bei einer Testsubstanz, die einem Festkörper ähnelt, die anfänglich elastische Verformung der Volumenelemente gegen eine raummäßige Veränderung ihrer Volumenteile zu ersetzen.

19 Methylcellulose ist eine partiell methylierte Cellulose (Ph. Eur. 2002). Eine 2%ige wässrige Zubereitung besitzt eine Viskosität von 3000 … 5000 mPas.

20 Auf die Darstellung der Fehlerindikatoren in den Fließkurven wurde verzichtet, um die Übersichtlichkeit zu wahren. Prinzipiell lagen die Streuungen der Einzelwerte um 2 ± 0,25 %.

21 Eine makroskopisch wahrnehmbare Fließgrenze unter dem Einfluss der Schwerkraft in den Probengefäßen konnte experimentell nicht gefunden werden. Deswegen wurde die Auswertung der Fließkurven nach Ostwald vorgenommen.

22 ohne graphische Darstellung

23 

24 zum statistischen Vergleich der Liberationsdaten siehe 7.7

25 Zu den Größen AUC , maximale Plasmakonzentration c max, Zeitpunkt der maximalen Plasmakonzentration t max , Invasionskonstante K in, Eliminationskonstante K el, Halbwertszeit t 1/2siehe 5.2.6 bzw. graphische Darstellung (Abb. 35)



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17.02.2004