6 DISKUSSION

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In der vorliegenden Arbeit wurde nach Zielproteinen der Mikrotubulus-assoziierten PP2A gesucht. Anhand überlappender Phänotypen von Patienten mit OS, bei denen die Aktivität der Mikrotubulus-assoziierten PP2A aufgrund von Mutationen im MID1-Protein missreguliert ist, und Patienten mit Mutationen in Bestandteilen der SHH-Signaltransduktionskaskade, wurde der Transkriptionsfaktor GLI3 als Kandidat für eine mögliche Interaktion mit der Mikrotubulus-assoziierten PP2A untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Lokalisation des Transkriptionsfaktors GLI3 über die gegensätzlichen Aktivitäten von GSK3β und der Mikrotubulus-assoziierten PP2A reguliert wird. Die Lokalisationsänderung von GLI3 geht dabei mit einer Veränderung des Phosphorylierungsstatus von Fu – einem cytosolischen Interaktionspartner von GLI3 – einher.

6.1  Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 hängt von der Integrität der Mikrotubuli ab

Während in Drosophila eine Mikrotubulus-Assoziation des Proteinkomplexes, bestehend aus Ci, Fu, SuFu und Cos2, bereits beschrieben wurde [zusammengefasst in (Murone et al., 1999)], gab es bislang noch keinen Beweis für eine Mikrotubulus-Assoziation der homologen Proteine im Säugetierorganismus. In dieser Arbeit konnte eine partielle, transiente Assoziation von GLI3 an Mikrotubuli sowie eine partielle, transiente Kolokalisation von GLI3 und dem Mikrotubulus-assoziierten MID1-Protein in HeLa-Zellen gezeigt werden. Dies deutet - wenigstens teilweise - auf eine Analogie zu den in Drosophila gezeigten Mechanismen hin.

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In Bezug auf die intrazelluläre Lokalisation der 3 GLI-Proteine werden in der Literatur gegensätzliche Ergebnisse beschrieben. Während GLI1 in humanen Tumorzelllinien sowohl im Cytosol als auch im Zellkern vorliegt, wurde es in Tera-1 und D259MG-Zellen überwiegend im Zellkern und in Basalzellcarzinom-Zellen größtenteils im Cytosol nachgewiesen [zusammengefasst in (Villavicencio et al., 2000)]. Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 wurde ebenfalls von verschiedenen Forschungsgruppen unterschiedlich beschrieben (Lee et al., 1997;Ruiz i Altaba, 1999;Shin et al., 1999). Weiterhin fanden Ruiz i Altaba (1999b), dass identische GLI-Konstrukte in Cos und 10T1/2-Zelllinien jeweils unterschiedliche Lokalisationen aufweisen. Mit diesen Studien wurde also auf eine Zelllinien-abhängige Lokalisation der GLI-Proteine hingewiesen.

In der vorliegenden Arbeit konnte durch Colcemid-Behandlung und Kälteschock-Experimente in HeLa-Zellen gezeigt werden, dass die intrazelluläre GLI3 Lokalisation von der Integrität der Mikrotubuli abhängt. Die Stabilität der Mikrotubuli wiederum ist von den Kulturbedingungen und der Fixierungsmethode abhängig. Diese Beobachtung könnte neben der gezeigten Gewebsspezifität ein weiterer Grund für die stark variierenden Ergebnisse in den bisher veröffentlichten Studien sein.

6.2 Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 – nicht aber die von GLI1 und GLI2 – wird über GSK3β und PP2A reguliert

In der vorliegenden Arbeit konnte eine antagonistische regulatorische Aktivität von GSK3β, einer Serin / Threonin-Kinase, und PP2A, einer Serin / Threonin-Phosphatase, auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 gezeigt werden. Hierbei wurde mit verschiedenen Ansätzen, durch die die Aktivität der Mikrotubulus-assoziierten PP2A erhöht wurde [wie zum Beispiel Ko-Expression der B-Box1 des MID1-Proteins, „Knockdown“ des α4-Proteins oder der Zusatz von Rapamycin (induziert PP2A-Aktivität)], eine Anreicherung von GLI3 im Cytosol gezeigt. Durch Verringerung der Aktivität der Mikrotubulus-assoziierten PP2A (zum Beispiel durch Überexpression des α4-Proteins) wurde der gegenteilige Effekt, eine nukleäre Akkumulation von GLI3, erreicht.

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Die Aktivität der GSK3β wirkt hierbei der PP2A-Aktivität entgegen. So führte sowohl die Inhibition der GSK3β durch LiCl, als auch deren „Knockdown“ zur Anreicherung des GLI3 im Cytosol. In zahlreichen verschiedenen Experimenten wurde ermittelt, dass durch die gegensätzlichen Aktivitäten der beiden Enzyme neben der intrazellulären Lokalisation von GLI3 auch der Phosphorylierungsstatus von Fu reguliert wird. Sowohl in einem in-vivo Orthophosphat-Markierungs-Experiment als auch durch in-vitro-Phosphorylierungsstudien wurden zwei phosphorylierte Isoformen von Fu gefunden. Der Phosphorylierungsschritt, der die beiden Isoformen unterscheidet, wird durch die antagonistischen Aktivitäten Mikrotubulus-assoziierter PP2A und GSK3β reguliert. Dies wurde sowohl durch GSK3β- bzw. α4-„Knockdown“ als auch durch Ko-Expression der B-Box1 des MID1-Proteins oder des α4-Proteins belegt. Ferner wurde durch Ko-Immunpräzipitationen gezeigt, dass die Phosphorylierung von Fu durch GSK3β notwendig ist, um eine Interaktion mit dem cytosolischen GLI3 zu ermöglichen. Diese Interaktion zwischen Fu und GLI3 erscheint nach den in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnissen notwendig, um GLI3 im Zellkern anzureichern. Die Mikrotubulus-assoziierte PP2A wirkt hierbei der Aktivität der GSK3β entgegen.

In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass nur die intrazelluläre Lokalisation von GLI3, nicht aber die von GLI1 und GLI2, über die gegensätzlichen Aktivitäten von PP2A und GSK3β reguliert wird. Die Regulation der drei GLI-Proteine erscheint wesentlich komplexer als die des Ci in Drosophila. So wurden eine Reihe unterschiedlicher Regulationsmechanismen für die einzelnen GLI-Proteine beschrieben:

a) Funktion als Transkriptionsaktivator und / oder –repressor

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Während für GLI1 bislang nur eine Funktion als Transkriptionsaktivator beschrieben wurde, können GLI2 und GLI3 sowohl als Transkriptionsaktivatoren als auch als Transkriptionsrepressoren fungieren (Sasaki et al., 1999).

b) Regulation der GLI-Proteine durch SHH:

In Bezug auf die Expression der GLI-Proteine hat SHH auf GLI1 eine positive, auf GLI2 keine signifikante und auf GLI3 eine negative Wirkung (Sasaki et al., 1999).

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Auch die Regulation der intrazellulären Lokalisation der GLI-Proteine durch SHH verläuft unterschiedlich: während SHH keinen Einfluss auf die Lokalisation von GLI1 und GLI2 hat, wurde eine Anhäufung von GLI3 im Zellkern nach Stimulation mit SHH beobachtet (Aza-Blanc et al., 2000).

c) PKA-abhängige Spaltung:

In Bezug auf eine PKA-abhängige Phosphorylierung und anschließende proteolytische Spaltung der drei GLI-Proteine wurden in verschiedenen Studien unterschiedliche Ergebnisse erzielt. Während Altaba et al. (1999b) eine PKA-abhängige Spaltung nur für GLI3 nicht aber für GLI1 und GLI2 fanden, beschrieben Wang et al. (2000) PKA-Phosphorylierungs-Stellen sowohl in GLI2 als auch GLI3. Aza-Blanc et al. (2000) beschrieben auch eine antagonistische Funktion von PKA auf die GLI1-Aktivität, allerdings ohne proteolytische Spaltung von GLI1. Ferner wurden in derselben Studie für GLI2 und GLI3 proteolytische Spaltungen nachgewiesen, wobei jedoch nur die Spaltung von GLI3 durch Stimulation mit SHH inhibiert werden konnte.

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d) Während alle GLI-Proteine an ähnliche Motive in der Promotorregion ihrer Zielgene binden, haben sie doch sehr distinkte Rollen während der Embryogenese. So wurde zum Beispiel gezeigt, dass durch ektope Injektion von GLI2 oder GLI3 in Gewebe, in denen normalerweise GLI1 die Transkription von HNF3β induziert, ein gegenteiliger Effekt, nämlich eine Repression der HNF3β-Transkription erreicht wurde (Ruiz i Altaba, 1998). Außerdem wurden für vertebrate Transgene von GLI1 und GLI2, die in Drosophila-Flügeln exprimiert wurden, Aktivitäten auf unterschiedliche Zielgene gemessen: So induzierte GLI1 dort die ptc-Expression, während GLI2 die dpp-Expression in Antwort auf das Hh-Signal aktivierte. Weiterhin wurde hier eine reprimierende Funktion von GLI2 auf Hh nachgewiesen (Aza-Blanc et al., 2000). Darüber hinaus wurden auch teilweise überlappende Funktionen für GLI2 und GLI3 beschrieben: So haben GLI2 und GLI3 induzierende Wirkung auf die Entwicklung ventraler Zellen in Mäuseembryonen in der Brustebene, die sich gegenseitig ersetzen können, während in der Rumpfebene nur GLI2 die Spezifizierung der Zellen induzieren kann (Motoyama et al., 2003). Daraus folgt, dass die Aktivität der GLI-Proteine lokal und temporal spezifisch reguliert wird.

e) Bindung an Interaktionspartner:

Ein bekannter Interaktionspartner der GLI-Proteine ist das CREB binding protein (CBP). Während für GLI2 und GLI3 die Bindung an das CBP-Protein nachgewiesen wurde, interagiert GLI1 nicht mit CBP (Akimaru et al., 1997;Dai et al., 1999). Zwei weitere bekannte Interaktionspartner der GLI-Proteine sind Fu und SuFu. In Ko-Immunpräzipitationsexperimenten konnte die Bindung aller drei GLI-Proteine an SuFu nachgewiesen werden (Ding et al., 1999;Pearse et al., 1999). Hierbei konnte für GLI1 gezeigt werden, dass SuFu dessen Aktivität als Transkriptionsaktivator entgegenwirkt (Kogerman et al., 1999;Merchant et al., 2004;Pearse et al., 1999;Ruiz i Altaba, 1999;Stone et al., 1999). Die Interaktion von Fu mit GLI1, GLI2 und GLI3 wurde von (Murone et al., 2000) beschrieben. Auch (Aza-Blanc et al., 2000) wiesen die Interaktion von Fu mit GLI1 nach.

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Hieraus wird ersichtlich, dass ein komplexer Regulationsmechanismus für die jeweilige Aktivierung spezifischer GLI-Proteine existiert. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen eine weitere Möglichkeit der spezifischen Regulation von GLI3 über den MID1 / α4 / PP2A-Komplex und GSK3β.

6.3  Die Regulation der intrazellulären Lokalisation von GLI3 ist PKA- und Spaltungs-unabhängig

In der vorliegenden Arbeit wurden in zahlreichen Immunfluoreszenz-Experimenten mit N-terminal und C-terminal markierten GLI3-Konstrukten vergleichbare Ergebnisse erzielt. Ferner konnten mittels Westernblot-Analysen nur Banden nachgewiesen werden, die zur Größe der ungespaltenen Form des GLI3 korrespondieren. Weiterhin wurden hier keine Effekte auf die intrazelluläre Lokalisation des GLI3 durch Inhibierung bzw. Induktion der PKA beobachtet. Die PKA-induzierte proteolytische Spaltung führt ja zu einer Verlagerung des N-terminalen Repressorpeptids in den Zellkern (Ruiz i Altaba, 1999). Demnach scheint die proteolytische Spaltung des GLI3 in seine Repressorform in den hier betrachteten Zellsystemen keine Rolle zu spielen. Vielmehr sind die beschriebenen Daten ein erster Hinweis darauf, dass die hier identifizierten Interaktionen möglicherweise bei der Reifung des ungespaltenen GLI3-Proteins in einen Transkriptionsaktivator eine Rolle spielen könnten. Nach dem Modell der SHH-Signaltransduktionskaskade wird die Aktivator-Form der GLI-Proteine durch das SHH-Signal induziert. SHH hat auf das GLI3-Protein zwei verschiedene Wirkungen (Ruiz i Altaba, 1999):

a) Posttranslational:

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Das SHH-Signal führt zur Umwandlung der reprimierenden Aktivität von GLI3 zu einer aktivierenden Funktion (Dai et al., 1999;Litingtung und Chiang, 2000;Shin et al., 1999). Dies geschieht durch Hemmung der proteolytischen Spaltung des GLI3 in seine Repressorform und der gleichzeitigen Induktion einer Umwandlung des ungespaltenen GLI3 in einen Transkriptionsaktivator. Die genauen molekularen Vorgänge bei dieser Umwandlung sind bislang noch unklar.

b) Transkriptionell:

SHH unterdrückt die Expression des GLI3-Gens (Ruiz i Altaba, 1998;Ruiz i Altaba, 1999).

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In der vorliegenden Arbeit wurden konstitutiv überexprimierte GLI3-Konstrukte eingesetzt, so dass eine transkriptionelle Regulation von GLI3 über SHH in dem hier verwendeten System keine Rolle spielt. Ferner wurde keine proteolytische Spaltung des GLI3 beobachtet. So bleibt noch die Möglichkeit, dass die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Interaktionen bei posttranslationalen Modifikationen des GLI3 zur Umwandlung in einen Transkriptionsaktivator wichtig sind. Interessanterweise wurden die hier benutzten Zelllinien nicht mit SHH induziert, so dass nach dem gängigen Modell keine Umwandlung in die Aktivatorform vorliegen sollte. Dies weist entweder auf eine Auto-Aktivität der SHH-Signaltransduktionskaskade in den benutzten Zelllinien, oder auf einen SHH-unabhängigen Mechanismus hin. Eine solche SHH-unabhängige Induktion der GLI-Proteine wurde bereits von Lee et al. (1997) gezeigt, die fanden, dass GLI1 und GLI3 auch in Geweben exprimiert werden, in denen kein SHH vorliegt. Außerdem machte auch (Ruiz i Altaba, 1999) die Beobachtung, dass transfizierte GLI-Proteine zwar in COS-Zellen proteolytisch gespalten werden, nicht aber in 10T1/2-Zellen. Auch hier spekulieren die Autoren entweder über eine Auto-Aktivität des SHH-Signalwegs oder eine SHH-unabhängige Regulation der GLI-Proteine in 10T1/2-Zellen.

6.4 Nicht alle Zellen reagieren in gleicher Weise auf die durchgeführten Behandlungen

Durch die in dieser Arbeit durchgeführten verschiedenen Behandlungen, die zur Veränderung der Aktivitäten von PP2A bzw. GSK3β führten, wurden die Lokalisationsänderungen des GLI3 nur in einem Teil der analysierten Zellen verursacht. Ähnliche Beobachtungen machte auch (Ruiz i Altaba, 1999). Hier lagen in COS-Zellen transfizierte GLI-Proteine in manchen Zellen nucleär vor, während diese in anderen Zellen cytosolisch lokalisiert waren. Die Autoren stellten die Hypothese auf, dass nicht alle Zellen GLI-Proteine prozessieren können.

Eine weitere Möglichkeit, ausbleibende Effekte in Zellen, die Proteine überexprimieren, zu erklären, ist, dass die in der Zelle endogen vorliegenden, zum Prozessieren notwendigen Interaktionspartner nicht in ausreichender Menge für die Interaktion mit dem überexprimierten Protein vorliegen („Sättigungseffekt“). Ein solcher Sättigungseffekt würde nur in den Zellen zum Tragen kommen, in denen besonders viel Protein exprimiert ist. Abgesehen davon könnte aber auch ein bislang noch nicht identifizierter Faktor beteiligt sein, der die hier gezeigten Regulationen begünstigt oder unterdrückt. Dies könnten zum Beispiel Zellzyklus-abhängige Bedingungen sein. Zur Analyse möglicher Zellzyklus-abhängiger Faktoren sollten Experimente mit synchronisierten Zellkulturen erfolgen.

6.5  MID1-Überexpression und Behandlungen mit „ocadaic acid“ haben keinen Einfluss auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3

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In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 über die Aktivität der Mikrotubulus-assoziierten PP2A reguliert wird. Drei Experimente, die zu diesem Ergebnis führten, waren die Kotransfektion von GFP-GLI3 mit der B-Box1 des MID1-Protein, dem α4-Proteins sowie mit α4-spezifischen siRNAs. Durch eine Anreicherung von α4 in der Zelle durch dessen Überexpression kann viel MID1 an die katalytische Untereinheit der PP2A binden und deren Abbau vermitteln. Das führt [nach Trockenbacher et al. (2001)] zu einer Reduktion der Mikrotubulus-assoziierten PP2A und folglich zur Hyperphosphorylierung ihrer Mikrotubulus-assoziierten Zielproteine. Wird die endogene Menge des α4-Proteins durch „Knockdown“ verringert, kann MID1 seine Ubiquitinligase-Funktion auf PP2A nicht mehr ausüben. Dies führt zur Akkumulation von Mikrotubulus-assoziierter PP2A und folglich zur Hypophosphorylierung ihrer Zielproteine. Die Überexpression der isolierten B-Box1-Domäne des MID1-Proteins erzeugt einen dominant negativen Effekt bezüglich der MID1-Funktion, wodurch die Aktivität der Mikrotubulus-assoziierten PP2A ebenfalls erhöht wird [nach Trockenbacher et al. (2001)]: Die isolierte B-Box1 bindet das α4-Protein mit einer höheren Affinität als das MID1-Protein (Winter et al, 2004). Die überexprimierte B-Box1 wird somit das in der Zelle vorhandene, endogene α4-Protein binden, und folglich dessen Bindung an MID1 stören. Dadurch kann MID1 seine Ubiquitinligase-Aktivität auf PP2A nicht mehr ausüben und deren Abbau wird verhindert. Zusammenfassend konnte aus den Experimenten der Koexpressionen von GLI3 und α4 bzw. GLI3 und der B-Box1 sowie der Kotransfektion α4-spezifischer siRNAs mit GLI3 der Schluss gezogen werden, dass eine erhöhte PP2A-Aktivität zur Akkumulation des GLI3 im Cytosol führt, während eine verringerte PP2A-Aktivität zur Akkumulation des GLI3 im Nukleus führt. Nach diesen Ergebnissen und dem Modell nach Trockenbacher et al. (2001) wäre auch bei der Koexpression von MID1 und GLI3 eine Akkumulation des GLI3 im Zellkern zu erwarten. In der vorliegenden Arbeit wurde jedoch kein Einfluss von MID1-Überexpression auf die intrazelluläre Lokalisation des GLI3 gefunden. Vermutlich liegt der Grund hierfür darin, dass die endogene Menge des α4-Proteins nicht ausreicht, um nach Überexpression alle MID1-Moleküle an die katalytische Untereinheit der PP2A zu binden. Somit kann das überexprimierte MID1 nicht als Ubiquitinligase aktiv werden. Dies führt zu einem Gleichbeiben des PP2A-Abbaus und die PP2A-Aktivität und die Lokalisation des GLI3 ändern sich nicht. Die Menge des α4-Proteins in den benutzten Zellen scheint somit der limitierende Faktor für den Ubiquitin-spezifischen Abbau von Mikrotubulus-assoziierter PP2A zu sein.

Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob durch Behandlung mit den PP2A-Inhibitoren „ocadaic acid“ und Fostriecin eine Veränderung der intrazellulären Lokalisation des GLI3 bewirkt wird, was durch die oben geschilderten Ergebnisse zunächst zu erwarten wäre. Diese Behandlungen führten jedoch nur zu einer leichten, statistisch nicht signifikanten Akkumulation des GLI3 im Zellkern. Bei Überexpression oder „Knockdown“ von α4 verändert sich die Menge der α4-Moleküle in der Zelle verändert. Da die regulatorischen Untereinheiten, α4 bzw. A und B, um die Bindung an die katalytische C-Untereinheit der PP2A konkurrieren, verschiebt sich dadurch das Verhältnis der verschiedenen Heterotrimere zueinander. Während durch die Bindung an α4 der Abbau, also eine Limitierung der Aktivität der PP2Ac vermittelt wird, könnte durch Bindung der PP2Ac an andere A- und B-Untereinheiten eine Aktivierung an anderer Stelle verursacht werden. Eine solche Veränderung der Zusammensetzung der Heterotrimere könnte die Effekte auf die intrazelluläre Lokalisation des GLI3 verursachen. Im Gegensatz hierzu haben die PP2A-Inhibitoren „ocadaic acid“ und Fostriecin auf alle Heterotrimere die gleiche inhibierende Wirkung; es kommt also zu keinem Verschieben der Aktivitäten der verschiedenen Heterotrimere.

Das Ergebnis, dass der durch Überexpression der B-Box1 des MID1-Proteins erzielte Effekt auf die intrazelluäre Lokalisation des GLI3 durch Fostriecin-Behandlung aufgehoben werden konnte, lässt sich hierdurch ebenfalls erklären: Durch Überexpression der B-Box1 wird die Bindung des MID1 / α4 / PP2A-Komplexes gestört. Die aus dem Komplex verdrängten PP2Ac-Moleküle werden nun von anderen A- und B-Untereinheiten gebunden und üben somit andere Funktionen aus, wodurch der Effekt auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 erzeugt wird. Die Behandlung mit Fostriecin führt zu Inhibition aller PP2A-Heterotrimere, unabhängig von den gebundenen Untereinheiten. Dadurch wird die veränderte PP2A-Aktivität, die zu den beobachteten Effekten geführt hat, aufgehoben.

6.6  Rapamycin-Behandlung führt zur Akkumulation des GLI3 im Cytosol

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In der vorliegenden Arbeit wurde nach Behandlung mit Rapamycin eine Akkumulation von GLI3 im Cytosol beobachtet. Rapamycin induziert die Aktivität der PP2A durch Inhibition der TOR-Kinase. Im Hefesystem wurde gezeigt, dass durch Inhibierung der TOR-Kinase die Bindung des TAP42-Proteins, dem α4-Homolog der Hefe, an die katalytische Untereinheit der PP2A gehemmt wird [zusammengefasst in Jacinto und Hall (2003)]. Da der in der vorliegenden Arbeit beschriebene Rapamycin-Effekt auf die intrazelluläre Lokalisation des GLI3 durch Koexpression des α4-Proteins aufgehoben werden konnte, liegt die Vermutung nahe, dass im humanen System vergleichbare Interaktionen stattfinden. Demnach würde durch Rapamycin-Behandlung die Bindung des endogenen α4-Proteins an die katalytische Untereinheit der PP2A gestört werden. Wird nun zusätzlich α4-Protein überexprimiert, so spielt im Verhältnis zur endogenen Menge der TOR-Kinase die indirekte Wirkung des Rapamycins keine Rolle mehr, und der Rapamycin-Effekt wird aufgehoben. Interessanterweise konnte der Rapamycin-Effekt auch durch Koexpression des MID1-Proteins aufgehoben werden. Dieser Effekt zeigt, dass hier TOR-unabhängig die Aktivität der PP2A reguliert werden kann, die der PP2A-Induktion durch Rapamycin entgegen wirken kann.

6.7  LiCl-Behandlung führt zur Reduktion der PTCH1-Expression

PTCH1 ist ein Zielgen der SHH-Signaltransduktionskaskade. Die Expression von PTCH1 wird über den Transkriptionsfaktor GLI3 gesteuert (Chen et al., 2004;Litingtung und Chiang, 2000;Motoyama et al., 2003;Ruiz i Altaba, 1999;Shin et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass die Behandlung mit dem GSK3β-Inhibitor LiCl zur Reduktion der PTCH1-Expression führt. Dieser Effekt kann durch die in dieser Arbeit gefundenen Lokalisationsänderung des GLI3 nach LiCl-Behandlung erklärt werden. Die gefundene Repression der PTCH1-Transkription ist ein wichtiger Hinweis darauf, dass die in der vorliegenden Arbeit identifizierten, Phosphorylierungs-abhängigen Interaktionen zwischen Fu und GLI3 zur Umwandlung des GLI3 in einen Transkriptionsaktivator notwendig sind. Wie Sasaki et al. (1999) und Altaba et al. (1999b) unabhängig voneinander gezeigt haben, wirkt auch das ungespaltene, nicht weiter modifizierte GLI3 als Transkriptionsrepressor. Ein zusätzlicher Reifungsprozess, der das ungespaltene GLI3 in einen Transkriptionsaktivator umwandelt, scheint daher nötig. Eine Phosphorylierung des GLI3, wie sie in der vorliegenden Arbeit gefunden wurde, könnte eine zentrale Rolle in einem solchen Reifungsprozess spielen. In der Abb.7.1 ist ein hypothetisches Modell der Regulierung der Repressor- bzw. Aktivatoreigenschaften von GLI3 dargestellt.

Abb.7.1: Schematische Darstellung der Repressor- bzw. Aktivator-Funktionen von GLI3. Während das ungespaltene, nicht modifizierte GLI3, sowie das proteolytisch gespaltene GLI3 Repressoreigenschaften haben, spielt die in der vorliegenden Arbeit identifizierte Phosphorylierungs-abhängige Interaktion zwischen GLI3 und Fu bei der Entstehung der Aktivator-Form des GLI3 eine Rolle.

6.8  Deletionskonstrukte

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Anhand von Untersuchungen der intrazellulären Lokalisation zahlreicher GLI3-Deletionskonstrukte konnte der Bereich von GLI3, der für die Phosphorylierungs-abhängige Interaktion mit Fu benötigt wird, eingegrenzt werden. Deletionskonstrukte, die die Aminosäuren 18-1100 bzw. 586-1549 von GLI3 umfassen, zeigten vergleichbare Änderungen in der intrazellulären Lokalisation nach LiCl-Behandlungen wie das vollständige GLI3. Dies gibt einen Hinweis darauf, dass die Interaktionsdomäne zwischen Aminosäure 586 und 1100 liegen muss. Zur näheren Eingrenzung dieser Interaktionsdomäne müssten weitere Deletionskonstrukte analysiert werden.

Außerdem wurde aus der Analyse der Deletionskonstrukte ersichtlich, dass C-terminale Deletionen (Konstrukte, die die Aminosäuren 1-667, 18-667, 1-828, 18-828, 1-1100, 18-1100 umfassen) im Gegensatz zum vollständigen GLI3 zu verstärkter Akkumulation im Zellkern führen. Vergleichbare Ergebnisse erzielte auch (Ruiz i Altaba, 1999), die die nukleäre Akkumulation von GLI3-Konstrukten, die die Aminsoäuren 18-745 bzw. 18-700 enthielten, beobachteten. Vermutlich führt eine Deletion des C-Terminus dazu, dass sich das Deletionskonstrukt analog dem proteolytisch gespaltenen GLI3 verhält und somit im Zellkern akkumuliert. Dies stimmt mit den Experimenten von Wang et al. (2000) und Dai et al. (1999) überein, die die proteolytische Spaltstelle des GLI3 zwischen Aminosäure 650 und 750 eingrenzten. Eine weitere Beobachtung, die aus den in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Analysen der GLI3-Deletionskonstrukte hervorgeht, ist, dass die Zink-Finger-Domänen des GLI3 offenbar für dessen Kernlokalisation notwendig sind. Konstrukte, die keine Zink-Finger, oder nur einen Teil der Zink-Finger-Domäne enthielten, waren deutlich häufiger im Cytosol lokalisiert als Konstrukte mit der Zink-Finger-Domäne. Darüber hinaus ist die Zink-Finger-Domäne für die Bindung des GLI3 an DNA verantwortlich. Ist die Fähigkeit des GLI3 an DNA zu binden gestört, wird es offenbar entweder aus dem Zellkern ausgeschleust, oder erst gar nicht in den Zellkern transportiert. Eine Untersuchung der Transportmaschinerie, die für den Kern-Import oder gegebenenfalls den Kern-Export von GLI3 verantwortlich ist, wäre ein interessanter Ansatzpunkt für nachfolgende Studien.

6.9  PP2A / GSK3β-abhängige Regulation von GLI3 – Implikation in die Entwicklung der ventralen Mittellinie

In der vorliegenden Arbeit konnte eine Interaktion des MID1 / α4 / PP2A-Komplexes mit der SHH-Signaltransduktionskaskade gezeigt werden. Erste Hinweise auf eine solche Interaktion lieferten auch die Experimente von (Granata und Quaderi, 2003), die antagonistische Funktionen von MID1 und SHH bei der Entwicklung der Rechts-Links-Asymmetrie in Hühnerembryonen zeigten. Die teilweise überlappenden Phänotypen von Patienten mit OS bzw. Greig-, Acrocallosal- oder Pallister-Hall-Syndrom geben einen Hinweis darauf, dass die in dieser Arbeit beschriebenen Interaktionen während der Entwicklung der vorderen Mittellinie eine wichtige Rolle spielen. Die Entwicklung der vorderen Mittellinie des Menschen ist ein komplexer Vorgang. Viele entscheidende molekulare Mechanismen, die der Entwicklung der vorderen Mittellinie zu Grunde liegen, sind noch weitgehend unerforscht. Gemeinsame Prozesse, die bei der Entwicklung aller Strukturen der vorderen Mittellinie eine Rolle spielen, sind die Migration von Neuralleistenzellen, die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und der programmierte Zelltod (Schweiger und Schneider, 2003). Die Entwicklung des Neuralrohrs und die Migration der Neuralleistenzellen werden durch die Expression verschiedener Bestandteile der SHH-Signaltransduktionskaskade bestimmt. SHH wird hierbei auf der ventralen und GLI3 auf der dorsalen Seite des Neuralrohrs exprimiert [zusammengefasst in (Ruiz i Altaba et al., 2003)]. MID1-Expression wurde vor allem in den auswandernden Neuralleistenzellen gefunden, die nach ventral wandern und dort die Entstehung der vorderen Mittellinie beeinflussen (Richman et al., 2002). Möglicherweise spielt die Interaktion zwischen dem MID1 / α4 / PP2A-Komplex und GLI3 / Fu eine wichtige Rolle bei der Auswanderung der Neuralleistenzellen. Liegen Mutationen in GLI3 bzw. MID1 vor, die diese Interaktion stören, so ließen sich die an der vorderen Mittellinie überlappenden Phänotypen der Patienten mit OS bzw. Greig-, Acrocallosal- oder Pallister-Hall-Syndrom hierdurch erklären.

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Außerdem wurde MID1-Expression in den aufeinander zuwachsenden Gesichtsfortsätzen beschrieben (Richman et al., 2002). Mutationen in MID1 oder GLI3, die die Interaktion zwischen dem MID1 / α4 / PP2A-Komplex und GLI3 / Fu stören, könnten bei der Gesichtsentwicklung Defekte hervorrufen, die sich dann bei Patienten mit OS, Greig- und Acrocallosal-Syndrom als Hypertelorismus oder Lippen-Kiefer-Gaumenspalten äußern. Bei der Enstehung der vorderen Mittellinie könnte der Prozeß der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) ebenfalls eine Rolle spielen, der zum Beispiel bei der Fusion der aufeinanderzuwachsenden Gesichtsfortsätze von großer Bedeutung ist. Dass MID1 bei der EMT eine wichtige Rolle spielt, wird auch durch Beobachtungen von Granata und Quaderi (2003) unterstützt, die zeigen, dass MID1 die Expression von BMP4 induziert. Die Expression von BMP4 induziert wiederum die EMT. Beobachtungen von (Kuschel et al., 2003) zeigen, dass auch GLI3 zur Induktion von BMP-Signalen wichtig ist. Hier wurde in GLI3-Mutanten gezeigt, dass diese keine BMP/Wnt-Expression aufweisen. Zusammengefasst legen diese verschiedenen Beobachtungen und die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse die Hypothese nahe, dass durch die Interaktion zwischen dem MID1 / α4 / PP2A-Komplex und GLI3 / Fu auf der dorsalen Seite des Neuralrohrs eine SHH-unabhängige Modifizierung von GLI3 in einen Transkriptionsaktivator erfolgt, der dann die BMP4-Expression induzieren kann. Hierdurch werden Prozesse wie das Auswandern der Neuralleistenzellen oder die EMT reguliert. Ferner spielt die GLI3-Repressorform, die nach Spaltung des GLI3 entsteht, eine Rolle beim Aufbau eines SHH-Gradienten auf der ventralen Seite des Neuralrohrs. GLI3 ist somit wichtig, um die gegenüberliegenden Zentren von SHH-Signalen bzw. BMP/Wnt-Signalen zu etablieren (Abb.9.1).

Abb.9.1: Hypothetisches Modell der Funktionen des MID1 / α4 / PP2A-Komplex und GLI3 während der Embryonalentwicklung.

6.10  Der MID1 / α4 / PP2A-Komplex und die Interaktion mit GLI3 / Fu – Treffpunkt vieler Signaltransduktionkaskaden

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Interaktion zwischen dem MID1 / α4 / PP2A-Komplex bzw. GSK3#SYMBOL#β und GLI3 und Fu beschrieben, die offenbar der Modifizierung des ungespaltenen GLI3 in einen Transkriptionsaktivator dient. Dies stellt eine SHH-unabhängige spezifische Regulation des GLI3, nicht aber des GLI1 oder GLI2, dar. Neben der SHH-gesteuerten Regulation der drei GLI-Proteine wurden in der Literatur auch alternative, SHH-unabhängige Regulationsmechanismen beschrieben:

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  1. GLI2 und GLI3 können über FGF-Signale reguliert werden (Brewster et al., 2000);
  2. GLI3 wird über BMP-Signale reguliert (Meyer und Roelink, 2003);
  3. GLI2 und GLI3 können über die Wnt-Signaltransduktionskaskade gesteuert werden (Borycki et al., 2000);
  4. Bei der Entwicklung der Extremitätenanlagen kann durch Interaktion des GLI3-Repressors mit HoxD12 eine GLI3-Aktivatorform erzeugt werden (Chen et al., 2004).

Diese SHH-unabhängigen Regulationsmechanismen der GLI-Proteine haben teilweise gegenläufige Wirkungen (wie sie auch für SHH und GLI3 beschrieben wurden). So kann GLI3 beispielsweise nicht nur über die Wnt-Signaltransduktionskaskade gesteuert werden (Borycki et al., 2000), sondern hat auch die Fähigkeit, die Expression von Wnt8 und Wnt11 zu regulieren (Mullor et al., 2001).

Neben den in der vorliegenden Arbeit gezeigten Funktionen der PP2A und GSK3β spielen diese beiden Enzyme auch eine wichtige Rolle im Wnt-Signaltransduktionsweg. Hier phosphoryliert GSK3ββ-catenin. Dadurch wird die ubiquitinvermittelte Degradierung von β-catenin über das Protein Slimb eingeleitet. PP2A wirkt diesem Effekt entgegen und stabilisiert somit β-catenin (Wodarz und Nusse, 1998). In der vorliegenden Arbeit konnte durch β-catenin-„Knockdown“-Experimente gezeigt werden, dass die hier beobachteten regulatorischen Aktivitäten von PP2A und GSK3β auf die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 β-catenin- und somit Wnt-unabhängig sind. Somit wurde hier eine neue Funktion für die beiden Enzyme identifiziert. Für die Wnt-Signaltransduktionskaskade und die SHH-Signaltransduktionskaskade wurden während der Embryonalentwicklung gegensätzliche Rollen beschrieben (Kalderon, 2002). Dies stimmt mit den in dieser Arbeit beschriebenen Aktivitäten der GSK3β und der Mikrotubulus-assoziierten PP2A überein: Während GSK3β durch die Phosphorylierung von β-catenin einen negativen regulatorischen Effekt auf die Wnt-Signaltransduktionskaskade hat, reguliert sie über die Phosphorylierung von Fu die Akkumulation des ungespaltenen GLI3 im Zellkern und hat somit einen positiven Einfluß auf die Aktivierung der SHH-Zielgene. Im Gegensatz hierzu hat PP2A eine stabilisierende Wirkung auf β-catenin und somit einen positiven Einfluss auf die Transduktion des Wnt-Signals, während sie der Phosphorylierung von Fu und somit der Akkumulation des ungespaltenen, aktiven GLI3 im Zellkern entgegenwirkt.

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Die in der vorliegenden Arbeit identifizierte Regulation von GLI3 und Fu über den MID1 / α4 / PP2A-Komplex bzw. GSK3#SYMBOL#β stellen zusätzlich zu den oben aufgeführten SHH-unabhängigen Regulationsmechanismen der drei GLI-Proteine stellt eine weitere Möglichkeit der spezifischen Regulation von GLI3 (unabhängig von SHH) dar.

Durch die unterschiedlichen Regulationswege der GLI-Proteine werden während der Embryonalentwicklung gewebsspezifische Expressionsmuster von GLI-Zielgenen induziert, und somit die Entwicklung verschiedener Gewebsstrukturen ermöglicht. Der in der vorliegenden Arbeit identifizierte Regulationsweg spielt wahrscheinlich bei der Entwicklung der Strukturen der vorderen Mittellinie eine Rolle. Funktionsverluste der beteiligten Proteinen, wie zum Beispiel MID1 oder GLI3, führen zu Defekte in diesen Strukturen (siehe Einleitung). GLI3-Mutationen können neben Fehlern bei der Entwicklung der vorderen Mittellinie auch Extremitäten-Fehlbildungen wie eine präaxiale oder postaxiale Polydaktylie verursachen. Interessanterweise wurden solche Fehlbildungen bei OS-Patienten mit MID1-Mutationen nicht beschrieben. Dies wäre dadurch zu erklären, dass bei Patienten mit GLI3-Mutationen alle in der Zelle vorhandenen GLI3-Moleküle fehlerhaft sind. Dadurch werden sowohl Mittellinien-Defekte als auch Extremitäten-Fehlbildungen verursacht. Bei MID1-Mutationen hingegen, würde nach den in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnissen, wahrscheinlich die Reifung des GLI3-Proteins in einen Transkriptionsaktivator gestört; dies gilt jedoch nicht für alle in der Zelle vorliegenden GLI3-Moleküle. Möglicherweise ist auch eine geringe Menge an GLI3-Transkriptionsaktivator-Molekülen für die Entwicklung der Extremitäten ausreichend, während die Verringerung dieser Menge zu Mittellinien-Fehlbildungen führt. Eine weitere Möglichkeit, um die unterschiedlichen Phänotypen von Patienten mit MID1- bzw. GLI3-Mutationen zu erklären, wäre, dass GLI3 bei der Entwicklung der Extremitätenanlagen eine lokal-spezifische Funktion ausübt, die nicht über die Interaktion mit dem MID1 / α4 / PP2A-Komplex bzw. GSK3β#SYMBOL#reguliert wird. In den Extremitätenanlagen könnte zum Beispiel die Interaktion mit HoxD12 für die gewebsspezifische Regulation von GLI3 verantwortlich sein.

6.11  Vergleich mit der Hh-Signaltransduktionskaskade in Drosophila

Die Hh-Signaltransduktionskaskade ist zwischen verschiedenen Spezies von Drosophila bis zum Menschen auffallend konserviert. Viele der an dem Signalweg beteiligten Proteine sind zwischen den Spezies homolog. Es gibt jedoch auch deutliche Unterschiede zwischen dem humanen SHH-Signalweg und der Drosophila Hh-Signaltransduktionskaskade:

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So gibt es im Gegensatz zu Drosophila in Säugetieren drei Hh-Homologe: Sonic Hedgehog (SHH), Indian Hedgehog (IHH) und Desert Hedgehog (DHH) [zusammengefasst in Murone et al. (1999)].

Weiterhin gibt es in Drosophila nur einen Transkriptionsfaktor, Ci, während das SHH-Signal im Menschen drei GLI-Proteine, GLI1, GLI2 und GLI3, reguliert. Hierbei üben die einzelnen GLI-Proteine vermutlich jeweils Teilfunktionen der Ci-Funktionen aus. Die Existenz von drei GLI-Proteinen im Menschen im Gegensatz zu einem Ci in Drosophila könnte im Laufe der Evolution zum Beispiel durch Gen-Duplikationen und Fächerung der Funktionen der einzelnen Genprodukte entstanden sein. Das Drosophila-Genom zeichnet sich durch seine geringe Gen-Anzahl aus, die sogar niedriger ist als die von C. elegans (Rubin, 2000). Durch einen solchen Mechanismus ließe sich die höhere Komplexität der Säugetierzelle im Gegensatz zum kompakten Transkriptom bei Drosophila erklären.

Zusätzlich zur Anzahl der Transkriptionsfaktoren in der Hh-Signaltransduktionskaskade unterscheidet sich auch deren Regulation über das Hh-Signal zwischen Drosophila und Mensch: In Antwort auf das Hh-Signal in Drosophila wird die nukleäre Konzentration der Repressorform des Ci verringert, und die Spaltung von Ci in einen Transkriptionsrepressor inhibiert. Darüber hinaus erhöht das Hh-Signal sowohl die cytosolische als auch die nukleäre Konzentration des Ci-Aktivators (Aza-Blanc et al., 1997;Chen et al., 1999). Die Regulation von GLI3 über SHH unterscheidet sich hiervon deutlich: So reprimiert SHH zum einen die Expression von GLI3 und stimuliert zum anderen die Formierung des GLI3-Aktivators.

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Ferner wurde in Drosophila beschrieben, dass zur proteolytischen Spaltung des Ci in einen Repressor Phosphorylierungsschritte durch die Kinasen CKI, GSK3#SYMBOL#β und PKA notwendig sind (Price und Kalderon, 2002). In der vorliegenden Arbeit wurde ein Zusammenhang zwischen GSK3β#SYMBOL#und GLI3 identifiziert, der bei der Bildung der Aktivatorform des GLI3 eine Rolle spielt. Dadurch wird der GSK3#SYMBOL#β eine gegensätzliche Aktivität im Hh-Signalweg in Drosophila im Vergleich zum Menschen zugeordnet. In Drosophila führt eine Hyperphosphorylierung des bereits durch PKA phosphorylierten Ci durch CKI und GSK3#SYMBOL#β zu einer Spaltung des Proteins und damit der Enstehung der Repressorform von Ci. Eine weitere Möglichkeit wäre auch eine duale Funktion der GSK3#SYMBOL#β im Menschen: Einerseits könnte das Enzym bei der SHH-unabhängigen Modifikation des GLI3 in einen Transkriptionsaktivator aktiv sein, und andererseits auch die proteolytische Spaltung des GLI3 induzieren, wie es in Drosophila für Ci beschrieben wurde.

6.12 Modell

Anhand der in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse wurde das folgende hypothetische Modell erstellt (Abb.12.1):

Durch die gegensätzlichen Aktivitäten der Mikrotubulus-assoziierten PP2A und der GSK3#SYMBOL#β wird die Hyperphosphorylierung des Fu-Proteins reguliert. Die Existenz zweier phosphorylierter Isoformen wurde durch Orthophosphatmarkierung, sowie durch in-vitro Phophatase-Behandlungen gezeigt. Die Abhängigkeit des Hyperphosphorylierungsschritts (Isoform 145kDa zu 150kDa) von den Aktivitäten der Mikrotubulus-assoziierten PP2A und GSK3#SYMBOL#β wurde durch Überexpression der B-Box1 des MID1-Proteins, durch Überexpression bzw. „Knockdown“ des α4-Proteins sowie durch LiCl-Behandlung (Inhibition der GSK3#SYMBOL#β) und „Knockdown“ der GSK3#SYMBOL#β bewiesen.

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Die durch GSK3#SYMBOL#β hyperphosphorylierte Isoform des Fu-Proteins interagiert mit dem ungespaltenen GLI3, wodurch dieses phosphoryliert wird und im Zellkern akkumuliert. Die Interaktion zwischen Fu und GLI3 wurde durch Ko-Immunpräzipitationen demonstriert und die Phosphorylierung von GLI3 durch in-vitro-Phosphatase-Behandlungen nahegelegt.

In Drosophila wurde dem Fu-Protein eine Kinase-Aktivität zugeschrieben (Nybakken et al., 2002). In Analogie dazu könnte in der Säugetierzelle die Fu-Kinase durch Hyperphosphorylierung aktiviert werden und dann die Phosphorylierung des GLI3 katalysieren. Um dies zu überprüfen sind weitere Experimente nötig. So würde zum Beispiel die in-vitro-Inkubation von aufgereinigtem Fu mit aufgereinigtem GLI3 unter Zusatz von radioaktiv markiertem ATP Auskunft über eine putative Kinase-Aktivität des Fu auf GLI3 geben.

Das nicht modifizierte ungespaltene GLI3 hat eine Repressorfunktion aufgrund der dominanten N-terminalen Repressor-Domäne. Durch die Phosphorylierung des ungespaltenen GLI3 könnte eine Umfaltung des Proteins stattfinden, bei der die Aktivierungsdomäne freigelegt wird. Dass in der vorliegenden Arbeit eine Aktivatorform des GLI3 analysiert wurde, konnte anhand von semiquantitativen RT-PCRs der mRNA des GLI3-Zielgens PTCH1 gezeigt werden. Die Westernblot-Analyse von C- und N-terminal markierten Konstrukten, die sich im verwendeten System vergleichbar verhielten, ergab, dass eine proteolytische Spaltung des GLI3 auszuschliessen war.

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Aus den in der Literatur beschriebenen, sowie den in der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten, lässt sich ableiten, dass es drei verschiedene Formen des GLI3-Proteins geben muss:

  1. die ungespaltene nicht modifizierte Form, die als Transkriptionsrepressor wirken kann (Ruiz i Altaba, 1999;Sasaki et al., 1999).
  2. die proteolytisch gespaltene C-terminal trunkierte Repressorform (Wang et al., 2000, Dai et al., 1999, Litingtung und Chiang, 2000),
  3. die modifizierte ungespaltenen Aktivatorform.

Im Drosophila-System wird in Abwesenheit von Hh Ci proteolytisch gespalten und in den Kern transportiert. Nicht gespaltenes in den Kern transportiertes Ci wird jedoch wieder aus dem Zellkern ausgeschleust. Erst nach den in Antwort auf das Hh-Signal erfolgenden Modifikationen des Ci in den ungespaltenen Transkriptionsaktivator wird das Verhältnis von Kern-Import und Export verschoben, so dass der Transkriptionsaktivator im Kern akkumulieren kann [zusammengefasst in (Ruiz, 1999)]. Beim Menschen scheint ein ähnlicher Regulationsmechanismus für GLI3 zu existieren. Somit würde nicht aktiviertes GLI3 proteolytisch gespalten und in den Kern transportiert werden (Repressorform), während ungespaltenes GLI3 (Repressorform), das in den Kern transportiert wurde, wieder aus dem Kern ausgeschleust werden würde. Durch die in dieser Arbeit beschriebenen Interaktionen könnte GLI3 aktiviert und modifiziert werden und folglich als Transkriptionsaktivator im Zellkern akkumulieren. Eine mögliche Inhibition des Kernexports von GLI3 wäre ein weiterer Ansatzpunkt für nachfolgende Studien.

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Abb.12.1: Hypothetisches Modell der Regulation von GLI3 über den MID1 / α4 / PP2A-Komplex und GSK3β


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