Das Opitz BBB/G Syndrom (OS) ist eine genetisch bedingte, heterogene Erkrankung des Menschen, die durch Defekte der vorderen Mittellinie charakterisiert ist. Das OS wurde erstmals von John Opitz beschrieben. Ursprünglich wurde zwischen BBB- und G-Syndrom unterschieden, wobei das BBB-Syndrom durch Lippen-Kiefer-Gaumenspalte und mentale Retardierung (Opitz J, 1969) und das G-Syndrom durch gastrointestinale Defekte (Opitz J, 1969) gekennzeichnet war. Nachfolgende Berichte von Familien, in denen beide Syndrome auftraten, deuteten darauf hin, dass beide Syndrome eine klinische Einheit darstellen. Die Buchstaben in den Bezeichnungen der Krankheiten (BBB/G) resultieren aus den Initialen der Familien, in denen die Erkrankung erstmals beschrieben wurde. Folgende Symptome charakterisieren OS:

1. fazial: Hypertelorismus, breiter Nasenrücken, Lippen-Kiefer-Gaumenspalte

2. gastrointestinal: Ösophagotracheale Fistel, Dysphagie, imperforierter Anus

3. kardiovaskulär: Atembeschwerden, angeborene Herzfehler

4. urogenital: Hypospadie, imperforiertes Hymen

5. Hirnanomalien, Entwicklungsstörungen, Agenesie des Corpus callosum, mentale Retardierung.

Die Patienten zeigen kein einheitliches Krankheitsbild, da die verschiedenen Symptome unterschiedlich stark ausgeprägt sein können. Auch innerhalb einer Familie können sich die Phänotypen bei Patienten mit der gleichen Mutation sehr unterschiedlich ausprägen.

Da sich die Defekte der vorderen Mittellinie, wie sie in OS-Patienten beobachtet wurden, während der Embryonalentwicklung des Individuums manifestieren, wird im Folgenden die Embryonalentwicklung des Menschen zum besseren Verständnis zusammengefasst.

Die Entwicklung der vorderen Mittellinie des Menschen ist ein komplexer Vorgang. Viele entscheidende molekulare Mechanismen, die der Entwicklung der vorderen Mittellinie zu Grunde liegen, sind noch weitgehend unerforscht. Gemeinsame Prozesse, die bei der Entwicklung aller Strukturen der vorderen Mittellinie eine Rolle spielen, sind die Migration von Neuralleistenzellen, die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und der programmierte Zelltod (Schweiger und Schneider, 2003).

Das Zusammenspiel dieser Prozesse in der Entwicklung der vorderen Mittellinie soll anhand der Gesichtsentwicklung exemplarisch erläutert werden:

Schon in der 4. Woche treten um die ektodermale Mundbucht herum fünf Gesichtsfortsätze auf (Abb.1.4.1):

Der unpaare Stirnfortsatz, der die obere Begrenzung der ektodermalen Mundbucht darstellt;

Die paarigen Oberkieferfortsätze an der lateralen Seite der ektodermalen Mundbucht;

Die paarigen Unterkieferfortsätze an der unteren Begrenzung der ektodermalen Mundbucht (Moore, 1988).

Zum Zeitpunkt der Ausbildung des Neuralrohrs wird in den Neuralleistenzellen ein verändertes Programm der Genexpression initiiert, das zur Auflösung der Zell-Zell-Adhäsionskomplexe und zur Veränderungen im Cytoskelett der Zellen führt. Dadurch werden diese Epithelzellen zu mesenchymartigen Zellen umgewandelt (Ectomesenchym). Dieser Prozess wird als epithelial-mesenchymale Transition (EMT) bezeichnet (Cox, 2004). Die Ausbildung der fünf Gesichtsanlagen wird durch die Immigration von solchen Neuralleistenzellen induziert (Ectomesenchym). Die Entwicklung des Gesichts erfolgt hauptsächlich zwischen der 5. und der 8. Woche. Zunächst wachsen die Unterkieferfortsätze aufeinander zu und verschmelzen an ihren medialen Enden. Im unteren Bereich des Stirnfortsatzes bildet sich beiderseits eine ovale Ektodermverdickung, die sogenannte Riechplakode (Abb.1.4.1). An den Rändern dieser Riechplatte proliferiert das Mesenchym und bildet dadurch den medialen und lateralen Nasenfortsatz. Die Oberkieferfortsätze wachsen aufeinander zu und verschmelzen mit der lateralen Nasenwulst (Moore, 1988). Zeitgleich wandern die Augenanlagen von beiden Seiten nach vorne.

Abb.1.4.1: Gesichtsentwicklung des Menschen. Die fünf Gesichtsfortsätze: der unpaare Stirnfortsatz (blau-weiß gestreift), die paarigen Oberkieferfortsätze (hellblau) und paarigen Unterkieferfortsätze (dunkelblau) sind dargestellt [Abb. aus (Moore, 1988)].

Das Zusammenwachsen und Verschmelzen der Gesichtsfortsätze umfasst sowohl die Proliferation und Differenzierung der Ectomesenchymzellen als auch den programmierten Zelltod (Apoptose). Die Fusion der Gesichtsfortsätze ist in Abb.1.4.2 detailliert dargestellt und ist in 7 Stadien gezeigt. In Stadium 1 sind die Zellen eines Gesichtsfortsatzes kurz vor der Fusion gezeigt. Die aus den Neuralleisten eingewanderten Zellen sind von einer Basalzell- und einer Epithelzellschicht überzogen. In Stadium 2 gehen einige der Epithelzellen in Apoptose. Die sterbenden Zellen werden ausgestoßen. In Stadium 3 werden die Zellkontakte der Epithelzellen gelockert und die Zellen beginnen sich aufzuwölben. In Stadium 4 werden von den Epithelzellen Filopodien gebildet, die den Kontakt zwischen den beiden Gesichtsfortsätzen herstellen. In Stadium 5 werden feste Zell-Zell-Kontakte zwischen den Epithelzellen der beiden Gesichtsfortsätze ausgebildet. Durch EMT werden die Epithelzellen in Stadium 6 und 7 in mesenchymartige Zellen umgewandelt und die hergestellte Verbindung zwischen den nun fusionierten Gesichtsfortsätzen verstärkt. Die während des Zusammenwachsens und Verschmelzens der Gesichtsfortsätze auftretende Differenzierung und Proliferation der aus den Neuralleisten stammenden Ectomesenchymzellen wird durch eine Vielzahl von Signaltransduktionswegen gesteuert. Unter anderem umfasst dies Mitglieder der FGF (fetal growth factor) und BMP (bone morphogenic protein) Familien, sowie Bestandteile der SHH (sonic hedgehog) Signaltransduktionskaskade (Cox, 2004).

Abb.1.4.2: Sieben Stadien der Fusion der Gesichtsfortsätze. Obere Reihe: Stadium 1-4 von links nach rechts. Untere Reihe Stadium 5-7 von links nach rechts.

Bei defekter Gesichtsentwicklung können Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalten entstehen. Diese sind mit einer Häufigkeit von 1 in 600 bis 1 in 1000 Neugeborenen eine der häufigsten kongenitalen Defekte. 70-90% der Patienten mit Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalten zeigen keine weiteren Symptome, während die restlichen Fälle von Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalten mit syndromischen Erkrankung wie dem OS in Verbindung gebracht werden (Cox, 2004). Die Entstehung von Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalten kann sowohl genetisch bedingt als auch umweltbedingt sein. Die einzelnen Faktoren beeinflussen möglicherweise die Einwanderung des Neuralleistenmaterials in die embryonalen Gesichtsanlagen. Steht zu wenig Material zur Verfügung, kommt es zur Spaltbildung der Lippe und/oder des Gaumens (Moore, 1988). Ferner spielen der programmierte Zelltod und der Prozess des EMT bei der Fusion der Gesichtsfortsätze eine wichtige Rolle. Auch hier können Fehler in den genannten Prozessen zur Ausbildung von Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalten führen. Mittels Positionsklonierung konnten zahlreiche Gene, die an der Enstehung von Syndromen mit Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalten beteiligt sind, identifiziert werden (z.B. PTCH1, MID1, MSX1, PVRL1) (Cox, 2004).

Der Phänotyp von Patienten mit OS wird durch Defekte der ventralen Mittellinie, wie zum Beispiel Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalten, gekennzeichnet. Dies gibt den Hinweis darauf, dass bei Patienten mit OS fundamentale Prozesse in der Embryonalentwicklung der vorderen Mittellinie, wie zum Beispiel die EMT, die Migration der Neuralleistenzellen oder der programmierte Zelltod, gestört sind. Während der EMT werden das Aktin- und Mikrotubulus-Cytoskelett reorganisiert. Möglicherweise spielt hierbei das Mikrotubulus-assoziierte MID1-Protein eine wichtige Rolle. Hinweise hierfür liefern folgende Beobachtungen: MID1 ist im Neuroepithelium exprimiert, wo eine partielle Colokalisation des MID1 und einem Marker für Neuralleistenzellen beobachtet wurde (Richman et al., 2002). Dies könnte bedeuten, dass die MID1-Funktion für die EMT, die die Migration der Neuralleistenzellen vorbereitet, wichtig ist. Darüber hinaus wurde MID1-Expression in den proliferierenden und differenzierenden Zellen der aufeinanderzuwachsenden Gesichtsfortsätze beobachtet (Richman et al., 2002). Mutationen im MID1-Protein, die in OS-Patienten gefunden wurden stören die Mikrotubulus-Assoziation von MID1 (Schweiger et al., 1999), was auf eine mögliche Funktion des MID1-Proteins während der Reorganisation des Cytoskeletts in EMT-Zellen hindeutet. So vermittelt MID1 mittels seiner Ubiquitinligase-Funktion die Degradierung von PP2Ac. In OS-Patienten können Mutationen im MID1-Protein dazu führen, dass diese Funktion nicht mehr ausgeübt werden kann. Die Folge ist eine erhöhte PP2Ac-Aktivität und folglich eine Hypophosphorylierung ihrer Zielproteine (Trockenbacher et al., 2001), was eine Vielzahl Mikrotubulus-abhängiger Prozesse, wie zum Beispiel die Reorganisation des Cytoskeletts während der EMT, beeinflussen kann.

Weiterhin wurde MID1 eine regulatorische Funktion auf BMP4 zugeordnet: demnach kann MID1 die Expression von BMP4 induzieren (Granata und Quaderi, 2003). Die verstärkte Expression von BMP4 ist für die Induktion der EMT wichtig.

Des weiteren beschrieben Granata und Quaderi et al. (2003) eine antagonistische Rolle von MID1 und SHH bei der Definition der Rechts-Links-Asymmetrie während der Embryonalentwicklung des Huhns. Auf der rechten Seite wird die MID1-Expression induziert, was zur Induktion der BMP4-Expression führt, das wiederum die Expression von SHH unterdrückt. Auf der linken Seite wird SHH exprimiert, was dort die MID1-Expression verhindert (Granata und Quaderi, 2003). Auch beim Menschen gibt es Hinweise auf eine Verbindung zwischen MID1 und der SHH-Signaltransduktionskaskade: Patienten mit SHH-Mutationen haben Hypotelorismus, oder in Extremfällen Zyklopie, während Patienten mit PTCH1- oder GLI3-Mutationen Hypertelorismus haben. PTCH1 und GLI3 sind negative Regulatoren von SHH. OS Patienten haben ebenfalls Hypertelorismus. Granata und Quaderi et al. (2003) stellten die Hypothese auf, dass MID1 auch in der Embryonalentwicklung des Menschen SHH unterdrücken kann, da Funktionsverluste von SHH und MID1 im Menschen gegensätzliche Phänotypen hervorrufen.

In Drosophila sind zwei Transmembranproteine an der Aufnahme und Transduktion des Hedgehog-Signals beteiligt: Patched (Ptc) und Smoothened (Smo). Ptc ist der Hh-Rezeptor und ein negativer Regulator der Hh-Signaltransduktion. In Abwesenheit von Hh reprimiert Ptc Smo. Bindet Hh an Ptc, so wird dieses inaktiviert und Smo folglich aktiviert. Smo ist ein positiver Regulator der Hh-Signaltransduktionskaskade, und die Aktivität von Smo ist für die Transduktion des Hh-Signals notwendig. Die genauen Mechanismen der Transduktion des Hh-Signals wurden bislang nur ansatzweise erforscht. In Abwesenheit von Hh liegt ein Mikrotubulus-assoziierter Komplex vor, der die Proteine Fused (Fu), Costal2 (Cos2), Supressor of Fused (SuFu) und Cubitus Interruptus (Ci) umfasst. Die Assoziation an Mikrotubuli wird über Cos2 vermittelt. Ci ist ein Zink-Finger-Transkriptionsfaktor, der ein 9bp umfassendes Konsensus-Motiv in der Promotorregion der Hh-Zielgene bindet und somit deren Expression steuern kann. In Abwesenheit von Hh wird Ci proteolytisch gespalten, wobei das hierbei entstehende N-terminale Fragment in den Zellkern transportiert wird, wo es als Repressor auf Hh-Zielgene wirkt. Diese proteasomabhängige Spaltung des Ci involviert PKA (Protein Kinase A), GSK3β (Glykogensynthasekinase 3β), CKI (Casein Kinase I) und das F-Box/WD40 Protein Slimb (Proteine dieser Familie spielen bei der ubiquitinabhängigen Proteolyse spezifischer Phosphoproteine eine Rolle). In Antwort auf das Hh-Signal wird die Spaltung von Ci in die Repressorform unterdrückt. Der Proteinkomplex (bestehend aus Fu, Cos2, SuFu, Ci) löst sich von den Mikrotubuli und das ungespaltene Ci wird zu einem Transkriptionsaktivator modifiziert, der den Cofaktor CBP bindet und dann die Transkription der Hh-Zielgene aktiviert. Diese Modifikationen von Ci werden durch Fu und Cos2 positiv reguliert. SuFu ist der Gegenspieler von Fu und wirkt der Reifung von Ci in einen Transkriptionsaktivator entgegen (Abb.2.1.1) [zusammengefasst in (Murone et al., 1999)].

Die genauen Mechanismen, die bei der Reifung des Ci in einen Transkriptionsaktivator beteiligt sind, sind noch weitgehend unerforscht. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass Fu eine Kinase-Aktivität aufweist, die zur Ci-vermittelten Aktivierung der Expression von Hh-Zielgenen benötigt wird. Diese Kinase-Aktivität von Fu wird durch eine Phosphorylierung des Fu an der Aminosäure Thr158 induziert (Fukumoto et al., 2001). Ferner konnte nachgewiesen werden, dass Fu, wenn es durch Phosphorylierung aktiviert wurde, Cos2 phosphoryliert (Nybakken et al., 2002). Dieser Prozess erscheint notwendig, um den Proteinkomplex (Fu, Cos2, SuFu, Ci) von den Mikrotubuli zu lösen und somit die Reifung von Ci in einen Transkriptionsaktivator zu ermöglichen. Ferner wurde gezeigt, dass die Regulation der intrazellulären Lokalisation von Ci für die Transduktion des Hh-Signals sehr wichtig ist. In Abwesenheit von Hh wird Ci proteolytisch gespalten und in den Kern transportiert. Nicht gespaltenes in den Kern transportiertes Ci wird jedoch wieder aus dem Zellkern ausgeschleust. Erst nach den in Antwort auf das Hh-Signal erfolgenden Modifikationen des Ci in den Transkriptionsaktivator wird das Verhältnis von Kern-Import und -Export verschoben, so dass der Transkriptionsaktivator im Kern lokalisiert wird [zusammengefasst in (Ruiz, 1999)].

Abb.2.1.1: Darstellung der Hh-Signaltransduktionskaskade in Drosophila (Murone et al., 1999).

Die Hh-Signaltransduktionskaskade ist im Interspeziesvergleich auffallend konserviert. Wie oben beschrieben gibt es drei Hh-Homologe (IHH, DHH, SHH) in Säugetieren. Das Transmembranprotein Ptc hat im Menschen zwei Homologe, PTCH1 und PTCH2, die sowohl SHH, DHH als auch IHH binden können. Da PTCH2 vorwiegend in Spermatocyten exprimiert wird, ist dies vermutlich der Rezeptor für DHH [zusammengefasst in (Murone et al., 1999)]. Im Folgenden soll die SHH-Signaltransduktionskaskade im Menschen näher erläutert werden. SHH wird zunächst durch eine Spaltung in zwei Fragmente geteilt. Das N-terminale Fragment wird mit einem Cholesterolrest fusioniert, und damit aktiviert. Das so aktivierte SHH kann dann an seinen Rezeptor PTCH1 binden, und diesen dadurch inaktivieren. PTCH1 ist ein negativer Regulator des SHH-Signalwegs und unterdrückt die Funktion des Transmembranproteins SMO. Bindet SHH an PTCH1 wird SMO aktiviert und erlaubt somit die Aktivierung der GLI-Transkriptionsfaktoren. Die GLI-Transkriptionsfaktoren GLI1, GLI2 und GLI3 sind die humanen Homologe von Ci in Drosophila. Die Transkriptionsfaktoren GLI1 und GLI3 binden beide an das Motiv GACCACCCA in der Promotorregion des jeweiligen Zielgens, während GLI2 das nahezu identische Motiv GAACCACCCA bindet, worüber die Expression der entsprechenden Gene gesteuert wird [zusammengefasst in (Villavicencio et al., 2000)]. Während Homologe von Fu (Fu) und SuFu (SuFu) bekannt sind, konnte bislang kein Cos2-Homolog identifiziert werden. Erste Hinweise auf die Existenz eines Cos2-Homologs in Säugetieren fanden Y.Katoh und M.Katoh (2004), die anhand von in-silico-Analysen nahelegten, dass KIF27 das wahrscheinliche Cos2-Homolog ist.

Die Transduktion des SHH-Signals auf die jeweiligen Zielgene wird durch die drei GLI-Transkriptionsfaktoren vermittelt. Wie das Drosophila-Homolog Ci enthalten die drei Proteine eine Zink-Finger-Domäne, die fünf Zink-Finger umfasst. Außerhalb der Zink-Finger-Domänen sind die drei GLI-Proteine untereinander, sowie im Vergleich zu Ci nur wenig konserviert (zwischen 21% Identität zwischen Ci und GLI1 und 39% Identität zwischen GLI2 und GLI3 auf Aminosäureebene) (Abb.2.3.1).

Abb.2.3.1: Sequenzvergleich der GLI-Proteine und Ci. Zwischen allen vier Proteinen identische Aminosäuren sind schwarz hervorgehoben, zwischen drei Proteinen identische Aminosäuren sind dunkelgrau hervorgehoben und zwischen zwei Proteinen identische Aminosäuren sind hellgrau hervorgehoben. Die Zink-Finger-Domänen sind durch eine rote Linie gekennzeichnet.

Abb.2.3.1 Fortsetzung: Sequenzvergleich der GLI-Proteine und Ci. Zwischen allen vier Proteinen identische Aminosäuren sind schwarz hervorgehoben, zwischen drei Proteinen identische Aminosäuren sind dunkelgrau hervorgehoben und zwischen zwei Proteinen identische Aminosäuren sind hellgrau hervorgehoben. Die Zink-Finger-Domänen sind durch eine rote Linie gekennzeichnet.

Viele Fragen bezüglich der Regulation der drei GLI-Proteine und deren Funktionen sind bislang unbeantwortet. In den letzten Jahren gab es zahlreiche Spekulationen darüber, ob die GLI-Proteine als Transkriptionsaktivatoren, -repressoren oder als beides wirken können. Für GLI1 konnte bislang nur eine Transkriptionsaktivator-Funktion nachgewiesen werden (Dai et al., 1999), während GLI2 und GLI3 sowohl Aktivator- als auch Repressor-Funktionen ausüben können (Dai et al., 1999;Sasaki et al., 1999;Wang et al., 2000). Weiterhin gibt es gegensätzliche Ergebnisse aus Analysen der intrazellulären Lokalisation der GLI-Proteine. Die intrazelluläre Lokalisation von GLI1 wurde von verschiedenen Forschungsgruppen untersucht. Die erzielten Ergebnisse zeigten, dass die Lokalisation in verschiedenen Zelllinien sehr unterschiedlich ist. Während GLI1 in humanen Tumorzelllinien sowohl im Cytosol als auch im Zellkern vorlag, wurde es in Tera-1 und D259MG-Zellen überwiegend im Zellkern und in Basalzellcarzinom-Zellen größtenteils im Cytosol nachgewiesen [zusammengefasst in (Villavicencio et al., 2000)]. Die intrazelluläre Lokalisation von GLI3 wurde ebenfalls von verschiedenen Forschungsgruppen unterschiedlich beschrieben. Während (Lee et al., 1997) GLI3 in COS-Zellen überwiegend im Cytosol beobachtete, fanden (Shin et al., 1999), dass GLI3 in HeLa-Zellen ebenfalls cytoplasmatisch lokalisiert ist, und die Lokalisation durch verschiedene Mutationen verändert werden konnte. Zusätzlich wird seit Jahren das Auftreten einer proteolytischen Spaltung der GLI-Proteine in mögliche Repressor-Formen, wie es für Ci beschrieben wurde, diskutiert. Während für GLI1 bislang kein Spaltungsprozess nachgewiesen werden konnte, gibt es verschiedene Studien, die eine Spaltung von GLI3 beschreiben. Wie bei Ci konnte für GLI3 gezeigt werden, dass eine PKA-abhängige Phosphorylierung eine Spaltung induziert (Wang et al., 2000). Durch diese Spaltung entsteht ein N-terminales Fragment, welches als Repressor auf SHH-Zielgene wirkt. Durch Analyse von GLI3-Deletionskonstrukten konnte die Repressor-Domäne von GLI3 im N-Terminus zwischen den Aminosäuren 1 und 397 lokalisiert werden (Dai et al., 1999;Sasaki et al., 1999). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass GLI3 eine Aktivierungsdomäne enthält. In Anwesenheit von SHH wird die proteolytische Spaltung von GLI3 in einen Transkriptionsrepressor unterdrückt, und das ungespaltene GLI3 kann durch noch nicht erforschte Modifikationen in einen Transkriptionsaktivator umgewandelt werden. Deletionen der Aktivierungsdomäne zeigten, dass dieser Bereich von GLI3 sowohl für die Bindung an dessen Co-Aktivator CBP (CREB Binding Protein) als auch für die Aktivierung der Transkription seiner Zielgene verantwortlich ist (Dai et al., 1999) (Abb.2.3.2). Weiterhin wurde nahegelegt, dass die intrazelluläre Lokalisation der GLI-Proteine –wie für Ci beschrieben- bei der Transduktion des SHH-Signals von großer Bedeutung ist. Nach dem Modell von (Ruiz, 1999) wird in Abwesenheit von SHH die proteolytisch gespaltene Repressorform der GLI-Proteine in den Zellkern transportiert. In den Kern transportierte ungespaltene GLI-Proteine würden jedoch wieder aus dem Zellkern ausgeschleust. In Antwort auf das SHH-Signal würden dann die ungespaltenen GLI-Proteine modifiziert und das Gleichgewicht von Kern-Import und –Export zugunsten der Kernlokalisation der Transkriptionsaktivatoren verschoben. Bislang konnte jedoch nur für GLI1 eine Abhängigkeit der intrazellulären Lokalisation vom Kern-Export bewiesen werden (Kogerman et al., 1999).

Abb.2.3.2: Darstellung der Struktur des GLI3-Proteins.

Zusätzlich zur Regulation der Aktivator- bzw. Repressoreigenschaften der GLI-Proteine reguliert SHH auch deren Transkription. Während durch SHH die Transkription von GLI1 und GLI2 induziert wird, unterdrückt es die Transkription von GLI3. Demnach werden GLI3 und SHH antagonistische Funktionen zugeordnet [zusammengefasst in (Ruiz i Altaba, 1999)]. Um die Transkription von GLI1 und GLI2 durch SHH zu induzieren, müsste ein schon vorher vorhandener Faktor existieren, der eine Antwort auf das SHH-Signal zulässt. Hierfür wurde eine schwache, SHH-unabhängige Transkription der GLI-Proteine nahegelegt (Ruiz i Altaba, 1999).

Die SHH-Signaltransduktionskaskade steuert die Expression zahlreicher Gene. Eine Zusammenfassung bekannter SHH-Zielgene ist in Tab.2.4.1 gegeben. Interessanterweise finden sich unter den SHH-Zielgenen auch Elemente der SHH-Signaltransduktionskaskade, wie zum Beispiel PTCH1 und GLI1. Die Transkription beider Gene wird über GLI3 gesteuert. Weiterhin wird die Transkription von HIP (Hedgehog Interacting Protein) über den SHH-Signalweg reguliert. HIP wirkt als Repressor auf SHH. Durch diese Art der Selbstregulation von Bestandteilen des SHH-Signalwegs wird ein negativer „Feedback Loop“ erzielt [zusammengefasst in (Ruiz, 1999)]. Hierüber könnte nach induziertem SHH-Signal dafür gesorgt werden, dass das Signal nur zeitlich begrenzt an einem Zielort zu einer bestimmten Zellantwort führt und anschließend wieder abgeschaltet wird.

Gen

Publikation

Genlocus

durch Mutation in diesem Gen hervorgerufene Krankheit

reguliert über....

ANG-2 (angiopoietin 2)

(Pola et al., 2001)

8p23

Hepatozelluläre Karzinome, wichtig in Angiogenese in Karzinomen

-

Anti-mullerian hormone (Amh)

(Ingram et al., 2002)

12q13

Syndrom des persistierenden Müllerschen Gangs

-

BCL2

(Regl et al., 2004)

18q21.3

Dereguliert in B-Zell-Lymphomen

GLI2

BF-2 (=FOXG1A / Brain factor 2)

(Ingram et al., 2002)

14q11-q13

-

-

Bmp-2 (bone morphogenic protein 2)

(Laufer et al., 1994)

20p12

wichtig in der Knochenbildung, Fibrodysplasia ossificans progressiva

-

Bmp4

(Kawai und Sugiura, 2001)

14q22-q23

Überexprimiert in Patienten mit Fibrodysplasia ossificans progressiva

GLI1 und GLI3

Bmp7

(Kawai und Sugiura, 2001)

20

-

GLI1 und GLI3

Bmp-4 (bone morphogenic protein 4)

(Weaver et al., 2003)

14q22-q23

spielt wichtige Rolle in Entwicklung der Rechts-Links-Asymmetrie, wichtig in der Knochenbildung, Überexpression in Patienten mit Fibrodysplasia ossificans progressiva

-

CCND1 (G1/S-specific cyclin-D1)

(Oliver et al., 2003)

11q13

die mRNA-Menge von CCND1 ist in verschiedenen Karzinomen erhöht;

von Hippel-Lindau Syndrom

-

CCND2 (G1/S-specific cyclin-D2)

(Yoon et al., 2002)

12p13

-

GLI1

COUP-TFII (COUP transcription factor II)

(Krishnan et al., 1997)

15q26

-

-

EMB (embigin)

(Yoon et al., 2002)

5q11.1

-

GLI1

Emx

(Theil et al., 1999)

-

-

GLI3

Fgf-4 (fibroblast growth factor-4)

(Hayes et al., 1998)

11q13.3

-

-

Fgf-8

(Aoto et al., 2002)

10q25-q26

-

GLI3

Foxc2 (Forkhead box protein C2

(Yamagishi et al., 2003)

16q12-16q24

Syndrom mit Lymphödem, Distichiasis und Ptosis

-

Foxe1

(Eichberger et al., 2004)

9q22

Bamforth-Lazarus Syndrom, Hypothyroidismus, Athyroidal, mit Haarveränderungen und Gaumenspalten

GLI2

Foxf1

(Mahlapuu et al., 2001)

16q24

Kandidat für Fehlbildungen wie Ösophagotrachealfistel und Lungenanomalien

GLI2 oder GLI3

Foxm1

(Teh et al., 2002)

12p13

hochreguliert in Basalzellkarzinomen

GLI1

GILZ (Glucocorticoid-induced leucine zipper protein)

(Ingram et al., 2002)

Xp22.3

-

-

GLI1

(Dai et al., 1999;Ikram et al., 2004),

12q13.3-14.1

Überexpression induziert: Basalzellkarzinom, Cylindrom, Trichoblastom und Trichoepitheliom

GLI3 oder GLI2

HKI (Hexokinase I)

(Brewster, et al., 2000)

Gallus gallus Chromosom 6

-

GLI2

HIP ( = HHIP / Hedgehog interacting Prot.)

(Ruiz, 1999)

4q28-q32

-

-

HNF-3ß (=Foxa2 / hepatocyte nuclear factor 3-beta)

(Sasaki et al., 1997)

20p11

-

GLI1

HoxD13 (homeobyx protein Hox-D13)

(Hayes et al., 1998)

2q31-32

Synpolydaktylie durch Expansion einer Poly-Alanin-Region im HoxD13-Protein, intragene Deletionen führen zu Synpolydaktylie und zur Entwicklung rudimentärer Extra-Zehen, mutiert in Brachydaktylie-Patienten

-

IGF2 (insulin-like growth factor II)

(Ingram et al., 2002)

11p15.5

Transkripte vermehrt in Wilms-Tumor; Kandidat für Beckwith-Wiedemann Syndrom; IGF2 unterliegt normalerweise imprinting: bei Hochwuchs-Syndromen Transkription von beiden Allelen

-

IGFBP-6 (Insulin-like growth factor binding protein 6)

(Yoon et al., 2002)

12q13

-

GLI1

LASP1 (Lim und SH3 protein 1)

(Ingram et al., 2002)

17q11-q21.3

überexprimiert in Brustkrebs

-

Mf2 (Maus-Homolog von Foxd2)

(Wu et al., 1998)

Foxd2 1p34-p32

-

-

Mip1-γ (macrophage inflammatory protein 1-gamma)

(Ingram et al., 2002)

mouse 12

-

-

Myf5 (myogenic factor 5)

(Gustafsson et al., 2002)

12q21

-

-

N-myc (N-myc proto-oncogene protein)

(Oliver et al., 2003)

2p24.1

Überexpression in Neuroblastomen und Retinoblastomen

-

Nr4a1 (Orphan nuclear receptor NR4a1)

(Ingram et al., 2002)

12q13

-

-

osteopontin (SPP1)

(Yoon et al., 2002)

4q11-q21

erhöhte Transkriptmengen wurden im Gehirn von Patienten mit multipler Sklerose detektiert

GL1

pax3 (paired box protein Pax-3)

(Ericson et al., 1996)

2q35-37

alveolares Rhabdomyosacrom

-

PAX7 (paired box proteon Pax-7)

(Ericson et al., 1996)

1p36.2-p36.12

Rhabdomyosarcom-2

-

plakoglobin

(Yoon et al., 2002)

17q21

-

GLI1

Poliovirus receptor / CD155

(Solecki et al., 2002)

19q13.2

hochreguliert in Medulloblastomen, Glioblastomen und kolorektalen Karzinomen

GLI1 oder GLI3

PTCH1

(Agren et al., 2004)

9q22.3

Gorlin Syndrom

GLI3

SFRP1 (secreted frizzled-related protein 1)

(Ingram et al., 2002)

8p12-p11.1

-

-

SFRP2 (secreted frizzled-related protein 2)

(Ingram et al., 2002)

4q31.3

-

-

Sox14

(Hargrave et al., 2000)

3q22-q23

-

-

SWiP-1 (SOCS box-containing WD protein SWiP-1 = WSB1)

(Vasiliauskas et al., 1999)

17q11.2

-

-

Tbx1

(Yamagishi et al., 2003)

22q11.21

Kandidat für DiGeorge Syndrom

indirekt: SHH aktiviert Foxc2 und Foxa2, welche Tbx1 induzieren

Thrombomodulin

(Ingram et al., 2002)

20p12-cen

könnte die Ursache von Thrombophilie sein

-

TSC22 (TGFß-stimulated clone)

(Yoon et al., 2002)

13q14

-

GLI1

USP7 (Ubiquitin carbosy-terminal hydrolase 7)

(Yoon et al., 2002)

16p13.3

deubiquitiniert und stabilisiert den Tumorsuppressor p53

GLI1

Wnt5a

(Mullor et al., 2001;Reddy et al., 2001)

3p21-p14

-

GLI1, GLI2, GLI3

Wnt7b

(Mullor et al., 2001)

22q13

hochreguliert in Tumoren

GLI1, GLI2, GLI3

Wnt7c

(Mullor et al., 2001)

Xenopus laevis

-

GLI1, GLI2, GLI3

Wnt8

(Mullor et al., 2001)

human Wnt8A 5q31

human Wnt8B 10q24

-

GLI1, GLI2, GLI3

Wnt8c

(Mullor et al., 2001)

Gallus gallus

-

GLI2, GLI3

Wnt11

(Mullor et al., 2001)

11q13.5

-

GLI2, GLI3

Tab.2.4.1: Darstellung bekannter SHH-Zielgene. Sowohl die Genloci als auch bekannte Krankheitsbilder, die mit Mutationen in den SHH-Zielgenen einhergehen, sind angegeben.

Auch wenn die drei GLI-Proteine möglicherweise nicht die einzigen Vermittler des SHH-Signals sind, wurde jedoch in vielen der SHH-Zielgene eine GLI-Bindungssequenz gefunden. Bei einigen SHH-Zielgenen wie zum Beispiel PTCH1 und GLI1 konnte sogar nachgewiesen werden, dass diese über GLI3 reguliert werden. Allerdings sind weitere Möglichkeiten der Regulation der GLI-Proteine – unabhängig von SHH – nicht auszuschließen. Nichtsdestotrotz wird den GLI-Proteinen die Hauptrolle bei der Transduktion und Interpretation des SHH-Signals zugeordnet.

Die SHH-Signaltransduktionskaskade spielt bei der Embryonalentwicklung des Menschen eine wichtige Rolle. Dies wird besonders deutlich durch Krankheitsbilder, die durch Mutationen in Bestandteilen des SHH-Signalwegs hervorgerufen werden:

Mutationen in SHH führen zu Holoprosencephalie [schwerer Mittelliniendefekt mit Lippen-Kiefer-Gaumenspalte, Hypotelorismus, Fusion der Schneidezähne und Defekten des zentralen Nervensystems; zusammengefasst in (Villavicencio et al., 2000)].

Mutationen, die die Cholesterol-Synthese betreffen, verursachen Smith-Lemli-Opitz-Syndrom [mentale Retardierung, Hypospadie, breiter Nasenrücken, Syndaktylie, Kleinwuchs; zusammengefasst in (Villavicencio et al., 2000)].

Mutationen in PTCH1 resultieren in Gorlin Syndrom [Hypertelorismus, Basalzellkarzinome; zusammengefasst in (Villavicencio et al., 2000)].

Mutationen in GLI3 können sowohl zu Greig-Syndrom [kraniofaziale Fehlbildungen, wie Hypertelorismus, Polydaktylie, Syndaktylie (Debeer et al., 2003;Wild et al., 1997)] als auch zu Pallister-Hall-Syndrom [Polydaktylie, Syndaktylie, undurchgängiger Anus, Gesichtsabnormalitäten (Kang et al., 1997)] oder zu Acrocallosal-Syndrom [Polydaktylie, Hallux Duplikation, Macrocephalus, Agenesie des Corpus Callosum, mentale Retardierung, Lippen-Kiefer-Gaumenspalte, Hypertelorismus (Elson et al., 2002)] führen.

Mutationen in GLI2 führen zu Holoprosencephalie-ähnlichen Phänotypen (Roessler et al., 2003).

Mutationen in CBP verursachen Rubinstein-Taybi-Syndrom [faziale Fehlbildungen, wie breite Nase, Syndaktylie, Kleinwuchs, Mikrocephalus, geistige Behinderung, breite Zehen und Finger; zusammengefasst in (Villavicencio et al., 2000)] (Abb.2.5.1).

Abb.2.5.1: Die SHH-Signaltransduktionskaskade im Menschen. Krankheiten, die durch Mutationen der jeweiligen Bestandteile des Signalwegs hervorgerufen werden, sind aufgeführt (Villavicencio et al., 2000).

Beim Vergleich der hier aufgezählten Krankheitsbilder wird deutlich, dass die SHH-Signaltransduktionskaskade besonders bei der Entwicklung der vorderen Mittellinie eine wichtige Rolle spielt. Es gibt drei bekannte Prozesse, die über den SHH-Signalweg gesteuert werden: Proliferation, Differenzierung und Schutz vor Zelltod. Diese Prozesse sind während der Embryonalentwicklung von besonderer Wichtigkeit. Demnach wird das Schicksal und die Funktion einzelner Zellen während der Embryonalentwicklung durch eine spezifische Kombination der GLI-Proteine und SHH und dem daraus resultierenden Expressionsprofil der SHH-Zielgene gesteuert [zusammengefasst in (Ruiz i Altaba, 1999)]. In Abb.2.5.2 ist das Expressionsprofil von SHH und den GLI-Proteinen gezeigt. Hier wird deutlich, wie die unterschiedliche Expression der GLI-Proteine und von SHH das Schicksal der einzelnen Zellen beeinflussen kann. So induziert die Expression von SHH sowie die der drei GLI-Proteine die Faltung des Neuralrohrs. Später reguliert die Expression der GLI-Proteine das Schicksal der jeweiligen Zellen: Motorneuronen bilden sich in Regionen hoher GLI-Transkriptionsaktivatoren-Expression, Neuralleistenzellen wandern aus Regionen, in denen GLI-Transkriptionsrepressoren exprimiert werden, aus.

Abb.2.5.2: Expression der GLI-Proteine und von SHH während der Embryonalentwicklung. (A) Frühe Neuralplatte. Die Induktion durch SHH ist mit grünen Pfeilen dargestellt, die Induktion durch BMP’s (bone morphogenic proteins) durch rote Pfeile. Die Expression der drei GLI-Proteine ist blau-gelb strukturiert dargestellt. (B) Neuralrohr. Die Induktion durch SHH ist mit grünen Pfeilen dargestellt, die Induktion durch BMP’s (bone morphogenic proteins) ist mit roten Pfeilen dargestellt. Die Regionen der Expression von SHH sind rot dargestellt. Die Regionen, in denen GLI-Transkriptionsaktivatoren exprimiert werden, sind gelb dargestellt, die Regionen, in denen GLI-Transkriptionsrepressoren exprimiert werden, sind blau dargestellt. Die Expression von BMP’s ist rot dargestellt [Abb. gezeichnet nach (Jacob und Briscoe, 2003;Ruiz i Altaba, 1999;Ruiz i Altaba et al., 2003)].