5 Ergebnisse

5.1  Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 in Abhängigkeit von Mikrotubuli

5.1.1  Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3

↓53

Zu Beginn der vorliegenden Arbeit wurde die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3-Fusionsproteinen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie (siehe Methodenteil) in HeLa-Zellen untersucht. Es wurden sowohl GLI3-Fusionsproteine, die N-terminal markiert waren, als auch GLI3-Fusionsproteine, die C-terminal markiert waren, verwendet. In den untersuchten Zellen wurden drei Kategorien von Zellen beobachtet: a) Zellen, in denen GLI3 ausschließlich im Zellkern lokalisiert ist, b) Zellen, in denen GLI3 sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert ist, c) Zellen, in denen GLI3 ausschließlich im Cytosol lokalisiert ist. Pro Immunfluoreszenz-Experiment wurden jeweils 100 GLI3-überexprimierende Zellen, die in eine der oben genannten Kategorien eingeordnet wurden, ausgezählt. Jedes Immunfluoreszenz-Experiment wurde drei mal wiederholt. Die Mittelwerte aus den so ermittelten Zahlenwerten wurden graphisch im Balkendiagramm dargestellt und zur Berechnung der Standardabweichung benutzt.

↓54

In 52 ± 6% der GFP-GLI3 exprimierenden HeLa-Zellen war das N-terminal markierte GFP-GLI3 ausschließlich im Zellkern lokalisiert, während es in 13 ± 8% der Zellen ausschließlich im Cytosol lokalisiert war. Die restlichen GFP-GLI3-positiven Zellen zeigten eine Verteilung des Fusionsproteins sowohl im Kern als auch im Cytosol (Abb.1.1.1).

Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit dem C-terminal markierten GLI3-GFP erzielt: Hier war in 57 ± 4% der GLI3-GFP exprimierenden HeLa-Zellen das C-terminal markierte GLI3-GFP ausschließlich im Zellkern lokalisiert, während es in 11 ± 3% der Zellen ausschließlich im Cytosol lokalisiert war. Die restlichen GFP-GLI3-positiven Zellen zeigten eine Verteilung des Fusionsproteins sowohl im Kern als auch im Cytosol (Abb.1.1.1).

Um auszuschließen, dass die Lokalisation der GLI3-Fusionsproteine durch die Markierung mit dem GFP (green fluorescend protein) verändert wird, wurde auch mit einem myc-Epitop fusioniertes GLI3 (myc-GLI3) in HeLa-Zellen auf seine Lokalisation hin untersucht. In 53 ± 3% der myc-GLI3 exprimierenden HeLa-Zellen war das N-terminal markierte myc-GLI3 ausschließlich im Zellkern lokalisiert, während es in 19 ± 6% der Zellen ausschließlich im Cytosol lokalisiert war. Die restlichen GFP-GLI3-positiven Zellen zeigten eine Verteilung des Fusionsproteins sowohl im Kern als auch im Cytosol (Abb.1.1.1).

↓55

Abb.1.1.1: Lokalisation verschiedener GLI3-Fusionsproteine in HeLa-Zellen. In HeLa-Zellen wurde C-terminal GFP-markiertes (weiße Balken), N-terminal GFP-markiertes (rote Balken) bzw. mit einem myc-Epitop fusioniertes (gelbe Balken) GLI3 überexprimiert. In jeweils drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 GLI3-überexprimierende Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) Zellen, in denen GLI3 ausschließlich im Zellkern lokalisiert ist, b) Zellen, in denen GLI3 sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert ist, c) Zellen, in denen GLI3 ausschließlich im Cytosol lokalisiert ist. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt.

5.1.2  Zerstörung der Mikrotubuli (MT) durch Colcemid beeinflusst die intrazelluläre Lokalisation von GLI3

Durch Zerstörung der MT mittels Colcemidbehandlung sollte untersucht werden, ob die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 von intakten MT abhängt. Die Zerstörung der Mikrotubuli wurde mittels Tubulin-Färbung überprüft (Abb.1.2.2). Die mikroskopische Auswertung der Colcemid-behandelten Zellen zeigte eine signifikante (p = 0,007) Veränderung der intrazellulären Lokalisation von GFP-GLI3 (Abb.1.2.1): in 27 ± 7% der HeLa-Zellen war GFP-GLI3 ausschließlich im Zellkern lokalisiert, während es in 24 ± 4% der Zellen ausschließlich im Cytosol lokalisiert war. In den restlichen Zellen wurde GFP-GLI3 sowohl im Zellkern als auch im Cytosol gefunden. Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit C-terminal markiertem GLI3-GFP in HeLa-Zellen erzielt (Abb.1.2.3).

Abb.1.2.1: Die Lokalisation von N-terminal markiertem GFP-GLI3 in HeLa-Zellen ist abhängig von intakten Mikrotubuli. GFP-GLI3 wurde in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Zugabe von Colcemid (100mg/ml) überexprimiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 GFP-GLI3-exprimierende Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GFP-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Die Signifikanz der beobachteten Lokalisationsänderung wurde unter Annahme einer Normalverteilung mittels T-Test überprüft, das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

↓56

Abb.1.2.2: Die Lokalisation von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen ist abhängig von intakten Mikrotubuli. GFP-GLI3 wurde in HeLa-Zellen mit bzw. ohne Zugabe von Colcemid überexprimiert. Die Zellkerne sind mit DAPI-Färbung visualisiert (blau, oben links). Die GFP-GLI3-Lokalisation (grün, oben rechts) nach Colcemid-Behandlung bzw. in Kontroll-Zellen ist exemplarisch gezeigt. Tubulin-Färbung zur Darstellung der Integrität der Mikrotubuli in Kontroll-Zellen bzw. zur Darstellung der Zerstörung der Mikrotubuli nach Colcemid-Behandlung (rot, unten links) sind gezeigt.

Abb.1.2.3: Die Lokalisation von C-terminal markiertem GLI3-GFP in HeLa-Zellen ist abhängig von intakten Mikrotubuli. GLI3-GFP wurde in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Zugabe von Colcemid überexprimiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 GFP-GLI3-exprimierende Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GLI3-GFP ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GLI3-GFP ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GLI3-GFP ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Die Signifikanz der beobachteten Lokalisationsänderung wurde unter Annahme einer Normalverteilung mittels T-Test überprüft, das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

5.1.3  Zerstören der Mikrotubuli durch Kälteschock

Um auszuschließen, dass die beobachteten Lokalisationsänderungen von GFP-GLI3 Nebeneffekte der Behandlung mit Colcemid sind, wurden in einem zweiten Experiment die Mikrotubuli mittels Kälteschock zerstört.

↓57

In HeLa-Zellen wurde N-terminal markiertes GFP-GLI3 exprimiert. Die Mikrotubuli wurden mittels Kälteschock zerstört (Abb.1.3.1). In 56% der Zellen mit intakten Mikrotubuli lag GFP-GLI3 ausschließlich im Zellkern vor, während es in 14% der Zellen im Cytosol und in 30% der Zellen in beiden Kompartimenten lokalisiert war. Nach Zerstörung der Mikrotubuli lag GFP-GLI3 nur noch in 24% der Zellen im Zellkern, in 30% der Zellen im Cytosol und in 46% der Zellen in beiden Kompartimenten vor (Abb.1.3.2). Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit C-terminal markiertem GLI3-GFP in HeLa-Zellen erzielt (Abb.1.3.3).

Abb.1.3.1: Die Lokalisation von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen ist abhängig von intakten Mikrotubuli. GFP-GLI3 wurde in HeLa-Zellen mit bzw. ohne Kälteschock überexprimiert. Die Zellkerne sind mit DAPI-Färbung visualisiert (blau, links). Die GFP-GLI3-Lokalisation (grün, Mitte links) nach Kälteschock bzw. in Kontroll-Zellen ist exemplarisch gezeigt. Tubulin-Färbung zur Darstellung der Integrität der Mikrotubuli in Kontroll-Zellen bzw. zur Darstellung der Zerstörung der Mikrotubuli nach Colcemid-Behandlung (rot, Mitte rechts) sind gezeigt.

Abb.1.3.2: Intrazelluläre Lokalisation von N-terminal markiertem GFP-GLI3 in HeLa-Zellen nach Zerstören der Mikrotubuli mittels Kälteschock (4°C, 30min). GFP-GLI3 wurde in HeLa-Zellen überexprimiert. Die GLI3-Lokalisation wurde in jeweils 100 Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Kälteschock analysiert. Dargestellt ist die Anzahl der Zellen (in %), die in jeweils eine der folgenden Kategorien eingeordnet wurden: a) GFP-GLI3 liegt ausschließlich im Nukleus vor, b) GFP-GLI3 liegt im Nukleus und im Cytosol vor, c) GFP-GLI3 liegt ausschließlich im Cytosol vor.

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Abb.1.3.3: Intrazelluläre Lokalisation von C-terminal markiertem GLI3-GFP in HeLa-Zellen nach Zerstören der Mikrotubuli mittels Kälteschock. Die Auswertung der Experimente sowie die Darstellung der Ergebnisse erfolgte exakt wie in Abb.1.3.2.

Zusätzlich wurde dieses Experiment in einer anderen Zelllinie (U373MG) durchgeführt, um auszuschließen, dass die beobachteten Effekte Zelllinien-abhängig sind.

N-terminal markiertes GFP-GLI3 wurde in U373MG-Zellen überexprimiert und die Mikrotubuli wurden mittels Kälteschock zerstört. In 54% der Zellen mit intakten Mikrotubuli lag GFP-GLI3 ausschließlich im Zellkern vor, während es in 8% der Zellen im Cytosol und in 38% der Zellen in beiden Zellkompartimenten lokalisiert war. Nach Zerstörung der Mikrotubuli lag GFP-GLI3 nur noch in 34% der Zellen im Zellkern vor, während es in 57% der Zellen sowohl im Kern als auch im Cytosol und in 9% der Zellen ausschließlich im Cytosol verteilt war (Abb.1.3.4). Mit C-terminal markiertem GLI3-GFP wurden in U373MG-Zellen ähnliche, wenn auch weniger deutliche Effekte beobachtet (Abb.1.3.5).

↓59

Abb.1.3.4: Intrazelluläre Lokalisation von N-terminal markiertem GFP-GLI3 in U373MG-Zellen nach Zerstören der Mikrotubuli mittels Kälteschock. GFP-GLI3 wurde in U373MG-Zellen exprimiert. Die GLI3-Lokalisation in jeweils 100 Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Kälteschock wurde analysiert. Dargestellt ist die Anzahl der Zellen (in %), die in jeweils eine der folgenden Kategorien eingeordnet wurden: a) GFP-GLI3 liegt ausschließlich im Nukleus vor, b) GFP-GLI3 liegt im Nukleus und im Cytosol vor, c) GFP-GLI3 liegt ausschließlich im Cytosol vor.

Abb.1.3.5: Intrazelluläre Lokalisation von C-terminal markiertem GLI3-GFP in U373MG-Zellen nach Zerstören der Mikrotubuli mittels Kälteschock. Die Auswertung der Experimente sowie die Darstellung der Ergebnisse erfolgte exakt wie in Abb.1.3.4.

5.2  Kolokalisation von GLI3 mit Mikrotubuli bzw. mit dem Mikrotubulus-assoziierten MID1-Protein

5.2.1  Kolokalisation von GLI3 mit Mikrotubuli

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die GLI3-Lokalisation von der Integrität der Mikrotubuli abhängt. Wie anhand der Immunfluoreszenz-Bilder zu erkennen ist, liegt GLI3 aber offensichtlich nicht vollständig an Mikrotubuli assoziiert in der Zelle vor. Es sollte nun untersucht werden, ob es eine partielle, zeitlich begrenzte Bindung von GLI3 an Mikrotubuli gibt. Hierfür wurde N-terminal markiertes GFP-GLI3 in HeLa-Zellen überexprimiert. Nach Färbung der Mikrotubuli wurden die Zellen mittels 3D-Mikroskopie analysiert. Es konnte eine partielle Kolokalisation von GFP-GLI3 mit Mikrotubuli gezeigt werden (Abb.2.1.2). Als Positiv-Kontrolle wurde MID1-myc in HeLa-Zellen exprimiert (Abb.2.1.1), hier konnte vollständige Kolokalisation gezeigt werden. Als Negativ-Kontrolle wurde GFP in HeLa-Zellen exprimiert (Abb.2.1.1), hier war keine Kolokalisation nachweisbar.

↓60

Abb.2.1.1: Kontrollen für 3D-Mikroskopie. Links: GFP (grün) wurde in HeLa-Zellen exprimiert. Die Mikrotubuli wurden mit anti-Tubulin gefärbt (rot). Hier ist keine Kolokalisation zu beobachten, weiterhin sind keine Protein-Akkumulationen wie bei GFP-GLI3 zu beobachten. Rechts: MID1-myc (grün) wurde in HeLa-Zellen exprimiert. Die Mikrotubuli wurden mit anti-Tubulin gefärbt (rot). Die gelbe Färbung zeigt deutlich Kolokalisation.

Abb.2.1.2: Partielle Kolokalisation von GFP-GLI3 mit Mikrotubuli. Links: Eine ganze HeLa-Zelle, die GFP-GLI3 (grün) exprimiert, ist gezeigt. Die Mikrotubuli wurden mit anti-Tubulin gefärbt (rot). Der Pfeil deutet auf eine partielle Kolokalisation von GFP-GLI3 mit Mikrotubuli (gelb). Rechts: Darstellung eines vergrößerten Ausschnitts einer z-Ebene des dekonvolutierten Bildes einer Zelle wie links. Der Pfeil deutet auf eine Stelle, an der GFP-GLI3 mit den Mikrotubuli Kolokalisiert.

5.2.2  Kolokalisation von GLI3 und MID1

Die oben gezeigte Kolokalisation legte die Vermutung nahe, dass GLI3 auch mit dem Mikrotubulus-assoziierten MID1-Protein partiell kolokalisieren könnte. Um dies zu überprüfen, wurden N-terminal markiertes GFP-GLI3 und MID1-myc in HeLa-Zellen koexprimiert. Die Zellen wurden mittels 3D-Mikroskopie analysiert. Die qualitative Analyse zeigt eine partielle Kolokalisation von GLI3 und MID1 (Abb.2.2.1).

↓61

Abb.2.2.1: Partielle Kolokalisation von GFP-GLI3 mit MID1-myc. Oben: Eine z-Ebene eines dekonvolutierten Bilds einer HeLa-Zelle, die GFP-GLI3 (grün, links) und MID1-myc (rot, Mitte) koexprimiert, ist gezeigt. Eine partielle Kolokalisation von GFP-GLI3 mit MID1-myc stellt sich gelb dar. Unten: Darstellung des im Bild oben markierten Ausschnitts. Der Bildabschnitt ist von verschiedenen Blickwinkeln gezeigt (Blickwinkel sind in den einzelnen Bildern unten rechts angegeben), um auszuschließen, dass die gelben Signale durch zufällige Überlagerung der roten und grünen Signale entstehen. Der Pfeil deutet auf die gleiche Stelle, betrachtet von verschiedenen Blickwinkeln, an der GFP-GLI3 und MID1 kolokalisieren.

5.3  Veränderung der intrazellulären Lokalisation von GLI3 durch veränderte Protein Phosphatase 2a (PP2A)-Aktivität

Ein wesentlicher Faktor für die Regulation des GLI3-Homologs in Drosophila, Ci, ist die Serin-Threonin-Phosphorylierung und Dephosphorylierung dessen Interaktionspartner Fu und Cos2 in dem dort vorliegenden Mikrotubulus-assoziierten Protein-Komplex [zusammengefasst in (Murone et al., 1999)]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 in Abhängigkeit der Integrität der Mikrotubuli reguliert wird und es eine partielle Kolokalisation von GLI3 und MID1 gibt. Mikrotubulus-assoziierte PP2A macht einen Großteil der Mikrotubulus-assoziierten Phosphatase-Aktivität aus. Durch Beeinflussung der Aktivität Mikrotubulus-assoziierter PP2A mit Hilfe verschiedener Mechanismen sollte deren Einfluss auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 untersucht werden.

5.3.1  Einfluss des α4-Proteins auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3

5.3.1.1  Koexpression von GLI3 und α4

Durch eine Anreicherung von α4 in der Zelle kann viel MID1 an die katalytische Untereinheit der PP2A binden und deren Abbau vermitteln. Das führt nach (Trockenbacher et al., 2001) zur Verringerung der Mikrotubulus-assoziierten PP2A und folglich zur Hyperphosphorylierung ihrer Mikrotubulus-assoziierten Zielproteine.

↓62

Um zu untersuchen, ob sich die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 durch Überexpression von α4 beeinflussen lässt, wurde N-terminal markiertes GFP-GLI3 in HeLa-Zellen mit α4-V5 koexprimiert. Der Anteil der Zellen, in denen GFP-GLI3 im Kern vorliegt, veränderte sich nach α4-V5-Coexpression von 55 ± 2% auf 75 ± 8%. Der Anteil der Zellen mit cytosolischem GFP-GLI3 änderte sich von 11 ± 6% auf 4 ± 3%. In den restlichen GFP-GLI3 und α4-V5 koexprimierenden Zellen lag GFP-GLI3 in beiden Kompartimenten verteilt vor (Abb.3.1.1.1). Die Signifikanz dieser Lokalisationsänderung wurde unter Annahme einer Normalverteilung mittels T-Test überprüft (p=0,014). Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit dem C-terminal markierten GLI3-GFP erreicht (Abb.3.1.1.2).

Abb.3.1.1.1: Koexpression von N-terminal markiertem GFP-GLI3 und α4-V5 in HeLa-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von α4-V5 wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GFP-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des beobachteten Effekts mittels T-Test ermittelt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

Abb.3.1.1.2: Koexpression von C-terminal markiertem GLI3-GFP und α4-V5 in HeLa-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3-GFP in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von α4-V5 wurde analysiert. Die Auswertung erfolgte exakt wie in 3.1.1.1. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des Ergebnisses mittels T-Test untersucht. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

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Um auszuschließen, dass die hier beobachteten Lokalisationsänderungen von GFP-GLI3 nach Koexpression von α4 artifiziell nur bei GFP-fusioniertem GLI3 auftreten, wurde myc-markiertes GLI3 mit α4-V5 koexprimiert. Die koexprimierenden Zellen wurden mittels Immunfluoreszenz und Fluoreszenzmikroskopie (siehe Methoden) analysiert. Wie bei GFP-markiertem GLI3 wurde nach Koexpression von α4 eine Anreicherung von myc-GLI3 im Zellkern beobachtet. So lag myc-GLI3 nach Koexpression von α4 in 61 ± 4% der Zellen im Zellkern vor, gegenüber 53 ± 3% in den Kontrollzellen. Der Anteil der Zellen mit cytosolischem myc-GLI3 änderte sich nach Koexpression von α4 von 15 ± 4% auf 17 ± 2%. In den restlichen myc-GLI3 und α4-V5 koexprimierenden Zellen lag myc-GLI3 in beiden Kompartimenten verteilt vor (Abb.3.1.1.3).

Abb.3.1.1.3: Koexpression von myc-GLI3 und α4-V5 in HeLa-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von myc-GLI3 in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von α4-V5 wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) myc-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) myc-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) myc-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des Ergebnisses mittels T-Test untersucht. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

5.3.1.2  GLI3 Lokalisation nach „Knockdown“ von α4

Das α4-Protein vermittelt die Interaktion zwischen MID1 und PP2A. Fehlt das α4-Protein, kann MID1 nicht mehr seine Ubiquitinligase-Funktion auf PP2A ausüben. Dies führt zur Akkumulation von Mikrotubulus-assoziierter PP2A und folglich zur Hypophosphorylierung ihrer Zielproteine. Es sollte nun in einer weiteren Serie von Experimenten die GLI3-Lokalisation nach Kotransfektion mit α4-spezifischen siRNAs, die die Reduktion der Menge des endogenen α4-Proteins einleiten (siehe Methoden RNAi), analysiert werden. Nach Kotransfektion von HeLa-Zellen mit GFP-GLI3 und α4-spezifischen siRNAs, wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie die intrazelluläre GFP-GLI3 Lokalisation untersucht. Nach „Knockdown“ von α4 verringerte sich die Anzahl der Zellen, bei denen GFP-GLI3 ausschließlich im Kern vorlag von 56 ± 7,8% auf 17 ± 11,6%. Die Anzahl der Zellen, in denen GFP-GLI3 ausschließlich im Cytosol vorlag, veränderte sich nach dem α4 „Knockdown“ von 11 ± 7% auf 31 ± 14%. In den jeweils restlichen GLI3-positiven Zellen lag GFP-GLI3 sowohl im Zellkern als auch im Cytosol vor (Abb.3.1.2.1). Die Effizienz des α4 „Knockdown“ wurde mittels Westernblot (siehe Methoden) gezeigt (Abb.3.1.2.2). Hier wurden jeweils 50µg Proteinextrakt der oben beschriebenen Zellen auf einem 10%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Die Blots wurden mit einem anti-α4-Antikörper bzw. einem anti-Aktin-Antikörper inkubiert.

↓64

Abb.3.1.2.1: Kotransfektion von GFP-GLI3 und α4-siRNA in HeLa-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Kotransfektion von α4-siRNA wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GFP-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des Ergebnisses mittels T-Test untersucht. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

Abb.3.1.2.2: Verifizierung des „Knockdown“ von α4. Jeweils 100µg Proteinextrakt von HeLa-Zellen, die mit α4-spezifischen siRNAs (rechte Spur) bzw. Kontroll-siRNAs (linke Spur) transfiziert wurden, wurden auf einem 10%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot analysiert. Die Detektion des Blots mit anti-α4-Antikörpern zeigt eine deutliche Abnahme der Menge an α4 nach dem „Knockdown“ (oben). Als Ladekontrolle wurde der gleiche Blot mit anti-Aktin-Antikörpern detektiert (unten).

5.3.2  Überexpression von MID1-myc hat keinen Einfluss auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3

Dem Modell nach Trockenbacher et al. (2001) (siehe Einleitung) zufolge sollte eine Überexpression von MID1 genauso wie eine Überexpression von α4 zu einem vermehrten Abbau der Mikrotubulus-assoziierten PP2A und somit zu einer reduzierten PP2A-Aktivität und einer Hyperphosphorylierung Mikrotubulus-assoziierter Proteine führen. Daher sollte überprüft werden, ob die Überexpression von MID1-myc die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 beeinflussen kann. Hierzu wurden N-terminal markiertes GFP-GLI3 und MID1-myc in HeLa-Zellen koexprimiert und die Zellen mittels Immunfluoreszenz und Fluoreszenz-Mikroskopie (siehe Methoden) analysiert. Pro Immunfluoreszenz-Experiment wurden jeweils 100 GFP-GLI3 und MID1-myc koexprimierende Zellen ausgezählt und wie in den vorhergehenden Kapiteln in eine der folgenden Kategorien eingeordnet: a) Zellen, in denen GFP-GLI3 ausschließlich im Zellkern lokalisiert ist, b) Zellen, in denen GFP-GLI3 sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert ist, c) Zellen, in denen GFP-GLI3 ausschließlich im Cytosol lokalisiert ist. Jedes Immunfluoreszenz-Experiment wurde drei mal wiederholt. Die Mittelwerte aus den so ermittelten Zahlenwerten wurden graphisch im Balkendiagramm dargestellt und zur Berechnung der Standard-Abweichung benutzt. Durch Überexpression von MID1-myc erhöhte sich der Anteil der Zellen, in denen GFP-GLI3 ausschließlich im Zellkern lokalisiert war von 54 ± 6% auf 60 ± 7%, während sich der Anteil der Zellen mit cytosolischem GFP-GLI3 von 11 ± 6% auf 7 ± 1 % änderte. In den jeweils restlichen GFP-GLI3-überexprimierenden Zellen verteilte sich das GLI3-Fusionsprotein in beiden Zellkompartimenten. Die statistische Analyse dieser Lokalisationsänderung mittels T-Test zeigte jedoch, dass diese Lokalisationsänderung nicht signifikant war (p = 0,32) (Abb.3.2.1). Vergleichbare Ergebnisse wurden mit dem C-terminal markierten GLI3-GFP erzielt (Abb.3.2.2).

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Abb.3.2.1: Koexpression von N-terminal markiertem GFP-GLI3 und MID1-myc in HeLa-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von MID1-myc wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GFP-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des beobachteten Effekts mittels T-Test ermittelt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

Abb.3.2.2: Koexpression von C-terminal markiertem GLI3-GFP und MID1-myc in HeLa-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3-GFP in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von MID1-myc wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GLI3-GFP ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GLI3-GFP ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GLI3-GFP ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des beobachteten Effekts mittels T-Test ermittelt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

Ein vergleichbares Experiment wurde auch in U373MG-Zellen durchgeführt, um zu zeigen, dass die in HeLa-Zellen erzielten Ergebnisse nicht Zelllinien-abhängig auftraten. Auch die hier festgestellten Änderungen (58 ± 5% gegenüber 60 ± 4% der Zellen mit nukleärem GLI3; 5 ± 5% gegenüber 6 ± 4% der Zellen mit cytosolischem GLI3; 37 ± 4% gegenüber 34 ± 3% der Zellen, in denen GLI3 in beiden Zellkompartimenten vorlag) waren statistisch nicht signifikant (p = 0,62) (Abb.3.2.3). Vergleichbare Ergebnisse wurden in U373MG-Zellen auch mit dem C-terminal markierten GLI3-GFP erzielt (Abb.3.2.4).

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Abb.3.2.3: Koexpression von N-terminal markiertem GFP-GLI3 und MID1-myc in U373MG-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 in U373MG-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von MID1-myc ist gezeigt. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GFP-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des beobachteten Effekts mittels T-Test ermittelt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

Abb.3.2.4: Koexpression von C-terminal markiertem GLI3-GFP und MID1-myc in U373MG-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3-GFP in U373MG-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von MID1-myc wurde analysiert. In zwei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GLI3-GFP ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GLI3-GFP ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GLI3-GFP ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des beobachteten Effekts mittels T-Test ermittelt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

5.3.3  Beeinflussung der Aktivität endogener PP2A durch Koexpression der B-Box1 des MID1-Proteins

Die Überexpression der isolierten B-Box1-Domäne des MID1-Proteins erzeugt einen dominant negativen Effekt bezüglich der MID1-Funktion, wodurch die Aktivität der Mikrotubulus-assoziierten PP2A erhöht wird [nach (Trockenbacher et al., 2001)]: Die isolierte B-Box1 bindet das α4-Protein mit einer höheren Affinität als das MID1-Protein (Winter et al., 2004). Die überexprimierte B-Box1 wird somit das in der Zelle vorhandene, endogene α4-Protein binden, und folglich dessen Bindung an MID1 stören. Dadurch kann MID1 nicht mehr seine Ubiquitinligase-Aktivität auf PP2A ausüben, wodurch deren Abbau verhindert wird. Dies führt zu einer erhöhten Aktivität der Mikrotubulus-assoziierten PP2A in der Zelle. N-terminal markiertes GFP-GLI3 und die myc-markierte B-Box1 des MID1-Proteins wurden in HeLa-Zellen kotransfiziert und mittels Immunfluoreszenz analysiert. Pro Immunfluoreszenz-Experiment wurden jeweils 100 GFP-GLI3 und B-Box1-myc koexprimierende Zellen ausgezählt und wie in Kapitel 1.1-3 quantifiziert.

↓67

Nach Koexpression von N-terminal markiertem GFP-GLI3 mit der B-Box1-myc in HeLa-Zellen reduzierte sich die nukleäre GLI3-Lokalisation von 58 ± 5% auf 30 ± 5% (Abb.3.3.1). Der Anteil der Zellen mit cytosolischer GLI3-Lokalisation veränderte sich nach Koexpression der B-Box1 von 5 ± 1% auf 12 ± 6%. In den restlichen GFP-GLI3-positiven Zellen war das Fusionsprotein in beiden Zellkompartimenten verteilt. Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit C-terminal markiertem GLI3-GFP erreicht (Abb.3.3.2).

Abb.3.3.1: Oben: GFP-GLI3 wurde in HeLa-Zellen mit bzw. ohne B-Box1-myc überexprimiert. Die Zellkerne sind mit DAPI-Färbung visualisiert (blau, links). Die typische GFP-GLI3-Lokalisation (grün, Mitte links) nach Koexpression der B-Box1-myc bzw. in Kontroll-Zellen ist exemplarisch gezeigt. Die Expression der B-Box1-myc ist gezeigt (rot, Mitte rechts). Das RGB-Bild (Rot-Grün-Blau) ist rechts dargestellt. Unten: Koexpression von N-terminal markiertem GFP-GLI3 und B-Box1-myc in HeLa-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression der B-Box1-myc ist gezeigt. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GFP-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des beobachteten Effekts mittels T-Test ermittelt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

Abb.3.3.2: Koexpression von C-terminal markiertem GLI3-GFP und B-Box1-myc in HeLa-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3-GFP in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression der B-Box1-myc wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GLI3-GFP ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GLI3-GFP ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GLI3-GFP ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des beobachteten Effekts mittels T-Test ermittelt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

↓68

Um auszuschließen, dass der hier gezeigte B-Box1-Effekt auf die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 artifiziell durch das an GLI3 fusionierte GFP erzeugt wird, wurde ein Immunfluoreszenz-Experiment mit flag-markiertem GLI3 in Anwesenheit bzw. Abwesenheit der B-Box1-myc wie für GFP-GLI3 oben beschrieben durchgeführt. Nach Koexpression von flag-GLI3 und der B-Box1-myc in HeLa-Zellen sank der Anteil der Zellen mit nukleärer Lokalisation von GLI3 von 56% der Zellen auf 32% (Abb.3.3.3). Der Anteil der Zellen mit cytosolischen GLI3 änderte sich von 18% auf 32%, der Anteil der Zellen, in denen GLI3 in beiden Zellkompartimenten vorliegt, änderte sich von 26% auf 36%.

Abb.3.3.3: Koexpression von N-terminal markiertem flag-GLI3 und B-Box1-myc in HeLa-Zellen. Die intrazelluläre Lokalisation von flag-GLI3 in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression der B-Box1-myc wurde analysiert. Jeweils 100 Zellen wurden ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) flag-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) flag-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) flag-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Ergebnisse sind im Balkendiagramm dargestellt.

5.3.4  Aufheben des B-Box1-Effekts durch Fostriecin

Im Folgenden sollte verifiziert werden, dass der in Abschnitt 3.3 beobachtete B-Box1-Effekt, der nach Überexpression der isolierten, myc-markierten B-Box1 des MID1-Proteins auf die Lokalisation von GLI3 zu beobachten war, spezifisch auf erhöhte PP2A-Aktivität zurückzuführen ist. Hierfür wurde zunächst N-terminal markiertes GFP-GLI3 mit der B-Box1 koexprimiert (um die PP2A-Aktivität in der Zelle zu erhöhen). Anschließend wurden dieselben Zellen zusätzlich mit Fostriecin, einem spezifischen PP2A-Inhibitor behandelt (wodurch die erhöhte PP2A-Aktivität annulliert werden sollte). Wie schon in Abschnitt 3.3 gezeigt, änderte sich die Lokalisation von GFP-GLI3 durch Koexpression der B-Box1 deutlich (von 54 ± 4% auf 39 ± 3% der Zellen mit nukleärem GFP-GLI3; von 10 ± 5 auf 21 ± 5% der Zellen mit cytosolischem GFP-GLI3; in den restlichen GFP-GLI3-positiven Zellen war das Fusionsprotein in beiden Zellkompartimenten verteilt). Die Zugabe von Fostriecin nach Koexpression von B-Box1 und GFP-GLI3 resultierte in vollständiger Wiederherstellung des Ausgangszustands (60 ± 7% Zellen mit nukleärem GFP-GLI3; 12 ± 4% Zellen mit cytosolischen GFP-GLI3) (Abb.3.4.1). Dies zeigt, dass der B-Box1-Effekt auf die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 mit Fostriecin aufgehoben werden konnte, was darauf hindeutet, dass der B-Box1-Effekt auf erhöhte PP2A-Aktivität zurückzuführen ist. Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit dem C-terminal markierten GLI3-GFP erzielt (Abb.3.4.2).

↓69

Abb.3.4.1: Intrazelluläre Lokalisation von N-terminal markiertem GFP-GLI3 in HeLa-Zellen (weiße Balken) nach Koexpression der B-Box1 mit (dunkelgraue Balken) bzw. ohne (hellgraue Balken) Zugabe von Fostriecin. In drei unabhängigen Experimenten wurde aus jeweils 100 Zellen der Anteil der Zellen, bei denen GFP-GLI3 ausschließlich im Kern, im Kern und im Cytosol, bzw. ausschließlich im Cytosol vorliegt, bestimmt. Die Ergebnisse sind unter Indikation der Standardabweichung im Balkendiagramm dargestellt.

Abb.3.4.2: Intrazelluläre Lokalisation von C-terminal markiertem GLI3-GFP in HeLa-Zellen (weiße Balken) nach Koexpression der B-Box1 mit (dunkelgraue Balken) bzw. ohne (hellgraue Balken ) Zugabe von Fostriecin. In drei unabhängigen Experimenten wurde aus jeweils 100 Zellen der Anteil der Zellen, bei denen GLI3-GFP ausschließlich im Kern, im Kern und im Cytosol, bzw. ausschließlich im Cytosol vorliegt, bestimmt. Die Ergebnisse sind unter Indikation der Standardabweichung im Balkendiagramm dargestellt.

5.3.5  Effekt von PP2A-Inhibitoren auf die GLI3-Lokalisation

In den vorhergehenden Kapiteln konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung der Aktivität von Mikrotubulus-assoziierter PP2A eine vermehrte Akkumulierung von GLI3 im Cytosol bewirkt. In einem weiteren Experiment sollte untersucht werden, ob durch Inhibition von PP2A ein gegenteiliger Effekt auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 beobachtet werden kann.

5.3.5.1  Behandlung mit dem PP2A Inhibitor „ocadaic acid“

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Zunächst wurde N-terminal markiertes GFP-GLI3 in HeLa- bzw. U373MG-Zellen exprimiert und diese Zellen mit dem PP2A-Inhibitor „ocadaic acid“ behandelt. „Ocadaic acid“ hemmt bei Konzentrationen von 1nM 50% der Aktivität von PP2A. In höheren Konentrationen (0,1-0,5mM) werden auch andere Phosphatasen inhibiert (Bialojan et al., 1988). Mittels Immunfluoreszenz und Fluoreszenz-Mikroskopie (siehe Methoden) wurde die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 ermittelt. Wie in den vorangegangenen Experimenten wurden die Zellen wieder in Abhängigkeit der intrazellulären GFP-GLI3 Lokalisation drei Gruppen zugeordnet: ausschließlich nukleäre Lokalisation, ausschließlich cytosolische Lokalisation oder Verteilung über beide Kompartimente. Durch Behandlung mit dem Phosphataseinhibitor „ocadaic acid“ änderte sich die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 nicht signifikant (Abb.3.5.1.1).

Abb.3.5.1.1: Intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen (homogene Balken) und U373MG-Zellen (gestreifte Balken) in Anwesenheit (graue Balken) bzw. Abwesenheit (weiße Balken) von dem Phosphatase-Inhibitor „ocadaic acid“. In jeweils 100 Zellen wurde die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 analysiert. Die Anzahl der Zellen, bei denen GFP-GLI3 ausschließlich im Zellkern, sowohl im Kern als auch im Cytosol, bzw. ausschließlich im Cytosol vorlag, wurde jeweils im Balkendiagramm dargestellt.

5.3.5.2  Behandlung mit dem PP2A-Inhibitor Fostriecin

Da „ocadaic acid“ neben PP2A auch noch andere Phosphatasen inhibieren kann, wurde ein vergleichbares Experiment mit dem für PP2A-Inhibition spezifischeren Fostriecin durchgeführt. Hierfür wurde N-terminal markiertes GFP-GLI3 in HeLa-Zellen exprimiert, die mit Fostriecin behandelt wurden. Die Zellen wurden mittels Immunfluoreszenz und Fluoreszenz-Mikroskopie analysiert und die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 wurde in drei unabhängigen Experimenten in jeweils 100 Zellen analysiert. Nach Behandlung mit Fostriecin erhöhte sich der Anteil der Zellen, bei denen GFP-GLI3 ausschließlich im Zellkern vorlag von 53 ± 1,5% auf 58 ± 4,2% (Abb.3.5.2.1). Ausschließlich cytosolisches GFP-GLI3 lag in 13 ± 2% der behandelten und 16 ± 1% der Kontrollzellen vor. In den restlichen GFP-GLI3-positiven Zellen war das Fusionsprotein in beiden Zellkompartimenten verteilt. Die statistische Auswertung dieser Ergebnisse mittels T-Test unter Annahme einer Normalverteilung zeigte jedoch, dass diese Unterschiede nicht signifikant waren (p = 0,091). Ein vergleichbares Experiment wurde auch mit dem C-terminal markierten GLI3-GFP durchgeführt. Auch hier veränderte sich die intrazelluläre Lokalisation von GLI3-GFP nach Fostriecin-Behandlung nicht signifikant (Abb.3.5.2.2).

↓71

Abb.3.5.2.1: Intrazelluläre Lokalisation von N-terminal markiertem GFP-GLI3 in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Zugabe von Fostriecin. In drei unabhängigen Experimenten wurde aus jeweils 100 Zellen der Anteil der Zellen, bei denen GFP-GLI3 ausschließlich im Kern, im Kern und im Cytosol, bzw. ausschließlich im Cytosol vorliegt, bestimmt. Die Ergebnisse sind unter Indikation der Standardabweichung im Balkendiagramm dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des beobachteten Effekts mittels T-Test ermittelt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

Abb.3.5.2.2: Intrazelluläre Lokalisation von C-terminal markiertem GLI3-GFP in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Zugabe von Fostriecin. In drei unabhängigen Experimenten wurde aus jeweils 100 Zellen der Anteil der Zellen, bei denen GLI3-GFP ausschließlich im Kern, im Kern und im Cytosol, bzw. ausschließlich im Cytosol vorliegt, bestimmt. Die Ergebnisse sind unter Indikation der Standardabweichung im Balkendiagramm dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des beobachteten Effekts mittels T-Test ermittelt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

5.3.6  Induktion der Aktivität endogener PP2A durch Rapamycinbehandlung beeinflusst die GLI3-Lokalisation

5.3.6.1  Rapamycin-Effekt auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3

Rapamycin wird zur Induktion von PP2A-Aktivität eingesetzt. Hierbei hemmt Rapamycin die TOR-Kinase (target of rapamycin), welche als Repressor auf PP2A wirkt. Hierdurch kommt es zur Induktion der PP2A-Aktivität [zusammengefasst in (Jacinto und Hall, 2003)]. Um zu untersuchen, ob eine Induktion der PP2A-Aktivität zu einer Veränderung der intrazellulären GLI3-Lokalisation führt, wurde zunächst N-terminal markiertes GFP-GLI3 in HeLa-Zellen exprimiert. Anschließend wurden diese Zellen mit Rapamycin behandelt. In drei unabhängigen Experimenten wurde in jeweils 100 Zellen die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 untersucht. Durch die Behandlung mit Rapamycin verringerte sich die Anzahl der Zellen, in denen GFP-GLI3 im Nukleus lokalisiert war, von 55 ± 2% auf 37 ± 8%, während sich die Anzahl von Zellen mit cytosolischem GFP-GLI3 von 11 ± 6% auf 18 ± 6% erhöhte (Abb.3.6.1.1). Vergleichbare Ergebnisse wurden mit dem C-terminal markierten GLI3-GFP erreicht (Abb.3.6.1.2).

↓72

Abb.3.6.1.1: Die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Zugabe von Rapamycin (25nM, 30min) wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GFP-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des Ergebnisses mittels T-Test untersucht. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

Abb.3.6.1.2: Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3-GFP in HeLa-Zellen mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Zugabe von Rapamycin (25nM, 30min) wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GLI3-GFP ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GLI3-GFP ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GLI3-GFP ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des Ergebnisses mittels T-Test untersucht. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

5.3.6.2 Aufheben des Rapamycin-Effekts auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 durch Überexpression von α4 bzw. MID1

Durch Induktion der PP2A-Aktivität konnte eine Veränderung der intrazellulären Lokalisation von GLI3 induziert werden. Im Gegensatz hierzu führte die Koexpression des α4-Proteins zu einer Anhäufung des GFP-GLI3-Fusionsproteins im Nukleus. Liegt eine Anreicherung von α4 in der Zelle vor, kann die Bindung von MID1 an die katalytische Untereinheit der PP2A vermehrt werden, was zu deren Abbau führt. Hierdurch wird die Aktivität der Mikrotubulus-assoziierten PP2A reduziert. Da diese beiden beobachteten Effekte auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 gegensätzlich zueinander sind, sollte im Folgenden analysiert werden, ob die Veränderung der intrazellulären Lokalisation von GLI3, die nach Rapamycin-Behandlung beobachtet wurde, durch Koexpression von α4 aufgehoben werden kann. Dazu wurden α4-V5 und N-terminal markiertes GFP-GLI3 in HeLa-Zellen koexprimiert, welche dann mit Rapamycin behandelt wurden.

↓73

Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 nach Rapamycin-Behandlung änderte sich durch die Koexpression von α4 von 37 ± 8% auf 66 ± 7% der Zellen, in denen GFP-GLI3 ausschließlich im Nukleus lokalisiert war, während sich die Anzahl der Zellen mit cytosolischem GFP-GLI3 von 19 ± 3% auf 9 ± 4% veränderte (Abb.3.6.2.1). Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit C-terminal markiertem GLI3-GFP erreicht (Abb.3.6.2.2).

Abb.3.6.2.1: Die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen nach Rapamycin-Behandlung (25nM, 30min) mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von α4 wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GFP-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt.

Abb.3.6.2.2: Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3-GFP in HeLa-Zellen nach Rapamycin-Behandlung (25nM, 30min) mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von α4 wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GLI3-GFP ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GLI3-GFP ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GLI3-GFP ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt.

↓74

Durch Rapamycin wird die Aktivität der PP2A induziert, während MID1 durch seine Ubiquitinligase-Aktivität den Abbau von PP2A einleiten kann. Nachdem hier gezeigt werden konnte, dass die Überexpression von α4 den Rapamycin-Effekt auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 aufheben konnte, sollte nun untersucht werden, ob die Überexpression von MID1 eine ähnliche Wirkung hat. Dazu wurden HeLa-Zellen, die N-terminal markiertes GFP-GLI3 und MID1-myc koexprimierten, mit Rapamycin behandelt.

Die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 nach Rapamycin-Behandlung änderte sich durch Koexpression von MID1-myc von 37 ± 8% auf 60 ± 4% der Zellen, in denen GFP-GLI3 ausschließlich im Nukleus lokalisiert war. Der Anteil der Zellen, in denen GFP-GLI3 im Cytosol vorlag, änderte sich von 19 ± 6% auf 12 ± 4%. In den restlichen Zellen war GFP-GLI3 in beiden Zellkompartimenten verteilt (Abb.3.6.2.3). Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit C-terminal markiertem GLI3-GFP erreicht (Abb.3.6.2.4).

Abb.3.6.2.3: Die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen nach Rapamycin-Behandlung mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von MID1-myc wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GFP-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt.

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Abb.3.6.2.4: Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3-GFP in HeLa-Zellen nach Rapamycin-Behandlung mit (graue Balken) bzw. ohne (weiße Balken) Koexpression von MID1-myc wurde analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GLI3-GFP ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GLI3-GFP ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GLI3-GFP ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt.

5.3.7  Proteasom-Inhibition mittels Lactacystin beeinflusst die GLI3-Lokalisation

Durch Behandlung von Zellen mit dem Proteasom-Inhibitor Lactacystin kann der Abbau Mikrotubulus-assoziierter PP2A über die MID1 vermittelte Ubiquitinierung der PP2A verhindert werden. Wird weniger Mikrotubulus-assoziierte PP2A abgebaut, so wird deren Aktivität erhöht. Um zu überprüfen, ob die Induktion der PP2A-Aktivität mittels Lactacystin-Behandlung die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 verändert, wurden HeLa-Zellen, die GFP-GLI3 exprimieren, mit Lactacystin behandelt und einer Lebendzellanalyse (siehe Methoden) unterzogen. Nach der Behandlung mit Lactacystin wurde in einem Zeitfenster von 4 Stunden eine Anreicherung von GFP-GLI3 im Cytosol beobachtet (Abb.3.7.1.).

Abb.3.7.1: Lebendzellanalyse. In HeLa-Zellen wurde GFP-GLI3 exprimiert. Nach Zusatz von Lactacystin wurden in 1-minütigen Intervallen über ein Zeitfenster von 4h Bilder aufgenommen (resultierend in 240 Einzelaufnahmen). Der jeweilige Zeitpunkt der Aufnahme ist in den Bildern angegeben. Der Pfeil zeigt auf eine GLI3-Anreicherung im Cytosol.

↓76

Um den hier gezeigten Effekt der Induktion endogener PP2A-Aktivität durch Proteasom-Inhibition mittels Lactacystin auf die GLI3-Lokalisation durch Immunfluoreszenz und anschließende Fluoreszenzmikroskopie in fixierten Präparaten zu verifizieren, wurde GFP-GLI3 in HeLa-Zellen exprimiert. Die Anzahl der Zellen mit nukleärer GLI3-Lokalisation veränderte sich durch Lactacystin-Behandlung von 50% auf 42% bei einer Konzentration von 300nM (die Anzahl der Zellen mit cytosolischer Lokalisation änderte sich von 13% auf 5%, die Anzahl der Zellen, in denen GLI3 in beiden Zellkompartimenten vorliegt, stieg von 37% auf 53%), und von 54% auf 29% bei einer Konzentration von 1mM (die Anzahl der Zellen mit cytosolischer Lokalisation änderte sich von 13% auf 2%, die Anzahl der Zellen, in denen GLI3 in beiden Zellkompartimenten vorliegt, stieg von 33% auf 69%) (Abb.3.7.2). Dies bestätigt den in der Lebendzellanalyse beobachteten Effekt der GLI3-Akkumulierung im Cytosol nach Lactacystin-Behandlung.

Abb.3.7.2: Einfluss des Proteasom-Inhibitors Lactacystin auf die GLI3-Lokalisation. GFP-GLI3 wurde in HeLa-Zellen exprimiert, die ohne (einfarbige Balken), mit 300nM Lactacystin (orange gestreifte Balken) bzw. 1mM Lactacystin (grün gestreifte Balken) behandelt wurden. Die Anzahl der Zellen, in denen GFP-GLI3 ausschließlich im Kern, in Kern und Cytosol, bzw. ausschließlich im Cytosol vorlag, ist im Balkendiagramm dargestellt.

5.3.8 Verifizierung der beobachteten Lokalisationseffekte mittels Westernblot

Um die in den oben beschriebenen Immunfluoreszenz-Experimenten beobachteten PP2A-abhängigen Effekte auf die GLI3-Lokalisation mit einer zweiten Methode zu verifizieren, wurden HeLa-Zellen mit GFP-GLI3 transfiziert bzw. mit der B-Box1 bzw. mit α4 kotransfiziert und einer Zellfraktionierung unterzogen. Jeweils 100µg Protein der Kern- und Cytosol-Fraktionen wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot (siehe Methoden) analysiert. Die GFP-GLI3-spezifischen Banden wurden mit einem anti-GFP-Antikörper detektiert. Zur Überprüfung des Erfolgs der Trennung der Kern- und Cytosol-Fraktionen wurde derselbe Blot mit anti-Lamin A/C-Antikörpern inkubiert. Als Ladekontrolle wurde derselbe Blot ebenfalls mit anti-Tubulin-Antikörpern inkubiert (Abb.3.8.1). Die resultierenden GFP-GLI3-spezifischen Banden wurden mittels ImageQuant5.2 quantifiziert (Abb.3.8.2). Die daraus berechneten Zahlenwerte wurden zur Ermittlung der jeweiligen Verteilung der Gesamt-GFP-GLI3-Menge zwischen den Kern- und Cytosol-Fraktionen benutzt, welche im Balkendiagramm dargestellt wurde (Abb.3.8.3). Der Anteil des Gesamt-GFP-GLI3 in der Kernfraktion verringerte sich nach Koexpression der B-Box1 von 79,4% auf 61,5%. Der Anteil des Gesamt-GFP-GLI3 in der Kernfraktion vergrößerte sich nach Koexpression von α4 von 79,4% auf 88,4%. Diese Veränderungen bestätigen die in den Immunfluoreszenz-Experimenten ermittelten Daten.

↓77

Abb.3.8.1: Westernblot-Analyse von Kern- bzw. Cytosol-Fraktionen GFP-GLI3 exprimierender bzw. GFP-GLI3 und B-Box1 bzw. α4 koexprimierender HeLa-Zellen. Jeweils 100µg der Proteine wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Die GFP-GLI3-spezifischen Banden wurden mit einem anti-GFP-Antikörper detektiert (oben). Die erfolgreiche Trennung der Kern- und Cytosol-Fraktionen wurde durch Inkubation des Blots mit anti-Lamin A/C-Antikörpern gezeigt (Mitte). Die geladene Proteinmenge wurde durch Inkubation des Blots mit einem anti-Tubulin-Antikörper gezeigt (unten).

Abb.3.8.2: Quantifizierung der Banden aus 3.8.1 mittels ImageQuant5.1. Die Fläche unter den Peaks korrespondiert jeweils zur Intensität der Banden auf dem Westernblot. Die Integrale der jeweiligen Flächen unter den Peaks sind in der Abbildung angegeben.

Abb.3.8.3: Die in 3.8.2 ermittelten Zahlenwerte der GFP-GLI3-spezifischen Banden der Kern- und Cytosol-Fraktionen aus 3.8.1 wurden jeweils zusammengefasst, um den Gesamt-GFP-GLI3-Gehalt der jeweiligen Zellen zu bestimmen. Der prozentuale Anteil der GFP-GLI3-Verteilung in den jeweiligen Zellkompartimenten ist im Balkendiagramm dargestellt. Die Balken der GFP-GLI3 exprimierenden Zellen sind weiß dargestellt, die der GFP-GLI3 und B-Box1 koexprimierenden Zellen hellgrau, und die der GFP-GLI3 und α4 koexprimierenden Zellen dunkelgrau.

5.4  Welche Kinase beeinflusst die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 als Gegenspieler von PP2A?

↓78

Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 ist von der Aktivität Mikrotubulus-assoziierter PP2A abhängig, wie in den Abschnitten 3.1-3.8 gezeigt wurde. Im Folgenden sollte untersucht werden, welche Kinase hierbei der PP2A entgegenwirkt. Dazu wurde GFP-markiertes GLI3 in HeLa-Zellen exprimiert und dessen intrazelluläre Lokalisation nach Behandlung mit verschiedenen Kinase-Inhibitoren mittels Immunfluoreszenz und Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Während Inhibitoren von PKA (Protein Kinase A), CK1 (Casein Kinase 1), PI3-Kinase und Phospholipase C keinen Effekt auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 hatten, veränderte sich diese nach Behandlung mit LiCl (Tab.4.1-4.2), einem Inhibitor der GSK3β (Glycogen Synthase Kinase 3β). Die Anzahl der Zellen mit ausschließlich nukleärer Lokalisation des N-terminal markierten GFP-GLI3-Fusionsproteins verringerte sich von 58 ± 6% auf 23 ± 6% nach LiCl-Behandlung (Tab.4.1). Die Anzahl der Zellen mit ausschließlich cytosolischem GFP-GLI3 veränderte sich nach LiCl-Behandlung von 12 ± 1% auf 16 ± 2%. Für das C-terminal markierte GLI3-GFP wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt (Tab.4.2).

Tab.4.1: GFP-GLI3-exprimierende HeLa-Zellen wurden mit verschiedenen Kinase-Inhibitoren behandelt. Mittels Immunfluoreszenz und Fluoreszenzmikroskopie wurde die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 analysiert. Die Wirkung der jeweiligen Substanz sowie die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 sind in der Tabelle dargestellt. In jeweils drei unabhängigen Experimenten wurde die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 in je 100 Zellen analysiert. Die Mittelwerte aus den drei Experimenten sind unter Angabe der jeweiligen Standardabweichung in der Tabelle angegeben.

Behandlung der Zellen mit...

Wirkung der Substanz

intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 (Anzahl der Zellen in %)

Nukleus

Nukleus und Cytosol

Cytosol

Kontrolle

58 ± 6

30 ± 5

12 ± 1

Forskolin

induziert PKA

65 ± 6

27 ± 6

9 ± 1

IBMX

induziert PKA

64 ± 11

28 ± 9

8 ± 3

CKI-7

inhibiert Casein Kinase 1

60 ± 2

26 ± 5

10 ± 2

Wortmannin

inhibiert PI3-Kinase

52 ± 4

36 ± 4

12 ± 6

HePC

inhibiert Phospholipase C

57 ± 4

35 ± 7

8 ± 3

U73122

inhibiert Phospholipase C

56 ± 3

34 ± 5

10 ± 2

U73343

Negativkontrolle für U73122

56 ± 3

32 ± 8

12 ± 6

LiCl

inhibiert GSK3β

23 ± 6

61 ± 6

16 ± 2

Tab.4.2: Darstellung der intrazellulären Lokalisation von C-terminal markiertem GLI3-GFP nach Behandlung der Zellen mit verschiedenen Kinase-Inhibitoren, wie in Tab.4.1.

Behandlung der Zellen mit...

Wirkung der Substanz

intrazelluläre Lokalisation von GLI3-GFP (Anzahl der Zellen in %)

Nukleus

Nukleus und Cytosol

Cytosol

Kontrolle

53 ± 8

38 ± 8

9 ± 5

Forskolin

induziert PKA

62 ± 10

32 ± 9

6 ± 2

IBMX

induziert PKA

63 ± 8

30 ± 6

6 ± 2

CKI-7

inhibiert Casein-Kinase 1

60 ± 5

32 ± 8

6 ± 2

Wortmannin

inhibiert PI3-Kinase

55 ± 6

36 ± 4

10 ± 4

LiCl

inhibiert GSK3β

33 ± 9

54 ± 14

13 ± 8

↓79

Um den hier beobachteten LiCl-Effekt auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 an lebenden Zellen zu verdeutlichen, wurde N-terminal markiertes GFP-GLI3 in HeLa-Zellen exprimiert. Diese Zellen wurden mit LiCl versetzt und anschließend einer Lebendzellanalyse unterzogen. Über ein Zeitfenster von 4 Stunden wurde alle 60 sek ein Bild einer GFP-GLI3 exprimierenden Zelle aufgenommen. Zu Beginn der Aufnahme war GFP-GLI3 ausschließlich im Zellkern lokalisiert. Nach LiCl-Behandlung bildeten sich GFP-GLI3-Akkumulate im Cytosol der Zelle; GFP-GLI3 war nach Ablauf der 4-stündigen Inkubation mit LiCl sowohl im Zellkern als auch im Cytosol nachweisbar (Abb.4.1). Dies unterstützt die Immunfluoreszenz Ergebnisse.

Abb.4.1: Lebendzellanalyse. In HeLa-Zellen wurde GFP-GLI3 exprimiert. Nach Zusatz von LiCl wurden in 1-minütigen Intervallen über ein Zeitfenster von 4h Bilder aufgenommen (resultierend in 240 Einzelaufnahmen). Der jeweilige Zeitpunkt der Aufnahme ist in den Bildern angegeben. Der Pfeil deutet auf eine Stelle, an der sich GFP-GLI3 im Cytosol angereichet hat.

Um auszuschließen, dass die hier beobachteten Effekte der LiCl-Behandlung nicht auf GSK3β-Inhibition zurückzuführen sind, wurde im folgenden Experiment die endogene Menge der GSK3β durch RNAi (siehe Methoden) reduziert. In HeLa-Zellen wurde N-terminal markiertes GFP-GLI3 mit GSK3β-spezifischen bzw. Kontroll-siRNAs kotransfiziert. Mittels Immunfluoreszenz und Fluoreszenzmikroskopie (siehe Methoden) wurde die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 analysiert. Durch GSK3β-„Knockdown“ änderte sich der Anteil der Zellen mit nukleärem GFP-GLI3 von 55 ± 6% auf 37 ± 7%, während sich der Anteil der Zellen mit cytosolischem GFP-GLI3 von 12 ± 1% auf 18 ± 4% veränderte. In den restlichen GFP-GLI3-positiven Zellen war GLI3 in beiden Zellkompartimenten verteilt (Abb.4.2). Die Analyse der beobachteten Lokalisationsänderung mittels T-Test zeigte, dass durch GSK3β-„Knockdown“ eine signifikante Reduktion der nukleären Lokalisation von GFP-GLI3 hervorgerufen wird (p = 0,024329). Diese Ergebnisse verifizieren die GSK3β-Spezifität der nach LiCl-Behandlung beobachteten Lokalisationsänderung von GLI3. Die Effizienz des GSK3β-„Knockdowns“ wurde mittels Westernblot (siehe Methoden) überprüft (Abb.4.3). Hierfür wurden jeweils 50µg Proteinextrakt der oben beschriebenen Zellen auf einem 10%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Der Blot wurde mit einem anti-GSK3-Antikörper, der sowohl GSK3α als auch GSK3β detektiert, wobei die untere Bande der GSK3β entspricht.

↓80

Abb.4.2: Intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 nach GSK3β-„Knockdown“. GFP-GLI3 wurde in HeLa-Zellen exprimiert, die mit Kontroll-siRNA (weiße Balken) bzw. mit GSK3β-siRNA (graue Balken) kotransfiziert wurden. Die Anzahl der Zellen, in denen GFP-GLI3 ausschließlich im Kern, in Kern und Cytosol, bzw. ausschließlich im Cytosol vorlag, ist im Balkendiagramm unter Darstellung der Standardabweichung dargestellt. Die Signifikanz der Lokalisationsänderung wurde unter Annahme einer Normalverteilung mittels T-Test gezeigt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

Abb.4.3: Westernblot-Analyse von HeLa-Zelllysaten nach Transfektion von Kontroll-siRNAs (linke Spur) bzw. GSK3β-siRNAs (rechte Spur). Jeweils 50µg Protein wurden auf einem 10%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Der Blot wurde mit einem GSK3-Antikörper inkubiert, der sowohl GSK3α (obere Bande) als auch GSK3β (untere Bande) detektiert.

5.5 Spezifität der beobachteten Lokalisationseffekte

Im Folgenden wurde untersucht, ob die hier beobachteten Lokalisationseffekte von PP2A- bzw. GSK3β-Aktivität außer der intrazellulären Lokalisation von GLI3 auch die intrazelluläre Lokalisation von GLI1 oder GLI2 beeinflussen kann. Dazu wurden GLI1 bzw. mGLI2 (das Maus-Homolog von humanem GLI2) in HeLa-Zellen (fusioniert mit entweder dem myc-Epitop oder dem flag-Epitop) exprimiert und – wie für GLI3 oben beschrieben – entweder mit der B-Box1 oder mit α4 koexprimiert, bzw. mit Rapamycin, Fostriecin oder LiCl behandelt. Durch keine der aufgeführten Behandlungen konnte die intrazelluläre Lokalisation von GLI1 oder mGLI2 beeinflusst werden (Tab.5.1).

↓81

Tab.5.1: Intrazelluläre Lokalisation von GLI1 und mGLI2. myc-GLI1 bzw. myc-mGLI2 wurden in HeLa-Zellen exprimiert und entweder mit α4 bzw. der B-Box1 koexprimiert oder mit LiCl, Rapamycin bzw. Fostriecin behandelt. Die intrazelluläre Lokalisation von GLI1 bzw. mGLI2 ist unter Angabe der jeweiligen Behandlung der Zellen in der Tabelle dargestellt. Jedes Experiment wurde drei mal wiederholt und pro Experiment wurden jeweils 100 Zellen analysiert. In der Tabelle sind die Mittelwerte aus diesen drei Ergebnissen unter Angabe der Standardabweichung dargestellt.

Exprimiertes Konstrukt

Behandlung

Intrazelluläre Lokalisation von GLI1 bzw. GLI2 (Anzahl der Zellen in %)

Nukleus

Nukleus und Cytosol

Cytosol

myc-GLI1

Kontrolle

0

38,7 ± 2,3

61,3 ± 2,3

myc-GLI1

Coexpression der B-Box1

0

40,7 ± 3,1

59,3 ± 3,1

myc-GLI1

LiCl

0

32,0 ± 5,3

68, 0 ± 5,3

myc-GLI1

Kontrolle

0

67,7 ± 10,1

32,3 ± 10,1

myc-GLI1

Rapamycin

0

66,7 ± 8,1

33,3 ± 8,1

myc-GLI1

Coexpression von α4

0

62,7 ± 10,2

37,3 ± 10,2

myc-GLI1

Kontrolle

0

49,3 ± 8,3

50,7 ± 8,3

myc-GLI1

Fostriecin

0

42,0 ± 5,3

58,0 ± 5,3

myc-mGLI2

Kontrolle

60,7 ± 1,2

28,0 ± 0

11,3 ± 1,2

myc-mGLI2

Coexpression der B-Box1

60,3 ± 0,6

26,7 ± 3,1

13,0 ± 3,0

myc-mGLI2

LiCl

63,3 ± 6,4

26,7 ± 4,6

10,0 ± 2,0

myc-mGLI2

Kontrolle

59,7 ± 1,5

29,3 ± 1,5

11,0 ± 3,0

myc-mGLI2

Rapamycin

63,0 ± 6,1

28,7 ± 7,0

8,7 ± 3,1

myc-mGLI2

Coexpression von α4

59,0 ± 4,4

33,3 ± 6,8

7,7 ± 2,5

myc-mGLI2

Kontrolle

59,3 ± 1,2

27,7 ± 1,5

13,0 ± 1,7

myc-mGLI2

Fostriecin

59,7 ± 3,2

29,7 ± 3,8

10,7 ± 0,6

5.6  Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 wird durch Phosphorylierung von Fu reguliert

Im Folgenden sollte untersucht werden, wie die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 über PP2A- bzw. GSK3β-Aktivität reguliert werden kann. In Drosophila liegt das GLI3-Homolog Ci in einem Proteinkomplex mit weiteren Proteinen – darunter Fu – vor (siehe Einleitung). In Drosophila wurde auch gezeigt, dass Fu eine Kinase ist, die durch Phosphorylierung aktiviert wird. Das aktivierte Fu phosphoryliert ein weiteres interagierendes Protein, Cos2, woraufhin der Transport der Aktivatorform des Ci in den Zellkern erfolgt (Fukumoto et al., 2001;Nybakken et al., 2002). Um zu überprüfen, ob ein ähnlicher Mechanismus in der Säugetierzelle für die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Lokalisationsänderungen des GLI3-Proteins verantwortlich ist, sollte zunächst überprüft werden, ob das Fu-Protein für den Kerntransport von GLI3 notwendig ist.

5.6.1  „Knockdown“ von Fu

Um den Einfluss des Fu-Proteins auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 zu untersuchen, sollte mittels „Knockdown“ die Menge des endogenen Fu reduziert werden. Nach Kotransfektion der Fu-spezifischen siRNAs bzw. Kontroll-siRNAs mit N-terminal GFP-markiertem GLI3 in HeLa-Zellen wurde die intrazelluläre Lokalisation des GFP-GLI3 mittels Immunfluoreszenz analysiert. Durch „Knockdown“ von Fu änderte sich die intrazelluläre Lokalisation von GFP-GLI3 von 54 ± 6% der Zellen, in denen GFP-GLI3 ausschließlich im Nukleus lokalisiert war auf 43 ± 2% (Abb.6.1.1). Der Anteil der Zellen, in denen GFP-GLI3 ausschließlich im Cytosol vorlag, stieg nach Fu-„Knockdown“ von 6 ± 3% auf 16 ± 5. In den restlichen Zellen war GFP-GLI3 sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert. Die Analyse dieser Lokalisationsänderung mittels T-Test unter Annahme einer Normalverteilung zeigte, dass diese statistisch signifikant war (p=0,026486). Die Effizienz des „Knockdown“ wurde mittels semiquantitativer RT-PCR überprüft (Abb.6.1.2). Dieses Ergebnis zeigt, dass das Fu-Protein für die Kernlokalisation des GLI3 wichtig ist.

↓82

Abb.6.1.1: Kotransfektion von N-terminal markiertem GFP-GLI3 mit Kontroll-siRNAs (weiße Balken) bzw. Fu-spezifischen siRNAs (graue Balken) in HeLa-Zellen. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 Zellen ausgezählt und in eine der drei folgenden Kategorien eingeordnet: a) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Zellkern lokalisiert, b) GFP-GLI3 ist sowohl im Zellkern als auch im Cytosol lokalisiert, c) GFP-GLI3 ist ausschließlich im Cytosol lokalisiert. Die Mittelwerte aus den jeweils drei Ergebnissen sind im Balkendiagramm mit den jeweiligen Standardabweichungen dargestellt. Unter Annahme einer Normalverteilung wurde die Signifikanz des beobachteten Effekts mittels T-Test ermittelt. Das Ergebnis des T-Tests ist in der Abbildung angegeben.

Abb.6.1.2: Semiquantitative RT-PCR. Auf cDNA aus HeLa-Zellen, die mit Kontroll-siRNAs (linke Spur) bzw. mit Fu-spezifischen siRNAs (rechte Spur) transfiziert wurden, wurde eine semiquantitative RT-PCR durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Die obere Bande ist die Kontroll-Bande, die untere die Fu-spezifische.

5.6.2  Die Phosphorylierung von Fu wird durch PP2A und GSK3β reguliert

Nachdem hier gezeigt werden konnte, dass das Fu-Protein Einfluss auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 hat, sollte nun untersucht werden, ob der Phosphorylierungsstatus des Fu-Proteins über die Aktivitäten der Mikrotubulus-assoziierten PP2A und GSK3β gesteuert wird, und ob somit, wie es in Drosophila beschrieben wurde, die Effekte der beiden Enzyme auf die intrazelluläre Lokalisation des GLI3 über eine Phosphorylierungs-abhängige Interaktion mit Fu erklärt werden könnten. Dazu sollte zunächst untersucht werden, ob das Fu-Protein ein Phosphoprotein ist.

5.6.2.1  Fu-Phosphorylierung in-vitro

↓83

Um zu überprüfen, ob Fu ein Phosphoprotein ist, wurde V5-markiertes Fu in HeLa-Zellen exprimiert. Jeweils 100µg Proteinextrakt dieser Zellen wurden mit aufgereinigter λ-Phosphatase bzw. ohne Zugabe der λ-Phosphatase inkubiert. Anschließend wurden diese Proteinextrakte auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot (siehe Methoden) analysiert. In nicht behandelten Kontrollzellen wurden auf dem Westernblot mit einem V5-Antikörper zwei Banden (150kDa und 145kDa) detektiert. Dies zeigt, dass in den analysierten Zellen zwei Isoformen des Fu-Proteins vorliegen. Nach Behandlung mit λ-Phosphatase konnte keine der beiden Fu-Isoformen mehr auf dem Westernblot nachgewiesen werden (Abb.6.2.1.1). Dies deutet darauf hin, dass beide Fu-Isoformen phosphoryliert sind.

Anschließend wurde Fu in HeLa-Zellen exprimiert und mittels Immunpräzipitation (siehe Methoden) mit V5-Antikörpern aufgereinigt. Die Immunpräzipitate wurden mit bzw. ohne Zugabe der gereinigten katalytischen Untereinheit von PP2A inkubiert und anschließend auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot analysiert. Wie auch bei der Behandlung mit λ-Phosphatase wurden im Kontrollansatz zwei Isoformen des Fu-Proteins nachgewiesen (150kDa und 145kDa), die nach PP2A-Behandlung nicht mehr nachweisbar waren (Abb.6.2.1.1).

Abb.6.2.1.1: Analyse von Zelllysaten Fu-V5 exprimierender HeLa-Zellen mittels Westernblot. Links: Jeweils 100µg Protein wurden mit (rechte Spur) bzw. ohne (linke Spur) Zugabe von λ-Phosphatase inkubiert und anschließend auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Fu-V5 wurde mittels anti-V5-Antikörper detektiert (oben). Das Auftragen gleicher Proteinmengen wurde mittels Tubulin-Antikörper nachgewiesen (unten). Rechts: Immunpräzipitate wurden mit (rechte Spur) bzw. ohne (linke Spur) Zugabe von PP2Ac inkubiert. Fu-V5 wurde mittels anti-V5-Antikörper detektiert.

5.6.2.2 Fu-Phosphorylierung in-vivo

↓84

In einem weiteren Experiment sollte die Phosphorylierung von Fu in-vivo untersucht werden. Hierzu wurde V5-markiertes Fu in HeLa-Zellen exprimiert bzw. mit der B-Box1 des MID1-Proteins koexprimiert. Diese Zellen wurden einer Orthophosphat-Markierung unterzogen (siehe Methoden). Aus den radioaktiv markierten Zelllysaten wurde Fu-V5 mittels Immunpräzipitation aufgereinigt. Die Immunpräzipitate wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt, das anschließend zur Belichtung eines Films benutzt wurde. Auf dem Film wurden Banden in Höhe der beiden Fu-Isoformen (150kDa / 145kDa) detektiert, was – übereinstimmend mit den Ergebnissen in Kapitel 6.2.1 – auf die Phosphorylierung beider Isoformen hinweist (Abb.6.2.2.1.). Interessanterweise verschwanden die Banden der beiden Fu-Isoformen nach Koexpression der B-Box1, was darauf hindeutet, dass die Phosphorylierung von Fu von der Aktivität endogener PP2A abhängig ist.

Abb.6.2.2.1: Orthophosphat-Markierung von Immunpräzipitaten Fu-V5 exprimierender (linke Spur) bzw. Fu-V5 und B-Box1-myc koexprimierender (rechte Spur) HeLa-Zellen. Die Pfeile zeigen auf die zu der 150kDa- bzw. 145kDa-Isoform korrespondierenden Banden von Fu.

5.6.2.3 Abhängigkeit der Fu-Phosphorylierung von endogener PP2A-Aktivität

Nachdem in Abschnitt 6.2.2 erste Hinweise darauf gefunden wurden, dass die Phosphorylierung von Fu über die Aktivität endogener PP2A reguliert werden könnte, sollten weitere Experimente durchgeführt werden, um dies zu verifizieren. Dazu wurde V5-markiertes Fu in HeLa-Zellen unter Koexpression von α4 bzw. der B-Box1 exprimiert. Nach dem Modell von (Trockenbacher et al., 2001) wird durch Koexpression von α4 die Mikrotubulus-assoziierte PP2A schneller abgebaut, während die Koexpression der B-Box1 den Abbau des Enzyms blockiert. Durch Koexpression von α4 kann demnach die Aktivität der endogenen PP2A reduziert werden, während deren Aktivität durch Koexpression der B-Box1 erhöht werden kann. Lysate von Zellen, die V5-markiertes Fu unter Koexpression von α4 bzw. der B-Box1 exprimieren, wurden auf einem Westernblot mit anti-V5-Antikörpern untersucht (Abb.6.2.3.1). Die Quantifizierung der auf dem Westernblot detektierten Banden ergab eine deutliche Anreicherung der 145kDa-Isoform im Verhältnis zur 150kDa-Isoform nach Koexpression der B-Box1 (Verhältnis 150kDa Isoform / 145kDa Isoform = 3,42 in Kontrollzellen im Gegensatz zu 1,64 nach Koexpression der B-Box1) (Abb.6.2.3.2). Dies deutet auf eine gesteigerte Dephosphorylierung der 150kDa-Isoform von Fu nach Koexpression der B-Box1 hin. Im Gegensatz dazu, erhöhte sich der Anteil der 150kDa-Isoform von Fu im Verhältnis zur 145-kDa-Isoform nach Koexpression von α4 (Verhältnis 150kDa Isoform / 145kDa Isoform = 3,42 in Kontrollzellen im Gegensatz zu 5,44 nach Koexpression von α4) (Abb.6.2.3.1-6.2.3.2). Auch dies deutet darauf hin, dass der Fu-Phosphorylierungsstatus von der Aktivität Mikrotubulus-assoziierter PP2A abhängig ist.

↓85

Abb.6.2.3.1: Westernblot-Analyse von Proteinextrakten von HeLa-Zellen, die Fu-V5 (linke Spur), Fu-V5 und die B-Box1 (mittlere Spur) oder Fu-V5 und α4 (rechte Spur) exprimieren. Jeweils 100µg Protein wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Die Detektion erfolgte mit einem anti-V5-Antikörper. Die Banden, die zur 150kDa-Isoform bzw. zur 145kDa-Isoform von Fu-V5 korrespondieren, sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Abb.6.2.3.2: Quantifizierung der Banden aus 6.2.3.1 mittels ImageQuant5.1. Die Fläche unter den Peaks korrespondiert jeweils zur Intensität der Banden auf dem Westernblot. Die Integrale der jeweiligen Flächen unter den Peaks sind in der Abbildung angegeben.

Um diese Ergebnisse weiter zu verifizieren, wurde in HeLa-Zellen V5-markiertes Fu exprimiert und gleichzeitig die endogene Menge von α4 mittels RNAi reduziert. Jeweils 100µg der Proteinextrakte dieser Zellen wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot (siehe Methoden) mit einem anti-V5-Antikörper analysiert (Abb.6.2.3.3) und die resultierenden Banden mittels ImageQuant5.1 quantifiziert (Abb.7.2.3.4). Nach α4-„Knockdown“ ergab sich eine deutliche Anreicherung der 145kDa-Isoform im Verhältnis zur 150kDa-Isoform (Verhältnis 150kDa Isoform / 145kDa Isoform = 3,82 in Kontrollzellen im Gegensatz zu 2,76 nach α4-„Knockdown“). Die Effizienz des „Knockdowns“ wurde auf einem Westernblot mittels Detektion mit einem anti-α4-Antikörper kontrolliert (Abb.6.2.3.5).

↓86

Abb.6.2.3.3: Westernblot-Analyse von Proteinextrakten von HeLa-Zellen, die mit Fu-V5 und Kontroll-siRNAs (linke Spur) oder mit Fu-V5 und α4-spezifischen siRNAs (rechte Spur) kotransfiziert sind. Jeweils 100µg Protein wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Die Detektion erfolgte mit einem anti-V5-Antikörper. Die Banden, die zur 150kDa-Isoform bzw. zur 145kDa-Isoform von Fu-V5 korrespondieren, sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Abb.6.2.3.4: Quantifizierung der Banden aus 6.2.3.3 mittels ImageQuant5.1. Die Fläche unter den Peaks korrespondiert jeweils zur Intensität der Banden auf dem Westernblot. Die Integrale der jeweiligen Flächen unter den Peaks sind in der Abbildung angegeben.

Abb.6.2.3.5: Westernblot-Analyse von denselben Proteinextrakten wie in Abb.6.2.3.4. Jeweils 50µg Proteinextrakt wurden auf einem 10%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Die Effizienz des α4-„Knockdowns“ wurde durch Detektion mit anti-α4 (oben) gezeigt. Als Ladekontrolle wurde der Blot mit einem anti-Aktin-Antikörper (unten) detektiert.

5.6.2.4  Abhängigkeit der Fu-Phosphorylierung von GSK3β

↓87

Nachdem gezeigt wurde, dass die PP2A-abhängige Regulation der intrazellulären Lokalisation von GLI3 mit einer Veränderung des Phosphorylierungsstatus von Fu einhergeht, sollte nun gezeigt werden, ob auch die von GSK3β-Aktivität abhängige Regulation der intrazellulären Lokalisation von GLI3 mit einer Fu-Phosphorylierung verbunden ist. Um zu überprüfen, ob die Kinase, die der PP2A-abhängigen Dephosphorylierung von Fu entgegenwirkt, GSK3β ist, wurde V5-markiertes Fu in HeLa-Zellen überexprimiert, die entweder mit Kontroll-siRNA oder mit GSK3β-spezifischer siRNA kotransfiziert wurden. Lysate dieser Zellen wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot mit anti-V5-Antikörpern analysiert (Abb.6.2.4.1). Die Quantifizierung der auf dem Westernblot detektierten Banden ergab eine deutliche Anreicherung der 145kDa-Isoform im Verhältnis zur 150kDa-Isoform nach GSK3β-„Knockdown“ (Verhältnis 150kDa Isoform / 145kDa Isoform = 5,70 in Kontrollzellen im Gegensatz zu 2,68 nach GSK3β-„Knockdown“) (Abb.6.2.4.2). Dies deutet auf eine gesteigerte Dephosphorylierung der 150kDa-Isoform von Fu nach GSK3β-„Knockdown“ hin. Hiermit wurde bestätigt, dass die GSK3β-abhängige Änderung der intrazellulären Lokalisation von GLI3 mit einer GSK3β-abhängigen Phosphorylierung des Fu-Protein einhergeht.

GSK3β spielt neben der hier neu identifizierten Kinase-Funktion auf Fu eine wichtige Rolle im Wnt-Signaltransduktionsweg. Um zu untersuchen, ob die hier gezeigten GSK3β-spezifischen Effekte über den Wnt-Signaltransduktionsweg reguliert werden, wurde in einem weiteren Experiment ein β-catenin-„Knockdown“ durchgeführt. β-catenin ist das zentrale Molekül der Wnt-Signaltransduktionskaskade. Hierfür wurde V5-markiertes Fu in HeLa-Zellen überexprimiert, die entweder mit Kontroll-siRNA oder mit β-catenin-spezifischer siRNA kotransfiziert wurden. Lysate dieser Zellen wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot mit anti-V5-Antikörpern analysiert (Abb.6.2.4.1). Die Quantifizierung der auf dem Westernblot detektierten Banden zeigte, dass der β-catenin-„Knockdown“ keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von Fu hat (Verhältnis 150kDa Isoform / 145kDa Isoform = 5,70 in Kontrollzellen und 5,63 nach β-catenin-„Knockdown“) (Abb.6.2.4.2). Dies zeigt, dass die in dieser Arbeit identifizierte Phosphorylierung von Fu über GSK3β eine von der Wnt-Signaltransduktionskaskade unabhängige, neue Funktion des Enzyms darstellt.

Abb.6.2.4.1: Westernblot-Analyse von Proteinextrakten von HeLa-Zellen, die Fu-V5 exprimieren und mit Kontroll-siRNA (linke Spur), β-catenin-siRNA (mittlere Spur) oder GSK3β-siRNA (rechte Spur) kotransfiziert sind. Jeweils 50µg Protein wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Die Detektion erfolgte mit einem anti-V5-Antikörper. Die Banden, die zur 150kDa-Isoform bzw. zur 145kDa-Isoform von Fu-V5 korrespondieren, sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

↓88

Abb.6.2.4.2: Quantifizierung der Banden aus 6.2.4.1 mittels ImageQuant5.1. Die Fläche unter den Peaks korrespondiert jeweils zur Intensität der Banden auf dem Westernblot. Die Integrale der jeweiligen Flächen unter den Peaks sind in der Abbildung angegeben.

5.6.3  Phosphospezifische Modifikation von GLI3

Nachdem hier gezeigt werden konnte, dass die Veränderung der intrazellulären Lokalisation von GLI3 über die Mikrotubulus-assoziierte PP2A bzw. GSK3β mit einer Veränderung des Phosphorylierungsstatus von Fu einhergeht, sollte nun untersucht werden, ob es, wie in Drosophila beschrieben, eine Interaktion zwischen Fu und GLI3 abhängig vom Phosphorylierungsstatus des Fu gibt. Dazu sollte zunächst untersucht werden, ob das GLI3 selbst ein Phosphoprotein ist, und ob es mit Fu interagieren kann.

5.6.3.1  GLI3-Phosphorylierung in-vitro

N-terminal bzw. C-terminal GFP-markiertes GLI3 wurde in HeLa-Zellen exprimiert. Nach dem Zellaufschluss wurden Kern- und Cytosol-Fraktionen voneinander getrennt (siehe Methoden). Die Fraktionen wurden mit aufgereinigter λ-Phosphatase bzw. der katalytischen Untereinheit von PP2A (PP2Ac) inkubiert und anschließend auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot analysiert (siehe Methoden). Die isolierte katalytische Untereinheit der PP2A dephosphoryliert in-vitro alle Serin- und Threonin-Phosphorylierungen, während λ-Phosphatase sowohl Serin- und Threonin-Phosphorylierungen als auch Tyrosin-Phosphorylierungen dephosphoryliert. Die Blots wurden mit einem anti-GFP-Antikörper inkubiert. Die GFP-GLI3-spezifischen Banden der nicht behandelten Kernfraktionen scheinen ein minimal anderes Laufverhalten im SDS-Gel zu haben als die Banden der PP2Ac bzw. λ-Phosphatase behandelten Kernfraktionen (Abb.6.3.1.1). Bei den Cytosol-Fraktionen ist kein Unterschied im Laufverhalten im SDS-Gel zwischen den Kontrollen und den Phosphatase-behandelten Ansätzen zu sehen. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass das im Zellkern vorliegende GFP-GLI3 phosphoryliert ist, nicht jedoch das cytosolische.

↓89

Abb.6.3.1.1: Westernblotanalyse von Kern-(oben) bzw. Cytosol-Fraktionen (unten) aus HeLa-Zellen, die entweder C-terminal (links) oder N-termial (rechts) GFP-fusioniertes GLI3 exprimieren. Die einzelnen Fraktionen wurden mit bzw. ohne (jeweils linke Spur) Zusatz von λ-Phosphatase (jeweils mittlere Spur) oder PP2Ac (jeweils rechte Spur) inkubiert und auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Die Detektion erfolgte mit einem anti-GFP-Antikörper.

Da diese Änderungen im Laufverhalten im SDS-Gel jedoch sehr klein und demnach schwer zu interpretieren sind, sollte im Folgenden mit Hilfe von GLI3-Deletionskonstrukten, die Region des GLI3 näher eingegrenzt werden, die für die Regulation der GLI3-Lokalisation über die Aktivitäten von PP2A und GSK3β wichtig ist. Anschließend sollte der Phosphorylierungsstatus der entsprechenden Proteindomäne untersucht werden.

5.6.3.2  Identifizierung eines kürzeren GLI3-Fragments, dessen Lokalisation über PP2A bzw. GSK3β reguliert wird.

10 verschiedene GFP-markierte GLI3-Deletionsfragmente wurden in HeLa-Zellen überexprimiert und auf ihre intrazelluläre Lokalisation hin untersucht. Exemplarisch sollten mit Hilfe einer LiCl-Behandlung mögliche Effekte von GSK3β-Aktivität auf die Lokalisation der entsprechenden GLI3-Deletionskonstrukte analysiert werden.

Die durch GSK3β beeinflusste Domäne liegt im C-Terminus des GLI3-Proteins

↓90

Die N- bzw. C-terminal GFP-markierten GLI3-Deletionskonstruke wurden in HeLa-Zellen überexprimiert. Die intrazelluläre Lokalisation der GFP-Fusionsproteine mit bzw. ohne Zugabe von LiCl – einem GSK3β-Inhibitor - wurde mittels Immunfluoreszenz analysiert. In drei unabhängigen Experimenten wurden jeweils 100 GFP-positive Zellen ausgezählt und in die drei Kategorien: a) GFP-Signal ausschließlich im Nukleus, b) GFP-Signal im Nukleus und im Cytosol und c) GFP-Signal ausschließlich im Cytosol eingeteilt. Die Mittelwerte der Auszählungen sind unter Angabe der Standardabweichung in Tab.6.3.2.1.1 dargestellt. Nur mit den Deletionskonstrukten, die die Aminosäuren 586-1549 bzw. 18-1100 umfassen, konnte eine statistisch signifikante Änderung der intrazellulären Lokalisation nach der LiCl-Behandlung erreicht werden. Für die folgenden Phosphorylierungsstudien wurden deshalb diese Konstrukte eingesetzt.

Tab.6.3.2.1.1: Intrazelluläre Lokalisation der verschiedenen GLI3-Deletionskonstrukte. Die Konstrukte sind unter der Angabe der enthaltenen Aminosäuren (AA) von GLI3 aufgeführt.

Exprimiertes Konstrukt

Behandlung

Intrazelluläre Lokalisation (Anzahl der Zellen in %)

T-Test

p=

Nukleus

Nukleus und Cytosol

Cytosol

 

GFP-GLI3 AA18-369

Kontrolle

0

76 ± 7

24 ± 7

-

GFP-GLI3 AA18-369

LiCl

0

69 ± 11

31 ± 11

GFP-GLI3 AA18-667

Kontrolle

77 ± 4

19 ± 5

5 ± 2

0,584815

GFP-GLI3 AA18-649

LiCl

74 ± 8

23 ± 7

3 ± 1

GFP-GLI3 AA18-828

Kontrolle

62 ± 11

31 ± 10

7 ± 3

0,772373

GFP-GLI3 AA18-828

LiCl

60 ± 10

35 ± 7

6 ± 4

GFP-GLI3 AA18-1100

Kontrolle

62 ± 3

32 ± 2

7 ± 2

0,007633

GFP-GLI3 AA18-1100

LiCl

52 ± 1

42 ± 2

6 ± 2

GFP-GLI3 AA586-1549

Kontrolle

17 ± 3

77 ± 2

6 ± 3

0,001353

GFP-GLI3 AA586-1549

LiCl

2 ± 1

73 ± 6

25 ± 5

GLI3-GFP AA1-369

Kontrolle

0

100

0

-

GLI3-GFP AA1-369

LiCl

0

100

0

GLI3-GFP AA1-667

Kontrolle

77 ± 3

18 ± 3

5 ± 2

0,917386

GLI3-GFP AA1-649

LiCl

77 ± 5

19 ± 5

4 ± 1

GLI3-GFP AA1-828

Kontrolle

75 ± 5

19 ± 2

5 ± 4

0,367856

GLI3-GFP AA1-828

LiCl

71 ± 5

16 ± 12

6 ± 4

GLI3-GFP AA1-1100

Kontrolle

71 ± 8

19 ± 2

5 ± 4

0,093904

GLI3-GFP AA1-1100

LiCl

61 ± 2

35 ± 2

4 ± 1

GLI3-GFP AA824-1100

Kontrolle

0

100

0

-

GLI3-GFP AA824-1100

LiCl

0

100

0

Phosphorylierungsstatus der GLI3-Fragmente (Aminosäure 586-1549 bzw. 18-1100)

Um zu überprüfen, ob die GLI3-Konstrukte AA586-1549 bzw. AA18-1100 phosphoryliert werden, wurden sie zunächst in HeLa-Zellen überexprimiert. Nach dem Zellaufschluss wurden die Zellen einer Zellfraktionierung, bei der die Kern- und Cytosol-Fraktionen voneinander getrennt wurden, unterzogen. Jeweils 50µg Protein der Fraktionen wurden in-vitro mit λ-Phosphatase inkubiert, welche alle Serin-, Threonin- und Tyrosinreste dephosphoryliert. Nach dieser Behandlung wurden die Ansätze auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot mit einem anti-GFP-Antikörper analysiert. Nach der Phosphatase-Behandlung war in der Kern-Fraktion der Zellen, die das GLI3-Konstrukt AA585-1549 exprimierten, kein GFP-GLI3-Fragment mehr detektierbar, während die Behandlung in der Cytosol-Fraktion keine Veränderung verursachte (Abb.6.3.2.3.1). Dies deutet darauf hin, dass dieses GFP-GLI3-Fragment in der Kern-Fraktion phosphoryliert vorliegt. Im dephosphorylierten Zustand wird es scheinbar instabil und abgebaut. Dieses Ergebnis bestätigt die in 6.3.1 vermutete Phosphorylierung des nukleären, nicht aber des cytosolischen GLI3-Proteins. Nach der Phosphatase-Behandlung der Kern- und Cytosol-Fraktionen der Zellen, die das GLI3-Konstrukt AA18-1100 exprimierten, wurde keine Veränderung beobachtet (Abb.6.3.2.3.1). Entweder ist dieses Fragment nicht phosphoryliert, oder die Dephosphorylierung führt nicht zu einer instabilen Form, wie es bei dem Fragment AA586-1549 der Fall ist. Der Erfolg der Zellfraktionierung wurde durch Inkubation derselben Blots mit einem anti-Lamin A/C-Antikörper gezeigt.

↓91

Abb.6.3.2.3.1: In-vitro-Phosphatase-Behandlung von Kern- (jeweils linke drei Spuren) und Cytosol-Fraktionen (jeweils rechte drei Spuren) GFP-GLI3-AA586-1549 (oben) bzw. GFP-GLI3-AA-18-1100 (unten) überexprimierender HeLa-Zellen. Die nicht behandelten (jeweils linke Spur), λ-Phosphatase-behandelten (jeweils mittlere Spur) bzw. PP2Ac-behandelten (jeweils rechte Spur) Proben wurden auf 6%igen SDS-Gelen aufgetrennt und geblottet. Die Blots wurden mit einem GFP-Antikörper inkubiert (jeweils obere Reihe). Der Erfolg der Zellfraktionierung wurde durch Inkubation der Blots mit einem anti-Lamin A/C-Antikörpern überprüft (jeweils untere Reihe).

5.6.4  Interaktion von Fu mit den GLI3-Fragmenten Aminosäure 586-1549 und Aminosäure 18-1100

Nachdem hier gezeigt werden konnte, dass die intrazelluläre Lokalisation von GLI3, sowie der Phosphorylierungsstatus von Fu über die Aktivitäten von Mikrotubulus-assoziierter PP2A und GSK3β reguliert werden, sollte nun untersucht werden, ob eine Interaktion zwischen Fu und dem cytosolischen, nicht phosphorylierten GLI3 – abhängig vom Phosphorylierungsstatus des Fu - stattfindet. Hierzu sollte eine Ko-Immunpräzipitation durchgeführt werden. Dazu wurden V5-markiertes Fu und das GFP-markierte GLI3-Fragment AA586-1549 bzw. das GLI3-Fragment AA18-1100 in HeLa-Zellen koexprimiert. In einem zweiten Ansatz wurde zur Ko-Expression eine Fu-Mutante, bei der durch eine Mutation (G13V) eine in-silico vorhergesagte Kinase-Domäne inaktiviert wurde, eingesetzt. Sollte – wie in Drosophila beschrieben – eine Kinase-Aktivität des Fu für die Interaktion mit GLI3 notwendig sein, so könnte die Ko-Immunpräzipitation von GLI3 und Fu durch eine Inaktivierung der Fu-Kinase erleichtert werden: Interaktionen mit Kinasen sind oft von kurzer Dauer. Wenn das entsprechende Zielprotein phosphoryliert ist, dissoziiert es von der Kinase. Durch das Inaktivieren der Kinase kann das Zielprotein nicht phosphoryliert werden und die Dissoziation wird verhindert, was eine Ko-Immunpräzipitation erleichtert. Nach der Koexpression der Konstrukte in HeLa-Zellen wurden mittels Zellfraktionierung die Zellkerne abgetrennt (siehe Methoden). Die Cytosol-Fraktionen der Zellen wurden zur Ko-Immunpräzipitation (siehe Methoden) einerseits mit einem V5-Antikörper und andererseits mit einem GFP-Antikörper versetzt. Als Negativkontrolle wurde eine Ko-Immunpräzipitation mit Maus-IgG’s durchgeführt. Die Immunpräzipitate wurden anschließend auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und auf einem Westernblot analysiert. Der Blot wurde sowohl mit V5- als auch mit GFP-Antikörpern detektiert. Dabei wird deutlich, dass das GLI3-Fragment AA586-1549 mit Fu ko-immunpräzipitiert, wobei die Ko-Immunpräzipitation mit der Fu-Mutante eine deutlich stärkere Anreicherung des GLI3-Fragments im Vergleich zur Negativ-Kontrolle zeigt als das Wildtyp-Fu (Abb.6.4.1). Die Präzipitation des GLI3-Fragments AA586-1549 mit anti-GFP-Antikörpern zeigt, dass im Vergleich zur Negativ-Kontrolle vor allem die 150kDa-Isoform der Fu-Mutante in der Ko-Immunpräzipitation angereichert wird. Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit dem GLI3-Fragment AA18-1100 erzielt (Abb.6.4.1). Diese Ergebnisse deuten auf eine Interaktion zwischen dem GLI3-Protein und dem hyperphosphorylierten Fu (150kDa-Isoform) hin, die von der Kinase-Aktivität des Fu abhängig ist. Diesen Ergebnissen nach führt die Interaktion des cytosolischen, nicht phosphorylierten GLI3 mit der phosphorylierten Form des Fu zur Akkumulation des phosphorylierten GLI3 im Zellkern. Durch Inaktivierung der Kinase-Domäne wird die Interaktion zwischen Fu und GLI3 noch verstärkt, was darauf hindeutet, dass Fu eine Kinase-Aktivität auf GLI3 ausübt, durch die dessen Akkumulation im Zellkern eingeleitet wird. An dieser Stelle sollten weitere Analysen, die eine direkte Phosphorylierung des GLI3 durch die phosphorylierte Form des Fu zeigen, durchgeführt werden.

↓92

Abb.6.4.1: Ko-Immunpräzipitationen von Fu-wt bzw. einer Fu-Mutante (Fu-G13V) mit den GFP-GLI3-Konstrukten AA586-1549 (oben) und AA18-1100 (unten). Mit Zelllysaten Fu (wt bzw. G13V) und GLI3 (AA586-1549 bzw. 18-1100) koexprimierender HeLa-Zellen wurden Immunpräzipitationen mit einem anti-GFP-Antikörper (bindet GLI3-Konstrukte), mit einem anti-V5-Antikörper (bindet Fu-Konstrukte) bzw. mit Maus-IgG’s (Negativkontrolle) durchgeführt. Die Immunpräzipitate wurden auf 6%igen SDS-Gelen aufgetrennt und geblottet. Die Blots wurden sowohl mit einem GFP-Antikörper (detektiert GLI3-Konstrukte) als auch mit einem V5-Antikörper (detektiert Fu-Konstrukte) inkubiert. Die jeweils resultierenden Fu- bzw.-GLI3-spezifischen Banden sind mit Pfeilen markiert.

5.7  Wird die transkriptionelle Aktivität von endogenem GLI3 durch Inhibierung von GSK3β bzw. Induktion von PP2A beeinflusst?

In den bisherigen Ergebnissen wurde die intrazelluläre Lokalisation und die Phosphorylierung von überexprimiertem GLI3 bzw. Fu untersucht. Nun sollte gezeigt werden, ob die transkriptionelle Aktivität von endogenem GLI3 durch seine intrazelluläre Lokalisation und somit über die Aktivität Mikrotubulus-assoziierter PP2A bzw. GSK3β reguliert wird. Hierfür wurde die Expression des SHH-Zielgens PTCH1 in HeLa-Zellen nach Behandlung mit LiCl, einem GSK3β-Inhibitor, mittels semiquantitativer RT-PCR untersucht. Bei der semiquantitativen RT-PCR wird das jeweils erwünschte genspezifische PCR-Produkt in einem Reaktionsgefäß mit einer internen Kontrolle (hier: 18S rRNA) amplifiziert. Hierdurch wird eine spätere Quantifizierung der PCR-Produkte ermöglicht. Dazu wurden in drei unabhängigen Ansätzen HeLa-Zellen 4 Stunden lang mit bzw. ohne LiCl-Zugabe inkubiert. Anschließend wurde aus diesen Zellen RNA isoliert (siehe Methoden) und eine cDNA-Synthese (siehe Methoden) durchgeführt. Auf der cDNA dieser Zellen wurde dann eine semiquantitative RT-PCR (siehe Methoden) mit PTCH1-spezifischen Primern und Kontroll-Primern, die die 18S rRNA amplifizieren (Ambion), durchgeführt. Die hier erzielten PCR-Produkte wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt. Das Photo des Gels ist in Abb.7.1 gezeigt. Die jeweils oberen Banden sind die genspezifischen, die unteren die Kontroll-Banden. Nach der LiCl-Behandlung verringerte sich die Transkriptmenge des SHH-Zielgens PTCH1 deutlich. Dies deutet darauf hin, dass die Aktivatorform des endogenen GLI3 –wie das oben analysierte überexprimierte GFP-GLI3 -nach LiCl-Behandlung nur noch in geringem Ausmaß in den Zellkern gelangen kann, und somit die Aktivierung des Zielgens PTCH1 nach dieser Behandlung zurück geht.

Abb.7.1: Semiquantitative RT-PCR. Auf cDNA aus HeLa-Zellen, die mit bzw. ohne Zugabe von LiCl inkubiert wurden, wurde eine semiquantitative RT-PCR durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf einem Agarose-Gel aufgetrennt (oben). Die obere Bande ist die PTCH1-spezifische, die untere die Kontroll-Bande. Nach der Quantifizierung der Banden wurde die relative PTCH1-Expression (in % von der Kontrollbande) im Balkendiagramm dargestellt (unten).

5.8  Herstellung eines anti-GLI3-Antikörpers

↓93

Im Vorangegangenen wurde die intrazelluläre Lokalisation und der Phosphorylierungsstatus von überexprimiertem, GFP-markiertem GLI3 untersucht und gezeigt, dass sowohl die intrazelluläre Lokalisation, als auch die transkriptionelle Aktivität von GLI3 über die gegenläufigen Aktivitäten von GSK3β und PP2A reguliert wird. Um analoge Experimente auch an endogenem GLI3 durchzuführen, benötigt man einen Antikörper, der endogenes GLI3 detektiert.

Um einen solchen Antikörper herzustellen, wurde zunächst ein GLI3-Peptid ausgewählt, das eine geringe Homologie zu GLI1 und GLI2 aufweist. Dieses Peptid umfasste die Aminosäuren 1-121 von GLI3. Die für diese Region kodierende cDNA wurde in den pET32a-Vektor kloniert. Das resultierende Plasmid wurde in E.coli-Zellen transformiert und zur Expression des gewünschten Peptids benutzt. Das so in E.coli exprimierte Peptid, das mit einem Hexa-HIS-Epitop fusioniert ist, wurde mit Hilfe des QIAexpressionist-Kits (Qiagen) über eine Nickel-Agarose-Säule aufgereinigt. Das aufgereinigte Peptid wurde zur Immunisierung eines Kaninchens benutzt und das Serum einer Affinitätsreinigung (siehe Methoden) unterzogen. Die Fraktionen der Affinitätsreinigung wurden zunächst auf einem Dotblot, auf dem das gereinigte Peptid aufgetragen wurde, getestet. Die Fraktionen I.1-II.2 und IV1-V1 zeigten positive Signale (Abb.8.1). Diese Fraktionen wurden für weitere Tests des Antikörpers eingesetzt: Nach Überexpression von GFP-GLI3 in HeLa-Zellen wurden jeweils 100µg der Proteinextrakte dieser Zellen auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot (siehe Methoden) mit den jeweiligen Fraktionen des affinitätsgereinigten Antikörpers analysiert (Abb.8.2). Um zu überprüfen, ob GFP-GLI3 auf den jeweiligen Westernblots detektierbar war, wurden dieselben Blots mit GFP-Antikörpern inkubiert (Abb.8.3). Die Fraktionen IV.3-IV.5 detektierten eindeutig das überexprimierte GFP-GLI3. Da außer der GFP-GLI3-Bande keine weitere Bande mit dem anti-GLI3-Antikörper detektiert werden konnte, scheint mit diesem Antikörper in HeLa-Zellen nur überexprimiertes, nicht aber das endogene GLI3 detektierbar zu sein. Möglicherweise ist die Menge an endogenem GLI3-Protein in HeLa-Zellen zu gering, um mittels Westernblot mit diesem Antikörper nachgewiesen zu werden.

Abb.8.1: Auf 26 Dotblots wurde aufgereinigtes GLI3-Peptid (Aminosäure 1-121) aufgetropft. Die Blots wurde mit den Fraktionen aus der Affinitätsreinigung des GLI3-Antikörpers detektiert. Die Nummern der jeweiligen Fraktionen sind in der Abbildung angegeben.

↓94

Abb.8.2: Westernblots von Proteinextrakten GFP-GLI3 überexprimierender (jeweils linke Spur) bzw. nicht transfizierter Zellen (jeweils rechte Spur). Jeweils 100µg Protein wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und geblottet. Die Blots wurden mit verschiedenen Fraktionen des affinitätsgereinigten anti-GLI3-Antikörpers inkubiert. Die Nummer der jeweiligen Fraktion ist angegeben. Die spezifischen GLI3-Banden sind mit Pfeilen markiert.

Abb.8.3: Detektion der Blots aus Abb.8.2 mit einem anti-GFP-Antikörper. Die Pfeile zeigen die GFP-GLI3-Bande.

Um zu überprüfen, ob der hier hergestellte GLI3-Antikörper endogenes GLI3 detektieren kann, wurden Kern- bzw. Cytosolfraktionen aus den Extremitäten-Anlagen von Mäuse-Embryonen (E11,5) mittels Westernblot (siehe Methoden) analysiert. Dieses Gewebe wurde ausgewählt, da bereits bekannt war, dass GLI3 in diesem Stadium in den Extremitäten-Anlagen hoch exprimiert wird. Jeweils 100µg Protein wurden auf einem 6%igen SDS-Gel aufgetrennt und mittels Westernblot analysiert. Mit dem GLI3-Antikörper aus der Fraktion IV.3 konnten in der Kernfraktion eine 170kDa-Bande detektiert werden, die dem ungespaltenen GLI3-Protein entspricht und eine 75kDa-Bande, die der gespaltenen Repressorform von GLI3 entspricht. Beide Banden konnten durch Präinkubation des Antikörpers mit dem GLI3-Peptid (Aminosäure 1-121) geblockt werden (Abb.8.4). In der Cytosolfraktion konnten 3 Banden (170kDa, 100kDa, 75kDa) detektiert werden, die auch durch Präinkubation des Antikörpers mit dem GLI3-Peptid (Aminosäure 1-121) geblockt werden konnten, was die Spezifität der detektierten Banden beweist. Dies zeigt, dass hier ein GLI3-spezifischer Antikörper hergestellt wurde, der endogenes GLI3 detektieren kann. Da in diesen Extremitäten-Anlagen von Mäuse-Embryonen (E11,5) - nicht aber in HeLa-Zellen - endogenes GLI3 detektierbar war, wäre es für weitere Experimente nötig, eine Zelllinie auszuwählen, in der eine ausreichende Menge an GLI3-Protein synthetisiert wird.

↓95

Abb.8.4: Westernblot-Analyse von Kern- (jeweils linke Spur) bzw. Cytosolfraktionen (jeweils rechte Spur) aus Extremitäten-Anlagen von Mäuse-Embryonen (E11,5). Links: Der Blot wurde mit anti-GLI3-Antikörpern [Fraktion IV.3 aus der Affinitätsreinigung (Abb.8.1-8.2)] inkubiert. Rechts: Der Blot wurde mit anti-GLI3-Antikörper (Fraktion IV.3) nach Präinkubation des Antikörpers mit dem GLI3-Peptid (Aminosäure 1-121) zum Blocken der GLI3-spezifischen Banden inkubiert.


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HTML-Version erstellt am:
17.08.2007