Analysis of components
of the mitochondrial transcription machinery in
Arabidopsis thaliana

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologin Kristina Kühn
geboren am 27.08.1974 in Stollberg

Prof. Dr. Hans Jürgen Prömel
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin in Vertretung

Dekan: Prof. Thomas Buckhout, PhD
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Gutachter:
1. Prof. Dr. Thomas Börner
2. Prof. Dr. Wolfgang Hess
3. Prof. Dr. Frank Kempken

Datum der mündlichen Prüfung: 24. Februar 2006

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde die Transkription mitochondrialer Gene durch die kernkodierten Phagentyp-RNA-Polymerasen RpoTm und RpoTmp der Pflanze Arabidopsis untersucht.

Im Mitochondriengenom von Arabidopsis wurden für 12 Gene Promotoren bestimmt. Diese zeigten verschiedene Sequenzelemente und wichen meist von der für Dikotyle publizierten Konsensussequenz ab. Für die Mehrheit der Gene wurden multiple Promotoren identifiziert. Es wurden weiterhin Promotoren nachgewiesen, welche die Transkription vermutlich nicht funktioneller Sequenzen aktivieren. Architektur, Lokalisation und Nutzung mitochondrialer Promotoren implizieren eine wenig stringente Kontrolle der Transkriptionsinitiation in Arabidopsis-Mitochondrien.

Zur Analyse der Funktionen von RpoTm und RpoTmp wurde ein in vitro-Transkriptionssystem entwickelt. Da RpoT-Enzyme möglicherweise Kofaktoren benötigen, wurde in Arabidopsis nach Genen potentieller mitochondrialer Transkriptionsfaktoren gesucht. Als mitochondriales Protein mit Ähnlichkeit zu mtTFB, einem essentiellen Transkriptionsfaktor in Hefemitochondrien, wurde MetA identifiziert. In in vitro-Assays initiierte RpoTm an verschiedenen Promotoren die Transkription, während RpoTmp keine signifikante Promotorspezifität zeigte. Die spezifische Promotornutzung durch RpoTm erforderte superhelikale DNA. Weder RpoTm noch RpoTmp wurde durch MetA stimuliert. Eine mtTFB-ähnliche Funktion von MetA ist daher unwahrscheinlich. Für MetA wurde ausserdem eine engere phylogenetische Beziehung zu nukleären rRNA-Dimethylasen als zu mtTFB ermittelt.

Die hier vorgestellten Studien belegen die Transkription mitochondrialer Gene in Arabidopsis durch RpoTm; für RpoTmp ist eine nicht-redundante Transkriptionsfunktion denkbar. Die Kofaktor-unabhängige Spezifität von RpoTm für verschiedene Promotoren und die wenig stringente Initiationskontrolle in vivo legen nahe, dass eine individuelle Regulation mitochondrialer Gene in Arabidopsis auf Transkriptionsebene nicht erfolgt.

Eigene Schlagworte: Pflanzenmitochondrien, Mitochondriengenom, Promotor, Transkription, Phagentyp-RNA-Polymerasen

Abstract

Mitochondria depend on a nucleus-encoded transcription machinery to express their genome. The present study examined the transcription of mitochondrial genes by two nucleus-encoded phage-type RNA polymerases, RpoTm and RpoTmp, in the plant Arabidopsis.

For selected mitochondrial genes in Arabidopsis, transcription initiation sites were determined. Most genes were found to possess multiple promoters. The identified promoters displayed diverse sequence elements and mostly deviated from a nonanucleotide consensus derived previously for dicot mitochondrial promoters. Several promoters were detected that activate transcription of presumably non-functional sequences. Promoter architecture, distribution and utilization suggest a non-stringent control of transcription initiation in Arabidopsis mitochondria.

An in vitro transcription system was set up to elucidate the roles of RpoTm and RpoTmp. Since RpoT enzymes possibly require auxiliary factors, the Arabidopsis genome was screened for potential cofactors of phage-type RNA polymerases. A mitochondrial protein (MetA) with similarity to mtTFB, an essential transcription factor in yeast mitochondria, was identified. In in vitro transcription studies, RpoTm recognized various promoters whereas RpoTmp displayed no significant promoter specificity. Promoter recognition by RpoTm depended on supercoiled DNA templates. Transcription initiation by RpoTm or RpoTmp was not affected by MetA, indicating that MetA is not functionally equivalent to mtTFB. Besides, MetA was found to be more closely related to non-mitochondrial rRNA dimethylases than to mtTFB.

The present study establishes RpoTm to transcribe mitochondrial genes; RpoTmp may have a non-overlapping transcriptional role in mitochondria. The cofactor-independent promoter specificity of RpoTm and the apparently non-stringent control of transcription initiation in vivo imply that mitochondrial genes in Arabidopsis may not be regulated individually at the transcriptional level.

Keywords: Plant mitochondria, Mitochondrial genome, Promoter, Transcription, Phage-type RNA polymerase

Zusammenfassung

Im Zellkern kodierte RNA-Polymerasen sind für die Transkription der mitochondrialen Genome eukaryotischer Zellen verantwortlich und übernehmen somit eine zentrale Rolle in der mitochondrialen Genexpression. Für verschiedenen Pflanzenspezies wurden nukleäre T7-phagenähnliche RNA-Polymerasegene (RpoT-Gene) beschrieben, welche vermutlich für katalytische Untereinheiten der mitochondrialen Transkriptionsmaschinerie kodieren. Eine mitochondriale Transkriptionsfunktion von RpoT-Genprodukten in photosynthetisierenden Eukaryoten wurde jedoch bislang nicht nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Transkription mitochondrialer Gene durch die mitochondrialen Phagentyp-RNA-Polymerasen RpoTm und RpoTmp der Pflanze Arabidopsis thaliana untersucht.

Im mitochondrialen Genom von Arabidopsis wurden Transkriptionsstartpunkte ausgewählter Gene und Gencluster bestimmt. Erstmals wurde hier für eine dikotyle Pflanze gezeigt, dass mitochondriale Gene häufig multiple Promotoren besitzen. Die identifizierten Promotoren zeigten verschiedene Sequenzelemente und wichen zumeist signifikant von der für Dikotyle publizierten Konsensussequenz ab. Es wurde darüber hinaus die Funktion von Promotoren nachgewiesen, welche die Transkription nichtkodierender und vermutlich nicht funktioneller Sequenzen aktivieren. Zwischen Promotoraktivitäten in Blüten- und in Blattgewebe wurden keine qualitativen Unterschiede beobachtet. Architektur, Häufigkeit, Lokalisation und Nutzung mitochondrialer Promotoren implizieren eine wenig stringente Kontrolle der Transkriptionsinitiation in Arabidopsis-Mitochondrien.

Die Identifizierung mitochondrialer Promotoren in Arabidopsis ermöglichte die Rekonstitution eines definierten in vitro-Transkriptionssystems zur Analyse der Transkription mitochondrialer Gene durch RpoTm und RpoTmp. In in vitro-Assays mit rekombinanten RNA-Polymerasen initiierte RpoTm an verschiedenen, jedoch nicht allen angebotenen Promotorsequenzen die Transkription, während für RpoTmp keine signifikante Promotorspezifität beobachtet wurde. Offenbar wird die Spezifität des mitochondrialen Transkriptionsapparates für zahlreiche Promotoren durch RpoTm vermittelt. RpoTm initiierte die in vitro-Transkription an Promotoren auf supercoiled-strukturierten, jedoch nicht auf linearen DNA-Molekülen und unterscheidet sich hierin von in früheren Arbeiten charakterisierten transkriptionsaktiven Extrakten aus Pflanzenmitochondrien. Dieser Befund impliziert, dass Kofaktoren, deren Funktion bei einer supercoiled-Konformation der DNA nicht essentiell ist, in in vitro-Assays mit mitochondrialen Extrakten und in vivo die Aufschmelzung der DNA unterstützen. Im Genom von Arabidopsis wurde nach Genen potentieller Kofaktoren von Phagentyp-RNA-Polymerasen gesucht. Ein durch den Kernlocus At5g66360 (MetA) kodiertes Protein, dessen mitochondriale Lokalisation hier nachgewiesen wurde, zeigt Ähnlichkeit zu mtTFB, einem essentiellem Kofaktor der T7-ähnlichen RNA-Polymerasen in Hefe- und Säugermitochondrien. In in vitro-Assays wurde die Initiation der RpoTm- und RpoTmp-abhängigen Transkription in keiner Weise durch MetA beeinflusst. Eine mtTFB-ähnliche Funktion von MetA in der mitochondrialen RNA-Synthese ist daher unwahrscheinlich. In Übereinstimmung hiermit wurde für MetA eine engere phylogenetische Beziehung zu nicht-mitochondrialen rRNA-Dimethylasen als zu mtTFB-Proteinen ermittelt.

Die hier vorgestellten Studien belegen die Transkription mitochondrialer Gene in Arabidopsis durch das Enzym RpoTm; für RpoTmp ist eine nicht-redundante mitochondriale Transkriptionsfunktion denkbar, welche die Erkennung bekannter Promotoren nicht erfordert. Im Pflanzenreich wird hiermit erstmals der funktionelle Nachweis erbracht, dass ein nukleäres Phagentyp-RNA-Polymerasegen für ein Transkriptionsenzym mit mitochondrialer Promotorspezifität kodiert. Die Kofaktor-unabhängige in vitro-Spezifität von RpoTm für verschiedene Promotorsequenzen und die offenbar nicht stringente Initiationskontrolle in vivo legen nahe, dass eine individuelle Regulation mitochondrialer Gene in Arabidopsis auf Transkriptionsebene nicht erfolgt.

Summary

Mitochondria depend on a nucleus-encoded transcription machinery to express their genome and maintain mitochondrial function. In plants, nuclear T7 bacteriophage-like RpoT genes identified in a variety of species have been suggested to encode catalytic subunits of the mitochondrial transcription apparatus. Still, functional evidence has been lacking for RpoT enzymes being involved in mitochondrial transcription in photosynthetic eukaryotes. The present study examined the transcription of mitochondrial genes by two mitochondrial phage-type RNA polymerases encoded by the RpoTm and RpoTmp genes in the plant Arabidopsis thaliana.

To study cis-elements that are recognized by these enzymes, transcription initiation sites of selected mitochondrial genes and gene clusters in Arabidopsis were determined. Most genes were found to possess multiple promoters, revealing for the first time that promoter multiplicity is a common feature of mitochondrial genes in a dicotyledonous plant. The identified promoters displayed diverse sequence elements and for the most part deviated significantly from a nonanucleotide consensus derived previously for dicot mitochondrial promoters. Several promoters were moreover detected that activate transcription of non-coding and presumably non-functional sequences. No qualitative differences in promoter utilization were observed between leaves and flowers. Promoter architecture, distribution and utilization suggest a non-stringent control of transcription initiation in Arabidopsis mitochondria.

The knowledge of mitochondrial promoters in Arabidopsis allowed a defined in vitro transcription system to be set up in order to elucidate the roles of RpoTm and RpoTmp in mitochondrial transcription. Since RpoT-driven transcription from mitochondrial promoters possibly requires a complementation of RpoT enzymes with as yet unidentified auxiliary factors, the Arabidopsis genome was screened for potential cofactors of phage-type RNA polymerases. A protein encoded by the nuclear locus At5g66360 (MetA) and shown here to be imported into mitochondria displays sequence similarity to mtTFB, an essential cofactor of the mitochondrial T7-like RNA polymerase in yeast and mammals that is related to rRNA methyltransferases. In vitro transcription studies examined the abilities of recombinant RpoTm and RpoTmp to transcribe DNA from mitochondrial promoters, and moreover tested MetA for its potential to modulate the transcriptional performances of RpoTm and RpoTmp. RpoTm recognized a variety of promoters whereas RpoTmp displayed no significant promoter specificity. Sequence specificity of the mitochondrial transcription apparatus thus appears to be conferred by the RpoTm core enzyme for the majority of promoters. RpoTm differed in its transcriptional performance from formerly characterized plant mitochondrial extracts in that it did not specifically initiate transcription at promoters located on linear DNA but required supercoiled templates. This indicates a participation of (an) auxiliary factor(s) in DNA melting in transcription experiments using mitochondrial extracts and in vivo, which is obviated by a supercoiled DNA conformation. Transcription initiation by RpoTm or RpoTmp appeared to be not affected by the presence of MetA in the in vitro assay, indicating that MetA does not have a role equivalent to that of yeast or mammalian mtTFB in mitochondrial RNA synthesis. In line with this, phylogenetic analyses revealed MetA to be more closely related to a group of non-mitochondrial rRNA dimethylases than to fungal or animal mtTFBs.

The data presented here establish RpoTm to transcribe mitochondrial genes. They thus provide the first direct linkage in the plant kingdom between an RNA polymerase activity recognizing mitochondrial promoters and a nuclear gene encoding a mitochondrial phage-type RNA polymerase. Experimental results suggest RpoTmp to have a non-overlapping transcriptional role in mitochondria, which might not involve the recognition of known mitochondrial promoters. The cofactor-independent in vitro specificity of RpoTm for diverse promoter sequences and the apparently non-stringent control of transcription initiation in vivo imply that mitochondrial genes in Arabidopsis may not be regulated individually at the transcriptional level.

Table of contents

Tables

Images



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML generated:
06.09.2006