2  Material und Methoden

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Die Skabies-positiven Humanseren sowie die der Hausstaubmilbenallergiker waren vor der Verwendung in dieser Arbeit im ELISA auf Antikörper gegen Sarcoptes-scabiei var. suis Gesamtantigen von der Afosa GmbH (Luckenwalde) getestet worden. Die Berechnung der Indizes erfolgte auf der Grundlage von mitgeführten Positiv- (OD=1.0) und Negativ-Kontrollseren (OD=0.00). Im Folgenden sind die IgG- und IgM-Titer der verwendeten Skabies-positiven Seren aufgeführt (s. Tab. 2):

Tab. 2: IgG- und IgM-Titer der für das Immunoscreening (A) und den ELISA mit rekombinanten Antigenen (B) genutzten Skabies-positiven Humanseren (ermittelt von der Afosa GmbH, Luckenwalde)

Die IgG-Titer der Schweineseren, die in dem ELISA mit rekombinantem Antigen verwendet wurden, wurden vor Gebrauch im Sarcoptes-ELISA 2001^® (Afosa GmbH) getestet. Die Indizes sind im Ergebnisteil aufgeführt.

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Die Primer wurden von den Firmen Roth (Karlsruhe) und TIB MOLBIOL (Berlin) synthetisiert.

OligodT

TPI (Triosephosphatisomerase)

CCE (Aktin)

TriplEX-Insertion

GA-Sonde

5´ RACE

Ss-4

[Seite 37↓]Ss-7

Ss-14

Ss-17

Ss-18

Ss-23

Ss-37

Ss-97

Ss-134

Die Peptide wurden von der Arbeitsgruppe von Dr. R. Volkmer-Engert (Medizinische Immunologie, Charité) synthetisiert.

A2-C:N´ C-ßA-KEEKEKKEKEEKEKKEKE ´C

B2-C:N´ C-ßA-QMYNEGQDPSMPTLTR ´C

D2-C:N´ C-ßA-DSFQSDVDEFQRYS ´C

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Acrylamid-Gebrauchslösungen

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Sowohl die Sarcoptes scabiei var. suis- als auch die Dermatophagoides pteronyssinus-Milben wurden von der Afosa GmbH (Luckenwalde) als kryozertrümmertes Material, das bei - 80 °C gelagert wurde, zur Verfügung gestellt. Komplette Sarcoptes-Milben, die bei ebenfalls bei - 80 °C eingefroren waren, dienten als Ausgangsmaterial für die Southern Blot-Analyse.

Für die Immunhistochemie wurden S. scabiei var. bovis-Milben verwendet, die von der Merial GmbH (Rohrdorf) zu Verfügung gestellt wurden. Hautgeschabsel von infizierten Rindern wurden unter dem Binokular bei Beleuchtung für 20 min bei RT inkubiert, und die ausgewanderten Milben anschließend mit einem Haarpinsel eingesammelt.

Für die Gewinnung von Gesamtantigen aus den kryozertrümmerten Milben wurden diese in PBS aufgenommen und einer einminütigen Ultraschallbehandlung bei 60 W auf Eis unterzogen. Anschließend wurden die aufgeschlossenen Milben 20 min bei 4 °C zentrifugiert (12.000 UpM) und der Überstand mit dem Antigen abgenommen. Das Antigen wurde bei - 20 °C gelagert, bis es im Western Blot oder im ELISA verwendet wurde.

Sämtliche Mehrwegartikel, die für die RNA-Isolierung benötigt wurden, wurden vor Verwendung einer RNAse-degradierenden Behandlung unterzogen. Zu diesem Zweck wurden Pipetten mit 0.1 M NaOH, 1 mM EDTA und DEPC-H₂O gesäubert. Gelelektrophoresetanks wurden mit 0.5% SDS behandelt und im Anschluss daran zunächst mit DEPC-H₂O und dann mit 70% Ethanol ausgespült. Es wurden nur RNase freie Einwegartikel verwendet.

Als Ausgangsmaterial für die RNA-Isolierung dienten ca. 20 mg kryozertrümmerte Milben, die nach der Lyse über QIAshredder Säulen (QIAGEN) homogenisiert worden waren. Die RNA von S. scabiei var. suis sowie von die von D. pteronyssinus wurde mit Hilfe des RNeasy^® Mini Kits (QIAGEN) nach Vorgaben des Herstellers isoliert. Das Grundprinzip dieser RNA-Isolierung basiert auf der selektiven Bindung von RNA > 200 bp an eine Silikat-Gel-Membran in stark denaturierendem Guanidin-Isothiocyanat Puffer. Die RNA wird abschließend in RNAse-freiem destilliertem H₂O eluiert.

Die Integrität der isolierten Gesamt-RNA wurde mittels der denaturierenden Gelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung der RNA überprüft. Unter elektrophoretischen Bedingungen sind die Phosphatgruppen im Rückgrat der Nukleinsäuren ionisiert und die Polydesoxynukleotide liegen als Polyanion vor. Sie bewegen sich im elektrischen Feld von Kathode zu Anode, und diese Beweglichkeit ist im Wesentlichen von der Größe der DNA bzw. RNA abhängig. Die entsprechenden Banden der ribosomalen RNA (28 S und 18 S) sollten als deutliche Banden zu erkennen sein, was als Indiz für eine unterbliebende Degradierung der RNA während der Präparation gewertet wird.

0.6 g hochschmelzende Agarose (Roth) wurden mit 5 ml 10 x FA-Puffer versetzt, auf 50 ml Gesamtvolumen mit DEPC-H₂O aufgefüllt und durch Aufkochen gelöst. Nach Abkühlung auf 65 °C wurden die Lösung mit 0.9 ml Formaldehyd sowie 1.5 μl Ethidiumbromid versetzt. Durch die Zugabe von Ethidiumbromid werden, auf Grund dessen interkalierenden Eigenschaft, Ribonukleinsäuren fluoreszenzmarkiert.

Nach Erstarren des Gels wurde dieses 30 min in 1 x FA- Laufpuffer equilibriert. 20 μl der RNA wurden mit 1 x RNA Ladepuffer versetzt, 3 min auf 65 °C erhitzt, auf Eis abgekühlt und anschließend damit das Gel beladen. Die RNA wurde bei 80 V nach Größe aufgetrennt und mit Hilfe eines UV-Transilluminators sichtbar gemacht. Es wurden nur die RNA-Isolate, bei denen im Gel zwei eindeutige Banden identifiziert werden konnten, für anschließende Zwecke weiterverwendet.

Die Qualität der RNA von S. scabiei, die für die Erstellung der cDNA-Phagen-Bank genutzt wurde, wurde zusätzlich im Bioanalyzer (Agilent) im Max-Planck-Institut (MPI) für Infektionsbiologie, Berlin geprüft.

Mittels der Reversen Transkriptase kann die mRNA unter Verwendung eines Poly-T-Primers in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben werden. Auf diese Weise können dann spezifische Transkripte in einem Organismus mittels einer PCR nachgewiesen werden. Zur Transkription der mRNA von D. pteronyssinus wurden ca. 5 μg der Gesamt-RNA mit 0.5 μg des Oligo-dT Primers versetzt und 10 min auf 70 °C erhitzt. Die Probe wurde 2 min auf Eis abgekühlt und anschließend 120 pmol eines jeden Nukleotids sowie 1 x Erststrangpuffer (Promega) und 10 mM DTT zugegeben. Es folgte eine zweiminütige Inkubation bei 42 °C, bevor 200 U Reverse Transkriptase (Promega) zu dem Reaktionsansatz pipettiert wurden. Nach einer weiteren Inkubation bei 42 °C für 50 min wurde das Enzym 15 min bei 70 °C hitzeinaktiviert. Die Qualität der cDNA wurde anschließend durch eine PCR mit spezifischen Primern für die Haushaltsgene Aktin und Triosephosphatisomerase überprüft (s. Punkt 2.2.2.7.1).

Die cDNA-Bank von S. scabiei var. suis wurde kommerziell (Clontech BD Biosciences) hergestellt. Als Ausgangsmaterial diente die mittels des RNeasy^® Mini Kits (QIAGEN) isolierte Gesamt-RNA der Milben. Auch die Amplifikation der cDNA-Bank erfolgte kommerziell.

Die genomische DNA (gDNA) von S. scabiei, die für die Detektion der „KE-reichen Antigene“ kodierenden Gene im Southern Blot benötigt wurde, wurde aus ca. 20 mg Milben isoliert. Zunächst wurden die Milben in Stickstoff zermörsert und dann in 1.5 ml Lysispuffer ü/N bei 50 °C verdaut. Das Lysat wurde für eine Denaturierung der Proteine mit der gleichen Menge Phenol versetzt, kurz geschwenkt und dann für 10 min bei 5000 x g und 4 °C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen und für eine weitere Reinigung der DNA mit der gleichen Menge Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol versetzt. Nach kurzem Schwenken wurde wiederum zentrifugiert und die DNA ü/N gegen die 1000fache Menge TE-Puffer bei 4 °C unter Rühren dialysiert. Am nächsten Tag erfolgte eine weitere Dialyse gegen 1 l TE_low-Puffer für 3 h, um die Konzentration des EDTA möglichst niedrig zu halten.

Die gDNA wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI und HindIII jeweils 2 h bei RT verdaut. Der Versuchsansatz setzte sich wie folgt zusammen:

15 μg gDNA

40 U Enzym

1 x Restriktionspuffer

Anschließend wurden 1/10 des Volumens 3 M Na-Acetat und 2.5 des Volumens eiskaltes Ethanol abs. zugegeben und die DNA ü/N bei - 20 °C gefällt. Es folgten eine Zentrifugation von 45 min bei 4 °C und ein anschließendes Waschen des DNA-Pellets mit 70% Ethanol. Die DNA wurde abschließend in 20 μl HPLC-H₂0 aufgenommen und für den Southern Blot verwertet (s. Punkt 2.2.2.28).

Bei der Primersynthese sollte im Allgemeinen ein Anteil an G/C-Nukleotiden von ca. 50% eingeplant werden. Des Weiteren wird eine optimierte Bindung der Primer an die DNA durch das Vorhandensein von ein bis zwei G/C-Nukleotiden am 3´-Ende des Primers ermöglicht, so dass das Risiko einer fehlerhaften Amplifikation verringert werden kann.

Für die spezifische Amplifikation von DNA-Sequenzen wurden Primer mit einer Länge von 12-30 Nukleotiden eingesetzt. Am 5´-Ende der Primer konnte für die [Seite 52↓]Klonierung der PCR-Fragmente eine Restriktionsstelle eingefügt werden. Ein weiteres überhängendes Ende aus zwei bis drei unspezifischen Nukleotiden am 5´-Ende ermöglichte ein effizientes Schneiden des PCR-Produktes durch das jeweilige Restriktionsenzym. Die Schmelztemperatur (T_m) der Primer wurde durch folgende Formel ermittelt:

T_m= {22+1.46 * [(Anzahl A + Anzahl T) + 2 * (Anzahl G + Anzahl C)]}

Die PCR (Mullis und Faloona 1987) wurde zur Amplifikation von cDNA-Sequenzen aus Plasmiden und Transkriptionsansätzen sowie zur Überprüfung eines Transformationserfolges (Kolonie-PCR) eingesetzt. Sie wurde unter Verwendung der unter Punkt 2.1.9 aufgeführten PCR-Primern in dem Thermoblock MJ Research PTC-200 (BIOzym) in 50 μl-Reaktionsansätzen durchgeführt.

Die Qualität der cDNA wurde mittels einer PCR mit Primern, die die Haushaltsgene (housekeeping genes) Aktin und Triosephosphatisomerase amplifizieren, überprüft. Ein Reaktionsansatz enthielt folgende Komponenten:

1x PCR Puffer

1.5 mM MgCl₂

40 μM je dNTP

je 50 pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer

1 U Taq DNA Polymerase

0.5-5 ng cDNA

Zur Amplifikation des Aktin-Gens wurden die Primer CCE 104 und -105 verwendet, während das Triosephosphatisomerase-Gen unter Verwendung der Primer TPI 5´ und -3´ amplifiziert wurde.

Die PCR begann mit einem Denaturierungsschritt bei 94 °C für 3 min. Es folgten 35 Zyklen mit 30 s Denaturierung bei 94 °C, 1 min Anlagerung der Primer bei 54 °C und [Seite 53↓]1 min Extension bei 72 °C. An den letzen Zyklus schloss sich ein Extensionsschritt von 10 min bei 72 °C.

Für die Detektion positiver Transformanden wurde die Hälfte einer putativ positiven E. coli-Kolonie in 10 μl dest. H₂O aufgenommen und für 5 min auf 95 °C erhitzt. 5 μl dieser Suspension wurden dann in der jeweiligen PCR eingesetzt. Der PCR-Ansatz sowie das PCR-Programm richteten sich nach den Bedingungen, unter denen auch die Klonierung der betreffenden Sequenz stattgefunden hatte.

Die Sonde für die DNA-Hybridisierung wurde aus dem aufgereinigten PCR-Produkt des Klons Ss-14 amplifiziert. Auf Grund der Tatsache, dass der Rückwärtsprimer innerhalb dieser Sequenz mehrfach bindet, konnte die Sonde mit der erwarteten Größe von 180 bp erst nach vier PCR-Durchläufen amplifiziert werden. Ein Reaktionsansatz enthielt die unter Punkt 2.2.2.7.1 aufgeführten Komponenten, mit der Ausnahme, dass 2.5 mM MgCl₂ und 10 pmol eines jeden Primers eingesetzt wurden.

Zur Amplifikation wurden die Primer RepGA-F und RepGA-R verwendet. Die PCR begann mit einem Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 min. Es folgten 30 Zyklen mit 30 s Denaturierung bei 94 °C, 30 s Anlagerung der Primer bei 55 °C und 30 s Extension bei 72 °C. An den letzen Zyklus schloss sich ein Extensionsschritt von 5 min bei 72 °C. Nach der Auftrennung des PCR-Produktes im Agarosegel wurde der Bereich des DNA-Schmiers, von einer Größe < 500 bp aus dem Gel herausgeschnitten und die DNA aufgereinigt (s. Punkt 2.2.2.10). Es folgte eine weitere PCR mit der aufgereinigten DNA und Aufreinigung der Produkte < 300 bp unter den oben genannten Bedingungen. Nach einer erneuten Aufreinigung des PCR-Produktes erfolgte eine weitere PCR mit den Ausnahmen, dass die Anlagerungstemperatur der Primer 54 °C betrug und lediglich 1.5 mM MgCl₂ eingesetzt wurden. Dieses Produkt, dessen Größe zwar < 250 bp betrug, das allerdings noch nicht als klare Bande im Gel zu identifizieren war, wurde wiederum als aufgereinigtes Template in einer abschließenden PCR eingesetzt, in der ebenfalls [Seite 54↓]eine Anlagerungstemperatur von 54 °C gewählt wurde, die Konzentration des MgCl₂ allerdings 2 mM betrug. Dieses Produkt wurde dann für eine Amplifikation und Sequenzierung in das Plasmid pGEM^®-T Easy (Promega) (s. Punkt 2.2.2.14) ligiert.

Mittels einer PCR sollte untersucht werden, ob die für die „KE-reichen Antigene“- kodierenden Transkripte, die in den Sarcoptes-Milben gefunden worden waren, auch in den Hausstaubmilben nachweisbar sind. Zu diesem Zeck wurden verschiedene Primerkombinationen verwendet. Ein PCR-Reaktionsansatz setzte sich wie unter Punkt 2.2.2.7.1 beschrieben zusammen, abgesehen davon, dass die MgCl₂-Konzentrationen zwischen 1.5 und 3 mM lagen, und 10 pmol von jedem Primer verwendet wurden.

Es wurden hier die Primerkombinationen Ss14F/RepGA-R, Ss-18F/RepGA-R, und RepGA-F/Ss14R sowie Ss14F/Ss14R und Ss18F/Ss14R verwendet. Die PCR begann mit einem Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 min. Es folgten 35 Zyklen mit 30 s Denautrierung bei 94 °C, 1 min Anlagerung der Primer bei 55-58 °C und einer Extension bei 72 °C für 1 min. An den letzen Zyklus schloss sich ein Extensionsschritt von 5 min bei 72 °C.

Die Größe der Insertionen der identifizierten Klone in dem Plasmid pTriplEx2 wurde durch eine PCR mit den phagenspezifischen Primern TriplEx5´und TriplEx3´ ermittelt. Der Reaktionsansatz setzte sich wie unter Punkt 2.2.2.7.1 beschrieben zusammen, abgesehen davon, dass nur 10 pmol je Primer für die PCR verwendet wurden. Die PCR begann mit einem Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 min. Es folgten 30 Zyklen mit 30 s Denaturierung bei 94 °C und 4 min Anlagerung der Primer sowie Extension bei 68 °C. An den letzen Zyklus schloss sich ein Extensionsschritt von 10 min bei 72 °C.

Für die Expression und Aufreinigung der immunreaktiven Antigene mussten die in das Plasmid pTriplEx2 inserierten Fragmente in Expressionsvektoren umkloniert werden. Zu diesem Zweck wurden diese jeweils durch eine PCR mit Primern, die am [Seite 55↓]5´- und 3´-Ende eine Restriktionsstelle für eine anschließende Klonierung trugen, amplifiziert. Der Reaktionsansatz für die Klone Ss-7, -14, -18, -23, -37, -97 setzte sich wie unter Punkt 2.2.2.7.5 beschrieben zusammen.

Der Reaktionsansatz für die Klone Ss-4 und -17 setzte sich mit Ausnahme der Konzentration des MgCl₂ (2.5 mM) gleichermaßen zusammen, ebenso wie für den Klon Ss-134, bei dem der PCR-Ansatz 3 mM MgCl₂ enthielt.

Die PCR für den Klon Ss-4 begann mit einem Denaturierungsschritt bei 94 °C für 3 min. Es folgten 35 Zyklen mit 45 s Denaturierung bei 94 °C, 1 min Anlagerung der Primer bei 55 °C und 1 min Extension bei 72 °C. An den letzen Zyklus schloss sich ein Extensionsschritt von 5 min bei 72 °C. Die PCR für die Klone Ss-7, -17 ,-97, -14, -18 und -23 verlief unter den gleichen Bedingungen mit der Ausnahme, dass die Anlagerungstemperatur der Primer für erstere Klone 59 °C betrug, während sie für Ss-14, -18, -23 bei 69 °C lag.

Die PCR für den Klon Ss-37 begann mit einem Denaturierungsschritt bei 94 °C für 1 min. Es folgten 25 Zyklen mit 30 s Denaturierung bei 94 °C, 1 min Anlagerung der Primer bei 59 °C und 1 min Extension bei 72 °C. An den letzen Zyklus schloss sich ein Extensionsschritt von 10 min bei 72 °C.

Die PCR für den Klon Ss-134 begann mit einem Denaturierungsschritt bei 94 °C für 3 min. Es folgten 30 Zyklen mit 1 min Denaturierung bei 94 °C, 1 min Anlagerung der Primer bei 65 °C und 1 min Extension bei 72 °C. An den letzen Zyklus schloss sich ein Extensionsschritt von 5 min bei 72 °C.

Die Methode der RACE-PCR (Frohman et al. 1988) ermöglicht die Vervollständigung von Sequenzen, deren 5´- bzw. 3´-Enden unbekannt sind.

Für die Aufklärung des 5´-Bereichs der für die „KE-reichen Antigene“-kodierenden Sequenzen wurde der BD SMART™ RACE cDNA Amplification Kit sowie der BD Advantage™ 2 PCR Kit (BD Biosciences) benutzt. In der SMART-Technologie wird eine Reverse Transkriptase verwendet, die eine terminale Transferase Aktivität entwickelt, durch die an das 3´-Ende der cDNA drei bis fünf Cytosine (C) angehängt werden. Ein Primer, der an seinem 3´-Ende drei Guanine (G) enthält, lagert sich an diese C-reiche Region und dient dann als erweitertes Template für die Reverse Transkription.

Es wurden 900 ng Gesamt-RNA von S. scabiei für die Reaktion der Transkription eingesetzt. Die Durchführung dieses Versuchs erfolgte nach Vorgaben des Herstellers. Die anschließende PCR wurde ebenfalls nach Vorgaben des Herstellers mit Hilfes des BD Advantage™ 2 PCR Kits durchgeführt. Hier wurden die Primer RACE5´-Ss18R und GArep5´RACE-R als Rückwärtsprimer verwendet.

DNA-Fragmente für analytische und präparative Zwecke wurden in Agarosegelen nach Größe aufgetrennt. Für die Präparation der Agarosegele wurde 1% hochschmelzende Agarose (Roth) in TAE-Puffer durch Aufkochen gelöst und dieser Lösung nach Abkühlen 1.5 μl Ethidiumbromid zugefügt. Die DNA-Proben wurden mit Farbstoffschwerelösung (6 x Agarose-Ladepuffer) versetzt und im Vergleich zu einem DNA-Standard (Rapidozym) zur Bestimmung der Fragmentgröße auf das Gel getragen. Die elektrophoretische Auftrennung der Fragmente erfolgte bei einer Spannung von 120 V in TAE-Puffer.

Die Isolierung von PCR-Fragmenten wurde mittels des NucleoSpin^® Extraction Kits (Macherey & Nagel) entsprechend der Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die Methodik dieses Kits beruht auf der selektiven Bindung der DNA an eine Silikatmembran unter Hochsalz- und einer abschließenden Elution unter Niedrigsalzbedingungen (dest. H₂O).

Lediglich das PCR-Produkt der Sonde, die für die Durchführung der DNA-Hybridisierung und des Southern Blots synthetisiert wurde, wurde mit Hilfe des NucleoTrap^® Gel Extraction Kit (Macherey & Nagel) aufgereinigt. Dieses PCR-Produkt mit einer Länge von 180 bp war zu klein, um in genügenden Mengen über die Membran aufgereinigt zu werde. Das Prinzip dieser Aufreinigung beruht auf der reversiblen Bindung von DNA an eine speziell aktivierte Matrix (Suspension) in Gegenwart von chaotropen Salzen. Selbst kurze Fragmente mit einer Länge von 20-50 bp können bis zu 50% unter Niedrigsalzbedingungen zurück gewonnen werden.

Plasmid-DNA im kleineren Maßstab wurde mittels des NucleoSpin^® Mini Plasmid Kits (Macherey & Nagel) gewonnen. Die Extraktion erfolgte nach Vorgaben des Herstellers. Das Prinizp beruht auf der Lyse von plasmidtragenden Bakterienzellen aus einer Kultur von bis zu 5 ml. Die Inkubationszeit garantiert eine Freisetzung der Plasmid-, nicht aber der chromosomalen DNA. Nach Zugabe des salzhaltigen Neutralisationspuffers wird das im Lysepuffer enthaltene SDS und die daran gebundenen Komponenten gefällt und abzentrifugiert. Der Überstand mit der Plasmid-DNA wird auf die DNA bindende aktivierte Silikat-Membran gegeben und in dest. H₂O eluiert.

Plasmid-DNA im mittleren Maßstab wurde mit Hilfe des NucleoBond^® Midi Plasmid Kits (Macherey & Nagel) nach Vorgaben des Herstellers isoliert. Auf diese Weise kann Plasmid-DNA aus einer Bakterienkultur bis zu 50 ml gewonnen werden. Die Plasmid-DNA wird über seine Phosphatgruppen an die Anion-Austausch-Membran gebunden und ebenfalls in dest. H₂O eluiert.

Die Konzentration von DNA und RNA in Lösung wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Der Reinheitsgrad der Nukleinsäurepräparation wurde durch den Quotienten der Extinktionsmessung von 260 nm/280 nm bestimmt, der für eine proteinfreie DNA-Lösung bei 1.8 und für eine reine RNA-Lösung bei 2.0 liegen sollte. Der Quotient der Extinktionswerte von 260 nm/230 nm hingegen gibt den Grad der Kontamination durch Kohlenhydrate, Peptide, Phenol oder aromatische Komponenten an, und sollte für beide Präparationen bei 2.2 liegen. Beide Werte gelten für neutrale Lösungen.

Restriktionsenzyme sind in der Lage, doppelsträngige DNA-Moleküle an spezifischen Erkennungsstellen zu binden und zu spalten. Unter Verwendung dieser Enzyme können DNA-Fragmente gerichtet kloniert werden.

Für den Restriktionsverdau wurden 2-10 μg DNA in einem Reaktionsansatz von 10-20 μl mit 10-20 U der entsprechenden Restriktionsendonukleasen und den dazu gehörenden Puffern versetzt. Die Inkubationsdauer und -temperatur sowie die Zugabe von BSA wurden nach Vorgaben des Herstellers für das betreffende Enzym festgelegt. Vor der Aufreinigung wurden die DNA-Fragmente im Agarosegel nach Größe aufgetrennt oder direkt, wenn keine anderen DNA-Fragmente in dem Ansatz zu erwarten waren, über eine Silikat-Membran aufgereinigt (s. Punkt 2.2.2.10).

In Gegenwart von DNA-Ligasen können DNA-Fragmente durch die Ausbildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei benachbarten Nukleotiden miteinander verknüpft werden.

Die Gene oder Genfragmente, die in den Plasmiden pET (Novagen) oder pQE (QIAGEN) exprimiert werden sollten, wurden nach vorhergegangener Restriktion mit den entsprechenden Enzymen in 10-20 μl Reaktionsansätzen mit den jeweiligen Plasmiden ligiert, die ebenfalls mit den entsprechenden Enzymen geschnitten worden waren.

Die Menge des zu inserierenden Fragmentes errechnete sich aus folgender Formel:

(100 ng Vektor x kb Insert / kb Vektor) x 5 = ng Insert

Ein Ligationsansatz setzte sich folgendermaßen zusammen:

ca. 100 ng Vektor

x ng Insert

1x T4 Ligationspuffer

400 U T4 Ligase

Die Ligation erfolgte 2 h bei RT oder ü/N bei 16 °C. Die Klone Ss-4, -7, -14, -17, -18, -23, -37, -97, -128 und –134 wurden zur Expression der Gene in das Plasmidsystem pQE-30 (QIAGEN) kloniert. Eine Klonierung in die Expressionssysteme pET-28 und pET-41a (+) (Novagen) erfolgte außerdem noch für die Klone Ss-14 und -18.

Die Fragmente, die in den Vektor pGEM^®-T Easy (Promega) inseriert wurden, wurden ebenfalls unter den oben beschriebenen Bedingungen ligiert, allerdings ohne eine vorangegangene Restriktion der DNA. DieTaq Polymerase produziert in der PCR keine glatten Enden, sondern schafft in der Mehrzahl der Fälle einen unspezifischen Überhang von einer Base, die meist ein Adenin ist. Auf Grund dieser Eigenschaft können Fragmente in Vektoren mit einem sog. T-Überhang, wie der pGEM^®-T Easy, ohne vorangegangene Restriktion effizient ligiert werden.

Des Weiteren wurde die Ligation in diesem System ü/N bei 4 °C durchgeführt.

Die meisten Bakterienarten nehmen DNA nur im begrenzten Umfang auf. Aus diesem Grund können sie, um wirksam transformiert zu werden, einer physikalischen und/oder chemischen Behandlung unterzogen werden.

Die Herstellung transformationskompetenter E. coli-Zellen wurde nach dem Protokoll von Inoue et al. (1990) durchgeführt. Der betreffende Bakterienstamm wurde über Nacht in LB-Medium angezogen und im Verhältnis 1/100 in SOB-Medium überimpft. Bei einer optischen Dichte OD₆₀₀ von ca. 0.6 wurden die Zellen für 10 min auf Eis inkubiert und anschließend abzentrifugiert (2500 x g, 10 min, 4 °C). Das Bakterienpellet einer 200 ml-Kultur wurde in 64 ml kaltem TB-Puffer resuspendiert und nach einer weiteren Inkubation auf Eis für 10 min erneut pelletiert. Die Zellen wurden dann in 16 ml TB-Puffer aufgenommen und unter Rühren mit 7% DMSO versetzt. Es folgte eine erneute Inkubation von 10 min auf Eis, bevor die Bakterien in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei - 80 °C gelagert wurden.

200 μl transformationskompetente E. coli-Bakterien wurden auf Eis aufgetaut und mit 2-10 μl eines Ligationsansatzes für 30 min auf Eis inkubiert. Auf einen Hitzeschock bei 42 °C für 90 s folgte eine erneute Inkubation auf Eis für 2 min. Die Bakterien wurden anschließend in 800 ml SOC-Medium bei 45 min bei 37 °C geschüttelt und dann auf dem geeignetem Selektivmedium ausplattiert. Nach einer Inkubation ü/N bei 37 °C konnte es so zu einer Ausbildung Plasmid-tragender Kolonien kommen.

Die Plasmide pGEM^®-T Easy (Promega) wurden in E. coli JM109 und die Plasmide pQE-30, -31, -32 (QIAGEN) in E. coli XL1Blue kloniert. Dahingegen wurden die [Seite 60↓]Plasmide pET (Novagen) zunächst in E. coli BL21DE und erst anschließend in E. coli DH5αtransformiert. Dieser Schritt beruht auf der Tatsache, dass das besondere Merkmal des pET-Expressionssystems die minimale Hintergrund-Expression bei Abwesenheit der T7 RNA-Polymerase ist, da die Wirtspolymerase nicht an den T7 Promotor bindet. Außerdem liegt die Multiple Cloning Site (MCS) des Vektors in einer Region, die durch die Leseaktivität der bakteriellen Polymerase äußerst schwach, wenn überhaupt, transkribiert wird. So wird vom Hersteller empfohlen, die Plasmide für größere Ausbeuten zunächst in recA #Symbol# endA #Symbol# -Stämme zu transformieren, da unter diesen Umständen ein schwaches Wachstum der Zellen oder eine Instabilität des Plasmids durch die basale Expression vermieden werden kann.

Positive Transformanden, die das Plasmid pQE oder pET 28 bzw. 41a (+) mit der gesuchten inserierten DNA-Sequenz trugen, wurden zunächst durch eine Kolonie-PCR identifiziert (s. Punkt 2.2.2.7.2). Im Falle eines positiven Signals wurde die verbliebende halbe Bakterienkolonie in LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum angezogen und nach einer Plasmidpräparation ein Restriktionsverdau unter Verwendung der entsprechenden Restriktionsenzyme durchgeführt. Stimmte die Größe der inserierten Sequenz mit der zu erwartenden überein, wurde die Identität zusätzlich durch eine Sequenzierung bestätigt.

Positive Transformanden, die das Plasmid pGEM^®-T Easy (Promega) trugen, konnten durch ein Blau/Weiß-Screening identifiziert werden. Dieses Plasmid trägt eine MCS, die in die α-Peptid kodierende Region des Enzyms β-Galactosidase inseriert ist. Eine insertionale Inaktivierung des Peptids ermöglicht eine direkte Identifizierung rekombinanter Klone durch eine Farb-Differenzierung auf Indikatorplatten. Nach Zusatz von X-Gal und IPTG kommt es nur in Klonen, die das intakte β-Galactosidase-Gen enthalten, zur Expression des Enzyms. Dieses setzt das X-Gal als Substrat in einer blauen Farbreaktion um. Die weißen Kolonien wurden zunächst durch eine Kolonie-PCR auf Insertion geprüft und anschließend durch Restriktion bestätigt.

Bakterienstocks für die Langzeitlagerung wurden aus einer ü/N-Kultur in LB-Medium mit dem entsprechenden Zusatz von Antibiotika angelegt. Ein Aliquot der Kultur wurde mit 7% Glycerin versetzt und nach Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff bei - 80 °C gelagert.

Die Sequenzierung von Plasmid-DNA wurde nach Aufreinigung (s. Punkt 2.2.2.10) von der Firma AGOWA (Berlin) nach dem Didesoxynukleotid-Verfahren von Sanger et al. (1977) durchgeführt. Dieses automatisierte Sequenzierverfahren basiert auf dem Einbau nukleotidspezifischer Farbstoffe während der Sequenzierreaktion, die nach Anregung durch Laserlicht einer bestimmten Wellenlänge Licht einer anderen spezifischen Wellenlänge emittieren. So können die Reaktionsprodukte bereits während der Auftrennung mit einem auf die Farbstoffe adaptierten laseroptischen System detektiert werden. Die Lichtsignale werden automatisch ausgewertet. Die Gen- und Proteinsequenzen wurden mittels des Computerprogramms MacVector (Accelrys) analysiert.

Epitopbestimmende Aminosäuren wie polare oder solche mit großen Seitenketten beeinflussen die immunogene Potenz der Epitope. Des Weiteren sollten immunogene Abschnitte mit eher hydrophilen Aminosäuren für die Erkennung exponiert auf der Oberfläche des Moleküls liegen. Diese Epitope sind flexibel und weisen keine ß-Struktur auf. Die Aminosäuren Glycin und Prolin, die hier gehäuft auftreten, führen zu einer Umkehr des Verlaufs der Polypeptidkette. Die potenzielle Immunogenität der rekombinanten Proteine wurde anhand dieser Parameter (MacVector, Accelrys) ermittelt.

Die seqenzierten Klone wurden durch einen Datenbank-Abgleich unter Gebrauch des Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) näher charakterisiert. Die Sequenzen wurden zunächst durch einen BLASTX-Abgleich, in dem Nukleotidsequenzen in Aminosäuresequenzen drei Leserahmen translatiert werden und mit Proteinen in öffentlichen Datenbanken verglichen werden, untersucht. Zusätzlich wurden die [Seite 62↓]Nukleotidsequenzen mit den öffentlich zugänglichen Nukleotidsequenzen und denen der Expressed Sequence Tag (EST)-Datenbank (BLASTN) abgeglichen. In einer BLASTP-Analyse, in der Proteine untereinander verglichen werden, konnten konservierte Domänen detektiert werden. Sequenzenanalysen von Klonen, die Anhäufungen bestimmter Aminosäuren aufwiesen, wurden unter Berücksichtigung geringer Komplexizität durchgeführt. Der E-Wert (Expect value), der in diesen Analysen angegeben wird, ist ein Parameter, das die Anzahl der Treffer beschreibt, die zufällig erwartet werden können, wenn eine Datenbank einer bestimmten Größe durchsucht wird. Je näher dieser Wert bei „0“ liegt, desto größer ist die Signifikanz des jeweiligen Treffers.

Eukaryotische, sekretorische Proteine werden in der eukaryotischen Zelle durch ihr Signalpeptid für eine spätere Passage in den sekretorischen Stoffwechsel zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) geleitet. Werden diese Gene heterolog in E. coli exprimiert, kann die Assoziation oder Inkorporation des Proteins in die Membran einen toxischen Effekt auf die Zelle haben.

Aus diesem Grund wurden die identifizierten immunreaktiven Klone auf das Vorhandensein von Signalpeptiden untersucht (SignalP Server: www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/; Nielsen und Krogh 1998). Mit Hilfe der SignalP-Methode kann die Existenz klassischer Signalpeptide, die am weitesten verbreitet sind und durch die Signal Peptidase I (SPase) gespalten werden, vorhergesagt werden. Die Antigene wurden ohne Signalpeptid kloniert.

Die MCS des λTriplEx2-Phagemids ist innerhalb eines Plasmids lokalisiert, das wiederum in dem Phagengenom liegt und durch loxP-Stellen flankiert wird. Die Überführung des λTriplEx2-Phagemids in einen E. coli-Stamm, der die Cre-Recombinase exprimiert, resultiert in der Freisetzung an den loxP-Stellen und einer anschließenden Zirkularisierung des Plasmids. Für die Bestimmung der Spezifität und der damit verbundenen Expression der immunreaktiven Klone in Flüssigkultur sollten die Plasmide aus den Phagen exzisiert werden.

E. coli-Bakterien des Stammes BM25.8 exprimieren die Cre-Recombinase bei Wachstumsbedingungen von 31 °C. Diese Bakterien wurden auf LB/Chloramphenicol/Kanamycin-Platten ausplattiert, bei 31 °C ü/N inkubiert und für den weiteren Gebrauch bei 4 °C gelagert. Für die sog. in vivo-Exzision wurde von dieser Platte eine einzelne Kolonie auf LB/MgSO₄/Chloramphenicol/Kanamycin-Platten überimpft und ebenfalls bei 31 °C ü/N inkubiert. Eine einzelne Kolonie wurde dann in 10 ml LB-Medium überführt, die Bakterien bei 31 °C bis zu einer optischen Dichte OD₆₀₀ von 1-1.4 wachsen lassen und mit 10 mM MgCl₂ versetzt. Ein Phagenklon wurde von einer Platte ausgestochen und die Phagen 3-4 h in 350 μl 1 x λ-Dilution-Buffer auswandern lassen. Für die Exzision des Plasmids wurden 200 μl der Bakterienkultur mit 150 μl des Phageneluats kombiniert und 30 min bei 31 °C inkubiert. Anschließend wurden 400 μl LB-Medium zugefügt und die Kultur eine weitere Stunde bei 31 °C geschüttelt. 10 μl der infizierten Zellsuspension wurden auf LB/Ampicillin Platten ausplattiert und ü/N bei 37 °C inkubiert. Von den Platten wurden einzelne Kolonien für Plasmidpräparationen im kleinen Maßstab (s. Punkt 2.2.2.11.1) isoliert, und die Größe der Insertionen nochmals durch PCR überprüft. Für eine Expression der Antigene folgte eine Transformation von E. coli XL1Blue mit den jeweiligen Plasmiden (s. Punkt 2.2.2.16).

Die im Immunoscreening isolierten Antigene sollten auf eine spezifische Reaktion mit Sarcoptes-positiven Seren, im Vergleich zu Sarcoptes-negativen und denen von Hausstaubmilbenallergikern, geprüft werden. Zu diesem Zweck wurde aus einer ü/N Kultur der Klone in LB-Medium/Ampicillin 200 μl entnommen und in 5 ml LB-Medium/Ampicillin überimpft. Nach ca. 2 h Inkubation im Schüttelinkubator bei 37 °C und 220 UpM war eine OD₆₀₀ von 0.6-0.8 erreicht, und die Genexpression wurde durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Nach 4 h weiterer Inkubation wurde die Expression durch das Auftragen der entnommenen Proben vor bzw. nach Induktion auf dem SDS-Gel überprüft und anschließend im Western Blot auf die Reaktion mit den entsprechenden Seren überprüft (s. Punkt 2.2.4.4.1).

Bei einer Überexpression in Bakterien kann es zu der Bildung von Proteinaggregaten (inclusion bodies) kommen. Proteine, die im Überschuss vorliegen und nicht verwertet werden können, werden so von den Zellen eingeschlossen. Unter diesen Umständen können rekombinante Proteine nicht unter nativen Bedingungen aufgereinigt werden. Die Bedingungen, unter denen die hier vorliegenden rekombinanten Proteine aus den Bakterienzellen isoliert werden konnten, wurden durch die Durchführung eines Löslichkeitstest ermittelt. Zu diesem Zweck wurde das Bakterienpellet einer induzierten 500 ml Kultur gedrittelt und die Zellen jeweils in Puffer A, B und C aufgenommen.

Die Menge (ml) des eingesetzten Puffers (y) errechnete sich aus folgender Formel:

(OD₆₀₀ x 40) / 2 = y

Die Zellen, die in Puffer C unter nativen Bedingungen resuspendiert worden waren, wurden durch eine Ultraschallbehandlung (3 min bei 60 Watt) und ein anschließendes dreimaliges Schockfrieren im Ethanol-Eisbad und Auftauen unter lauwarmen Wasser lysiert. Die Zellen in Puffer A und B hingegen wurden durch Rühren mit dem Magnetrührer bis zu einer Klärung der Lösung aufgeschlossen. Die Zellrückstände wurden dann 30 min bei 13.000 UpM abzentrifugiert und das Pellet in der gleichen Menge des entsprechenden Puffers aufgenommen. Durch die Analyse auf dem SDS-Gel mit anschließender Coomassie-Färbung (s. Punkt 2.2.2.26) wurde ermittelt, unter welchen Bedingungen das rekombinante Protein in den Überstand entlassen wurde.

Die in das Expressionssystem pQE 30,-31 und -32 (QIAGEN) klonierten Gene oder Genfragmente wurden für die Aufreinigung der rekombinanten Proteine unter folgenden Bedingungen als 6-Histidin-Fusionproteine exprimiert:

Aus einer Bakterien-ü/N-Kultur in LB-Medium/Ampicillin wurden 20 ml auf 500 ml LB-Medium/Ampicillin/1% Glucose überimpft. Durch die Zugabe der Glucose wird die [Seite 65↓]basale Expression in diesem System unterdrückt. Nach dem Erreichen einer OD₆₀₀ von 0.6-0.8 wurden die Gene oder Genfragmente durch die Zugabe von IPTG in einer Konzentration von 0.1, 0.5 und 1 mM zur Expression induziert. Nach einer Induktion im Schüttelinkubator von 3 h bei 37 °C und 220 UpM wurden die Zellen durch eine 15minütige Zentrifugation bei 4°C und 3000 UpM geerntet.

Für die anschließende Aufreinigung der rekombinanten Proteine wurden die Zellen unter den Bedingungen, die sich im Löslichkeitstest (s. Punkt 2.2.2.23.2.1) für das betreffende Protein als optimal erwiesen hatten, lysiert. Über die Histidin-Fusion am N-Terminus folgte die Bindung des rekombinanten Proteins an ein Ni²⁺-Säulenmaterial.

Der Überstand des Zelllysats wurde zweimal auf 1 ml Ni-NTA-Matrix (QIAGEN), die vorher mit dem entsprechenden Lysispuffer äquilibriert worden war, pipettiert. Es folgten drei Waschschritte: Die Matrix, auf die Lysate in Puffer A und B geladen worden war, wurde jeweils mit 10 ml des jeweiligen Lysispuffers und anschließend mit 10 ml des Puffer D und E gewaschen, bevor die gebundenen Proteine mit 5 ml des Puffers H eluiert wurden. Die Matrix, auf die Bakterien-Lysate in Puffer C pipettiert worden war, wurde zunächst mit 10 ml des Lysispuffers und anschließend jeweils mit 10 ml der Puffer F und G gewaschen. Eine Elution des Proteins erfolgte in 5 ml Puffer J. Das Volumen aller Elutionsfraktionen betrug 0.5 ml.

Die Klone Ss-14 und Ss-18 wurden in das Expressionssystem pET28 kloniert. Die Genexpression wurde, wie unter Punkt 2.2.2.23.3 beschrieben, durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Das Medium enthielt hier keine Glucose, da in diesem System keine basale Expression auftritt.

Das Expressionssystem pET-41 ermöglicht durch die Fusion des klonierten Fragmentes mit dem löslichen Protein Glutathion-S-Transferase (GST) am N-Terminus eine native Aufreinigung des Fusionsproteins.

Die Klone Ss-14 und Ss-18 wurden in das Expressionssystem pET-41a (+) kloniert. Durch die Zugabe von 1 mM IPTG wurde die Genexpression induziert. Der Aufschluss der Bakterien erfolgte, wie unter Punkt 2.2.2.23.2.1 beschrieben, unter nativen Bedingungen in dem Lysispuffer GST.

Das rekombinante Protein wurde anschließend über eine Glutathion-Matrix aufgereinigt. Zu diesem Zweck wurde 1 ml Matrix zunächst mit 20 ml eiskaltem PBS pH 7.4 gewaschen und anschließend 30 min schwenkend mit der Proteinlösung inkubiert. Nach Ablaufen des Überstandes wurde die Matrix mit 20 ml PBS gewaschen und das Protein in 4 ml Elutionspuffer GST (0.5 ml-Fraktionen) eluiert.

Proteine, die Guanidiniumpuffer gelöst waren oder solche, die aufkonzentriert werden mussten, wurden durch Zugabe von Trichloressigsäure (TCA) gefällt. Zu diesem Zweck wurden die Probe mit 5% TCA versetzt und 30 min auf Eis gestellt. Es folgte eine Zentrifugation von 30 min bei 4 °C und 13.000 UpM. Das Protein-Pellet wurde mit 200 μl eiskaltem Ethanol abs. gewaschen, getrocknet und das Protein in PBS gelöst.

Proteine werden bei der eindimensionalen Gelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen nach Laemmli (1970) in Gegenwart von 0.1% SDS entsprechend ihres Molekulargewichtes in Richtung Anode aufgetrennt. Die Polypeptide werden bei der Probenaufbereitung in SDS-Probenpuffer hitzedenaturiert. Der Zusatz des anionischen Detergenz bewirkt eine Überlagerung der Eigenladung der Proteine, so dass anionische Mizellen mit konstanter Nettoladung pro Masseneinheit entstehen (Gassen und Schrimpf 2002).

Die SDS-Gele wurden in der unter Punkt 2.1.12.4 beschriebenen Zusammensetzung gegossen und die Proteine in vertikalen Elektrophorese-Apparaturen (Hoefer) in der diskontinuierlichen Elektrophorese bei 120 V nach Größe und Ladung aufgetrennt.

Die aufgereinigten Proteine wurden mit 1 x Ladepuffer versetzt, die Proben 5 min bei 95 °C hitzedenaturiert und kurz abzentrifugiert, bevor sie auf das Gel geladen wurden.

Aus der Bakterienkultur wurde 1 ml entnommen und die Zellen abzentrifugiert. Das Pellet wurde in einer Menge (μl) PBS (y) aufgenommen, die sich nach folgender Formel berechnete:

(OD₆₀₀ x 50) / 0.6 = y

Nach Zugabe des Probenpuffers wurden die Proben wie oben beschrieben erhitzt und das Zelllysat anschließend 5 min bei 13.000 UpM abzentrifugiert. 15 μl des Überstandes pro Spur wurden auf das Gel geladen.

Die Proteine wurden nach Auftrennung im SDS-Gel durch eine Inkubation von 1 h bei 60 °C in Coomassie-Färbelösung und einer anschließenden Entfärbung des Geles in Coomassie-Entfärbelösung sichtbar gemacht.

Mit allen im Immunoscreening identifizierten Klonen wurde eine DNA-Hybridisierung mit Hilfe des DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche) durchgeführt. Hier werden DNA-Sonden, die mit dem Steroid-Hapten Digoxygenin (DIG) markiert sind, für eine Hybridisierung genutzt, so dass in einer nachfolgenden Enzymreaktion die Chemilumineszenz detektiert werden kann.

Für die DNA-Hybridisierung wurde eine DNA-Sonde von 161 bp Länge, bestehend aus 43 bp der konservierten GA-repetitiven Sequenz und 118 bp des konservierten Bereichs, der stromaufwärts der repetitiven Sequenz liegt, verwendet (s. Punkt 7.4.10). Mit allen im Immunoscreening isolierten Klonen wurde unter Gebrauch der GA-repetitiven Sonde eine DNA-Hybridisierung durchgeführt. Auf diese Weise konnte die Anzahl der Klone, die die repetitiven Sequenzen enthalten, ermittelt werden, ohne dass eine Sequenzierung durchgeführt werden musste.

Für die Markierung der Sonde mit DIG wurden ca. 700 ng des aufgereinigten PCR-Produktes in 16 μl dest. H₂O 10 min bei 95 °C denaturiert und anschließend auf Eis abgekühlt. 4 μl der DIG High Prime-Markierungslösung wurden zugegeben und der Ansatz ü/N bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch das Erhitzen auf 65 °C für 10 min beendet.

Die Markierungsreaktion der DIG-markierten Sonde wurde durch Auftragen einer Verdünnungsreihe im Vergleich zu einer Verdünnungsreihe von DIG-markierter Kontroll-DNA nach Vorgaben des Herstellers überprüft. Die Detektion der Markierung erfolgte wie unter Punkt 2.2.2.27.3 beschrieben. Auf Grund der geringen Konzentration der DIG-markierten Sonde wurde für die Detektion der Klone, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren, der gesamte Markierungsansatz in 10 ml Hybridisierungspuffer aufgenommen und für die DNA-Hybridisierung verwendet.

Für die Detektion der Klone, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren, wurden je 1 μg des exzisierten Plasmids auf eine mit 5 x SSC angefeuchtete Nylonmembran (Pall) pipettiert und diese getrocknet. Die DNA wurde durch die Positionierung der Membran mit der DNA-Seite nach oben auf mit Denatierungspuffer durchtränktem Whatmanpapier denaturiert (15 min). Anschließend erfolgte eine zweimalige Neutralisation von jeweils 15 min auf mit Neutralisationspuffer durchtränktem Whatmanpapier, bevor die Membranen erneut getrocknet und dann durch UV-Crosslinking fixiert wurden. Nach einer 45minütigen Prähybridisierung bei 38 °C im Prähybridisierungspuffer wurden die Membranen über Nacht bei 38 °C mit der Sonde im Hybridisierungsofen inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Membranen mit 2 x SSC/0.1% SDS und anschließend zwei Mal mit 0.5 x SSC/0.1% SDS jeweils 5 min gewaschen. Es folgte ein Waschschritt von 3 min mit dem Waschpuffer, bevor unspezifische Bindungsstellen für 30 min mit dem Blockierungspuffer blockiert wurden. Daran schlossen sich eine Inkubation von 30 min mit dem anti-DIG-Antikörper (1/10000 in Blocklösung) und zwei Waschschritte von jeweils 15 min mit dem Waschpuffer. Die Membranen wurden 2 min im Detektionpuffer äquilibriert und dann in die mit Frischhaltefolie ausgelegte Entwicklungskammer gelegt. Jeweils 1 ml Substratlösung (1/100 CSPD (Roche) in Detektionspuffer) wurde auf die Membranen gegeben, nach ca. 5 min der Röntgenfilm aufgelegt und die Kammer geschlossen. Nach 30 min Inkubation wurde die Reaktion auf dem Röntgenfilm durch kurzes Schwenken in Entwicklungslösung, kurzes Waschen in dest. H₂O und einer abschließenden Fixierung in Fixierlösung sichtbar gemacht. Alle Reaktionsschritte wurden, wenn nicht anders benannt bei RT durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde der Klon Ss-14 und als Negativkontrolle der Klon Ss-37 verwendet, deren Identität durch eine vorangegangene Sequenzierung ermittelt worden war.

Anhand der Southern Blot-Analyse können im Gel aufgetrennte DNA-Fragmente auf einer Membran fixiert und diese mittels der Hybridisierung mit einer entsprechenden Sonde spezifisch nachgewiesen werden. In dieser Arbeit sollte zum einen die Kopienzahl der Gene in S. scabiei, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren,detektiert und außerdem ermittelt werden, ob ensprechende Gene auch im Genom [Seite 70↓]von D. pteronyssinus vorhanden sind. Auch hier wurde das DIG-System (Roche) (s. Punkt 2.2.2.27) verwendet. Nach der Restriktion von 15 μg gDNA von S. scabiei und D. pteronyssinus (s. Punkt 2.2.2.5) wurde diese auf ein 0.8%iges Agarosegel getragen und ca. 45 min bei 120 V nach Größe aufgetrennt. Sowohl die Gelvorbehandlung als auch der Transfer der DNA auf die Membran erfolgte nach den Vorgaben des Herstellers. Die weiteren Schritte zur Denaturierung, Neutralisation und Fixierung der DNA sowie der Hybridisierung und Entwicklung erfolgten wie unter Punkt 2.2.2.27.3 beschrieben.

Aus drei konservierten Bereichen der repetitiven Proteine wurden Sequenzen ausgewählt und Peptide synthetisiert. Für die Kopplung an das Maleimid aktivierte Trägerprotein Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) wurde ein Cystein an den N-Terminus der Peptide gefügt, mit dem die Maleimidgruppe des Trägermoleküls reagiert.

Kleine Moleküle (Haptene) wie Peptide sind nicht in der Lage eine Immunantwort zu stimulieren, obwohl eine Interaktion mit Produkten der Immunantwort möglich ist. Diese Haptene können aber durch eine Kopplung an Trägerproteine vollständig immunogen gemacht werden. Als Trägermoleküle eignen sich hier das Bovine Serum Albumin (BSA), das Ovalbumin (OVA) sowie das Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH), von denen sich das KLH auf Grund seiner großen Molekülmasse (MW von 4.5 x 10⁵ bis zu 1.3 x 10⁷), der starken Immunogenität und seines hohen Anteils (6%) an freien Lysinen besonders eignet .

Die synthetischen Peptide wurden unter Verwendung des Imject^® Maleimide Activated mcKLH Kits (Pierce) an das aktivierte KLH gekoppelt. Die Durchführung erfolgte gemäß den Vorgaben des Herstellers. Die Eluate wurden in 0.5 ml-Fraktionen aufgefangen, deren Proteinkonzentration anschließend im BCA gemessen wurde.

Die Effizienz der Konjugation der Peptide und des KLHs wurde in einem Ellmann´s Assay ermittelt. In diesem Test reagiert das Ellmann´s Reagenz mit freien Sulfhydrylgruppen und bildet ein Chromophor, das bei einer maximalen Absorption bei 412 nm gemessen werden kann.

In 96 well-Mikrotiterplatten wurden je 200 μl Konjugationspuffer mit 10 μl ungekoppeltem und gekoppeltem Peptid versetzt. Als Standard diente hier eine Verdünnungsreihe von L-Cystein (1.5 mg, 1.14 mg, 0.86 mg, 0.64 mg, 0.48 mg, 0.18 mg, 0.09 mg, 0 mg), von der ebenfalls jeweils 10 μl mit 200 μl Konjugationspuffer [Seite 72↓]versetzt wurden. 20 μl Ellmann´s Reagenz wurden zugegeben und die freien Sulfhydrylgruppen nach einer 15minütigen Inkubation bei RT bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen. Standards und Proben wurden in Doppelbestimmungen angesetzt.

Die Konzentration von Protein in Lösung wurde mittels des BCA-Protein-Assays Kits (Pierce, USA) nach Vorgaben des Herstellers ermittelt. Gemäß der Biuret-Reaktion wird Cu²⁺ durch Protein zu Cu⁺ reduziert, und dieses Cu⁺ reagiert mit BCA (bicinchoninic acid) zu einem violett gefärbten Produkt. Die Farbreaktion wurde bei einer Wellenlänge von 562 nm gemessen und die Proteinkonzentration gegen eine Standardreihe von BSA ermittelt. Standards und Proben wurden in Dreifachbestimmungen eingesetzt.

Die Humanseren, die für das Immunoscreening genutzt wurden, wurden vor Verwendung mit E. coli-Protein präabsobiert. Auf diese Weise können unspezifische Reaktionen mit dem Protein der Bakterien reduziert werden.

Eine ü/N Kultur von E. coli XL1Blue wurde abzentrifugiert und in PBS aufgenommen. Die Bakterien wurden anschließend einer Ultraschallbehandlung von 5 min bei 60 Watt unterzogen und die Zellreste abzentrifugiert. Nitrozellulosemembranen wurden mit dem E. coli-Lysat 2 h unter Schwenken inkubiert, so dass die Proteine an die Membran binden konnten, und anschließend drei Mal mit TBS-T gewaschen. Die Seren wurden dann in ihrer endgültigen Verdünnung (1/150 in TBS) jeweils 30 min unter Schwenken bei RT mit vier E. coli-Protein-beschichteten Nitrozellulosemembranen inkubiert.

Die Humanseren, die für den ELISA mit dem GST-Fusionsprotein des Klons Ss-18 verwendet wurden, wurden gegen GST präabsorbiert, um die unspezifische Bindung von Antikörpern mit den Fusionspartner zu verhindern. Zu diesem Zweck wurden die Seren mit 2% aufgereinigtem GST versetzt und 2 h bei 37 °C inkubiert. Auf gleiche Weise wurden die Schweineseren, die im ELISA verwendet wurden, gegen E. coli-Protein präabsorbiert.

Die hier beschriebene Methode basiert auf der spezifischen Bindung eines Antiimmunglobulins mit dem Erst-Antikörper, der gegen ein gesuchtes Protein gerichtet ist. Der Zweit-Antikörper ist mit einer enzymatischen Aktivität gekoppelt, so dass das Farbsignal direkt auf der Nitrozellulose sichtbar wird und eine eindeutige Plaqueidentifizierung möglich wird. Bei der hier verwendeten Enzymaktivität handelte es sich um die Peroxidase aus Meerrettich. Das Enzym setzt sein Substrat, das Hydrogenperoxid, in Wasser um, wenn Elektronendonatoren, wie das Diaminobenzidin oder Tetramethylbenzidin, zur Verfügung stehen. Diese werden in der Reaktion oxidiert und die Oxidationsprodukte polymerisieren zu einem farbigen Produkt.

Für das Immunoscreening wurde zunächst die amplifizierte cDNA-Bank verwendet, bevor auf die nicht amplifizierte übergegangen wurde.

E. coli XL1Blue wurden auf LB/Tet ausplattiert und bei 37 ° ü/N inkubiert. Von dieser Platte wurde eine einzelne Kolonie auf einer LB/Tet/MgSO₄ Platte ausgestrichen und angezogen. Beide Platten wurden bei 4 °C gelagert und konnten bis zu zwei Wochen genutzt werden.

15 ml einer E. coli XL1Blue ü/N-Kultur in LB/10 mM MgSO₄/0.2% Maltose, die von der MgSO₄ enthaltenden Platte angeimpft worden war, wurde durch Zentrifugation bei 3000 UpM pelletiert und in 7.5 ml 10 mM MgSO₄ resuspendiert. 1.2 x 10⁴ plaque forming units (pfu) wurden zu 200 μl dieser Lösung pipettiert und mit 100 μl λ-Dilution-Buffer gemischt. Die Phagen konnten 15 min bei 37 °C adsorbieren und wurden anschließend in 5 ml 50 °C warmen Top Agar auf 150 mm LB/MgSO₄-Platten ausplattiert. Es folgte eine Inkubation bei 40 °C von etwa 3-5 h, bis eine erste Lyse der Bakterien durch die Phagen erkennbar wurde. Nitrozellulose-Membranen (Schleicher & Schuell), die zuvor 20 min in 10 mM IPTG getränkt und leicht abgetupft worden waren, wurden in feuchtem Zustand auf den Bakterienrasen gelegt. Nach einer Inkubation ü/N bei 37 °C wurden die Platten für 30 min bei 4 °C abgekühlt, so dass sich beim Abnehmen der Membranen die Top-Agar Schicht nicht löste. Die Membranen wurden entsprechend der Platten markiert, abgenommen und drei Mal jeweils 10 min mit TBS-T gewaschen. Unspezifische Bindungsstellen wurden durch eine einstündige Inkubation in 5% Magermilchpulver in TBS blockiert. Nach drei weiteren Waschschritten in TBS-T wurden die Membranen für 1.5 h mit einem Sammelserum von zehn Skabies-positiven Patienten (1/150 in TBS) inkubiert. Die Membranen wurden erneut drei Mal gewaschen und anschließend für weitere 1.5 h in dem Peroxidase markierten anti-Human-Antikörper (1/2500 in TBS) geschwenkt. Nach drei weiteren Waschschritten wurden die Reaktionen der exprimierten Klone mit dem Skabies-positiven Serum durch die Zugabe des Substrates (TBS/0.02% Chlornaphthol/0.01% H₂O₂) sichtbar gemacht. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Positive Plaques wurden anschließend identifiziert, und nach visuellem Abgleich mit den Membranen wurde der auf der Platte identifizierte Bereich mit einer sterilen 1 ml-Pipettenspitze, deren Spitze abgeschnitten war, ausgestochen. Die Phagen wurden in 500 μl λ-Dilution-Buffer ü/N bei 4 °C aus dem Agar eluiert, das Eluat zur Langzeitlagerung mit 8% DMSO [Seite 75↓]versetzt und bei - 80 °C gelagert. Der Titer der eluierten Phagen wurde folgendermaßen bestimmt: 1 bzw. 5 μl aus einer 1/100 Verdünnung des Phagenlysats wurden wie oben beschrieben in 3 ml Top Agar auf 90 mm Platten ausplattiert und ü/N bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Plaques ausgezählt und der Titer (y) nach folgender Formel berechnet:

(# Plaques x Verdünnungsfaktor x 10³μl/ml) / μl d. ausplattierten Phagen = y

Zu der Isolierung klonaler Phagen wurden 3 x 10³ pfu des Eluats unter den oben beschriebenen Bedingungen auf 90 mm Platten in 3 ml Top Agar ausplattiert und der Prozess des Immunoscreenings wiederholt, bis klonale Phagen isoliert werden konnten. Die Klonalität der Phagen sowie die Größe der Insertion wurde durch PCR mit phagenspezifischen Primern (s. Punkt 2.2.2.7.5) bestimmt.

Die Klone, die im Immunoscreening isoliert wurden, sollten auf ihre Spezifität getestet werden. Zu diesem Zweck wurde die Reaktion der Seren von Skabies-positiven bzw. negativen Personen sowie von Hausstaubmilbenallergikern getestet.

E. coli XL1Blue ohne den Zusatz von Phagen wurden wie beschrieben ausplattiert. Nach ca. 4 h Inkubation bei 37 °C, nachdem der E. coli Rasen sichtbar geworden war, wurden 25 μl des Phagenlysats aufgetragen. Sobald eine Lyse der Bakterien an der betreffenden Stelle detektierbar war, wurde eine in 10 mM IPTG getränkte Nitrozellulosemembran aufgelegt. Der weitere Versuchsablauf verlief wie unter Punkt 2.2.4.2 beschrieben.

Ein anderer Versuchsansatz war, die Phagenklone wie unter Punkt 2.2.4.2 beschrieben, in 90 mm Petrischalen auszuplattieren. Allerdings wurde die Expression hier durch den Zusatz des IPTGs zu dem Top-Agar, und nicht durch das Auflegen IPTG-beschichteter Nitrozellulosemembranen induziert. Auf Grund des unmittelbaren Kontaktes der Phagen zu dem IPTG enthielt der Top-Agar hier nur 0.5 mM IPTG. Nach einer vollständigen Lyse des E. coli-Rasens wurden die Platten mit 0.5 ml 1 x λ-Dilution-Buffer bzw. PBS überschichtet und ü/N bei 4°C inkubiert. 20 μl des Überstandes, in dem sich das rekombinante Antigen befinden sollte, wurden auf eine [Seite 76↓]Nitrozellulosemembran aufgetragen, diese getrocknet und anschließend im Western Blot entwickelt (s. Punkt 2.2.4.4.1).

Alle Western Blots, die mit Humanseren durchgeführt wurden, wurden nach folgendem Protokoll durchgeführt:

Nach einem 45 minütigen Semi-Dry Transfers der Proteine aus dem SDS-Gel auf die Nitrozellulosemembran bei 80 mA wurden unspezifische Bindungsstellen 1 h mit 5% Magermilchpulver in TBS blockiert. Die Membranen wurden 1.5 h mit den Seren in einer Verdünnung von 1/150 in TBS inkubiert. Es folgten drei fünfminütige Waschschritte mit TBS-T, bevor die Membranen für weitere 1.5 h mit dem Peroxidase-konjugierten Antikörper inkubiert wurden. Nach drei weiteren Waschschritten (s.o.) erfolgte die Visualisierung der Reaktion durch die Zugabe von TBS/0.02% Chlornaphthol/0.01% H₂O₂. Alle Reaktionsschritte wurden bei RT durchgeführt.

Das Gen Ss-18, das in dem Vektor pET-41a (+) exprimiert wurde, wurde mittels eines anti-GST-Antikörpers im Western Blot detektiert. Nach dem Semi-Dry Transfer (s.o.) wurden unspezifische Bindungsstellen 1 h mit 5% Magermilchpulver in PBS blockiert. Die Inkubationsdauer mit dem anti-GST-Antikörper (Amersham Pharmacia Biotech) in einer Verdünnung 1/1000 in 5% Magermilchpulver/PBS betrug 1 h. Nach dreimaligem Waschen von jeweils 5 min mit PBS/0.3% Tween folgte eine einstündige Inkubation mit dem mit Alkalischer Phosphatase-konjugiertem Antikörper (1/5000 in PBS/5% Magermilchpulver). Die Membran wurde erneut drei Mal gewaschen (s.o.) und kurz mit AP-Puffer gespült. Abschließend wurde die Reaktion durch die Zugabe der Substrate BCIP (0.017%) und NBT (0.033%) in AP-Puffer farblich sichtbar gemacht. Alle Reaktionsschritte wurden bei RT durchgeführt.

Die in dem Vektor pQE-30, -31 und -32 (QIAGEN) exprimierten Gene bzw. Genfragmente wurden mittels eines anti-His-Antikörpers im Western Blot detektiert. [Seite 77↓]Nach dem Semi-Dry Transfer der Proteine auf die Nitrozellulosemembran (s.o.) wurden unspezifische Bindungsstellen 30 min mit TBS/2% BSA blockiert. Es folgte eine 1.5stündige Inkubation mit dem anti-His-Antikörper (1/2500 in TBS/2% BSA) gefolgt von einem dreimaligen Waschen von jeweils 5 min mit TBS/0.2% Triton. Anschließend wurden die Membranen für 1.5 h in dem mit Alkalischer Phosphatase-konjugierten Antikörper (anti-His 1/5000 in TBS/2% BSA) geschwenkt. Es folgten drei weitere Waschschritte mit TBS und ein kurzes Abspülen der Membran mit AP-Puffer. Die Reaktion wurde durch die Inkubation mit 0.017% BCIP und 0.033% NBT in AP-Puffer sichtbar gemacht. Alle Reaktionsschritte wurden bei RT durchgeführt.

Für die Detektion der repetitiven Proteine im Gesamtantigen von S. scabiei wurden die Seren der BALB/c-Mäuse, die gegen das Peptid A2-KLH und gegen das Fusionsprotein Ss-18/GST immunisiert worden waren, genutzt. Auch die erfolgreiche Immunisierung der Mäuse wurde im Western Blot unter Verwendung des rekombinanten Proteins von Klon Ss-14, exprimiert in TriplEx2, überprüft.

Es wurden ca. 50 μg des Überstandes von dem Antigenextrakt und nach Auftrennung der Proteine diese in einem Semi-Dry Transfer auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Es folgte eine 30minütige Blockierung unspezifischer Bindungsstellen durch die Inkubation mit 5% Milchpulver in TBS. Nach dreimaligem Waschen mit TBS-T wurden die Membranen mit dem BALB/c-Serum (1/100 in TBS der α-Peptidseren, 1/150 der α-Ss18/GST-Seren) 1.5 h inkubiert. Es folgten drei weitere Waschschritte, bevor der AP-konjugierte Antikörper (1/2500 in 5% Magermilchpulver/TBS) für 1.5 h auf die Membranen pipettiert wurde. Nach erneutem dreimaligen Waschen und Spülen mit AP-Puffer wurde die Reaktion mit 0.017% BCIP und 0.033% NBT in AP-Puffer sichtbar gemacht. Alle Reaktionsschritte wurden bei RT durchgeführt.

Die Proteine, die unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigt werden mussten, wurden gegen Harnstoff-niedermolare Puffer dialysiert, um sie im ELISA verwenden zu können.

Zu diesem Zweck wurden 0.5-1 ml des jeweiligen Proteineluats in Dialyseschläuche, die 5 min in dest. H₂O gekocht worden waren, pipettiert und die Schläuche mit den dazugehörigen Klemmen verschlossen. In dem zehnfachen Volumen eines 4 M Harnstoffpuffers erfolgte unter ständigem Rühren bei 4 °C ü/N die Dialyse. Am nächsten Morgen wurde der 4 M Harnstoffpuffer durch einen 3 M Harnstoffpuffer ersetzt. Die weitere Dialyse erfolgte jeweils in zweistündigen Inkubationsschritten über einen 2 M- und einen 1 M Harnstoffpuffer bis hin zu PBS. Die Proteine wurden dann bei - 20 °C gelagert. Im ELISA konnten die Proteine in 2 M Harnstoffpuffer eingesetzt werden.

Die Schweineseren mussten vor Verwendung im ELISA mit den rekombinanten Antigenen auf ihre Reaktivität mit Gesamtantigen von S. scabiei getestet werden.

Der Sarcoptes-ELISA 2001^® (Afosa GmbH) wurde zu diesem Zweck nach Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die Seren, die eine eindeutig positive Reaktion, die hier in Form eines Index angegeben wird, zeigten, wurden in dem ELISA mit den rekombinanten Antigenen verwendet.

Die rekombinanten Antigene wurden im ELISA auf ihre potenzielle Eignung für die Serodiagnostik untersucht. Zu diesem Zweck wurden 100 ng des zu untersuchenden Antigens in 50 μl Beschichtungspuffer in 96-Loch-Platten (Nunc) pipettiert und für die Bindung an die Platte ü/N bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Platten drei Mal mit jeweils 300 μl PBS/0.025% Tween pro Loch gewaschen und anschließend unspezifische Bindungsstellen 45 min mit 3% BSA in PBS in einem Volumen von 100 μl pro Loch blockiert. Nach drei weiteren Waschschritten (s.o.) folgte eine Inkubation von 1 h mit 50 μl des entsprechenden Serums (Schweine- und Humanseren) in verschiedenen Verdünnungsstufen in PBS/3% BSA (s. Punkt 3.10). Es wurde erneut drei Mal gewaschen (s.o.) und dann 1 h mit 50 μl des mit Peroxidase-konjugierten Antikörpers in einer Verdünnung von 1/10.000 in PBS/3% BSA inkubiert. Alle Inkubationsschritte wurden bei 37 °C durchgeführt. Nach drei weiteren Waschschritten wurde die Substratlösung in einem Volumen von 50 μl pro [Seite 79↓]Loch pipettiert. Nach ca. 3-5 min wurde die Reaktion mit dem gleichen Volumen von 1 M H₂SO₄ abgestoppt und die Extinktion photometrisch bei 450/630 nm bestimmt. Die Mittelwerte von zwei Parallelansätzen wurden ermittelt.

Die Immunreaktion der gegen die synthetischen Peptide immunisierten BALB/c-Mäuse wurde ebenfalls im ELISA gemessen. Die Testdurchführung erfolgte wie unter Punkt 2.2.4.6.2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die BALB/c-Seren in einer Verdünnung von 1/200 eingesetzt wurden. Bei dem verwendeten zweiten Antikörper handelte es sich um ein AP-Konjugat, so dass die Phosphatase-Substratlösung in einem Volumen von 50 μl pro Loch eingesetzt wurde, mit der 30 min bei 37 °C inkubiert wurde. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe des halben Volumens von 0.1 M EDTA abgestoppt. Die OD wurde photometrisch bei 405/630 nm gemessen und der Mittelwert von zwei Parallelansätzen ermittelt.

Das Gesamtantigen von Sarcoptes wurde deglykosiliert, um festzustellen, ob bei einer Infektion eine Immunreaktion des Wirtes gegen das reine Protein vorliegt, oder ob diese gegen glykosiliertes Protein gerichtet ist.

Die Perjodatoxidation öffnet, durch die Spaltung zwischen angrenzenden Zuckern, die Hydroxylgruppen enthalten, Zuckerringe und zerstört so die Integrität der Kohlenhydratstruktur. Zu diesem Zweck wurden ELISA-Platten mit 100 ng Gesamtantigen beschichtet (s. Punkt 2.2.4.6.2). Es wurde drei Mal mit PBS/0.025% Tween gewaschen und anschließend mit 50 mM Na-Acetat-Puffer pH 4.5 gespült. Die Deglykosilierung erfolgte durch eine Inkubation von 1 h unter Lichtausschluss mit 30 mM NaIO₄ in Na-Acetat-Puffer. Die Platten wurden erneut mit Na-Acetat-Puffer ausgespült, bevor das Antigen 30 min mit 50 mM Na-Borhydrid inkubiert wurde. Als Negativkontrolle wurde das Antigen wie oben beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, dass nicht NaIO₄, sondern nur Na-Acetat-Puffer eingesetzt wurde. Das Gesamtantigen der dritten Larven von Acanthocheilonema viteae diente als Positivkontrolle. Ein monoklonaler Antikörper (24-4 Antikörper, Adam et al. 1996), der im folgenden ELISA verwendet wurde, reagiert ausschließlich mit der nativen [Seite 80↓]Chitinase, d.h. dem glykosilierten Protein dieser Larven. Der ELISA wurde, wie unter Punkt 2.2.4.6.2 beschrieben, durchgeführt.

Das Serum von BALB/c-Mäusen, immunisiert mit Peptiden, deren Sequenz aus den „KE-reichen Antigenen“ abgeleitet worden war, sollte für Lokalisierungsstudien dieser Proteine in der Milbe verwendet werden.

Für die Immunisierung der Mäuse wurde das Adjuvans STP, welches sowohl die zellvermittelte als auch die humorale Immunantwort anregt, verwendet. Jeweils drei BALB/c-Mäuse (männlich oder weiblich), die zwischen 8-10 Wochen alt waren, wurden an Tag 0 mit 100 μg an KLH gekoppeltem Peptid, das im gleichen Volumen wie das Adjuvans eingesetzt wurde, immunisiert. Die Lösung wurde sowohl intraperitoneal als auch subkutan in die Halsfalte appliziert. Am Tag 14 wurde eine erneute Immunisierung vorgenommen und am Tag 21 das Testblut auf eine Antikörperantwort im ELISA gemessen. Es folgten eine weitere Immunisierung amTag 28 und die Messung der Antikörperantwort am Tag 35. Am Tag 38 wurden die Tiere getötet und das gewonnene Serum konnte in der Immunhistochemie sowie im Western Blot eingesetzt werden. Die Immunisierung der BALB/c-Mäuse mit dem Protein des Klons Ss18/GST sowie mit reinem GST erfolgte auf die gleiche Weise. Das α-Ss18/GST-Serum sollte dem Nachweis der in den Sarcoptes-Milben exprimierten Proteine dienen.

Für eine Detektion von Proteinen im Gewebe ist es wichtig, dass das zu untersuchende Material in frischem Zustand eingefroren wird, um eine Proteolyse zu vermeiden. Aus diesem Grund wurden lebendige S. scabiei var. bovis-Milben in kleinen Einbettungsschalen (Miles Inc.) in Tissue Tek^® (Zakura) aufgenommen und sofort bei - 80 °C eingefroren. Im Cryocut (Leica) wurden von diesen Blöcken 9 μm dicke Schnitte angefertigt, die auf beschichtete Objektträger (Menzel-Gläser) überführt wurden. Diese Objektträger wurden dann bis zu weiteren Verarbeitung der Schnitte ebenfalls bei - 80 °C gelagert.

Die Fixier-, Wasch- und Blockierungsschritte wurden in Färbeküvetten durchgeführt, während die Antikörper direkt auf die Objekttäger pipettiert wurden.

Für die Fixierung und Freilegung der Epitope wurden die Schnitte 10 min in 2.5% Paraformaldehyd inkubiert. Anschließend wurde das Einbettungsmedium durch eine 20minütige Inkubation in 0.1 M Tris-HCl pH 7.5 vom Objektträger gewaschen. Unspezifische Bindungsstellen wurden 45 min in PBS/10% FCS blockiert. Nach dreimaligem Waschen für 5 min mit PBS/0.05% Tween wurde das Serum der immunisierten BALB/c-Mäuse in einer Verdünnung 1/20 in 2% FCS in einem Volumen von etwa 600 μl auf die Objektträger pipettiert. Der 60minütigen Inkubation mit dem ersten Antikörper folgten drei weitere Waschschritte und eine Inkubation von einer Stunde mit dem FITC-markierten Maus-Konjugat (1/100 in 2% FCS). Nach dreimaligem Waschen wurden die Schnitte mit Mowiol (Sigma) bedeckt und eingedeckelt. Die markierten Schnitte können bei 4 °C im Dunkeln für mehrere Monate gelagert werden, ohne dass die mikroskopische Detektion des FITC-markierten Antikörpers beeinträchtigt wird.

Wie unter Punkt 2.2.4.9.1 beschrieben wurden auch hier die Fixier-, Wasch- und Blockierungsschritte in Färbeküvetten durchgeführt, wohingegen die Antikörper direkt auf die Objektträger pipettiert wurden.

Die Fixierung und Freilegung erfolgte ebenfalls durch eine Inkubation der Sarcoptes-Gefrierschnitte in 2.5% Paraformaldehyd. Das Einbettungsmedium wurde durch eine Inkubation von 10 min in PBS entfernt. Anschließend folgte die Inaktivierung der endogenen Peroxidase durch eine 30minütige Inkubation in 0.3% H₂O₂ in Methanol. Durch diese Inaktivierung werden unspezifische Reaktionen der endogenen Peroxidase und damit Hintergrundsreaktionen unterdrückt. Es folgten drei Waschschritte von jeweils 10 min mit PBS und anschließend eine Blockierung der unspezifischen Bindungsstellen von 30 min in PBS/10% FCS. Nach Waschen von 10 min mit PBS wurden die Gefrierschnitte dann mit dem BALB/c-anti-Peptid A2 -Serum (1/20 in PBS/2% FCS) 2 h bei RT inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden durch zweimaliges Waschen mit PBS von jeweils 10 min entfernt. Es folgte eine 30minütige Inkubation mit dem Peroxidase konjugierten Ziege-anti-Maus Antikörper [Seite 82↓](1/100 in PBS/2% FCS), bevor erneut 10 min mit PBS gewaschen wurde. Die Schnitte wurden dann 5-10 min mit der Substratlösung inkubiert, bis eine deutliche Braunfärbung zu erkennen war. Nach weiterem Waschen in PBS wurde eine Haematoxylin-Eosin-Gegenfärbung durchgeführt.

Die Hämatoxylin-Eosin Färbung wurde durchgeführt, um innere Strukturen näher determinieren zu können. Der Farbstoff Hämalaun ist positiv geladen und bindet an die sauren Bestandteile der DNA, so dass Zellkerne blau angefärbt werden. Eosin hingegen ist negativ geladen und bindet an positiv geladene Gewebebestandteile wie Eiweiße, so dass das Plasma rot angefärbt wird.

Die Objektträger mit den Gefrierschnitten wurden kurz mit dest. H₂O abgespült und dann 3 min in Hämalaun inkubiert. Nach einem 5minütigen Waschen mit Leitungswasser wurden die Objektträger ein weiteres Mal mit dest. H₂0 gewaschen. Es folgten 5 min Inkubation in Eosin und ein erneutes Abspülen in dest. H₂0, bevor die Gefrierschnitte unter Verwendung von Mowiol (Sigma) eingedeckelt wurden.

Semidünnschnitte (1 μm) der Sarcoptes-Milben wurden 5 min in Methylenblau gefärbt (Böck 1989).

Für eine effektive Fixierung der Sarcoptes-Milben wurde diesen vorher der Kopf mittels einer Skalpellklinge abgetrennt, so dass das Medium in den Milbenkörper eindringen konnte. Darauf folgten eine 24stündige Fixierung in Fixierlösung I bei 4 °C und ein Waschen ü/N in Waschpuffer I. Die Milben wurden dann 5 h bei 4 °C in Lösung II nachfixiert, bevor sie jeweils mit den Waschpuffern I und II gewaschen wurden. Es folgte eine Inkubation der Milben für 1 h in der Färbelösung inkubiert. In einer aufsteigenden Ethanolreihe (50%, 70%, 80%, 90%, 96% jeweils 20 min und 3 x 100% jeweils 45 min) erfolgte die Dehydrierung der Milben und eine anschließende Einbettung in Spurr´s Epoxy-Medium. Nachdem die Schnitte angefertigt worden waren, wurden diese mit Uranyl-Acetat und Reynold´scher Lösung nachfixiert. Diese Arbeiten wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Elektronenmikroskopie [Seite 83↓]unter Leitung von PD Dr. W. Bleiß (Lehrstuhl für Molekulare Parasitologie) durchgeführt.

Die Ergebnisse aus den ELISAs wurden auf signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen der Positiv- und der Negativseren hin überprüft. Zu diesem Zweck wurden der t-test bzw. der Mann-Whitney Rank Sum Test unter Verwendung des Computerprogramms SigmaStat 2.0 (Jandel) eingesetzt.

Eine potenzielle Korrelation der Ergebnisse aus den ELISAs, in denen die rekombinanten Antigene getestet wurden, zu denen aus dem ELISA mit Gesamtantigen wurde nach SPEARMAN berechnet (SigmaStat 2.0, Jandel).