5. Materialien und Methoden

5.1. Materialien

5.1.1. Arzneistoffe

Natriumcromoglicat

ratiopharm GmbH, Ulm

Xylometazolinhydrochlorid

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Oxymetazolinchlorid

Merck Produkte GmbH, Darmstadt

Fluorescein-Natrium

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

5.1.2. Fertigarzneimittel

Natriumcromoglicat

Cromo pur von ct®

ct-Arzneimittel, Berlin

Cromohexal®

Hexal AG, Holzkirchen

Cromohexal sanft®

Hexal AG, Holzkirchen

Cromo ratiopharm®

ratiopharm GmbH, Ulm

Vividrin®

Dr. Mann Pharma, Berlin

Xylometazolinhydrochlorid

Xylo von ct®

ct-Arzneimittel, Berlin

Nasan®

Hexal AG, Holzkirchen

Nasentropfen E ratiopharm®

ratiopharm GmbH, Ulm

Xylo comod®

Ursapharm, Saarbrücken

Oxymetazolinhydrochlorid

Nasivin®

Merck Produkte GmbH, Darmstadt

5.1.3. Hilfsstoffe

Tenside, Konservierungsmittel, Isotonisierungsmittel

Tween 80® (Polysorbat, HLB-Wert 15)

E. Merck, Darmstadt

Benzalkoniumchlorid

E. Merck, Darmstadt

Natrium-EDTA

Isocomerz, Herzberg

Phenylethanol

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Thiomersal

E. Merck, Darmstadt

Glukose

E. Merck, Darmstadt

Natriumchlorid

E. Merck, Darmstadt

Sorbitol

E. Merck, Darmstadt

Polymere

Hyaluronsäure, Natriumsalz

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Methocel® (Methylcellulose, U.S.P. 4000 cP)

Fluka AG, Buchs, Schweiz


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5.1.4. Pufferlösungen

Earles Balanced Salt Solution Modified (EBS pH 7.4)

Es wurde folgende Puffermischung verwendet:

Calciumchlorid

0,265 g/l

D-Glukose

1,0 g/l

Kaliumchlorid

0,4 g/l

Magnesiumsulfat

0,0977 g/l

Natriumbicarbonat

2,2 g/l

Natriummonohydrogenphosphat

0,122 g/l

Phosphatpuffer pH 5,5; 6,0 und 7,4

Phosphatpuffersysteme List [131] pH 5,5; 6,0; 7,4 mit gleicher Molarität (LIST 5,5; 6,0; 7,4)

Phosphatpuffersysteme Hager [228] pH 6,0 mit verschiedener Tonizität (PBS)

Natriumphosphatpuffer pH 3.0 (HPLC XYLO/OXY)

Natriumphosphatpuffer pH 5.2 (HPLC DSCG)

Kaliumphosphatpuffer pH 6,0 (Permeationsstudie)

Acetatpufferlösung pH 6,0 (Mucinwechselwirkungen)

Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 100 mM (Plasmaextraktion)

Erforderliche Elektrolyte

Calciumchlorid (CaCl2∙2 H2O)

E. Merck, Darmstadt

 

D(+)-Glukose (wasserfrei)

E. Merck, Darmstadt

 

Kaliumchlorid

Ferak Laborat, Berlin

 

Magnesiumsulfat (wasserfrei)

E. Merck, Darmstadt

 

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)

Ferak Laborat, Berlin

 

Natriummonohydrogenphosphat (Na2HPO4∙2 H2O)

Laborchemie, Apolda

 

Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4∙2 H2O)

Laborchemie, Apolda

 

Kaliumdihydrogenphosphat

Laborchemie, Apolda

 

Natriumacetat (NaCH3COO∙3 H2O)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

  

Steinheim

 

Natriumhydroxid

Chemapol (Prag, CZ)

 

Phosphorsäure 85 %

Laborchemie, Apolda

 

Wasserfreie Essigsäure

E. Merck, Darmstadt

5.1.5. Chemikalien

HPLC

Acetonitril (analytical grade)

J.T. Baker B.V., Deventer, Holland

Tetrabutylammoniumbromid

Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz

Triethylamin

J.T. Baker B.V., Deventer, Holland

Phosphorsäure 85 %

Laborchemie, Apolda

Pentansulfonsäure, Natriumsalz

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Rheologie

Mucin Type II: Crude

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

Tierversuche

Ethylacetat

J.T. Baker B.V., Deventer, Holland

Natrium-EDTA

Isocomerz, Herzberg

Salzsäure 36 %

E. Merck, Darmstadt

Isotonische Natriumchloridlösung

Delta Pharma, Pfullingen

Ursotamin®

Serum Werke, Bernburg

Rompun 2 %®

Bayer Vital GmbH, Leverkusen


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Weitere Chemikalien

n-Oktanol (zur Analyse)

J.T. Baker B.V., Deventer, Holland

Kaliumchlorid

Laborchemie, Apolda

Natriumcarbonat(Na2CO3∙12 H2O)

E. Merck, Darmstadt

L(+)-Weinsäure

E. Merck KgaA, Darmstadt

Folins-Ciocalteus Phenolreagenz

E. Merck, Darmstadt

Kupfersulfat (CuSO4∙5 H2O)

Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz

Pyren

Riedel-de-Haen AG, Seelze

Precimat® (Gesamtproteinstandard)

Böhringer, Mannheim

LDH-Kit MPR 3®

Böhringer, Mannheim

Sulfanilsäure

Serva, Feinchemika, Heidelberg

Amidoschwefelsäure

Ferak Laborat GmbH, Berlin

Natriumnitrit

Berlin-Chemie, Berlin

5.2. Methoden

5.2.1. Physikalisch-chemische Untersuchungen

5.2.1.1. pH-Wert

Der pH-Wert wurde mit einer Einstabmesskette Typ SE 101 (Knick, Elektronische Messgeräte GmbH & Co, Berlin) und einem Labor-pH-Meter 766 101 (Knick, Elektronische Messgeräte GmbH & Co, Berlin) bei RT bestimmt. Die automatische Kalibrierung des Messinstruments erfolgte bei Bedarf mit drei pH-Pufferlösungen (pH 2,00; 7,00; 9,00) (Mettler Toledo GmbH, Steinbach).

5.2.1.2. Osmolalität

Die Bestimmung der Osmolalität der verwendeten Puffer, Arzneistoff- und Hilfsstofflösungen erfolgte mittels eines Halbmikroosmometers (Knauer, Berlin). Zur Kalibrierung wurden bidestilliertes Wasser (0 mOsmol/kg) und eine Eichlösung (400 mOsmol/kg) (Knauer, Berlin) verwendet. Die angegebenen Tonizitäten sind die Mittelwerte aus jeweils drei Bestimmungen bei RT.

5.2.1.3. Oberflächenspannung

Zur Erfassung der statischen Oberflächenspannung wurde das Tensiometer TE 1C (Lauda, Königshofen) nach Lecompte du Noüy verwendet. Als Messkörper diente ein Platin/Iridium­Ring. Die angegebenen Oberflächenspannungen [mN/m] sind die Mittelwerte aus der Anzahl Messwerte, die nötig waren, um eine Standardabweichung von 0,1 zu erreichen. Die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur.


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5.2.1.4. 

5.2.1.5. Dichte

Zur Ermittlung der Dichte wurde ein Density meter DMA 38 (Anton Paar KG, Graz, Österreich) verwendet. Die Kalibrierung des Messgerätes erfolgte bei der gewählten Messtemperatur (20°C, 35°C) unter Verwendung von bidestilliertem Wasser.

5.2.1.6. Dynamische Viskosität

Im Falle der Fertigarzneimittel wurde die kinematische Viskosität υ [m2/s] mittels eines Kapillarviskosimeters mit hängendem Kugelniveau nach Ubbelohde (Schott Geräte, Hofheim) bestimmt. Die Messtemperatur betrug 35°C (Durchsichtthermostat CT 1450/2 und AVS 350, Schott, Hofheim). Die Umrechnung in die dynamische Viskosität η [Pas] erfolgte durch Multiplikation anhand der für die Messtemperatur bestimmten Dichte (↓ 5.2.1.4).

5.2.1.7. Leitfähigkeitsmessungen

Die Leitfähigkeiten wurden in den Side-Bi-SideTM-Diffusionszellen mittels einer Platinelektrode (eigene Konstruktion) in jedem Kompartiment oder mit der Leitfähigkeits­messzelle (Forschungsinstitut Meinsberg) und der RLC-Universalmessbrücke Typ E 313 (Meratronik, Polen) bestimmt. Die Platinierung der Elektroden erfolgte nach Schuppan [169]. Die Bestimmung der Zellkonstante erfolgte unter Verwendung einer 0,1 N Kalium­chloridlösung. Der Leitfähigkeitswert für diese Lösung bei der jeweiligen Messtemperatur wurde dem D’Ans Lax [229] entnommen. Anhand der bestimmten Zellkonstante erfolgte die Umrechnung der ermittelten Widerstände [Ω] in die jeweiligen Leitfähigkeiten [S/cm].

5.2.1.8. Verteilungskoeffizient

Der Verteilungskoeffizient als Maß für das Verteilungsverhalten eines Stoffes zwischen zwei nicht miteinander mischbaren Phasen wurde unter Verwendung von n-Oktanol als lipophiler Phase und Puffer bzw. Wasser als hydrophiler Phase bestimmt. Es wurden jeweils 5 x 10 ml arzneistoffhaltige Lösung und 1 x 10 ml arzneistofffreie Lösung (Blindwert) mit jeweils 10 ml des puffer- bzw. wassergesättigten n-Oktanols versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Die abgetrennte, wässrige Phase wurde einer zusätzlichen Zentrifugation (Eppendorfzentrifuge Z 230, Hermle AG, Gosheim) unterzogen. Die Arzneistoffgehalte in der wässrigen Phase nach dem Schütteln und die Ausgangsgehalte wurden mittels HPLC (XYLO, OXY) (↑ 5.2.2.3) bzw. photometrisch (DSCG) (↑ 5.2.2.5) bei einer Wellenlänge von 326 nm gegen einen Blindwert bestimmt.


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Die angegebenen Verteilungskoeffizienten wurden nach folgender Formel berechnet:

(Gl. 15)

V W

Volumen der wässrigen Phase [ml]

V L

Volumen der lipophilen Phase [ml]

Ausgangskonzentration des Arzneistoffes in der wässrigen Phase [µg/ml]

Endkonzentration des Arzneistoffes in der wässrigen Phase [µg/ml]

5.2.1.9. Assoziatbildungen, Kritische Mizellbildungskonzentration

Tensiometrie

Zur Bestimmung der CMC der verwendeten Tenside wurde die unter 5.2.1.3 beschriebene Messanordnung verwendet. Mittels einer automatischen Bürette (665 Dosimat, Methrom, Herisau, Schweiz) wurde im logarithmischen Zugabemodus über einen Konzentrationsbereich von 5 x 10-5 bis 1,33 x 10-1 g/l die Tensidstammlösung (0,2 g/l) in das vorgelegte Startvolumen von 40 ml Gereinigtem Wasser oder PBS titriert. Die dargestellten Werte sind Ergebnisse einer Dreifachbestimmung und wurden graphisch ausgewertet.

Fluorimetrie

Die fluorimetrische Bestimmung der CMC von PS und BAC erfolgte unter Verwendung einer methanolischen Pyrenstammlösung (10- 7M) [230]. Die Verdünnungen der Tensidlösungen in Gereinigtem Wasser oder PBS (ggf. mit DSCG-Zusatz) wurden nach Zusatz der Pyrenlösung zu 10,0 ml aufgefüllt und kräftig geschüttelt. Das Fluorimeter und die Geräteparameter zur Aufnahme der Exzitations- und Emissionsspektren sind unter 5.2.2.4 beschrieben. Die Exzitationsspektren wurden im Bereich von 300 bis 400 nm aufgenommen. Die dargestellten Werte entsprechen dem Verhältnis der Intensitäten bei einer Wellenlänge von 338 und 333 nm (I338/333) und sind Ergebnisse einer Dreifachbestimmung. Analog zur Verschiebung des Intensitätsverhältnisses konnte eine bathochrome Verschiebung in den Emissionsspektren im Bereich von 450 bis 470 nm beobachtet werden. Die Auswertung erfolgte graphisch aus der halblogarithmischen Darstellung des Intensitätsverhältnisses bei der jeweiligen Konzentration.


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UV/Vis- Spektroskopie

Der Nachweis der Assoziatbildung von DSCG erfolgte durch Aufnahme der Spektren der unverdünnten, entsprechend temperierten Lösungen (20°C, 4°C) im Bereich von 350 bis 450 nm mittels des UV/Vis-Scanning Spektralphotometers (Shimadzu Corporation, Japan) (↑ 5.2.2.5). Den Spektren wurde bei einer Wellenlänge von 395 nm die Absorption entnommen. Die dargestellten Werte sind Ergebnis einer Dreifachbestimmung. Die graphische Auswertung wurde anhand der halblogarithmischen Darstellung von Absorption gegen Konzentration vorgenommen.

Die Untersuchung auf mizellare Assoziationskolloide mit Eosin-Natrium erfolgte unter Verwendung einer 2 x 10-3 molaren wässrigen Stammlösung. 100,0 µl dieser Lösung wurden mit der entsprechenden Versuchslösung zu 20,0 ml verdünnt. Nach 24 h wurden die Absorptionsspektren von 500 bis 550 nm mittels des UV/Vis-Scanning Spektralphotometers (Shimadzu Corporation, Japan) (↑ 5.2.2.5) gegen das verwendete Medium aufgenommen. Die Höhe und die Lage des Absorptionsmaximums wurden bestimmt.

5.2.2. Gehaltsbestimmungen

5.2.2.1. Validierungsparameter

Die Validierung erfolgte anhand der in der analytischen Praxis üblichen Grundsätze [119, 120, 126]. Der Umfang der Validierung wurde dem beabsichtigten Zweck der Methode angepasst, so wurde z. B. in allen Fällen auf die Bestimmung der Nachweisgrenze verzichtet. Ebenso wurde nur die Wiederholpräzision (von Serie zu Serie und Tag zu Tag) überprüft, da stets derselbe Bearbeiter, im selbem Labor mit dem selbem Gerät die analytische Bestimmung durchführte (spektroskopische Verfahren DSCG, chromatographisches Verfahren XYLO und OXY).

Systemeignung (Optimierung chromatographischer Verfahren)

Die Optimierung der chromatographischen Verfahren erfolgte entsprechend gängiger Grundsätze [122, 126]. Die 95 % Konfidenzintervalle der Tailingfaktoren und Retentions­zeiten wurden ermittelt.

Standards

Als Standards wurden zertifizierte Substanzen verwendet, deren Identität, Reinheit und Gehalt nachgewiesen wurden oder die Prüfung erfolgte gegebenenfalls (OXY, DSCG) entsprechend der Monographie einer aktuellen Pharmakopöe. Die Stabilität der Standardlösungen wurde bei Bedarf, d. h. soweit nicht anderweitig bestätigt (XYLO, OXY [231]), überprüft (DSCG, ↑ 5.2.10). Die Herstellung der Standardstammlösungen erfolgte durch Einwaage und Auffüllen auf das entsprechende Volumen mit Gereinigtem Wasser. Die Stammlösungen [Seite 129↓]wurden bei Bedarf entsprechend verdünnt. Für die Erstellung der Kalibriergeraden und die Erfassung von Präzision und Richtigkeit einer Methode kamen zur Herstellung der Standardlösungen jeweils andere Stammlösungen zum Einsatz.

Stabilität des Analyten

Die Stabilität des Analyten in der Matrix wurde bei Bedarf nach für die praktische Anwendung relevanten Lagerungsbedingungen (Kühlschrank) und ggf. nach einem Einfrier­, Auftauzyklus untersucht (Differenzentest).

Arbeitsbereich der Kalibrierfunktion

Die obere und untere Grenze des Konzentrationsbereiches der Kalibriergeraden richtete sich nach dem erwarteten Konzentrationsbereich des jeweiligen Analyten in den Proben. Auf Varianzhomogenität der oberen und unteren Konzentration sowie Linearität wurde geprüft. Die Kalibrierfunktion wurde durch Vermessen von sechs unabhängigen Einwaagen mit entsprechenden, äquidistanten Verdünnungen aufgenommen. Im Falle der Gehalts­bestimmung in einer Matrix wurde diese für die Herstellung der Kalibrierlösungen verwendet. Jede Lösung wurde dabei 6mal vermessen.

Präzision

Die Messpräzision wurde bereits mit der Ermittlung der Kalibrierfunktion durch das 6malige Vermessen der Standards erfasst.

Die Methodenpräzision wurde durch Vermessen (Doppelbestimmung) von sechs unabhängigen Lösungen (im unteren, mittleren und oberen Konzentrationsbereich der Kalibriergeraden) des jeweiligen Standards in der jeweiligen Matrix, die dem kompletten Analysenprozess unterworfen wurden, ermittelt. Die Vermessung erfolgte dreimal an einem Tag (intraday Präzision) und an drei aufeinander folgenden Tagen (interday Präzision). Die Präzision ist als Variationskoeffizient angegeben.

Richtigkeit

Die Richtigkeit wurde bei gegebener Linearität der Kalibrierfunktion, Spezifität und Wiederfindungsrate als gegeben betrachtet (spektroskopische Verfahren) oder erfolgte anhand der ermittelten Werte der Standardlösungen der Präzisionsbestimmung. Angegeben ist die prozentuale Abweichung vom richtigen Wert.

Im Falle von DSCG wurde die Richtigkeit der HPLC-Methode zusätzlich mittels eines Referenzverfahrens überprüft [119, 120]. Die Überprüfung erfolgte durch den Vergleich der Ergebnisse, die mittels HPLC ermittelt wurden, mit denen der Referenzmethode (USP XXIII, S. 430).

Die Wiederfindung wurde ggf. durch Aufstocken der betreffenden analytfreien Matrix mit der Kalibriersubstanz ermittelt. Sie ist angegeben als prozentuale Abweichung vom richtigen Wert und wurde ggf. bei der Ermittlung der Probenkonzentrationen berücksichtigt.


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Spezifität

Bei den chromatographischen Verfahren wurde durch den Vergleich von Chromatogrammen und entsprechende Schnelltests auf Spezifität geprüft [119]. Bei den spektroskopischen Verfahren wurde gegen dokumentierte Spektren verglichen (DSCG: [95], OXY: [105], XYLO: [231]).

Robustheit (chromatographische Verfahren)

Die verwendeten chromatographischen Analysenmethoden wurden begrenzt auf Robustheit überprüft, da lediglich ein Bearbeiter und ein relevantes Gerät benutzt wurden. Die Verfahrensstabilität und dabei insbesondere zeitabhängige Komponenten und Lagerungsbedingungen (Kühlschrank, Raumtemperatur, Gefrierschrank) wurden mit der Präzisionsbestimmung erfasst.

Für die chromatographische Methode von DSCG wurde die Robustheit der Methode hinsichtlich des Wechsels von Labor und Gerät überprüft (Differenzentest).

Bestimmungsgrenze

Die Bestimmungsgrenze wurde anhand der Kalibrierfunktion nach dem Kalibrierverfahren ermittelt [119].

5.2.2.2. Qualitätssicherung während der Probenmessungen

Systemeignungstests (Chromatographische Verfahren)

Die Systemeignung wurde mittels einer Lösung des jeweiligen Analyten überprüft. Regenerationsbedarf des Säulenmaterials deutete sich in allen Fällen in zunehmendem Tailing der Peaks bei kleiner werdenden Retentionszeiten an. Als Grenzen galten die 95 % Konfidenzintervalle der ermittelten Tailingfaktoren und Retentionszeiten (↑ 5.2.2.1).

Qualitätskontrollproben

Mit jeder Analysenserie wurden drei bis sechs Qualitätskontrollproben (QP) bekannter Konzentration analysiert (Doppelbestimmung von drei Konzentrationen), deren Konzentration sich aus dem Arbeitsbereich der Kalibriergeraden ergab. Die Kontrollgrenzen wurden aus der Methodenpräzision abgeleitet (wahrer Wert ± 2 x Standardabweichung), da die in der Routineanwendung einer Methode analysierten Qualitätskontrollproben der Erkennung systematischer Fehler dienen. Zugleich dient die graphische Darstellung der Ergebnisse der Qualitätskontrollproben der Aufdeckung von Trends. Die Qualitätskontrollproben wurden bei einem Matrixeinfluss auf die quantitative Bestimmung unter Verwendung der jeweiligen Matrix hergestellt.


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Kalibrierfunktion

Für jede Analysenserie wurde die charakteristische Kalibrierfunktion durch die Vermessung von Kalibrierproben ermittelt, die der Berechnung der unbekannten Konzentration der Proben sowie der der QP dienten. Die Bestimmung der Kalibrierfunktion erfolgte analog der Validierung und als Block vor der jeweiligen Analysenserie. In Fällen bei denen ein Matrixeinfluss auf die Kalibrierfunktion nicht vorlag, wurden wässrige Standards verwendet.

5.2.2.3. HPLC-Methoden

Die entwickelten HPLC-Methoden dienten der quantitativen Bestimmung von XYLO und OXY im Rahmen der Permeations- und Liberationsstudien. Die DSCG-Konzentrationen wurden im Rahmen der Liberations-, Penetrations- und In-vivo-Studien mittels HPLC erfasst.

Die Parameter der entwickelten Methoden sind unter 4.1 angeführt. Die allgemeinen chromatographischen Bedingungen sind in Tabelle 37 aufgelistet, die substanzspezifischen in Tabelle 38.

Tabelle 37: Allgemeine chromatographische Bedingungen

Gerät

L-6200 A Intelligent Pump, L-4500 Diode Array Detector oder L

4000 UV-Detektor, D-6000 Interface, AS-2000 A Autosampler

(ggf.), Merck-Hitachi, Japan

Säule

LiCrospher® 100, RP-18 (5 µm), 125-4, Merck, Darmstadt

Vorsäule

LiCrospher® 100, RP-18 (5 µm), 4-4, Merck, Darmstadt

Injektionsvolumen

20 µl, Rheodyne, Cotati, California, USA

Tabelle 38: Spezielle chromatographische Bedingungen

 

OXY

XYLO

DSCG

   

Gehaltsbestimmung

Plasmaanalytik

Mobile Phase

Acetonitril : Puffer1 (V/V)

   
 

45:55

70:30

75:25

80:20

Fließgeschwindigkeit

1,25 ml/min

1,0 ml/min

  

Detektionswellenlänge

220 nm

240 nm

  


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5.2.2.4. Fluorimetrie

Die Fluorescein-Natrium Konzentrationen im Rahmen der Permeationsstudien und bei der Bestimmung des Verteilungskoeffizienten wurden mit Hilfe des Spektrofluorometers RF 5001 PC (Shimadzu, Japan) nach entsprechender Verdünnung mit 0,01N NaOH bestimmt. Die Parameter der fluorimetrischen Bestimmung fasst Tabelle 39 zusammen.

Tabelle 39: Parameter der fluorimetrischen Fluorescein-Natrium-Bestimmung

Fluoreszenz-Bedingungen:

Anregungswellenlänge

498 nm

Emissionswellenlänge

512 nm

Scangeschwindigkeit

High

Spaltbreite

3,0

Küvette

1ml Quarzküvette

5.2.2.5. UV/Vis-Spektroskopie

Die Durchführung der spektralphotometrischen Gehaltsbestimmungen erfolgte mittels UV/Vis-Scanning Spektralphotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Die Bestimmung der Arzneistoffkonzentration erfolgte, ggf. nach entsprechender Verdünnung, in 1 cm Halbmikroquarzküvetten. Als Bezugsgrößen dienten Gereinigtes Wasser oder das beim Versuch eingesetzte Medium.

Die Absorption im Rahmen der Gehaltsbestimmung von Natriumcromoglicat wurde bei einer Wellenlänge von 326 nm ermittelt.

Für OXY und XYLO wurden die Absorptionswerte bei einer Wellenlänge von 220 nm bestimmt.

Im Rahmen von Vorversuchen zu den Permeationsstudien mit DSCG wurde überprüft, ob die verwendeten Hilfsstoffzusätze und/oder Puffersysteme einen Einfluss auf die spektralphotometrische Gehaltsbestimmung hatten. Es wurde die Wiederfindung von DSCG aus dem verwendeten Puffersystem, ggf. mit dem entsprechenden Hilfsstoffzusatz, bestimmt. Das Absorptionsmaximum und die Wellenlänge des Maximums wurden ermittelt.


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5.2.3. In-vitro-Permeationen

Allgemeines

Die Permeationsstudien wurden in drei Side-Bi-SideTM-Diffusionszellen (Crown Glass Company, Sommerville, NJ, USA) (Abb. 5) durchgeführt. Diese bestehen aus zwei horizontalen Halbzellen mit einer Diffusionsfläche von 0,6362 cm², zwischen die die verwendete Membran eingespannt wird. Das Volumen je Halbzelle beträgt 3 ml. Über den thermostatierbaren (Thermostat A 100, Lauda, Lauda-Königshofen) Wassermantel wurden die Zellen konstant auf 35°C temperiert. Die Agitation der Medien in den Kompartimenten erfolgte durch Magnetrührer.

Zur Aufrechterhaltung der Vitalität der biologischen Membran wurden beide Kammern während des gesamten Versuches mit Carbogen® begast. Zudem wurde vor dem Permeationsversuch 30 min mit EBS vorinkubiert. Über die gesamte Versuchsdauer wurde über die Membran mittels Platinelektroden in jedem Kompartiment die Leitfähigkeit bestimmt (↓ 5.2.1.6).

Bei den Permeationsstudien wurde nach der Vorinkubation akzeptorseitig mit EBS, donatorseitig durch die Untersuchungslösung befüllt. Dabei waren beide Lösungen temperiert und begast.

Die Proben wurden im Abstand von 10 min über einen Zeitraum von 60 min aus dem Akzeptor entnommen und durch frisches Medium ergänzt. Die Bestimmung des Gehaltes erfolgte mittels HPLC (OXY, XYLO: ↓ 5.2.2.3)), fluorimetrisch (FLU: ↓ 5.2.2.4) oder spektralphotometrisch (DSCG: ↓ 5.2.2.5). Auf einen linearen Zusammenhang der permeierten Arzneistoffmenge pro Zeiteinheit wurde geprüft.

Bei Permeationsuntersuchungen (Vorinkubationsversuche) durch eine vorbehandelte Membran wurde anstelle von EBS donatorseitig mit der entsprechenden Hilfsstofflösung vorinkubiert. Vor dem eigentlichen Versuch erfolgte ein zweimaliges Spülen beider Kompartimente mit dem jeweiligen Puffersystem.

In den Donatoren und Akzeptoren wurden nach beendetem Versuch die Gesamtproteine bestimmt (↑ 5.2.7). Dargestellt sind die Werte von mindestens sechs Versuchen. Die Permeabilitätskoeffizienten sind mit ihrem Standardfehler (SEM), alle anderen Ergebnisse mit ihrer Standardabweichung (SD) angegeben.


[Seite 134↓]

Membranen

Zum Einsatz kam Rindernasenschleimhaut als biologische Membran und Nephrophan® als synthetische.

Die Rindernasenschleimhäute wurden von den Schlachthöfen Eberswalder Fleischwerke, Britz und Kasel-Golzig zur Verfügung gestellt. Die Entnahme des vorderen Teiles der Nasenmuschel erfolgte unmittelbar nach der Schlachtung der Tiere. Die entnommenen Stücke wurden in Carbogen®-begastem, eisgekühltem EBS ins Labor transportiert und unverzüglich verarbeitet. Aus den Nasenstücken wurden ca. 3-4 cm2 große Schleimhautstücke durch vorsichtiges Abtrennen vom unterliegenden Bindegewebe präpariert.

Die synthetische Membran Nephrophan® (Filmfabrik, Wolfen) ist eine Dialysemembran aus regenerierter Cellulose mit einer Porengröße von ungefähr 2,4 nm und einer Dicke von 14 bis 15 µm [136]. Die Membran wurde vor dem Versuch in Gereinigtem Wasser gewässert, um die Imprägnierung mit Glycerol als Weichmacher zu entfernen.

5.2.4. In-vitro-Penetrationen

Die Penetrationsstudien mit Rindernasenschleimhaut wurden entweder in der unter 5.2.3 beschriebenen Art und Weise durchgeführt oder es wurde mit der Untersuchungslösung über den gleichen Zeitraum bei 35°C und bei 100 U/min inkubiert (Schüttelinkubator 3032, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel). Während der Versuchsdauer von 1 h wurden keine Proben gezogen. Nach 60 min wurde die Mukosa entnommen und gespült. Die getrockneten Membranen wurden gewogen und nach Ultraschallaufschluss (Sonoplus HD 70 und UW 70, Bandelin electronic, Berlin) wie unter 5.2.6 aufgearbeitet und analysiert. In den Inkubationsflüssigkeiten, Spülflüssigkeiten und Donatoren/Akzeptoren wurden die DSCG­ und Proteingehalte nach 5.2.2.3, 5.2.6 und 5.2.7 bestimmt. Die dargestellten Werte sind Ergebnis einer Vierfachbestimmung.

5.2.5. Rheologische Untersuchungen

Die rheologischen Messungen erfolgten an der Universalmesseinrichtung UM Rheolab MC 100 (Physica, Stuttgart). Es kamen folgende Messsysteme (MS) zum Einsatz: MS-Z1 DIN und MS-KP 24 DIN. Die Temperierung erfolgte mittels des Kryostaten ecoline RE 104 (Lauda, Königshofen)

Als Modellsubstanz zur Erfassung der Mucinwechselwirkung diente eine Mucindispersion mit einer Konzentration von 20 % (m/m in PBS). Die Dispersion wurde hergestellt durch [Seite 135↓]12stündiges Quellen unter Rühren (Laborrührer IKA-Labortechnik, Staufen i.Br.) bei Raumtemperatur.

5.2.5.1. Oszillationsrheologie

Mucinwechselwirkungen

Portionen der Mucindispersion (↓ 5.2.5 ) zu 3 g wurden eingefroren und bei Bedarf bei 4°C aufgetaut. Nach Zusatz von 1 g Versuchslösung wurde unter Rühren 10 min homogenisiert und bei 4°C equilibriert. Die Aufnahme der Sweeps erfolgte unter Verwendung des Messsystems MS-KP 24 DIN. Die Equilibrierung bei der jeweiligen Versuchstemperatur im Messsystem betrug 15 min.

Das Einfrieren der Proben hatte keinen Einfluss auf die bestimmten rheologischen Parameter und beobachteten Effekte (Differenzentest, p < 0.005).

Amplitudensweep

Vor jeder Messung erfolgte die Ermittlung des viskoelastischen Bereiches der Messsubstanz durch Aufnahme eines Amplitudensweeps bei 1 und 10 Hz mit Vorgabe eines Drehmomentes im Bereich von 0,5 bis 30 mN mit logarithmischer Steigerung.

Frequenzsweep

Die Aufnahme der Frequenzsweeps erfolgte bei dem im Amplitudensweep ermittelten, geeigneten Drehmoment über einen Frequenzbereich von 0,1 bis 10 Hz. Es wurden die rheologischen Parameter Verlustmodul G´´, Speichermodul und tan δ mittels der Universalsoftware US 200 (Physica, Stuttgart) erfasst. Die weitere Bearbeitung der Daten erfolgte mit MS-Exel®. Die dargestellten Werte sind Ergebnis einer Sechsfachbestimmung. Vergleichend ausgewertet wurden die oben erwähnten rheologischen Parameter, die den Frequenzssweeps bei einer mittleren Kreisfrequenz (16, 9 1/s) entnommen wurden.

5.2.5.2. Rotationsrheologie

Dynamische Viskosität

Die Bestimmung der Viskositäten im Rahmen der Charakterisierung der DSCG-Lösungen erfolgte durch Schergeschwindigkeitsvorgabe in drei Stufen (250, 500, 750 1/s (KP 24) bzw. 500, 750, 1000 (Z 1 DIN)). Für jeden Einzelwert wurden pro Messreihe 50 Einzelwerte aufgenommen. Die angegebenen Werte sind Ergebnis einer Dreifachbestimmung.

Rheogramme

Proben der Mucindispersion (↓5.2.5.1) wurden nach Zusatz der Versuchslösung unter Rühren 10 min homogenisiert und bei 4°C equilibriert. Die Aufnahme der Rheogramme erfolgte durch Vorgabe der Deformationsgeschwindigkeit im Bereich von 0 bis 10 1/s oder 10 bis 100 [Seite 136↓]1/s bzw. umgekehrt. Für die Aufwärtskurve und Abwärtskurve wurden dabei 60 Einzelwerte aufgenommen. Die dargestellten Kurven sind Ergebnis einer Dreifachbestimmung.

Mukoadhäsionsindex

Der im Falle der Fertigarzneimittel bestimmte Mukoadhäsionsindex wurde nach dem modifizierten Verfahren [89] von Hassan und Gallo [88] durchgeführt. Die dabei bestimmten Viskositäten wurden durch Vorgabe von vier Schergeschwindigkeiten (25, 50, 75, 100 1/s) ermittelt. Für jede Viskosität wurden 15 Messwerte nach einer Vorscherung über 180 s aufgenommen. Die Messtemperatur betrug 35°C. Die dargestellten Ergebnisse sind das Ergebnis einer Dreifachbestimmung.

Der Ansatz der Proben erfolgte nach 5.2.5.1. Das verwendete Messsystem war Z 1 DIN.

Die Auswertung erfolgte nach [89]. Dazu wurden die der Mukoadhäsion proportionalen Viskositätskomponenten η b [Pas] aus den apparenten Viskositäten der Mucin/Proben­Gemische η t und der 15%igen Mucindispersion η m berechnet: .Der Mukoadhäsionsindex M-Ix [Pa] berechnet sich dann durch Multiplikation der Viskositätskomponente η b [Pas] mit dem angelegten Schergefälle [1/s].

5.2.5.3. In-vitro-Liberationen

Die Liberationsstudien wurden in Freigabezellen nach Siebenbrodt [232] durchgeführt. Es wurde mit einem Akzeptorvolumen von 25 ml gearbeitet. Das Volumen der Donatorzelle betrug 1,5 ml. Das Freigabemedium in der Donatorzelle wurde nicht agitiert. Als Akzeptormedium wurde EBS verwendet und mittels einer Schlauchpumpe (Ismatec, Glattbrugg-Zürich, Schweiz) im Kreislauf gepumpt. Die Versuche wurden bei 20°C (Schüttelinkubator 3032, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) durchgeführt.

Der Ansatz der Proben erfolgte im Falle der mucinhaltigen Systeme nach 5.2.5.1. Nephrophan® wurde als Membran zur Trennung von Akzeptor- und Donatorkompartiment verwendet. Die Versuchsdauer betrug 60 min. Die Entnahme des Probenvolumens (1 ml) erfolgte alle 15 min. Das entnommene Volumen wurde durch EBS ergänzt. Nach entsprechender Verdünnung wurden die Gehalte von OXY und DSCG mittels HPLC (↓ 5.2.2.3) bestimmt. Im Falle von FLU kam zur Bestimmung der Gehalte die Fluorimetrie zum Einsatz (↓ 5.2.2.4). Es wurde jeweils eine Sechsfachbestimmung durchgeführt. Zur Bestimmung des Diffusionsquotienten wurde der Anstieg von „freigesetzter Arzneistoffmenge [µg/ml] gegen [min] „ermittelt. Die dargestellten Diffusionsquotienten sind mit ihren Standardfehlern (SEM) und die Q60-Werte mit ihren Standardabweichungen (SD) angegeben.


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5.2.6. In-vivo-Versuche

Die In-vivo-Versuche2 wurden nach den Bestimmungen des Tierschutzgesetzes im Land Berlin beantragt und genehmigt. Die Haltung der Tiere erfolgte entsprechend den Vorgaben des Tierschutzgesetzes: in Einzelkäfigen bei einem Hell/Dunkel-Rhythmus von 12 h und freiem Zugang zu Wasser und Futter.

Die Versuche wurden an vier männlichen Albinokaninchen (New Zealand White, Charles River, Kißlegg, Deutschland) mit einem Gewicht von 3,0 bis 3,5 kg durchgeführt. Die Tiere erhielten während des Versuches eine Narkose (Ketamin 40 mg/kg, Xylazin 0,4 mg/ml, intramuskulär). Die nasalen Zubereitungen wurden mit Sprühsystemen der Firma Pfeiffer, Radolfzell mit drei Sprühstößen (à 45 µl) in ein Nasenloch appliziert. Die Entnahme des Blutes (Zusatz von 1 mg EDTA je ml Blut) erfolgte über einen Zeitraum von 60 min zu 6 sechs Zeiten aus der Ohrvene.

Das Blutplasma wurde durch Zentrifugation (Eppendorfzentrifuge Z 230, Hermle AG, Gosheim) bei 4000 U/min über 15 min gewonnen.

Das gewonnene Plasma wurde wie folgt aufgearbeitet: Dem Plasma (0,2 ml) wurden definierte Volumina Ger. Wasser (0,5 ml), konzentrierte Salzsäure (0,18 ml) und Ethylacetat (1,5 ml) zugesetzt. Die Proben wurden 30 min geschüttelt und 15 min bei 2000 U/min zentrifugiert. Eine definiertes Volumen Ethylacetat (1,2 ml) wurde abgenommen und mit
100 µl eines Kaliumphosphatpuffers pH 7,0 erneut 30 min geschüttelt. Nach der anschließenden Zentrifugation wurden die Reste des Ethylacetats abgedampft und die wässrigen Proben mittels HPLC (↓ 5.2.2.3) analysiert. Zusätzlich zu der Probenserie jeden Tieres wurden drei Qualitätskontrollproben (1, 2, 3 µg/ml) extrahiert.

Die Berechnung der AUC erfolgte entweder nach der Trapezregel [218] oder bei gegebener Anpassung der Werte an das Einkompartimentmodell anhand pharmakokinetischer Größen. Es wurden die Plasmaeinzelwerte aller Tiere zu einer resultierenden Plasmaspiegelkurve vereint (s. Abb. 35) [218].

Das dosierte Volumen eines Sprühstoßes des verwendeten Sprühsystems wurde durch Einsprühen einer DSCG-Lösung in einen Maßkolben mit anschließender photometrischer Bestimmung (↓ 5.2.2.5) aus den gemittelten Werten von 20 Sprühstößen ermittelt. Die Dosierungsgenauigkeit wurde entsprechend der Monographie Nasalia des Europäischen Arzneibuches geprüft.

Die Freisetzung von DSCG aus dem 1%igen Hyaluronat-Gel wurde nach 5.2.5.3 bestimmt.


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Der Einfluss der Herkunft des verwendeten Plasmas (Schwein, Kaninchen) auf die Kalibriergerade wurde untersucht. Da sich die Achsenabschnitte und Steigungen der beiden Geraden nicht unterschieden (t-Test), wurde anstelle des Kaninchenplasmas Schweineplasma für die Kalibrierung verwendet.

5.2.7. Proteinbestimmungen

Die Proteinbestimmungen erfolgten nach der Methode von Lowry [167]. Dabei wurden 0,4 ml der Prüflösung mit 2 ml einer frisch hergestellten Lösung von 0,01 % (m/m) Kupfer-II­sulfat und 0,016 % Weinsäure in 2%iger natronalkalischer (0,1 N) Natriumcarbonatlösung versetzt. Nach 10 min erfolgte die Zugabe von 0,2 ml Folin-Ciocalteau-Reagenz. Die Extinktion bei 720 nm gegen einen Blindwert wurde frühestens nach 30 min und spätestens nach 60 min gemessen. Mit jeder Probe wurde eine Zweifachbestimmung durchgeführt.

Donatoren/Akzeptoren, Inkubations- und Spülflüssigkeiten

Die Kalibrierung erfolgte mit fünf geeigneten Konzentrationen eines Gesamtproteinstandards (60 mg/ml).

Die Prüflösungen und die Standardlösungen wurden vor der Bestimmung einer Ultrazentrifugation unterworfen. Es wurden Filtrationseinheiten (Nalgene® Mini Centrifuge Filter 4 kDa MMCO) der Firma Nalge Nunc International Corporation (Rochester, USA) mit einem Deadstop-Volumen von 10 µl verwendet. Die Zentrifugation bei 5000 U/min erfolgte mit der Eppendorfzentrifuge Z 230 (Hermle AG, Gosheim). Der Rückstand wurde zweimal mit Ger. Wasser durch Zentrifugation gewaschen. Nach der Zentrifugation wurden die Lösungen verdünnt und wie oben angegeben die Proteingehalte bestimmt. Für jedes System gelangten drei Donatoren und Akzeptoren zur Auswertung.

Membranen

Die Kalibrierung erfolgte mit fünf geeigneten Konzentrationen eines Gesamtproteinstandards (60 mg/ml). Die Standards wurden analog den Prüflösungen behandelt.

Die getrockneten Membranen (↓ 5.2.4) wurden durch den Zusatz von 1,25 N NaOH hydrolysiert. Nach der Filtration erfolgten eine Verdünnung mit Gereinigtem Wasser und die Bestimmung des Proteingehaltes nach oben beschriebener Verfahrensweise.

5.2.8. Gleichgewichtsdialysen

Die Gleichgewichtsdialysen erfolgten mit der Equilibrium Dialysis Apparatur (Dianorm, München) unter Verwendung von Teflon Dialysezellen Makro 1 (1,0 ml Arbeitsvolumen).

Zur Trennung der Kompartimente wurde gewässertes Nephrophan® (↓ 5.2.3) verwendet. Nach der Befüllung der Kompartimente wurde über 48 h bei Raumtemperatur dialysiert. Die [Seite 139↓]Arzneistoffgehalte in beiden Kompartimenten wurden nach entsprechender Verdünnung mittels HPLC (↓ 5.2.2.3) analysiert. Der osmotische Ausgleich im Falle der Liberation mit Mucin erfolgte durch Zusatz geeigneter Mengen Natriumchlorid.

5.2.9. Stabilitätsuntersuchungen

Die Stabilitätsuntersuchungen im Falle von DSCG wurden in den Pufferlösungen nach List (pH 5,4, 6 und 7) [ 131 ] und in Gereinigtem Wasser vorgenommen und wurden im Rahmen der Validierung der Analysenverfahren durchgeführt. Die Lösungen wurden über einen Zeitraum von drei Jahren bei 4°C, Raumtemperatur und 40°C gelagert. Die Auswertung erfolgte durch Aufnahme der Spektren (↓ 5.2.2.5) nach Verdünnung und die Bestimmung der Lage und der Höhe des Absorptionsmaximums.

5.2.10. Statistik

Die Signifikanzprüfung erfolgte in allen Fällen auf einem Signifikanzniveau von 5 % Irrtumswahrscheinlichkeit.

Normalverteilung

Die Prüfung auf Normalverteilung der Stichproben erfolgte mit dem Test nach Kolmogoroff­Smirnoff vor jeder statistischen Prüfung. Nur normalverteilte Stichproben gelangten zur Auswertung.

Mittelwertsvergleich zweier Stichproben (t-Test)

Auf Gleichheit der Varianzen wurde bei mittels F-Test geprüft. Bei gleicher Varianz erfolgte der Mittelwertsvergleich mittels t-Test , bei ungleicher Varianz mittels Welch-Test . Bei verbundenen Stichproben erfolgte die Signifikanzprüfung mittels Differenzentest .

Statistik der Geraden

Durch lineare Regression wurden die Achsenabschnitte und Steigungen der resultierenden Geraden ermittelt. Die Prüfung auf Linearität erfolgte durch eine einfache Varianzanalyse .

Mittelwertsvergleich mehrerer Stichproben (ANOVA)

Es wurde eine einfache Varianzanalyse mit anschließendem multiplen Vergleich der Mittelwerte nach Tukey durchgeführt. Die Prüfung auf Gleichheit der Varianzen erfolgte mit der Testmethode nach Bartlett .


Fußnoten und Endnoten

1 

XYLO/OXY: 100 ml Reinstwasser werden mit 0,68 ml Phosphorsäure 85 % versetzt. Es wird mit Reinstwasser zu 800 ml aufgefüllt, der pH mit 0,1 N NaOH auf 3,0 eingestellt, Triethylamin zu 0,1 % (w/w) zugesetzt und der pH mit Phosphorsäure 10 % auf 2,6 eingestellt.

DSCG: 1,36 g KH2PO4 und 0,3224 g Tetrabutylammoniumbromid werden zu 1000,0 ml in Reinstwasser gelöst und der pH-Wert mit 0,1 N NaOH auf 5,2 eingestellt.

2 Herrn Prof. Borchert sei an dieser Stelle für die wertvolle Hilfe bei der Etablierung der Tierversuche herzlich gedankt.



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17.02.2004