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8  Zusammenfassung

In Bakterien werden Phospholipide auf der cytoplasmatischen Seite der Plasmamembran synthetisiert. Damit ein gleichmäßiges Wachstum und somit die Stabilität biogener Membranen, d.h. Membranen, an bzw. in denen Lipidsynthese stattfindet, gewährleistet ist, muss zumindestens die Hälfte neu synthetisierter Lipide auf die entgegengesetzte Membranhälfte gelangen. Aus früheren Untersuchungen ist bereits bekannt, dass dieser transversale Phospholipidaustausch, auch als Flip-Flop bezeichnet, sehr schnell, kopfgruppenunabhängig und möglicherweise proteinabhängig ist. Dennoch sind die genauen Mechanismen dieser Prozesse noch weitgehend unverstanden.

Um die oben erwähnten grundlegenden Phospholipidtransportprozesse zwischen beiden Membranhälften genauer untersuchen zu können, wandten wir einen neuartigen, sogenannten stopped-flow BSA back-extraction Assay an. Mit Hilfe dieses Assays, waren wir in der Lage, die transversale Bewegung und die Verteilung von kurzkettigen, fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga über beide Membranhälften in ex vivo-Membranen zu charakterisieren. Der stopped-flow BSA back-extraction Assay basiert auf der Technik der stopped-flow-Spektroskopie und der Tatsache, dass BSA in der Lage ist, kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Lipidanaloga aus der äußeren Leaflet von (biologischen) Membranen zu extrahieren. Wir entschieden uns für invertierte Membranvesikel der Plasmamembran (IIMV) vom E.coli Wildtypstamm MG1655 als Untersuchungsobjekt, einerseits, weil diese Vesikel nur eine Membran besitzen und zum Anderen, weil IIMV sich sehr gut als Modell für den Flip-Flop von Phospholipiden nutzen lassen.

Wir beobachteten, dass kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Analoga der beiden am häufigsten in E.coli vorkommenden Phospholipide, Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylglycerol (PG), sehr schnell, d.h. mit Halbwertzeiten von weniger als drei Minuten, über die Membran von IIMV verteilten. Weiterhin verhielten sich kurzkettige, fluoreszenzmarkierte Analoga von den E.coli-fremden Phospholipiden, Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylserin (PS), ähnlich wie die Analoga von PE und PG. Überraschenderweise, fanden wir heraus, dass alle oben genannten [page 91↓]Phospholipidanaloga im Gleichgewichtszustand nicht gleichmässig über beide Membranhälften verteilt waren. Unseren Ergebnissen zur Folge, waren nur ca. 23% der PE-, 18% der PC-, 34% der PG- und 26% der PS-Analoga auf der cytoplasmatischen Hälfte der IIMV lokalisiert. Schlussfolgernd aus unseren Analysen konnten wir zeigen, dass die transversale Bewegung von Phospholipidanaloga über die Membran von IIMV sehr schnell, bidirektional und kopfgruppenunbhängig ist. Diese Ergenisse konnten wir durch einen alternativen Assay, der auf der chemischen Löschung der Fluoreszenz durch Dithionit beruht, untermauern. Die Analyse von Proteoliposomen, die mit kopfgruppenmarkierten oder langkettigen, fluoreszenten Analoga von PE markiert waren, ergaben, dass die Kettenlänge von Phospholipidanaloga keinen Einfluß auf den Flip-Flop ausübt.

Inwiefern Proteine an dieser transversalen Bewegung der Phospholipidanaloga beteiligt sind, sollten Messungen des Flip-Flop von Analoga an unbehandelten und mit Proteinase K inkubierten Vesikeln zeigen, die aus einem Detergenzextrakt von IIMV rekonstituiert wurden. Zunächst konnten wir zeigen, dass die schnelle Bewegung der Phospholipidanaloga über die Membran von rekonstituierten, nicht mit Proteinase K behandelten Vesikeln (Proteoliposomen) erhalten blieb. Nach Inkubation mit Proteinase K wurde jedoch der Flip-Flop von PE- und PG-Analoga vollständig inhibiert. Um die Proteinabhängigkeit dieses Prozesses intensiver zu untersuchen, rekonstituierten wir Serien von Proteoliposomen mit ansteigendem bakteriellen Proteingehalt. Während wir in Proteoliposomen ohne bakterielle Proteine keinen Flip-Flop feststellen konnten, beobachteten wir, dass in Proteoliposomen mit mehr als 100 µg/ml Proteingehalt, der Flip-Flop der kurzkettigen Analoga von PE und PG sehr schnell war – mit Halbwertzeiten von weniger als zwei Minuten, die wir auch in isolierten IIMV fanden. In Proteoliposomen mit weniger als ~100 µg/ml korrelierte die Anzahl der durch BSA extrahierten fluoreszenten Analoga mit der Menge an aus IIMV in Proteoliposomen rekonstituierten Proteinen. Dieser Umstand wies eindeutig darauf hin, daß eine Proteinkonzentration von unter ~100 µg/ml in den Vesikeln nicht ausreicht, um jeden Vesikel mit einem Flippaseprotein auszustatten. Diese Daten zeigten sehr deutlich, dass die [page 92↓]transversale Bewegung von Phospholipiden über die innere Membran von E.coli durch Proteine vermittelt wird.

Zur Identifizierung der molekularen Grundlagen der proteinvermittelten, schnellen Transversalbewegung von Phospholipiden über IIMV-Membranen, nutzen wir Ionenaustauschchromatografie. Um die IIMV-Proteine zu separieren, wurden Detergenzextrakte von IIMV mittels eines starken Anionenaustauschers in zwei Fraktionen getrennt, und diese fraktionierten Proteine in Proteoliposomen rekonstituiert. Zur unserer Überraschung mussten wir feststellen, dass in keiner der rekonstituierten Fraktionen eine nennenswerte Anreicherung der Flippaseaktivität auftrat. Möglicherweise sind mehrere Proteine, mit unterschiedlichen Nettoladungen, oder aber auch Untereinheiten, die sich nicht durch Anionenaustauscher trennen liessen, am Flip-Flop von Phospholipiden beteiligt. Weitergehende Analysen mit anderen Proteinfraktionierungsmethoden sind notwendig, um den oder die Flippasekomplex(e) zu identifizieren.

Dennoch, die hier präsentierten Daten liefern starke Beweise für die Hypothese, dass der bidirektionale transversale Phospholipidaustausch zwischen den Membranhälften biogener Membranen proteinvermittelt und kopfgruppen-unabhängig ist und kein ATP benötigt.


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