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Kapitel 2. MATERIAL und METHODEN

2.1 Aufbau des Neokortex

Da alle Messungen im Neokortex der Ratte stattfanden, soll auf den Bau dieses Hirnabschnitts eingegangen werden.

Das ektodermale zentrale Nervensystem (ZNS) mit Gehirn und Rückenmark ist aus Nervenzellen (Neuronen) und nicht-neuronalen Zellen (Glia-Zellen) aufgebaut. Von außen umgibt der Cortex cerebri (Großhirnrinde) haubenförmig die darunterliegende weiße Substanz (Substantia alba) des Großhirns sowie darin eingebettete Hirnkerne und wird als entwicklungsgeschichtlich jüngster Hirnabschnitt (Neokortex) angesehen. Bereits makroskopisch ist der Kortex durch eine gräuliche Farbe (Substantia grisea) von der weißen Substanz unterscheidbar. Der Neokortex gliedert sich in verschiedene Areale, die funktionell aus vertikalen Kolumnen unterschiedlicher kortikaler Responsivität aufgebaut sind (Mountcastle, 1957; Hubel, Wiesel, 1959 & 1962; Creutzfeldt, Kuhnt, 1973). Horizontal zur Kortexoberfläche lassen sich mikroskopisch unter NISSL-Färbung 6 verschiedene Schichten erkennen (I-VI):

I	Lamina molecularis
II	Lamina granularis externa
III	Lamina pyramidalis externa
IV	Lamina granularis interna
V	Lamina pyramidalis interna
VI	Lamina multiformis

Die darin befindlichen Neurone kommunizieren mittels Neurotransmitter hauptsächlich durch chemische Synapsen oder gap junctions („elektrische Synapsen“) (Dermietzel, Spray, 1993) miteinander, können durch eine exzitatorische oder inhibitorische Zellantwort Informationen hierarchisch geordnet oder parallel verarbeiten bzw. verändern (van Essen et al. 1992) und bilden so insgesamt ein funktionelles Netzwerk. Die hier vorgestellten Untersuchungen fanden alle im primär-somatosensorischen Kortex des Gyrus postcentralis adulter (Alter >28 Tage postnatal) Albinoratten des Stammes Wistar statt. Dieser Teil des Parietallappens erhält zahlreiche Afferenzen (thalamokortikal, callosal, trigeminal) und sendet corticofugale Fasern zu Thalamus, Corpus callosum, motorische Kerngebiete, Brücke, Rückenmark, sowie intrakortikalen Efferenzen zu anderen Neokortexregionen aus, deren Fasersysteme von den Axonen der Projektionsneurone gebildet werden (Abb. 3A). Die Gliazellen stellen mit 90 % den häufigster Zelltyp des Kortex (Barres, 1991) dar und werden in Astrozyten, Oligodenroglia und Mikroglia unterteilt.

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Abb. 3. 3A (obere Abb.): Vereinfachtes Schema der afferenten thalamokortikalen, intrakortikalen und efferenten Verbindungen im Neokortex der Ratte. Der adulte Neokortex der Ratte besteht wie der anderer Säugetiere aus 6 horizontalen Zellschichten (dargestellt am linken Bildrand). Schwarze Dreiecke symbolisieren exzitatorische Pyramidenzellen (Transmitter: Glutamat), der schwarze Kreis eine multipolare Sternzelle sowie grau schraffierte Kreise veranschaulichen inhibitorische Interneurone (Transmitter: Gamma-Aminobuttersäure (GABA). (aus Luhmann, 1993).
3B: Neurone mit ihrem Dendritenbaum (4, links) sind von Gliazellen (3, hier nur Astrozyt) und zerebralen Kapillaren (2) umgeben, wobei letztere zusammen mit umschließenden Astrozytenfortsätzen die Blut-Hirn-Schranke („BBB“- blood-brain-barrier) bilden (aus Ganong, 1997). Unter in vitro Bedingungen hat die Blut-Hirn-Schranke keinen Einfluß.

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Die Neurone des Neokortex lassen sich morphologisch in Pyramidenzellen und nichtpyramidale Zellen unterscheiden. Ein Teil der Zellen weist an den Dendriten Dornfortsätze auf, an denen oft die Kontaktaufnahme mit anderen Zellen über exzitatorische Synapsen erfolgt. Der überwiegende Teil der laminären Schicht II/III besteht aus bedornten Pyramidenzellen, in denen immunohistochemisch Glutamat oder Aspartat nachgewiesen werden kann und die so eine exzitatorische Funktion ausüben (Feldman, 1984). Funktionell sind diese Neurone Projektionsneurone, die über kortikofugale Fasertrakte Verbindungen zu anderen Neuronen herstellen. Eine weitere exzitatorische Zelle des Neokortex ist die multipolare Sternzelle, der die Funktion eines Schaltneurons zukommt und die morphologisch viele Dornfortsätze an den Dendriten aufweist. Eine andere nichtpyramidale Zellart stellen die intrinsischen Interneurone dar, die an den Dendriten keine oder wenig Dornfortsätze erkennen lassen, histochemisch positiv auf den inhibitorischen Neurotransmitter GABA reagieren (Houser et al. 1984) und somit eine inhibitorische Funktion ausüben. Da zu den Zellarten, die im Neokortex eine selektive Vulnerabilität gegenüber pathophysiologischen Einflüssen aufweisen, Pyramidenzellen der Schicht II/ III sowie die inhibitorischen Interneurone zählen (Rosner et al. 1986; Romijn et al. 1988), fanden die extrazellulären Messungen in Schicht II/III des Neokortex statt.

2.2 Neokortikale Hirnschnittpräparation

Die Entwicklung der in vitro „Slice-Präparation“ stellte eine große Weiterentwicklung der neurophysiologischen Techniken dar, da so eine gezielte Isolierung und standardisierte Beeinflussung physiologischer und pathophysiologischer Mechanismen möglich wurde. Die Tierpräparation zur Gewinnung der neokortikalen Rattenhirnschnitte wurde gemäß einer vorbeschriebenen Methode nach Luhmann und Heinemann durchgeführt (1992).

Insgesamt wurden für die hier vorgestellten Versuche 45 männliche Albinoratten des Stammes Wistar verwendet, wobei von jeder Ratte mehrere Hirnschnitte gewonnen wurden (4 - 10).

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NaCl	KCl	NaH2PO4	MgSO4	CaCl2	NaHCO3	Glukose
124	3	1.25	1.8	1.6	26	10

Durch 2 bis auf die Schädelbasis geführte koronare Schnitte 5 mm ventral und dorsal des Sulcus praecentralis wurde ein den primären somatosensorischen Kortex enthaltender Gewebeblock (Zilles, Wree, 1985) vom übrigen Gehirn abgetrennt. Vorsichtig konnte das separierte Gehirngewebe mit einem rechtwinklig umgebogenen Spatel an der Basis des Lobus parietalis ansetzend herausgehoben und in ein Vorratsgefäß mit eiskalter (4°C ), oxygenierter aCSF überführt werden. Die Oxygenierung erfolgte durch eine Begasung mit Karbogen (Gasgemisch aus 95 % O₂ und 5 % CO₂). Nach Sättigung der aCSF-Lösung mit dem Karbogen-Gasgemisch stellte sich mit der bereits enthaltenen Bikarbonatpufferung bei 34°C ein pH-Wert von 7,4 ein. Der Gewebsblock wurde nach 1 Minute weiterer Kühlung und Oxygenierung im Vorratsgefäß mit einem Spatel auf einem Filterpapier zum Abtrocknen kurz aufgesetzt und im Schlitten eines Campden Vibratoms (Campden Instr., Loughborough, UK) auf einem Teflon-Block mittels Zyanoakrylat-Sekundenkleber Krazy Glue (Borden Inc., Columbus, U.S.A.) fixiert und anschließend unter aCSF-Kühlung, die das Vibratomschneidemesser gut bedeckte, in 400µm dicke Gewebsschnitte (engl. slices) geschnitten. Diese Schnittdicke stellt bei adulten Tieren eine Sauerstoff- und Nährstoffversorgung

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2.3 Interface-Meßkammer

Alle Gewebsschnitte wurden nun in eine oxygenierte Vorratskammer (in Wasserbadheizung auf 32 - 33 °C temperiert) bzw. 2 x 2 Schnitte in die beiden inneren Perfusionskammern des Deckels der Interface (Grenzschicht)-Doppelmeßkammer aus dem Institutseigenbau eingebracht, die in Höhe der Schnitte eine Temperatur von 34°C sicherstellten. Die Interface-Meßkammer bestand aus Plexiglas und war auf einer magnetischen vibrationsgedämpften Arbeitsplatte fixiert. Die Kammer enthielt im unteren Teil destilliertes Wasser, das über eine Heizspirale unter Thermofühlerkontrolle erwärmt wurde. In das erwärmte Wasserbad wurde über einen mehrfach perforierten Polyethylenschlauch Karbogengas eingeleitet, befeuchtet und vorgewärmt. Über dem Wasserbad stellte sich so eine mit Wasserdampf und Karbogengas gesättigte Phase ein, die über seitliche Öffnungen mit den oberen Perfusionskammern in Verbindung stand. An der Heizung war meist ein höherer Sollwert als die gewünschte Temperatur von 34°C in Höhe der Gewebsschnitte eingestellt, da sich das gesättigte Gasgemisch beim Aufsteigen und Eindringen in die eigentliche Meßkammer im oberen Teil wieder leicht abkühlte. Die untere Schnittseite wurde in den Kammern auf Nylonnetzen oder mehreren Lagen KODAK-Linsenpapier gelagert, die eine große Diffusionsoberfläche für die zwischen den Fasern entlang laufende aCSF-Flüssigkeit bot, und kontinuierlich mit aCSF in einer Flußgeschwindigkeit der Badlösung von 1 - 1,2 ml/min umspült. Die umspülende Badlösung wurde über Polyethylenschläuche mittels Abimed-Peristaltikpumpe aus einem Vorratsgefäß zugeführt, das in einer Wasserbadheizung vorgewärmt wurde. Sollte eine Testsubstanz eingewaschen werden, wurde der zuführende Schlauch in ein anderes Vorratsgefäß mit der in einer gewünschten Konzentration gelösten Substanz umgehängt. Vor Beginn der Messungen wurden die Schnitte 1 Stunde inkubiert, wobei beide inneren Kammern mit Filterpapier abdeckt wurden, um die Gasphase über der oberen Schnittseite gesättigt zu halten und ein potentielles Austrocknen der Schnittoberfläche zu verhindern, da der Hirnschnitt sehr sensibel auf ein Austrocknen an der Oberfläche reagiert. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß der Hirnschnitt durch herabfallende Tropfen aus einer übersättigten Gasphase traumatisiert werden kann. Unter Abdeckung der Meßkammer mit Filterpapier stellte

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2.4 Verwendete Testsubstanzen

Die für die in vitro Untersuchungen verwendeten Substanzen wurden mit destilliertem Wasser als konzentrierte Stammlösung hergestellt, in Einzeldosen pipetiert und bei -18°C eingefroren. Vor Versuchsbeginn wurde die gewählte Testsubstanz aufgetaut und auf die gewünschte Konzentration mit aCSF verdünnt. Verwendet wurden in Badapplikation:

Abb. 4a. Struktur von NBQX

-der selektive AMPA-Rezeptor-Antagonist 6-Nitro-7-sulphamoylbenz(f)quinoxalin-2,3-dion (NBQX; Novo Nordisk, 10 µM)

- der selektive NMDA-Rezeptor-Antagonist Ketamin (als Hydrochloridsalz; Sigma, 100 µM)

Abb. 4b. Struktur von Ketamin

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Abb. 5. Struktur von 8-OH-DPAT

-der selektive 5-HT_1A-Rezeptor-Agonist (-)-(R)-2-[4-[(Chroman-2-ylmethyl)amino]butyl]-1,1-dioxo-1,2-benzisothiazol-3(2H)-onmonohydrochlorid (BAY x 3702; Bayer AG; 1, 10 und 100 µM)

Abb. 6. Struktur von BAY x 3702

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2.5 Elektrophysiologische Ableittechnik

Alle elektrophysiologischen Ableitungen erfolgten in Schicht II/III des primär somatosensorischen (Par1 Region) in einem Segment des Parietallappens der adulten Wistar-Ratte (Abb. 7A, 1-2). Für die Feld- und DC-Potentialaufzeichnung wurden 2-5 MOhm messende Mikroelektroden verwendet, die aus einlumigen Thetaglaskapillaren hergestellt und dazu an einem vertikalen Elekrodenziehgerät unter starkem Erwärmen auf eine Spitze von etwa 1 µm ausgezogen wurden. Unter mikroskopischer Kontrolle wurde jede nur einmal zu verwendende Glaselektrode kurz vor einem Versuch auf ca. 3 µm Öffnungsdurchmesser mechanisch zurückgebrochen. Vor Versuchsbeginn wurde die Glaselektrode mittels Injektionsspritze blasenfrei mit aCSF gefüllt, ein chlorierter Silberdraht eingebracht und durch einen Manipulator in gute Position zum Hirnschnitt gebracht und schließlich unter mikroskopischer Sichtkontrolle in Schicht II/III des Hirnschnittes positioniert. Dieser Versuchsaufbau ermöglichte es, Konzentrationsänderungen aller extrazellulären Ionen durch transmembranalen Ionenströme infolge von Neuronenaktivität im Hirnschnitt als elektrische Potentialänderungen durch die elektrisch leitende aCSF Lösung und den Chloriddraht auf einen Vorverstärker zu übertragen. Um von einer konstanten Zellanzahl, die zu diesem Signal beitragen, ausgehen zu können, verblieb jede der Elektroden an ihrem ursprünglichen Ort zu Beginn der Messung. Eine Impedanzwandlung ermöglicht die Registrierbarkeit des Signals, das durch den Vorverstärker 10fach verstärkt wurde, nach einem Tiefpaß von hohen Störfrequenzen befreit und nochmals 100fach nachverstärkt wurde.

Das verhältnismäßig langsame SD-Signal wurde mit einem Einkanalthermoschreiber oder bei dem Versuch mit einer 8fach-Extrazellulärelektrode mittels 8-Kanalschreiber aufgezeichnet. Schnelle Signalveränderungen wie die der evozierten synaptischen Aktivität wurden mit einem Speicheroszillographen festgehalten und auf ihre Verwendbarkeit geprüft. Beide Potentiale wurden neben der graphischen Darstellung nach analog-digitaler on-line Wandlung auf einem Labor-PC mittels des TIDA Softwareprogramms (Heka Electronic, Lambrecht) auf der Computerfestplatte

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Abb. 7. A: Schematische Darstellung eines Rattengehirns, der knöcherne Schädel ist entfernt (A). (A1) Laterale Gesamtansicht. Die vertikale Linie markiert die Schnittebene zur Gewinnung der koronalen Hirnschnitte. (A2) Veranschaulichung der einzelnen Kortexareale eines Koronalschnittes. Fr1 und 3: frontaler Kortex, primäres Motorkortexareal; Fr2: frontaler Kortex, supplementäres Motorkortexareal; HL: hindlimb, sensomotorisches Areal; Par1: parietaler Kortex, primäres somatosensorisches Areal, Par2: parietaler Kortex, sekundäres somatosensorisches Areal. Nach (Mittmann, 1994). Darstellung des Versuchsaufbau im neokortikalen Schnittpräparat des Areals Par1 der Ratte (B). Eine mit aCSF gefüllte extrazelluläre Glaselektrode befindet sich in Schicht II/III. Über eine bipolare Reizelektrode Schicht VI wurden afferente Fasern stimuliert (•), die zu den Neuronen der Schicht II/III projizieren und deren synaptische Feldpotentialantworten registriert. Daran anschließend wurde ein Tropfen aus einer mit 3 M KCl-Lösung gefüllten Glaselektrode ca. 200 µm lateral der aCSF Elektrode auf die Schnittoberfläche appliziert. Dieses Verfahren löst eine typische spreading depression aus. Die eintretende Veränderung des extrazellulären DC-Potentials wurden mit einem XY-Schreiber sowie on-line mit einem Computer aufgezeichnet.

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2.5.1 Synaptisch-evozierte Feldpotentiale

Zum Hervorrufen einer synaptischen Extrazellulärantwort supragranulärer Zellpopulationen wurden thalamokortikale Afferenzen in Schicht VI des Neokortex kurz über der beginnenden Substantia alba mittels parallel zur pialen Oberfläche mit in den Hirnschnitt eingeführten Reizelektrode orthodrom gereizt (Abb. 7B). Die dazu benötigte bipolare Reizelektrode wurde aus scharfen Wolframdrahtelektroden gefertigt, die in bilumiges Thetaglas so eingelassen wurden, daß sie noch ca. 1 cm aus dem Thetaglas herausragten. Mit erwärmten Schellack wurden sie danach in der Glaskapillare fixiert. An zwei Platin-Iridiumdrähte, die mit den Elektroden verbunden und auch jeweils durch Schellack voneinander separiert waren, wurden zwei Silberdrähte angelötet, die später die Verbindung zur Reizisoliereinheit herstellten. An der Reizisoliereinheit war die Reizstärke (2 - 40 V) einstellbar, wobei das Gerät selbst durch ein Reizgenerator (Master 8 A.M.P.I.) angetriggert wurden. Am Reizgenerator war die gewünschte Stimulationsdauer (200 µs) und der Interstimulusintervall (15 - 20 ms) frei wählbar. Die durch orthodrome Stimulation afferenter Nervenfasern evozierten synaptischen Antworten postsynaptischer Zellen konnten mit der extrazellulären Feldelektrode in Schicht II/III registriert werden. Obwohl die transmembranalen Ströme einer einzelnen aktivierten Zelle mit dieser Methode nicht aufgezeichnet werden kann, kommt es durch die Aktivierung einer Vielzahl von Zellen, zu denen die gereizten Afferenzen projizieren, zu einer ausreichenden Summation des Signals, um über die elektrisch leitenden aCSF-Lösung regisriert zu werden. Elektrophysiologische Messungen wurden nur in Hirnschnitten ausgeführt, deren Feldpotentialantwort, gemessen als absoluter Betrag der Differenz von positivster und negativster Potentialspitze (FP1 bzw. FP2), mindestens 1mV betrug („peak-to-peak“-Feldpotentialantwort) und eine intakte Doppelpulshemmung aufwiesen. Ein Doppelpulsprotokoll mit dem vorgenannten Interstimulusintervall von 15 - 20 ms wurde verwendet, um die Intaktheit von Verbindungen vor Versuchsbeginn zu kontrollieren bzw. den Einfluß einer oder mehrerer SDs auf die exzitatorische und inhibitorische synaptische Transmission zu ermitteln. Die Reizung thalamokortikaler Afferenzen zu Pyramidenzellen der Schicht II/III bewirkt eine gleichzeitige Aktivierung von Kollateralen zu inhibitorischen Interneuronen in den granulären Schichten. Die Stimulierung dieser hemmenden Interneurone bewirkt die Auslösung eines GABA vermittelten schnellen inhibitorischen postsynaptischen Potentials (f-IPSP), das auf Pyramidenzellen supragranulärer Schichten hyperpolarisierend und hemmend wirkt. Bei dem verwendeten Interstimulusintervall beträgt die Unterdrückung der Feldpotentialantwort in Schicht II/ III auf den zweiten orthodromen Reiz im Durchschnitt 50-70 % (Luhmann, Heinemann, 1992). Die Stärke dieser sogenannten Doppelpulshemmung ist aufgrund einer höheren Reizschwelle der inhibitorischen Schaltkreise stark von der Eingangsreizstärke der thalamokortikalen Afferenzen und ihrer Kollateralen abhängig, da die inhibitorischen Interneurone bei einer verminderten Reizung der zu ihnen projizierenden afferenter Fasern auch eine verminderten Menge des inhibitorischen Neurotransmitter GABA freisetzen. Deshalb erfolgte eine Standardisierung der Feldpotentialaufzeichnung

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2.5.2 Induktion der Spreading depression (SD)

Die extrazelluläre Kaliumkonzentration beträgt im Gehirn unter physiologischen Bedingungen 3 mM und kann sich während neuronaler Aktivität auf 12 mM erhöhen (Somjen, 1975; Somjen, 1979). Während einer spreading depression kann die Kaliumkonzentration auf Werte von 40 - 60 mM ansteigen (Lauritzen, Hansen, 1992). Diese Sequenz wurde mit der extrazellulären Mikrotropfenapplikation einer 3 M KCl Lösung aus einer Mikrokapillare (Durchmesser 33 - 36 µm) 200 µm lateral von der die DC-Potentialänderung aufzeichnenden Extrazellulärelektrode vorweggenommen und führte zur reproduzierbaren Auslösung einer typischen spreading depression. Die Negativierung des DC-Potential erfolgte abrupt und ohne jegliche Latenzzeit.

2.6 Untersuchungsparameter und statistische Auswertung

Bei extrazellulären Messungen in Schicht II/III des Neokortex der adulten Ratte wurden im allgemeinen nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde Parameter nach folgendem Schema untersucht:

• bei Versuchsbeginn Überprüfung der Intaktheit des Schnittes anhand der transienten Feldpotentialänderung auf einen orthodromen Doppelstimulus (FP1 bzw. FP2)
• Auslösung einer SD und Aufzeichnung der assoziierten DC-Potentialänderung (SD1)
• ggf. Einwaschen einer Substanz für 30 min
• wiederum Auslösen einer Feldpotentialantwort (FP1 bzw. FP2)
• erneute Auslösung einer SD und Aufzeichnung der assoziierten DC-Potentialänderung.

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Abb. 8. A: Typischer Verlauf einer KCl-induzierten spreading depression (SD). Die starke Potentialnegativierung entspricht der SD-assoziierten DC-Potentialänderung. Die Pfeile weisen auf die analysierten SD-Parameter: Amplitude (getrennt nach erstem (P1) und ggf. zweitem Maximum (P2), jeweils in mV; Dauer bei halbmaximaler Amplitude in s sowie Integral der SD in mVs.
B: Repräsentatives Beispiel von durch einen elektrischen Doppelreiz ausgelösten Feldpotentialantworten (FP, jeweils in mV). Die Amplitude einer FP-Antwort auf den zweiten Reiz (FP2) ist je nach Interstimulusintervall und Reizintensität deutlich kleiner als die erste FP-Antwort (FP1). Die Effizienz der intrakortikalen GABAergen Inhibition kann aus dem Verhältnis der Hemmung der zweiten Antwort zur ersten Antwort quantifiziert werden (paired-pulse inhibition, [%]). Negative Potentiale in A und B sind jeweils nach unten aufgezeichnet, die Stimulusartefakte wurden entfernt.

Die Überprüfung der synaptischen Feldpotentialantwort erfolgte durch orthodrome Doppelpulsreizung im Abstand von 20 s. Die so gewonnenen 10 - 12 Feldpotentialantworten wurden PC-gestützt gemittelt und die Amplitude der ersten Feldpotentialantwort (FP1), die Amplitude der zweiten Feldpotentialantwort (FP2) sowie die Stärke der Doppelpulshemmung ermittelt. Betrug FP1 mindestens 1 mV und die Doppelpulshemmung mindestens 40 % wurde der Schnitt verwendet. Zur nun folgenden Auslösung der spreading depression wurde die Tropfenapplikation angewandt. Dabei wurde ein Mikrotropfen der KCl-Lösung aus einer stumpf gebrochenen Glas-elektrode 200 µm lateral der aufnehmenden Extrazellulärelektrode direkt auf die Hirnschnitt-oberfläche appliziert. Nach 3 - 4 s erfolgte der abrupte Beginn der DC-Potentialnegativierung einer SD. Da die verwandten Mikropipetten immer auf einen gleichen Öffnungsdurchmesser von 33 - 36 µm gebrochen waren, ist von einem konstanten Tropfenvolumen auszugehen. Die so aufgezeichnete SD wurde auf die maximale negative Amplitude (Peak1), gegebenenfalls auf eine nach einer relativen Positivierung folgende zweite negative Amplitude (Peak2), auf die Dauer bei halbmaximaler Amplitude sowie auf die Fläche unterhalb der Ausgangslinie (Integral) untersucht. Eine Übersicht der Untersuchungsparameter gibt Abb. 8. In der Versuchsreihe der Ermittlung der Ausbreitungsgeschwindigkeit mit einer 8fach-Extrazellulärelektrode fand keine Auswertung der Feldpotentiale statt, da die Reizelektrode nur unter der ersten Feldpotentialelektrode in den Hirnschnitt eingeführt und dort belassen wurde, da ein mehrfaches Umsetzen unter die

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Da Testreihen bei einem hier vorliegenden Stichprobenumfang von n = 8 - 10 nicht normalverteilt sind, wurden zur PC-gestützten Analyse auf signifikante Unterschiede nichtparametrische statistische Tests unter Verwendung der Programme Excel und SPSS herangezogen. Zum Vergleich von mehreren verbundenen Stichproben kam der Friedmann-two-way-ANOVA-Test zum Einsatz. Beim Vergleich von 2 verbundenen Stichproben wurde der Wilcoxon-matched-pairs-signed-rank-Test, bei 2 nicht verbundenen Stichproben der Mann-Whitney-U-Test verwendet. Als signifikant wurden Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen bei p < 0,05 (*) bzw. p < 0,01 (**) angesehen. Wenn nicht anders angegeben, erfolgt die Angabe der Messwerte als arithmetischer Mittelwert ± Standardabweichung.

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