Charakterisierung rekombinanter immunreaktiver Antigene der Krätzmilbe Sarcoptes scabiei

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Dipl.-Biol. Carola Kuhn
geb. von Witzendorff, geb. 30.04.1972 in Hannover

Präsident der Humboldt-Universität
Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. T. Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. R. Lucius
2. Prof. T. Schnieder
3. Prof. W. Presber

Tag der mündlichen Prüfung: 15.04.2005

Diese Arbeit wurde im Rahmen eines von der Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen „Otto von Guericke“ (AiF) geförderten Projektes (Förderungskennzeichen KF 0185602KUL1) durchgeführt.

Zusammenfassung

Die parasitische Milbe Sarcoptes scabiei, die im Stratum corneum ihres Wirtes lebt, ist weit verbreitet. Eine zuverlässige Diagnose mittels herkömmlicher Techniken ist unzulänglich. Serologische Tests unter Verwendung von Gesamtantigen sind aufwändig und teuer in der Herstellung, und Kreuzreaktionen mit freilebenden Milben können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Von dem Einsatz spezifischer rekombinanter Antigene ist eine Verbesserung der Serodiagnostik zu erwarten.

In dieser Arbeit wurde eine cDNA-Bank aller Entwicklungsstadien von S. scabiei var. suis erstellt. Unter Verwendung eines humanen Skabies-positiven Sammelserums wurden 61 rekombinante immunreaktive Klone von S. scabiei isoliert, und das Protein von sieben dieser Klone als Diagnostikkandidaten wurde aufgereinigt. Die identifizierten Sequenzen zeichnen sich z. T. durch das Vorhandensein repetitiver Bereiche aus. Die rekombinanten Proteine wurden im ELISA unter Verwendung von Human- und Schweineseren auf ihre Sensitivität geprüft. Die Antigene zeigten signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen mit den humanen Positiv- bzw. Negativseren, während dies bezüglich der Reaktion mit den porzinen Seren, nur für vier der Antigene der Fall war. Unspezifische Reaktionen mit E. coli-Protein sowie GST bei einem als Fusionsprotein exprimierten Antigen erwiesen sich als störend.

42.6% der isolierten Klone enthalten eine repetitive zentrale Region, deren offener Leserahmen hauptsächlich für die Aminosäuren Glutamat und Lysin kodiert. Obwohl sie große Homologien aufweisen, unterscheiden sich die Transkripte sowohl im zentralen Bereich als auch am 3´-Ende voneinander. Mittels der Southern Blot-Analyse konnte in Sarcoptes nur eine Genkopie detektiert werden, während dieses Gen in Dermatophagoides-Milben nicht nachgewiesen werden konnte. Auf Grund der Spezifität des Antigens für die parasitischen Milben könnte dieses Antigen für die Serodiagnostik besonders geeignet sein. Anhand von immunhistochemischen Untersuchungen wurden entsprechende Proteine in einer Organstruktur, bei der es sich vermutlich um die Hoden der Milben handelt, detektiert.

In dieser Arbeit wurden rekombinante Antigene für die Serodiagnostik der Sarcoptes-Infektion bereitgestellt. Es wurde gezeigt, dass das Expressionssystem E. coli als Produktionssystem rekombinanter Antigene für die Serodiagnostik von Sarcoptes-Infektionen möglicherweise ungeeignet ist.

Eigene Schlagworte: Sarcoptes scabini, rekombinante Antigene, ELISA, Diagnose

Summary

The parasitic mite Sarcoptes scabiei, which lives in the Stratum corneum of the host, is prevalent worldwide. Reliable diagnosis using conventional methods is unsatisfying. Serological tests using the total antigen are labour intensive and expensive to produce, and moreover there exist unspecific crossreactions against house dust mites, which lead to false positive results. We expect an improvement of serological diagnosis using specific recombinant antigens of the Sarcoptes-mites.

In this work, we constructed a cDNA-library of all stages from S. scabiei var. suis. Using scabies-positive pooled human sera, we isolated 61 recombinant immunoreactive clones and purified the protein of seven clones as potential candidates for diagnosis. The identified sequences are partially characterized by the presence of repetitive domains. The recombinant proteins were tested for their sensitivity in the ELISA, using positive and negative human- and porcine sera. There exist significant differences between the reactions of the positive and negative sera for all the seven antigens using human sera. In contrast, with the porcine sera, significant difference could be detected only in four antigens. Reactions against of E. coli-protein and the GST in the fusionprotein caused problems of unspecific background.

42.6% of the isolated clones contain a repetitive central region, and the ORF mainly encodes the aminoacids glutamate and lysine. Altough there exist high homologies, the sequences of the transcripts differ in the central region and at the 3´-end. By southern blot analysis we could show one copy of the gene, while it was not detected in the genome of the free-living Dermatophagoides-mites. As for the specificity for the parasitic mites, the antigens might be good candidates for immunodiagnosis. In immunohistochemical studies the proteins were detected in a paired structure in the posterior part of the mites opisthosoma, which might be the testis.

In this study, recombinant antigens of S. scabiei were produced and tested for the use in immunodiagnosis. It was shown, that the E. coli-expression system might be unsuitable for the production of recombinant antigens for their use in immunodiagnosis of Sarcoptes-infections.

Eigene Schlagworte: Sarcoptes scabiei, recombinant antigens, ELISA, Einleitung

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Sarcoptes scabiei
    • 1.1.1 Der Erreger
    • 1.1.2 Biologie
    • 1.1.3 Wirtsspezifität
    • 1.1.4 Vorkommen
    • 1.1.5 Pathogenese und Klinik
  • 1.2 Bedeutung der Sarcoptes-Infektion
  • 1.3 Therapie
  • 1.4  Immunologie
    • 1.4.1 Immunreaktive Sarcoptes-Antigene
    • 1.4.2 Immunantwort bei einer Sarcoptes-Infektion
    • 1.4.3 Kreuzreaktionen zwischen S. scabiei und anderen Milben
  • 1.5 Diagnostik von Sarcoptes-Infektionen
    • 1.5.1 Konvenzionelle Diagnostik
    • 1.5.2 Nachweis von Sarcoptes-DNA
    • 1.5.3 Serodiagnostik
  • 1.6 Serodiagnostik von Parasiten unter Verwendung rekombinanter Antigene
  • 1.7  Molekularbiologische Studien mit S. scabiei
  • 1.8  Ziel dieser Arbeit
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Material
    • 2.1.1 Parasiten- und Tiermaterial
    • 2.1.2 Laborgeräte
    • 2.1.3 Einwegartikel
    • 2.1.4  Mehrwegartikel
    • 2.1.5 Reagenzien
    • 2.1.6 Kommerzielle Kits und Standards
    • 2.1.7 Enzyme
    • 2.1.8  Seren und Antikörper
    • 2.1.9 Primer
    • 2.1.10  Synthetische Peptide
    • 2.1.11 Vektoren, cDNA-Banken und E. coli-Stämme
      • 2.1.11.1 Expressionsvektoren
      • 2.1.11.2 cDNA-Bank
      • 2.1.11.3  E. coli-Stämme
    • 2.1.12  Lösungen und Puffer
      • 2.1.12.1 Agarosegel-Elektrophorese Puffer
      • 2.1.12.2 Antibiotika
      • 2.1.12.3  Bakterien-Kulturmedien
      • 2.1.12.4 SDS-PAGE
      • 2.1.12.5 Immunoscreening, Western Blot
      • 2.1.12.6 RNA-Isolierung und Reverse Transkription
      • 2.1.12.7 Isolierung genomischer DNA
      • 2.1.12.8 DNA-Hybridisierung
      • 2.1.12.9  Proteaseinhibitoren
      • 2.1.12.10 Löslichkeitstest und Ni-NTA-Affinitätschromatographie
      • 2.1.12.11  Dialyse
      • 2.1.12.12 GST-Affinitätschromatographie
      • 2.1.12.13 ELISA
      • 2.1.12.14 Deglykosilierung von SsGesamtantigen
      • 2.1.12.15 Ellmann´s Assay
      • 2.1.12.16  Immunisierung der BALB/c-Mäuse
      • 2.1.12.17 Immunhistochemie
      • 2.1.12.18 Elektronenmikroskopie
  • 2.2  Methoden
    • 2.2.1 Gewinnung von Parasitenmaterial
      • 2.2.1.1  Sarcoptes scabiei var. suis und Dermatophagoides pteronyssinus
      • 2.2.1.2  Sarcoptes scabiei var. bovis
      • 2.2.1.3 Herstellung von Antigenextrakt
    • 2.2.2  Molekularbiologische Methoden
      • 2.2.2.1 RNA-Isolierung
      • 2.2.2.2 Integrität der Gesamt-RNA
      • 2.2.2.3 Reverse Transkription der Dermatophagoides pteronyssinus-mRNA
      • 2.2.2.4 cDNA-Bank
      • 2.2.2.5  Isolierung und Restriktion genomischer DNA
      • 2.2.2.6 Primer-Design
      • 2.2.2.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
        • 2.2.2.7.1 PCR zur Kontrolle der Qualität der cDNA
        • 2.2.2.7.2 Kolonie-PCR
        • 2.2.2.7.3 PCR zur Amplifikation der repetitiven Sonde für die DNA-Hybridisierung
        • 2.2.2.7.4 PCR zu Amplifikation der repetitiven Sequenzen aus D. pteronyssinus
        • 2.2.2.7.5 PCR zur Kontrolle der Insertionen in pTriplEx2
        • 2.2.2.7.6 PCR zur Amplifikation der immunreaktiven Gene von S. scabiei
      • 2.2.2.8 Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)
      • 2.2.2.9 Agarose-Gelelektrophorese mit DNA-Fragmenten
      • 2.2.2.10 Isolation von DNA-Fragmenten
      • 2.2.2.11  Isolation von Plasmid-DNA
        • 2.2.2.11.1 Extraktion im kleinen Maßstab
        • 2.2.2.11.2 Extraktion im mittleren Maßstab
      • 2.2.2.12 DNA- und RNA-Konzentrationsbestimmung
      • 2.2.2.13 Restriktionsverdau von Vektoren und DNA-Fragmenten
      • 2.2.2.14 Ligation von DNA
      • 2.2.2.15 Herstellung transformationskompetenter E. coli-Bakterien
      • 2.2.2.16 Transformation kompetenter E. coli-Bakterien mit Plasmid-DNA
      • 2.2.2.17 Identifizierung positiver Transformanden
      • 2.2.2.18  Langzeitlagerung von Bakterienstocks
      • 2.2.2.19 Sequenzanalyse
      • 2.2.2.20 Datenbank-Abgleich
      • 2.2.2.21 Identifizierung von Signalpeptiden
      • 2.2.2.22  in vivo-Exzision
      • 2.2.2.23 Expression der Gene in Flüssigkultur
        • 2.2.2.23.1 Genexpression in pTriplEx2 zur Detektion Sarcoptes-spezifischer Klone
        • 2.2.2.23.2  Genexpression im Expressionssystem pQE
          • 2.2.2.23.2.1 Löslichkeitstest
        • 2.2.2.23.3 Expression und Aufreinigung der Proteine
        • 2.2.2.23.4 Expression im System pET und Aufreinigung der Proteine
          • 2.2.2.23.4.1 Expression pET-28
          • 2.2.2.23.4.2 Expression und Aufreinigung in pET-41a (+)
      • 2.2.2.24 Proteinfällung mit Trichloressigsäure
      • 2.2.2.25 SDS-PAGE
        • 2.2.2.25.1  Probenaufbereitung von aufgereinigtem Protein
        • 2.2.2.25.2 Aufbereitung der Proben aus der Genexpression
      • 2.2.2.26 Coomassie-Färbung
      • 2.2.2.27  DNA-Hybridisierung
        • 2.2.2.27.1 Markierung der Sonde mit DIG High Prime
        • 2.2.2.27.2 Spot-Test zur Quantifizierung der Markierungsausbeute
        • 2.2.2.27.3  Detektion der „KE-reichen Antigene“-kodierenden Klone
      • 2.2.2.28 Southern Blot
    • 2.2.3  Biochemische Methoden
      • 2.2.3.1 Synthetische Peptide
      • 2.2.3.2 Kopplung der Peptide an KLH
      • 2.2.3.3 Quantifizierung der Konjugation durch den Ellmann´s Assay
      • 2.2.3.4 Bestimmung von Proteinkonzentrationen
    • 2.2.4  Immunologische Methoden
      • 2.2.4.1 Präabsorption der Seren
      • 2.2.4.2 Immunoscreening
      • 2.2.4.3 Detektion Sarcoptes-spezifischer Klone im Dot Blot
      • 2.2.4.4 Western Blot
        • 2.2.4.4.1 Western Blot mit Humanseren
        • 2.2.4.4.2 Western Blot zur Detektion des Glutathion-S-Transferase-Anhangs
        • 2.2.4.4.3 Western Blot zur Detektion des Histidin-Anhangs
        • 2.2.4.4.4 Western Blot mit BALB/c-Seren
      • 2.2.4.5 Dialyse von harnstoffhaltigen Proteinlösungen
      • 2.2.4.6 ELISA
        • 2.2.4.6.1 Sarcoptes-ELISA 2001^®
        • 2.2.4.6.2 ELISA mit rekombinanten Antigenen und Gesamtantigen
        • 2.2.4.6.3 ELISA mit synthetischen Peptiden
      • 2.2.4.7 Deglykosilierung von SsGesamtantigen
      • 2.2.4.8 Immunisierung von BALB/c-Mäusen
      • 2.2.4.9 Immunhistochemie
        • 2.2.4.9.1  Detektion durch Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierte Antikörper
        • 2.2.4.9.2 Detektion durch Peroxidase-markierte Antikörper
        • 2.2.4.9.3 Hämatoxylin-Eosin Färbung
        • 2.2.4.9.4 Methylenblau Färbung
        • 2.2.4.9.5 Elektronenmikroskopie
    • 2.2.5 Statistische Analyse
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Reaktion der humanen Patientenseren mit SsGesamtantigen im ELISA
  • 3.2  Reaktion der Schweineseren mit SsGesamtantigen im ELISA
  • 3.3 Reaktion der humanen Patientenseren mit SsGesamtantigen im Western Blot
  • 3.4 Antikörperantwort der Patienten gegen deglykosiliertes SsGesamtantigen
  • 3.5  Isolierung der Gesamt-RNA aus Sarcoptes scabiei
  • 3.6 cDNA-Phagen-Bank in λTriplEx2
  • 3.7 Immunoscreening
    • 3.7.1 Insertionsgrößen der isolierten immunreaktiven Klone
  • 3.8 Auswahl von Sarcoptes-spezifischen Klonen
  • 3.9 Charakterisierung, Expression und Aufreinigung der immunreaktiven Antigene
    • 3.9.1 Antigene ohne repetitive Domänen
      • 3.9.1.1 Klon Ss-4
      • 3.9.1.2  Klon Ss-7
      • 3.9.1.3 Klon Ss-17
      • 3.9.1.4 Klon Ss-37
        • 3.9.1.4.1 Sequenzcharakterisierung und Aufreinigung des Proteins
    • 3.9.2  Antigene mit repetitiven Domänen
      • 3.9.2.1 Klon Ss-23
      • 3.9.2.2  Klon Ss-97
      • 3.9.2.3 Klon Ss-134
      • 3.9.2.4 „KE-reiche Antigene“-kodierende Klone
        • 3.9.2.4.1 DNA-Hybridisierung
        • 3.9.2.4.2  Sequenzanalyse
        • 3.9.2.4.3  Strukturanalyse
        • 3.9.2.4.4  Klon Ss-14
        • 3.9.2.4.5 Klon Ss-18
        • 3.9.2.4.6  Detektion der für die „KE-reichen Antigene“-kodierenden Gene in S. scabiei und D. pteronyssinus
        • 3.9.2.4.7 Nachweis der „KE-reichen Antigene“ in SsGesamtantigen
        • 3.9.2.4.8  Lokalisation der „KE-reichen Antigene“ in S. scabiei
          • 3.9.2.4.8.1 Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit KLH-gekoppelten Peptiden
          • 3.9.2.4.8.2  Immunhistochemische Versuche zur Lokalisation der „KE-reichen Antigene“ in S. scabiei
            • 3.9.2.4.8.2.1 Detektion mit FITC-markierten Antikörpern
            • 3.9.2.4.8.2.2 Detektion mit Peroxidase-markierten Antikörpern
            • 3.9.2.4.8.2.3 Methylenblaufärbung von S. scabiei-Semidünnschnitten
            • 3.9.2.4.8.2.4 Elektronenmikroskopische Aufnahmen
  • 3.10 Immundiagnostisches Potenzial der rekombinanten Antigene
    • 3.10.1 Klon Ss-4
    • 3.10.2  KlonSs-7
    • 3.10.3 Klon Ss-17
    • 3.10.4 Klon Ss-18
    • 3.10.5 Klon Ss-23
    • 3.10.6  Klon Ss-37
    • 3.10.7 Klon Ss-97
• 4  Diskussion
  • 4.1 Parasitenmaterial
  • 4.2 Reaktion der Patientenseren mit SsGesamtantigen
  • 4.3 RNA-Isolierung und Klone aus der cDNA-Bank
  • 4.4  Expression der rekombinanten Antigene
  • 4.5 Antigenität und potenzielle Funktionen der isolierten Antigene
  • 4.6  Charakterisierung der für die „KE-reichen Antigene-kodierenden Sequenzen
    • 4.6.1 Genkopien und Transkripte
    • 4.6.2 Lokalisierung der „KE-reichen Antigene“
• 5  Ausblick
• Literatur
• Abkürzungsverzeichnis
• Symbole für Aminosäuren
• Buchstabencode mehrdeutiger Nukleotide (Wobbles)
• Sequenzen der charakterisierten Klone
• Danksagung
• Anhang
• Lebenslauf

Tabellen

• Tab. 1: Darstellung einiger bedeutender Sarcoptes-Varietäten, ihrer Wirte und die hier ausgelöste Krankheit.
• Tab. 2: IgG- und IgM-Titer der für das Immunoscreening (A) und den ELISA mit rekombinanten Antigenen (B) genutzten Skabies-positiven Humanseren (ermittelt von der Afosa GmbH, Luckenwalde)
• Tab. 3: Darstellung der Homologien der bekannten, im Immunoscreening identifizierten Klone. Von den hier gezeigten Klonen wurden die Sequenzen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 8 sowie einer der unter Sequenz 11 zusammengefassten Klone erfolgreich exprimiert und das rekombinante Protein aufgereinigt.
• Tab. 4: Antikörperantworten der mit den synthetischen Peptiden immunisierten BALB/c-Mäuse gegen die jeweiligen Peptide. Die Immunantwort wurde mittels eines anti-IgG-Konjugates im ELISA ermittelt und in den Wellenlangen OD_450/630 gemessen. In Klammern sind die Standardabweichungen angegeben. Die Verdünnung der eingesetzten Seren betrug hier 1/200.
• Tab. 5: Antikörperantworten der mit den synthetischen Peptiden immunisierten BALB/c-Mäuse gegen Ss Gesamtantigen. Die Immunantwort wurde mittels eines anti-IgG-Konjugates im ELISA ermittelt und in den Wellenlangen OD_450/630 gemessen. In Klammern sind die Standardabweichungen angegeben. Die hier dargestellten Werte wurden anhand einer Serumverdünnung von 1/50 ermittelt.
• Tab. 6: Übersicht der Ergebnisse aus den ELISAs mit den rekombinanten Antigenen. A:ELISA mit Humanseren B: ELISA mit Schweineseren

Bilder

• Abb. 1: Lebenszyklus von Sarcoptes scabiei
• Abb. 2: ELISA mit Gesamtantigen von S. scabiei var. suis unter Verwendung von Skabies-positiven und -negativen Patientenseren. Bei den Seren KT4 bis L46 handelt es sich um Seren von erkrankten Patienten, während die Seren S1 bis S20 von gesunden Kontrollpersonen stammen.
• Abb. 3: Index der im ELISA mit rekombinanten Antigenen verwendeten Schweineseren. Die Seren WB1 bis WB23 stammen von Räude positiven-Schweinen, während die Seren 000613/2 bis einschließlich 000425/14 Seren von Räude-negativen Schweinen sind.
• Abb. 4: ELISA mit deglykosiliertem und glykosiliertem Gesamtantigen von S. scabiei var. suis . Nach Deglykosilierung des Antigens wurde ein ELISA unter Verwendung von Skabies-positivem und –negativem Serum durchgeführt. Als Positivkontrolle diente der 24-4 Antikörper, der nur mit der glykosilierten Chitinase der dritten Larven (L3) von A. vitae, nicht aber mit der deglykosilierten reagiert.
• Abb. 5: Darstellung der Gesamt-RNA von S. scabiei im Bioanalyzer (links) und im Ethidiumbromid gefärbten Formaldehyd-Agarosegel (rechts). Die links dargestellte RNA setzt sich aus den im Gel (rechts) aufgetrennten Isolaten (Spur 1-5) zusammen.
• Abb. 6: Beispielhafte Darstellung der Insertionsgrößen von isolierten immunreaktiven Klonen. Die Insertionen wurden mittels einer PCR mit phagenpezifischen Primern amplifiziert. Eine einzelne Bande wurde als Indiz für die Klonalität des jeweiligen isolierten Phagenklons gewertet.
• Abb. 7: Darstellung von sechs der sieben im Western Blot identifizierten Sarcoptes -spezifischen immunreaktiven Klone. Die spezifischen Banden, die eine Reaktivität mit dem Serum aufwiesen, sind markiert (A: Skabies-positives Sammelserum). Eine Reaktion mit dem Sammelserum gesunder Personen (B) ist im Western Blot (rechts) nicht detektierbar. Für alle hier markierten Klone ergab die Sequenzierung eine homologe Sequenz, die sich durch eine hochrepetitive Zentralregion auszeichnet. Ein weiterer Klon (Ss-37), der im Western Blot nur mit dem positiven Serum reagierte, ist hier nicht dargestellt.
• Abb. 8: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-4 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein konnte durch Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 von der Matrix eluiert werden.
• Abb. 9: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-4. Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilie, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.
• Abb. 10: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-7 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilie, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.
• Abb. 11: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-7 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein konnte durch die Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.1 von der Matrix eluiert werden.
• Abb. 12: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-17 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilität, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.
• Abb. 13: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-17 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein konnte durch Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 von der Matrix eluiert werden.
• Abb. 14: Alignment der Aminosäuresequenzen einer vermeintlich aktiven (Sar s 3) und einem inaktiven Serin-Protease Paralog (SMIPP) von S. scabiei sowie der des Klons Ss-37. Die grünen Boxen markieren die Positionen, an denen konservierte Cysteine und die Aminosäuren, die entscheidend für die katalytische Aktivität und Spezifität des aktiven Proteins sind, in den inaktiven Proteinen durch andere Aminosäuren ersetzt sind. Die roten Boxen hingegen markieren die auch in den inaktiven Proteinen konservierten Cysteine.
• Abb. 15: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-37. Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilie, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.
• Abb. 16: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-37 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein wurde durch Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 von der Matrix eluiert.
• Abb. 17: Repetitive Domänen in dem Protein des Klons Ss-23.Die Domänen sind farblich (rot und blau) gekennzeichnet.
• Abb. 18: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-23 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilität, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.
• Abb. 19: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-23 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein wurde durch Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 von der Matrix eluiert.
• Abb. 20: Repetitive Domänen im Protein des Klons Ss-97 . Einige repetitive Domänen sind farblich (rot, blau und schwarz) markiert.
• Abb. 21: Strukturanalyse bezüglich der Immunogenität des Proteins von Klon Ss-97 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilität, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.
• Abb. 22: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-97 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein wurde durch Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 von der Matrix eluiert.
• Abb. 23: Repetitive Domänen in dem Protein des Klons Ss-134 . Die Domänen sind farblich (rot und blau) dargestellt.
• Abb. 24: Potenzielle Immunogenität des Proteins von Klon Ss-134 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilität, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.
• Abb. 25: DNA-Hybridisierung mit den im Immunoscreening isolierten Klonen unter Verwendung der GA-repetitiven Sonde. An Position C4 wurden die Positivkontrolle und an Position D4 die Negativkontrolle aufgetragen. Position E2 zeigt eine positive Reaktion der Sonde mit dem Klon, während alle weiteren hier dargestellten Klone als negativ bewertet wurden.
• Abb. 26: Amplifikation der 5´-Enden der für „KE-reiche Antigene“ kodierenden Sequenzen mittels der RACE-PCR. A: Darstellung der Fragmente im Agarosegel, die unter Verwendung eines Rückwärtsprimers, der eine konservierte Region aller bekannten für „KE-reiche Antigene“ kodierenden Klone repräsentiert, amplifiziert wurde. B: Darstellung des Fragmentes im Agarosegel, das unter Verwendung eines Ss-18-spezifischen Primers amplifiziert wurde. Hierbei handelt es sich um ein unspezifisches Produkt C: Die Sequenzierung eines der Fragmente (253 bp) aus A ergab die dargestellte Sequenz. Bei dem hier markierten Start-Codon handelt es sich um dasselbe, wie bei dem in Abb. 27 markierten.
• Abb. 27: Alignment der Aminosäuresequenz von den sequenzierten, für „KE-reiche Antigene“ -kodierenden Klonen. Die Box an Position 13 (grün) markiert das putative Start-Codon der Klone. Stop-Codons werden in roten Boxen indiziert.
• Abb. 28: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-14 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilität, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.
• Abb. 29: Repetitive Domänen in dem Protein des Klons Ss-18 . Der Klon ist stellvertretend für die anderen Klone, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren, dargestellt, bei denen sich die Domänen entsprechend der Sequenz von den hier dargstellten unterscheiden. Hier sind zwei unterschiedliche Domänen (rot und blau markiert) gezeigt.
• Abb. 30: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-18 /GST über die Glutathione Sepharose® 4B-Matrix (Pharmacia). Das Protein wurde durch die Zugabe von red. Glutation von der Matrix eluiert.
• Abb. 31: Southern Blot Analyse zur Detektion der „KE-reichen Antigene“-kodierenden Sequenzen im Genom von S. scabiei (S.s.) und D. pteronyssinus (D. pt.).Im Gegensatz zu S. scabiei ist bei D. pteronyssinus kein Gen nachweisbar, das für die „KE-reichen Antigene“ kodiert. Bei S. scabiei wurde von diesem Gen eine Kopie nachgewiesen.
• Abb. 32: Western Blot mit SsGesamtantigen zum Nachweis der „KE-reichen Antigene“.Mittels des α-Ss-18/GST-Serums wurden fünf Proteinbanden detektiert.
• Abb. 33: Detektion des rekombinanten Protein von Klon Ss-14 durch die Seren der mit den Peptiden A2, B2 und D2 immunisierten BALB/c-Mäuse Western Blot. M: Marker. Die Spuren 1-9 stellen jeweils die Reaktion der Seren von den immunisierten Tieren dar (Spur 1-3: Tier 1-3 immunisiert mit Peptid A2; Spur 4-6 Tier 1-3 immunisiert mit Peptid B2; Spur 7-9 Tier 1-3 immunisiert mit Peptid D2; Spuren 10-18: Reaktionen der korrespondierenden 0-Seren). Die Pfeile markieren die jeweiligen positiven Reaktionen.
• Abb. 34: Lokalisation der immunreaktiven „KE-reichen Antigene“: Immunhistochemische Detektion einer paarigen Struktur im posterioren Teil des Opisthosomas von S. scabiei var . bovis. A: Unter Verwendung eines gegen das repetitive Peptid A2 gerichteten BALB/c-Serums und eines FITCmarkierten Antikörpers konnte die markierte Struktur in Gefrierschnitten von den Milben nachgewiesen werden. B: Lichtmikroskopische Aufnahme der untersuchten Milbe C: Übereinander gelegte Bilder aus A und B D: Anhand eines negativen Kontrollserums wurde diese Struktur in dem darauffolgenden Gefrierschnitt nicht detektiert.
• Abb. 35: Methylenblaufärbung eines Semidünnschnittes von S. scabiei. Pfeile markieren ein paariges Organ im posterioren Opisthosoma einer Milbe unbekannten Geschlechts. a: abgetrennter Kopf, b: braune Bestandteile: Fettzellen, c: Struktur wird in den folgenden Schnitten unpaar, d: Anus
• Abb. 36: Elektronenmikroskopische Aufnahme der paarigen Struktur aus Abb. 35 in einem darauffolgenden Schnitt.B: Feindarstellung der in A dargestellten Struktur. a: Proteinansammlungen, b: Nuklei
• Abb. 37: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen von Klon Ss-4 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.
• Abb. 38: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen von Klon Ss-4 . Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
• Abb. 39: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen von Klon Ss-7 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.
• Abb. 40: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen von Klon Ss-7 . Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
• Abb. 41: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen von Klon Ss-17 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.
• Abb. 42: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen von Klon Ss-17. Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
• Abb. 43: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen von Klon Ss-18 /GST als GST-Fusionsprotein. Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.
• Abb. 44: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen von Klon Ss-18/GST als GST-Fusionsprotein abzüglich der Reaktion gegen reines GST.Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, die Seren S1 bis einschließlich S20 sind Seren gesunder Personen. Die Reaktion im ELISA gegen reines GST wurde von der Reaktion gegen das Fusionsprotein subtrahiert.
• Abb. 45: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen von Klon Ss-18 /GST als GST-Fusionsprotein. Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
• Abb. 46: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen von Klon Ss-18 /GST als GST-Fusionsprotein abzüglich der Reaktion gegen reines GST. Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine. Die Reaktion im ELISA gegen reines GST wurde von der Reaktion gegen das Fusionsprotein subtrahiert.
• Abb. 47: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen des Klons Ss-23 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.
• Abb. 48: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen des Klons Ss-23 . Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
• Abb. 49: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen des Klons Ss-37 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.
• Abb. 50: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen des Klons Ss-37 . Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
• Abb. 51: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen des Klons Ss-97 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, die Seren S1 bis einschließlich S20 sind Seren gesunder Personen.
• Abb. 52: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen des Klons Ss-97 . Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.