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4  Diskussion

Eine Sarcoptes-Infektion zeichnet sich in der Mehrheit der Fälle durch das Auftreten geringer Milbenanzahlen auf dem Wirt aus. Allerdings können schon wenige Milben die typische Skabies- bzw. Räudesymptomatik auslösen. Liegt der Verdacht auf eine Infektion mit den Milben vor, kann es daher schwierig sein, einen direkten Sarcoptes-Nachweis zu erbringen. In der jüngsten Vergangenheit wurden diverse serologische Tests entwickelt, in denen Gesamtextrakt der Milben als Antigen verwendet wird. Problematisch ist hier zunächst, dass oft Kreuzreaktionen auftreten, die keine eindeutige Diagnose der Sarcoptes-Infektion zulassen. Der wesentliche Nachteil in diesem System besteht allerdings in der Notwendigkeit einer Stammhaltung der Milben auf einem geeigneten Wirt. Dabei handelt es sich um ein verhältnismäßig kostspieliges und anfälliges Verfahren, das belastend für das Wirtstier ist. In diesem Zusammenhang ist es sinnvoll, ein System zu entwickeln, in dem geeignete rekombinante Antigene ohne großen materiellen und zeitlichen Aufwand synthetisiert werden können. Ziel dieser Arbeit war es, derartige Antigene zu finden, die hochspezifisch für S. scabiei sind, und anhand derer eine Skabies- bzw. Räude-Infektion zuverlässig detektiert werden kann. Es sollten die Voraussetzungen für einen serologischen Test geschaffen werden.

4.1 Parasitenmaterial

Auf Grund der schlechten Verfügbarkeit von S. scabiei var. hominis-Milben, wurde in dieser Arbeit die Milbenvarietät vom Schwein verwendet. Die Isolierung der Klone sowie Teile der weiteren serologischen Untersuchungen wurden allerdings anhand von humanen Seren unternommen. Immunologische Studien haben ergeben, dass die S. scabiei-Varietäten suis, canis und hominis dem Wirt einige gleiche Antigene präsentieren und daher in immunologischer Hinsicht verwandt sind. Trotzdem wurden auch unterschiedliche Reaktionen der verschiedenen Wirte gegen Varietät-spezifische Epitope in gleichen oder unterschiedlichen Molekülen beobachtet (Arlian et al. 1996a). In dieser Arbeit wurden Antigene gesucht, die in erster Linie der Diagnose der Skabies beim Menschen dienen sollten. Auf Grund der Tatsache, dass diese Antigene aber auch auch auf ihre potenzielle Eignung in der Räudediagnostik [Seite 143↓]beim Tier getestet werden sollten, war die Verwendung der Schweinemilben als Ausgangsmaterial durchaus akzeptabel.

4.2 Reaktion der Patientenseren mit SsGesamtantigen

Es konnte gezeigt werden, dass die IgG-Antikörperantwort von Skabies-Patienten unabhängig von einer Glykosilierung des Milben-Proteins ist. Das Gesamtantigen von S. scabiei wurde mittels einer Natriumperjodatbehandlung deglykosiliert und im ELISA eingesetzt. Die Reaktion der Skabies-positiven Seren mit dem Antigen wurde durch die Deglykosilierung nicht herabgesetzt. In der Literatur existieren keine vergleichbaren Untersuchungen an parasitischen Arthropoden, die das in dieser Arbeit ermittelte Ergebnis bestätigen können, das Gegenteil ist der Fall. Tellam et al. (2001) unternahmen vergleichende Vakzinierungsstudien mit dem nativen und rekombinant in E. coli bzw. Sf9 Zellen hergestelltem Peritrophin-95, einem larvalen Glykoprotein von Lucilia cuprina. Sie kamen zu dem Schluss, dass u. a. die Oligosaccharide des nativen Proteins für die Induktion der Aktivität der Larvenentwicklungshemmung im Serum von vakzinierten Schafen verantwortlich sind. Diese Aktivität war mit IgG1- und IgG2,- nicht aber mit IgM-Antikörpern assoziiert. Auch Studien an anderen Parasiten ergeben ähnlich Ergebnisse: In Untersuchungen an Patienten mit Helmintheninfektionen konnte gezeigt werden, dass die Th-2-Antwort des Wirtes abhängig von der Glykosilierung der Parasitenproteine ist (Okano et al. 1999, Tawill et al. 2004). Sommer et al. (2001) fanden in Onchozerkose-Patienten im Vergleich zu dem nativen OvGST eine signifikant verringerte Reaktion gegen das deglykosilierte- bzw. in E. coli exprimierte OvGST.

Gleichzeitig berichten Oleaga-Perez et al. (1994), dass falsch positive Ergebnisse bei einer Diagnose von Ornithodoros erraticus durch Reaktionen mit Zuckerepitopen des löslichen Speicheldrüsenextraktes (SGE-2) zustande kommen. Bei einer Deglykosilierung des Antigens wurde die Spezifität wesentlich erhöht, so dass keine falsch positiven Ergebnisse mehr auftraten. Auch Lorenzo et al. (2000) fanden nach einer O-Deglykosilierung eine erhöhte Spezifität des Antigens UA3R von Anisakis simplex. In dieser Arbeit ist die Antikörperreaktion mit dem deglykosilierten Protein im Vergleich zum der mit dem glykosilierten tendenziell leicht erhöht (s. Abb. 4). Diese [Seite 144↓]leicht erhöhte Reaktion mit dem deglykosilierten Protein könnte durch eine spezifischere Bindung an das reine Protein bedingt sein, da die Epitope nicht durch Zuckergruppen verdeckt und so besser zugänglich für die Antikörper sind.

Die Hintergrundsreaktionen im ELISA mit SsGesamtantigen sind hier nicht auf die Glykosilierung zurückzuführen, da die Reaktion mit dem Negativserum nicht durch die Deglykosilierung beeinflusst wird. Diese Hintergrundsreaktion kann andere Gründe haben: Die freilebenden Hausstaubmilben, die in naher Verwandtschaft zu den Sarcoptes-Milben (Astigmata) stehen, sind weit verbreitet (Arlian et al. 1992). Immunisierungen von Kaninchen mit Extrakten von D. farinae und D. pteronyssinus (Arlian et al. 1995) führten zu einer Reduktion der Parasitenbürde bei nachfolgenden Sarcoptes-Infektionen. Antigene bzw. Epitope dieser freilebenden Milben können demnach den Wirt gegen Sarcoptes-Milben sensibilisieren und eine protektive Immunität gegen Sarcoptes-Infektionen induzieren. Mit Sarcoptes-Milben infizierte Hunde zeigten erhöhte Antikörperreaktionen gegen Hausstaubmilbenantigen, als vor der Infektion (Arlian et al. 2000). Seren von Sarcoptes-infestierten Kaninchen enthielten Antikörper, die mit diversen Antigenen in Extrakten von D. farinae und D. pteronyssinus reagierten. Umgekehrt präzipitierten Antikörper, die gegen D. farinae und D. pteronyssinus gerichtet waren, in der Kreuzimmunelektrophorese (CIE) Proteine in Sarcoptes-Extrakten (Übersicht Arlian 1996). Molekularbiologische Studien haben Homologien zwischen Antigenen der Sarcoptes- und Hausstaubmilben ergeben (Ljunggren et al. 2003, Holt et al. 2003, Fischer et al. 2003, Harumal et al. 2003). Auf Grund der permanenten Konfrontation des Menschen mit Hausstaubmilbenantigen muss also bei einer Serodiagnose anhand von Gesamtantigen mit Kreuzreaktionen gerechnet werden, die die spezifische Diagnose einer Sarcoptes-Infektion erschweren.

Die Ergebnisse aus dem ELISA mit SsGesamtantigen unter Verwendung der Humanseren korrelierten nicht mit den Ergebnissen, die von der Afosa GmbH ermittelt wurden. Die Ursache für die fehlende Korrelation liegt vermutlich darin, dass der hier durchgeführte Test unter anderen Bedingungen, als bei der Afosa GmbH, durchgeführt wurde. Die Werte der Firma waren unter Verwendung des Sarcoptes-ELISA 2001® ermittelt worden. Bei dem in dieser Arbeit durchgeführten ELISA stand [Seite 145↓]kein Kontrollserum, um dessen Wert die Ergebnisse hätten korrigiert werden, zur Verfügung. Des Weiteren können unterschiedliche Blockierungsmedien zu abweichenden Ergebnissen führen (persönliche Mitteilung Dr. H.-F. Matthes). Hier führten große Abweichungen bei einzelnen Seren zu den fehlenden Korrelationen. Hohe unspezifische Hintergrundsreaktionen trugen ebenfalls zu den abweichenden Ergebnissen bei.

Die im Anschluss an die Humanseren verwendeten Schweineseren zeigten in dem ELISA mit SsGesamtantigen spezifische Reaktionen ohne Hintergrund. Bei dem ELISA, der hier verwendet wurde, handelte es sich ebenfalls um den für die Räude-Diagnostik beim Schwein etablierten, der sich in Vergleichen mit anderen durch eine hohe Sensitivität auszeichnete (Kessler et al. 2003, Löwenstein et al. 2004). Hintergrundsreaktionen sind hier durch die Optimierung des Tests in geringeren Maßen als bei einem nicht kommerziellen Test zu erwarten. Des Weiteren kann davon ausgegangen werden, dass das Schwein auf Grund seiner kürzeren Lebensdauer einer geringeren Anzahl von Antigenen ausgesetzt ist, als es der Mensch im Laufe seines Lebens ist. Allein auf Grund dieser Tatsache muss beim Menschen mit höheren Kreuzreaktionen bei einer serologischen Sarcoptes-Diagnostik gerechnet werden.

4.3 RNA-Isolierung und Klone aus der cDNA-Bank

Im Allgemeinen ist zu erwarten, dass in einer Genbank, die aus Parasitenmaterial hergestellt wird, Kontaminationen durch Wirts-RNA auftreten (Harumural et al. 2003, Fischer et al. 2003). Durch den Sequenzenabgleich der isolierten Klone mit denen aus der öffentlichen Datenbank wurden in der hier verwendeten cDNA-Bank keine kontaminierenden cDNA-Sequenzen vom Schwein gefunden. Zunächst handelte es sich bei den Milben um hochreines Parasitenmaterial, das durch das Auswandern der Parasiten aus der Haut gewonnen worden war. So kann davon ausgegangen werden konnte, dass sich nur wenige Kontaminanten, verursacht z. B. durch Hautrückstände des Wirtes auf der Milbenoberfläche oder im Milbendarm, in der cDNA-Bank befanden. Ein viel wesentlicherer Aspekt ist aber die Tatsache, dass alle hier charakterisierten Klone durch eine Antikörperreaktion mit dem Serum Skabies-[Seite 146↓]positiver Patienten gefunden wurden. Unter diesen Umständen konnten eventuelle Kontaminationen durch Wirts-RNA schwerlich detektiert werden.

Ein Problem bei der Interpretation der Sequenzdaten lag in den Eigenschaften des exprimierenden Vektors λTriplEx2, in dem die cDNA-Bank konstruiert wurde.

Der λ-Phage TriplEx2 zeichnet sich durch das Vorhandensein von zwei Start-Codons in unterschiedlichen Leserahmen und einen Bereich von 13 Thymidinen zwischen dem zweiten Start-Codon und der MCS aus. Dieser Bereich ermöglicht der RNA-Polymerase ein Gleiten und damit das Auslassen von Nukleotiden während der Transkription. Der Vorteil dieses Systems besteht darin, dass die klonierten Sequenzen in allen drei Leserahmen exprimiert werden, so dass theoretisch jeder rekombinante Phage in der cDNA-Bank ein Protein produziert. In manchen Fällen war es allerdings nach der Sequenzierung der Insertionen schwierig zu entscheiden, in welchem Leserahmen das Protein exprimiert wurde. Dies war insbesondere der Fall, wenn innerhalb der klonierten Sequenz zunächst sequenzeigene Start-Codons auftraten, auf die dann Stop-Codons sowie weitere, stromabwärts liegende Start-Codons folgten (Ss-17, Ss-23 und Ss-97). In der Mehrheit der Fälle wird in einem Transkript das erste Start-Codon von der RNA-Polymerase genutzt. Allerdings gibt es Ausnahmen, in denen weiter stromabwärts gelegene Methionine als Translationsstart dienen, z. B. wenn die Sequenzumgebung des Start-Codons nicht optimal ist. Auf diese Weise können die Transkripte, die von dem stromabwärts gelegenen Start-Codon gebildet werden, auf einem quantitativ geringen Niveau gehalten werden (Übersicht Mignone et al. 2002). In den Plasmid- bzw. Phagenklonen lag das erste Start-Codon innerhalb des Vektors. Alle Sequenzen der Insertionen wurden mit den Proteinsequenzen aus öffentlichen Datenbanken abgeglichen (BLASTX). Die Homologien aus dem Datenbankabgleich zu bekannten Proteinen in einem bestimmten Leserahmen sowie der Ausschluss der jeweiligen zwei anderen Leserahmen führten dazu, dass in einigen Fällen der Leserahmen, in dem das Start-Codon auf ein oder mehrere Stop-Codons folgte, für die Genexpression gewählt wurde. Bei diesen Klonen wurde davon ausgegangen, dass die RNA-Polymerase nicht das Start-Codon des Vektors, sondern das ermittelte, innerhalb der klonierten Sequenz genutzt hatte. Auf diese Weise konnten die Klone Ss-17, Ss-23 und Ss-97 exprimiert und das rekombinante Protein aufgereinigt [Seite 147↓]werden. In den Klonen, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren, ist der offene Leserahmen eindeutig. In der dargestellten Aminosäuresequenz treten, im Gegensatz zu den beiden anderen Leserahmen, weder Stop-Codons am N-Terminus noch in der zentralen Region des Proteins auf.

Einige der sequenzierten Klone weisen kein Stop-Codon auf, obwohl die mRNA über den Poly-A-Anhang aus der Gesamt-RNA selektiert wurde. Dies ist bei den meisten der für die „KE-reichen Antigene“-kodierenden Klonen sowie den Sequenzen der Klone Ss-7, Ss-23 und Ss-97 zu beobachten. Es ist möglich, dass die betreffenden Klone eine Adenin reiche Region im 3´-Bereich enthalten, anhand derer die mRNA fälschlicherweise bei der Poly-T-Aufreinigung isoliert wurde. Aus diesem Grund könnte es sich bei diesen Klonen um Sequenzen handeln, deren 3´-Enden unvollständig sind. Der Klon Ss-7, der weder ein Start- noch ein Stop-Codon enthält, weist eine Homologie zu einem Titin von D. melanogaster auf (Acc. No.: DAA00021). Bei diesem Protein handelt es sich um ein Protein der Größe von etwa 2034 kDa, so dass davon ausgegangen werden muss, dass es sich bei dem in dieser Arbeit isolierten Klon lediglich um ein Proteinfragment handelt. Fehlende Start-Codons, wie z. B. bei einigen repetitiven Klonen, können durch eine unvollständige Reaktion der Reversen Transkriptase bedingt sein (Wellenreuther et al. 2004). Allerdings war es für diese Arbeit nicht relevant, vollständig Gene zu erhalten, sondern die Fragmente zu isolieren, die Epitope enthielten. Dies war auf dem Weg des Immunoscreenings erfolgt.


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4.4  Expression der rekombinanten Antigene

Die Auswahl Sarcoptes-spezifischer Antigene sollte zunächst über ein relativ einfaches Auswahlverfahren erfolgen, in dem die exprimierten Klone in Form von Lysaten infizierter E. coli-Bakterien im Dot Blot parallel mit Skabies-positiven und -negativen Seren getestet werden sollten (Bradley et al. 1991). Auf diese Weise hätten alle Klone parallel auf ihre Spezifität für Sarcoptes getestet werden können, so dass ein geringer Zeit- und Arbeitsaufwand nötig gewesen wäre. Allerdings traten hier starke Hintergrundsreaktionen, vermutlich durch Antikörperreaktionen mit E. coli-Protein hervorgerufen, auf, so dass eine eindeutig positive bzw. negative Reaktion der Klone nicht ermittelbar war. So wurde mit allen Klonen eine in vivo-Exzision durchgeführt und die cDNA in dem Plasmid pTriplEx2 standardmäßig mit 1 mM IPTG exprimiert. Das Gesamtprotein wurde im Anschluss im SDS-Gel nach Größe aufgetrennt. Auf diese Weise konnten zusätzliche Banden, die nach Induktion auftraten, identifiziert und die Reaktion mit dem Serum eindeutig zugeordnet werden. Die Expressionsbedingungen sind nicht für alle Gene gleich, und die Bedingungen in dem Plasmid waren nicht dieselben, wie die während des Immunoscreenings, in dem die Gene in dem Phagen exprimiert wurden. So war es nicht verwunderlich, dass unter diesen Standardbedingungen nicht alle rekombinanten Antigene exprimiert wurden. Eine Bestimmung der Sarcoptes-Spezifität dieser Antigene war auf Grund der unterbliebenden Expression nicht möglich. So wurden alle bis dahin unbekannten Klone, die im Immunoscreening eine verhältnismäßig starke Reaktion mit dem Skabies-positiven Serum gezeigt hatten, und für die die DNA-Hybridisierung keine Sequenz ergeben hatte, die für „KE-reiches Antigen“ kodiert, sequenziert. Die Klone, die die stärkste Reaktion gezeigt hatten, versprachen ein höheres Potenzial für die Immundiagnostik als die schwächer reagierenden. Diese Klone wurden dann für eine Expression der Gene in Expressionsvektoren kloniert und die Bestimmung der Spezifität für Sarcoptes erfolgte erst nach der Aufreinigung des rekombinanten Proteins. Der gewählte Weg der in vivo-Exzision und der Expression der Klone in Flüssigkultur war zwar erheblich zeit- und arbeitsaufwändiger als der des Dot Blots (s.o), allerdings wurden durch die Auftrennung der Proteine im SDS-Gel und anschließendem Western Blot die Probleme mit unspezifischen Hintergrundsreaktionen mit E. coli-Protein umgangen. Durch die nachfolgende [Seite 149↓]Sequenzierung der stark immunreaktiven, in dem exzisierten System nicht exprimierenden Klone, konnte der Verlust von potenziellen Diagnostik-Kandidaten vermieden werden.

Von den neun ausgewählten rekombinanten Antigenen konnten sieben erfolgreich in Expressionsvektoren kloniert und exprimiert werden, und das Protein konnte aufgereinigt werden. Abgesehen von dem Protein des Klons Ss-18 wurden alle Antigene als einzelne Polypeptide in dem System pQE-30-32 exprimiert. Eine Expression des Klons Ss-18 war nur als Fusionsprotein mit GST in dem System pET-41 möglich. Bei zwei Klonen (Ss-14 und Ss-134) konnte eine Expression nicht erreicht werden, obwohl verschiedene Expressionszeiten und -temperaturen sowie unterschiedliche IPTG-Konzentrationen getestet wurden. Auch durch die Klonierung als GST-Fusionsgene konnte keine Expression erzielt werden. Die Gründe für eine nicht detektierbare Überexpression rekombinanter Proteine können in der Toxizität des Proteins oder in dessen proteolytischen Abbau liegen (Lottspeich und Zorbas 1998). So könnte hier die Klonierung in z. B. ein System, in dem im Cytoplasma toxische Proteine in das Periplasma sezerniert werden, zu einer erfolgreichen Überexpression führen.

Das rekombinante Fusionsprotein des Klons Ss-18 weist im SDS-Gel ein Molekulargewicht von etwa 70 kDa auf. Das reine GST hat ein Molekulargewicht von etwa 25 kDa, was bedeutet, dass das rekombinante Sarcoptes-Protein ein apparentes Molekulargewicht von etwa 45 kDa hat, während das errechnete bei 27 kDa liegt. Aus Abb. 7 wird ersichtlich, dass sowohl das exprimierte Protein von Klon Ss-14 (errechnet 40.3 kDa, apparent etwa 62 kDa) als auch das von Klon Ss-18 in dem Plasmid pTriplEx2 ebenfalls größer als errechnet sind. Bei Proteinen, die sich aus vielen polaren Aminosäuren zusammensetzen, ist das tatsächliche Gewicht oft ein anderes als das errechnete (Ramachandran et al. 1998). Vermutlich ist dies auf die vielen Wiederholungen der stark polaren Domänen, bestehend aus den Aminosäuren Glutamat und Lysin, zurückzuführen. Das apparente Gewicht des Proteins von Klon Ss-97 hingegen ist mit 19 kDa anstelle von 29.3 kDa geringer als das errechnete, obwohl auch hier der Anteil der polaren Aminosäure Glutamat (13.08%) verhältnismäßig hoch ist. Allerdings ist der prozentuale Anteil der unpolaren Aminosäure Glycin (36.34%) wesentlich höher. Es ist nicht zu erwarten, dass das [Seite 150↓]Protein am C-Terminus unvollständig exprimiert wurde, da im Gel keine Degradationsprodukte zu sehen sind (s. Abb. 23). Allerdings könnten Start-Codons, die in der Sequenz auftreten, für einen internen Translationsstart verantwortlich sein, so dass das exprimierte Protein am N-Terminus verkürzt ist.

Das Protein des Klons Ss-7 weist im SDS-Gel ein wesentlich größeres Molekulargewicht auf, als das errechnete. Auf Grund der Tatsache, dass es doppelt so groß ist (62 kDa anstelle von 27.3 kDa), ist es wahrscheinlich, dass das Protein hier als Dimer vorliegt.

4.5 Antigenität und potenzielle Funktionen der isolierten Antigene

Auf der Suche nach parasitenspezifischen Antigenen für eine Serodiagnose von Onchocerca ssp. haben einige Autoren Antigene gefunden, denen ein geringes Molekulargewicht (< 31 kDa) gemein war (Gallin et al. 1989, Lobos et al. 1990, Bradley et al. 1991, Cho-Ngwa et al. 2003). Auch bei anderen Nematoden, wie z. B. Cooperia oncophora (de Graaf et al. 1993, Nieuwland et al. 1995) und Dictyocaulus viviparus (Schnieder 1992) wurden kleinere Proteine durch das Serum infizierter Tiere erkannt. Bei kleineren Proteinen sind im Vergleich zu den größeren weniger Epitope vorhanden, die kreuzreagieren können, so dass im Allgemeinen von diesen Molekülen eine höhere Spezifität als von den größeren zu erwarten ist. Auch bei den in dieser Arbeit isolierten immunreaktiven Klonen, die exprimiert wurden, ist eine Tendenz zu kleineren Molekülen ersichtlich. Diese Klone umfassen ein Größenspektrum, bei dem es sich um Proteine der Größen zwischen etwa 20 kDa bis 45 kDa handelt. Allerdings können keine detaillierten Aussagen über die Spezifität dieser Antigene gemacht werden, da sie zu diesem Zweck mit den Seren von Hausstaubmilbenallergikern und Patienten, die mit anderen Ektoparasiten infiziert sind, getestet werden müssten.

Es wurden auch Klone isoliert, die ein Insert trugen, deren Basenpaarlänge auf ein größeres Protein schließen ließ. Allerdings wurden diese Klone nicht sequenziert, und so kann auch keine Aussage über die Größe des Proteins gemacht werden, da weder die Position des Translationsstarts noch die des Translationsendes bekannt sind.


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Die Klone Ss-17, -23, -97, sowie die für die „KE-reichen Antigene“-kodierenden Klone beinhalten eine Signalsequenz. In Klon Ss-37 fehlt der 5´-Bereich, aber der Datenbankabgleich ergab, dass auch dieses vollständige Gen eine Signalsequenz enthält. Bei der Mehrzahl der isolierten Proteine handelt es sich demnach um sezernierte Antigene oder Oberflächenproteine (Übersicht Dalton et al. 2003), gegen die der Wirt spezifische Antikörper bilden kann (Lightowlers und Rickard 1988, Molinari et al. 2002). Auf dieser Basis sind diverse exkretorisch-sekretorische Parasitenantigene für die Verwendung in der Serodiagnostik kloniert worden (Kumari et al. 1994, Chung und Ko 1999, Yamasaki et al. 2000, Fong und Lau 2004). Abgesehen von Klon Ss-37 sind in dieser Arbeit die Klone, die für sezernierte Proteine kodieren, mehr als ein Mal identifiziert worden. Die direkte Konfrontation des Wirtes mit den exkretorisch-sekretorischen Proteinen erklärt den hohen Anteil (55.5%) isolierter Klone, die für sezernierte- oder Oberflächenproteine kodieren und damit potenzielle Kandidaten für die Serodiagnostik sind.

Die Sequenzen, die für „KE-reiche Antigene“ kodieren, stellen einen Großteil (42.6%) der identifizierten Klone dar. Diese Klone wurden in 67.6% der Fälle aus der amplifizierten Bank isoliert, während sie unter Verwendung der nicht amplifizierten Bank nur 12.5% der Klone darstellten. So muss davon ausgegangen werden, dass es sich bei diesen Sequenzen nicht um besonders abundante Transkripte handelt, sondern diese durch die Amplifikation der cDNA-Bank überproportional amplifiziert worden sind.

Zu den „KE-reichen Antigenen“ konnten keine bereits bekannten und charakterisierten, homologen Proteine aus den öffentlichen Datenbanken ermittelt werden. Aus diesem Grund ist es auch nicht möglich, Aussagen über eventuelle Funktionen der Antigene zu treffen.

In dem zentralen Bereich dieser Antigene sind die basische und polare Aminosäure Glutamat sowie die polare Aminosäure Lysin dominant. Die theoretische Strukturanalyse (MacVector, Accelrys) ergab für diesen Bereich eine Hydrophilie und damit verbunden einen erhöhten Oberflächenindex sowie eine erhöhte Flexibilität der Aminosäuren. Bezüglich der Sekundärstruktur wird in diesem Bereich ist eine α-Helix vorhergesagt.


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Die Immunogenität von Proteinen wird durch diverse Fakoren bestimmt. Dazu gehört unter anderen die Art der Seitenkette der Aminosäuren. Die am stärksten epitopbestimmenden Aminosäuren sind polare, wie z. B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Lysin und Arginin und solche mit großen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan). Immunogene Proteine sollten nach den Autoren außerdem eine hohe Flexibilität zeigen (Lottspeich und Zorbas 1998). Die polaren Aminosäuren Glutamat und Lysin sind in den repetitiven Proteinen im zentralen Bereich überdurchschnittlich hoch vertreten. Dieser zeichnet sich außerdem durch einen hohen Flexibilitätsindex aus. Des Weiteren sollten die immunogenen Abschnitte für die Erkennung frei zugänglich auf der Oberfläche des Moleküls liegen und keine ß-Struktur aufweisen (Lottspeich und Zorbas 1998). Beide Charakteristika werden für den KE-reichen Bereich dieser Proteine vorausgesagt. Für diese spezifischen Sarcoptes-Proteine treffen demnach eine Reihe der Punkte zu, die die Immunogenität eines Proteins bestimmen (s. Abb. 28).

Auch für einige der anderen exprimierten Antigene treffen oben genannte Parameter zu: die Proteine der Klone Ss-7, Ss-23 und Ss-97 enthalten vermehrt Aminosäuren, die massiv zu einer Erhöhung des Antigenitätsindex der jeweiligen Epitope beitragen. Dazu gehören auch die Umkehrungen in der Polypeptidkette, bedingt durch das vermehrte Auftreten von Prolin bzw. Glycin im Fall der Klone Ss-23 bzw. Ss-97. Die Strukturanalyse des Proteins von Klon Ss-134 sagt für den zentralen Bereich eine Hydrophobie voraus, der außerdem eine erhöhte Flexibilität aufweist. Auch hydrophobe Bereiche können immunogen sein, sofern sie flexibel sind. Auf diese Weise können sich die Epitope, die durch die Hydrophobie der betreffenden Aminosäuren nicht an der Oberfläche exponiert sind, dem Antikörper zuwenden und so eine Bindung eingehen (persönliche Mitteilung Dr. R. Volkmer-Engert). Der erhöhte Antigenitätsindex zeigt für diesen Klon die potenzielle Immunogenität, die hier durch die Hydrophobie und nicht durch die Hydrophilie der Aminosäuren bedingt ist. Insgesamt gesehen tritt die polare Aminosäure Lysin bei allen diesen Antigenen überproportional häufig auf (Ss-7 20.08%, Ss-14 27.35%, Ss-23 29.47%, Ss-97 15.76%), gefolgt von Glutamat (Ss-7 19.69%, Ss-14 23.82%, Ss-97 12.73%). Auch Ramachandran et al. (1998) isolierten auf der Suche nach rekombinanten Antigenen für die Diagnose der Strongyloidose diverse Proteine, die viele geladene [Seite 153↓]Aminosäuren und auffällig viele Proline, die zu Umkehrungen in der Polypeptidkette führen, enthielten.

Die in dieser Arbeit isolierten Antigene erfüllen somit in der Mehrzahl die theoretischen Anforderungen an ein Immunogen.

Auf Grund der Tatsache, dass bei den Klonen Ss-7, -23 und -97 kein Stop-Codon ermittelt werden konnte, wurden diese stromaufwärts des vermeintlichen Poly-A-Anhangs kloniert. Auf Grund des fehlenden Stop-Codons ist allerdings anzunehmen, dass es sich hierbei lediglich um eine Adenin-reiche Region und nicht um den Poly-A-Anhang des Transkriptes handelt. Der offene Leserahmen eines Adenin-Tripletts kodiert für die immunogene Aminosäure Lysin (s. o.), so dass empfohlen wird, in Zukunft diesen Bereich der Transkripte in die Klonierung für die Expression mit einzubeziehen.

Die Proteine der Klone Ss-23, -97 und -134 sowie die der „KE-reichen Antigene“-kodierenden enthalten repetitive Domänen, die in den „KE-reichen Antigenen“ besonders ausgeprägt sind. Sich wiederholende Regionen innerhalb der verschiedensten Proteine sind bei eukaryotischen Parasiten häufig zu beobachten. Diese Regionen zeichnen sich durch das bevorzugte Auftreten bestimmter Aminosäuren (N, A, D, V, P, E G, Q und S) aus, während andere (C, M, F, W, Y, I und L) selten vorhanden sind (Übersicht Schofield 1991). Auch in den hier isolierten Klonen, die repetitive Domänen enthalten, treten die Aminosäuren N, E, G und Q vermehrt auf. Catmull et al. (1994) haben ein unlösliches Protein mit repetitiven Domänen von Onchocerca ssp. beschrieben, das von Seren infizierter Patienten erkannt wurde. Unter diversen anderen repetitiven Parasitenantigenen wurden aus Leishmania major mittels eines Immunoscreenings mit Kaninchenseren zwei Proteine isoliert, die repetitive Regionen enthalten (Wallis und McMaster 1987). Auch das stadienspezifische Protein Pfs230 von Plasmodium falciparum stellt ein immundominantes repetitives Antigen dar (Williamson et al. 1996). Für Arthropoden sind bisher keine Antigene beschrieben worden, die derartige Regionen aufweisen.

Die Rolle von repetitiven Bereichen in Parasitenantigenen ist von Anders et al. (1986) als Präsentation einer Reihe von kreuzreagierenden Epitopen beschrieben worden, die mit der Reifung von potenziell protektiven Antikörpern interferieren. Schofield (1991) hat diese Hypothese ausgebaut, indem er auf eine Funktion der repetitiven [Seite 154↓]Bereiche in der Immunevasion, durch die Induktion einer T-Zell- unabhängigen B-Zell-Aktivierung des Parasiten, verwies. Antikörper gegen die repetitiven Regionen zeigen nur in artifiziellen Versuchen einen inhibitorischen Effekt auf den Parasiten, sind aber sonst nicht protektiv (Schofield 1991). Die repetitiven Domänen könnten als „Designer“-B-Zell-Epitope fungieren, indem sie wichtige Moleküle auf antigen-spezifische B-Zellen fokussieren und bei diesem Prozess die Antikörper gegen benachbarte Regionen unterdrückten (epitopische Suppression). Gleichzeitig würden die Oberflächen-Antikörper auf den B-Zellen kreuzvernetzt. Auch bei Leishmania und Onchocerca spp. wird ein Zusammenhang zwischen repetitiven Proteinen und der Immunevasion des Parasiten diskutiert (Wallis und McMaster 1987, Catmull et al. 1994).

Die Klone, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren, sind während des Immunoscreenings überproportional häufig (42.6%) isoliert worden, was für eine starke Immundominanz spricht. Dieses Kriterium wird von Schofield (1991) ebenfalls als ein Parameter für seine Hypothese angeführt. Es wurde in dieser Arbeit nicht untersucht, ob die isolierten Antigene Antikörperantworten gegen Proteinregionen außerhalb der repetitiven Domänen auslösen. Für eine Aussage über eine immunevasive Funktion der repetitiven Regionen wäre es allerdings nötig, zu wissen, gegen welche Epitope der Proteine die Antikörper des Wirtes gerichtet sind. Auf Grund der Tatsache, dass die für die „KE-reichen Antigene“-kodierenden Klone zum Teil große Differenzen zumindest am C-Terminus aufweisen, allen aber ein mehr oder weniger ausgeprägter repetitiver KE-Bereich gemeinsam ist, liegt die Vermutung nahe, dass die Antikörperreaktion gegen diesen Bereich gerichtet ist. Diese Tatsache spricht für eine Rolle dieser Epitope in der Immunevasion der Parasiten.

Die Funktion der Immunevasion wird auch für die SMIPPs (Scabies Mite Inactivated Protease Paralogues) (Holt et al. 2003) diskutiert, die Homologien zu dem in dieser Arbeit isolierten Klon Ss-37 zeigen. Die Autoren isolierten eine Multigenfamilie mit mindestens 24 Mitgliedern, die Homologien zu einem Serinprotease-Allergen von D. pteronyssinus zeigten. Abgesehen von einem Isolat, war die Voraussage der katalytischen Aktivität auf Grund von Mutationen in aktiven Zentren der Proteine für alle anderen Isolate negativ. Holt et al. (2003) stellten die Hypothese auf, dass die inaktiven Proteine der Immunevasion des Parasiten dienten, indem diese Antikörper [Seite 155↓]binden könnten, und auf diese Weise die aktiven Proteasen vor der Blockierung durch Antikörper schützten. Der in dieser Arbeit isolierte Klon Ss-37 kodiert ebenfalls für ein vermeintlich inaktives Enzym. Wie allen SMIPPs fehlt auch diesem Klon das aktive Serin im katalytischen Zentrum, das durch ein Glutamat ersetzt ist. Auch eine intakte katalytische Triade (H, D und S) wird nicht kodiert. Vier der sechs konservierten Cysteine fehlen, darunter auch die beiden das aktive Serin flankierenden (s. Abb. 14), die im Allgemeinen in S1 Chymotrypsin-Familien über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind (Rawlings und Barrett 1994). Dahingegen befand sich ein potenziell aktives Enzym nicht unter den sequenzierten, mittels des Immunoscreenings gefundenen Klonen. Diese Tatsache weist nicht darauf hin, dass vermehrt Antikörper gegen das inaktive Enzym gebildet wurden, sondern bestätigt das vermehrte Auftreten der inaktiven Form (Holt et al. 2003) des Enzyms. Allerdings bleibt zu beweisen, ob diese inaktiven Enzyme tatsächlich der Immunevasion dienen.

In dieser Arbeit wurden erste Versuche durchgeführt, um das allergene Potenzial des Klons Ss-37, der Homologien zu dem Allergen Der f III von D. farinae (Nishiyama et al. 1997) zeigt, anhand von drei Skabies-positiven Seren im Mediatorfreisetzungstest zu ermitteln (Daten nicht gezeigt). Parallel wurde auch das Gesamtantigen der Milben auf die allergene Wirkung untersucht. Für beide Antigene konnte diese bislang nicht nachgewiesen werden.

Es existieren diverse Berichte über die humorale Antwort in Sarcoptes-positiven Patienten, in denen ebenfalls nur teilweise eine erhöhte IgE Antwort ermittelt wurde (Übersicht Arlian 1996, Morgan et al. 1997, Arlian et al. 2004). In den meisten rekombinant in E. coli hergestellten Allergenen bleiben die IgE-bindenden Epitope erhalten und die Proteine zeigen eine zu dem nativen Allergen vergleichbare IgE-Reakivität (Übersicht Chapman et al. 2000). Allerdings wird auch von rekombinant in E. coli hergestellten Proteinen, wie z. B. dem heterodimeren Allergen Fel d I aus der Katze, berichtet, deren IgE-Reaktivität erst nach einer Reassoziierung und Rückfaltung der Proteine vergleichbar hoch wie die des nativen Proteins war (Keating et al. 1995).

Für definitive Aussagen über das allergene Potenzial dieses Antigens muss dieses mit einer größeren Anzahl von Seren gestetet werden. Die prokaryotische Expression des Klons Ss-37 kann ein Grund für das nicht nachweisbare allergene Potenzial sein. [Seite 156↓]Allerdings ist es auch möglich, dass die verwendeten Patientenseren keine IgE-Antikörper gegen das Protein des Klons Ss-37 enthielten, da diese hier auch nicht gegen das Gesamtantigen von S. scabiei nachgewiesen werden konnten.

Harumal et al. (2003) haben mittels eines Hyperimmunserums von Kaninchen einen Klon Ssag2 isoliert, der homolog zu dem in dieser Arbeit gefundenen Klon Ss-97 ist. Die Autoren haben keine Studien über die Eignung des rekombinanten Antigens für die Serodiagnostik unternommen, und so liegen auch keine Berichte über die Spezifität bzw. Sensitivität dieses Proteins vor. Immunhistochemische Untersuchungen zeigten, dass es sich bei diesem Protein definitiv um einen Bestandteil der Sarcoptes-Milben handelt. In der vorliegenden Studie wurde der Klon Ss-97, der insgesamt drei Mal isoliert wurde und bei dem die Strukturanalyse einen potenziell erhöhten Antigenitätsindex ergibt, ebenfalls durch eine immunologische Reaktion mit dem Humanserum detektiert. Allerdings zeigten sowohl die negativen Human- als auch Schweineseren eine Reaktion mit dem Antigen, so dass das Protein unter diesen Expressionsbedingungen (s. u.) keinen Wert für die serologische Diagnostik hat.

Auch der Klon Ss-134 wurde in anderen Studien (Fischer et al. 2003) isoliert. Allerdings handelte es sich bei diesen Untersuchungen nicht um immunologische, sondern um die Sequenzierung diverser ESTs. Die Autoren schlossen wegen der Abundanz des Moleküls und des Vorhandenseins diverser Sequenzwiederholungen innerhalb der Gensequenz auf eine potenzielle Eignung des Proteins für die Serodiagnostik. Die strukturelle Analyse des Klons Ss-134 weist ebenfalls auf eine erhöhte Immunogenität des Moleküls hin. Besonders der mit Glycinen angereicherte Bereich verursacht auf Grund der daraus resultierenden Umkehr in der Polypeptidkette einen theoretisch erhöhten Antigenindex des Proteins. Dieser Klon konnte in dieser Arbeit allerdings trotz verschiedener Optimierungen des Expressionssystems nicht zur Expression gebracht werden (s. Punkt 4.4).

Sandeman (2001) beschrieben in einer Patentschrift diverse Antigene, die von den Autoren im ELISA auf Antikörperreaktionen im Serum von Sarcoptes-infizierten Schweinen getestet wurden. Zu den parasiteneigenen Proteinen, die starke Reaktionen mit dem Serum zeigten, gehörten hier die α-Amylase sowie einige Serin-Proteasen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls eine Trypsin-ähnliche [Seite 157↓]Serin-Protease (Ss-37) gefunden. Trypsine sind im Dünndarm auftretende Verdauungsenzyme, die mit dem Kot ausgeschieden werden. Damit gehören sie zu den antigenwirksamen Bestandteilen bei einer Sarcoptes-Infektion, die in Form von Kot, Eiern, möglicherweise als Sekrete aus den Geschlechtsorganen und besonders als Speicheldrüsensekret in den Wirt abgegen werden (Matthes et al. 1992, Arlian et al. 1994b). Der Protein von Klon Ss-37 zeigte im ELISA signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen sowohl der humanen als auch der porzinen Positiv- und Negativseren. Allerdings ist die unspezifische Hintergrundsreaktion der negativen Schweineseren sehr hoch (s. u.). Bei den Humanseren ist eine hohe Reaktion des Serums S17 zu beobachten, das von einem Hausstaubmilbenallergiker stammt. Auf Grund dieser Reaktion muss davon ausgegangen werden, dass unter Verwendung des Antigens von Klon Ss-37 im ELISA Kreuzreaktionen mit Hausstaubmilben auftreten werden. Für eine detaillierte Aussage sollte hier eine große Anzahl von Allergikerseren getestet werden.

Die α-Amylase der Sarcoptes-Milben befand sich dagegen nicht unter den sequenzierten Isolaten. Auch zwei von S. scabiei bekannte rekombinante Antigene, das Ssag1 mit Homologien zu dem Hausstaubmilbenallergen M 177 (Harumal et al. 2003) und das Paramyosin (Mattson et al. 2000), die beide mittels eines Immunoscreenings mit Kaninchenseren isoliert wurden, wurden in dieser Arbeit nicht identifiziert. Auch hier könnte der Grund in der unterschiedlichen Antigen-Erkennung bei verschiedenen Wirten liegen (Arlian et al. 1996a).

Im ELISA sind hohe Hintergrundsreaktionen der Schweineseren mit den rekombinanten Antigenen zu beobachten. Im Vergleich zu dem Menschen sind die Schweine ihren Exkrementen, und damit auch E. coli-Bakterien, wesentlich direkter ausgesetzt. Es ist aus diesem Grund nicht verwunderlich, wenn vermehrt Antikörper gegen E. coli-Proteine gebildet werden. Die in dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Antigene wurden in dem prokaryotischen System E. coli exprimiert. Selbst nach einer Aufreinigung dieser Proteine mittels einer Bindung an die spezifische Matrix und ausgiebigen Waschens verbleibt restliches E. coli- Protein in den Eluaten (s. Abb. 11 und 16), deren Konzentration allerdings durch die anschließende Dialyse der Eluate weiter verringert wurde. Während der Dialyse gegen Harnstoff-niedermolaren Puffer präzipitierten oft Proteine, und das [Seite 158↓]rekombinante Protein zeigte im SDS-Gel eine höhere Reinheit als vor der Dialyse. Es ist davon auszugehen, dass es sich bei den Präzipitaten um E. coli-Proteine handelte. Allerdings verblieb auch hier restliches E. coli-Protein in den Eluaten, welches im ELISA ebenfalls mit den Serumantikörpern reagieren kann. Eine Präabsorption der Seren mit E. coli-Protein erbrachte keine Verminderung dieser unspezifischen Reaktionen. Es ist zu vermuten, dass eine derartige Präabsorption nicht ausreicht, um die entsprechenden Antikörper zu binden. Aus diesem Grund wäre in diesem Zusammenhang ein eukaryotisches Expressionssystem wie z. B. das Baculovirus für eine Serodiagnose der Räude beim Schwein zu empfehlen, da unspezifische Reaktionen gegen Insektenproteine unwahrscheinlich sein dürften.

Die unspezifischen Reaktionen der Humanseren waren in dieser Arbeit wesentlich geringer als die der Schweineseren (s. o.). Allerdings konnte hier im ELISA mit dem Fusionsprotein Ss-18 eine hohe unspezifische Reaktion mit dem GST beobachtet werden. Auch hier führte eine Präabsorption der Seren mit reinem GST zu keiner Verminderung der unspezifischen Reaktion. Ralston und Heath (1995) empfehlen eine Fusion mit einem inerten Trägerprotein wenn eine Expression als Fusionsprotein notwendig ist, um eine Aufreinigung des Proteins zu ermöglichen. Das repetitive Protein konnte in den vorliegenden Studien nur als Fusionsprotein mit GST exprimiert werden. Es wurde nachträglich auch in das Plasmid pQE als Fusionsgen mit der Sequenz des Klons Ss-17 am N-Terminus kloniert, um die Spezifität der Reaktion zu erhöhen, und gleichzeitig die unspezifische Reaktion mit dem GST zu umgehen. Allerdings konnte dieses Fusionsprotein bislang nicht in voller Länge erhalten werden, da das Gen nicht vollständig, sondern in Fragmenten unterschiedlicher Länge exprimiert wurde.

Es sind Fusionsproteine für die Diagnostik von Onchocerca volvulus-Infektionen beschrieben worden (Nde et al. 2002), für die eine Sensitivität von 95.5% und eine Spezifität von 97.9% bzw. 95.35% ermittelt werden konnte. Die einzelnen Proteine hatten zuvor eine Sensitivität von 93.3% bzw. zwischen 54% und 95% und eine Spezifität von 93.3% bzw. 99% gezeigt. Über die Spezifität der hier untersuchten Antigene ist bislang keine valide Aussage möglich, da diese nur mit Seren Sarcoptes-positiver und -negativer Patienten getestet wurden. Zu diesem Zweck müssten die Antigene mit Seren von Haustaubmilbenallergikern und Patienten mit [Seite 159↓]anderen Arthropodeninfektionen getestet werden. Eine Kreuzreaktivität bei den rekombinanten „KE-reichen Antigenen“ ist allerdings unwahrscheinlich, da dieses nicht in Hausstaubmilben, die mit den Sarcoptes-Milben eng verwandt sind (Astigmata), nachgewiesen werden konnte. Aus diesem Grund ist von einer Spezifität dieses Proteins für die parasitischen Milben auszugehen. Auch bei den hier fusionierten Antigenen (Ss-17/14) wäre eine Verbesserung der Sensitivität der Antigene denkbar, indem sie als Hybride eingesetzt würden. Die unspezifischen Hintergrundsreaktionen der Negativseren könnten eventuell durch andere Blockierungsmedien, wie z. B. Milchpulver an Stelle von BSA, verringert werden. Verlängerte Blockierungsszeiten hatten zu keiner Verminderung der unspezifischen Hintergrundsreaktionen geführt.

Die mittleren OD450/630-Werte der ELISAs wiesen bei den Humanseren eine größere Diskrepanz zwischen den Positiv- und den Negativseren auf, als es bei den Schweineseren der Fall war (s. Punkt 3.10). Dieses kann diverse Gründe haben. Laut Arlian et al. (1996a) werden den verschiedenen Wirten durch die unterschiedlichen Sarcoptes-Varietäten gleiche Antigene präsentiert, aber die Wirte bilden auch Antikörper gegen Varietät-spezifische Epitope der gleichen oder unterschiedlichen Antigene. Es ist also möglich, dass in den Humanseren Antikörper vorhanden waren, die andere, spezifischere Epitope in dem betreffenden Antigen erkannten, als es in den Schweineseren der Fall war. Gleichzeitig können die geringeren Unterschiede auch in einer anderen Ursache begründet sein. Es ist davon auszugehen, dass die Schweineseren mit E. coli-Protein aus den Proteineluaten reagieren (s. o.). Aus diesem Grund kann diese unspezifische Reaktion die spezifische vollkommen überlagern, so dass keine Aussage über eine potenzielle Infektion möglich ist. Es muss davon ausgegangen werden, dass das Expressionssystem E. coli für eine Räudediagnostik mit Hilfe rekombinanter Antigene beim Schwein vollkommen ungeeignet ist. Sollten die geringeren unspezifischen Hintergrundsreaktionen bei den Humanseren ebenfalls auf E. coli-Protein zurückzuführen sein und nicht durch andere Blockierungsmedien verringerbar, wäre das E. coli-Expressionssystem auch für die Skabiesdiagnostik beim Menschen unbrauchbar.


[Seite 160↓]

4.6  Charakterisierung der für die „KE-reichen Antigene-kodierenden Sequenzen

4.6.1 Genkopien und Transkripte

Mittels des Immunoscreenings wurden diverse Klone isoliert, die für „KE-reiche Antigene“ kodieren und sich teilweise wenig, teilweise aber massiv unterscheiden. Allen gemeinsam ist der repetitive zentrale, hauptsächlich aus den Nukleotiden Guanin und Adenin bestehende Bereich, der allerdings in unterschiedlicher Ausprägung auftritt. Die größten Unterschiede sind am 3´-Ende dieser Klone zu beobachten, während sich die 5´-Bereiche nur geringfügig voneinander unterscheiden. In der Southern Blot-Analyse wurde unerwarteterweise nur eine Kopie des Gens nachgewiesen. Aus diesem Grund liegt die Vermutung nahe, dass für die Ausbildung der unterschiedlichen Transkripte posttranskriptionale Modifikationen verantwortlich sind, wie die des „alternativen Spleißens“ (“Alternative Splicing“) sowie des Editierens von RNA (“RNA Editing“).

Durch das alternative Spleißen können aus einem Primärtranskript viele unterschiedliche mRNAs gebildet werden, die dann für unterschiedliche Proteine kodieren können. Dieses erfolgt durch das Einfügen oder Entfernen von Exons, oder aber auch durch das Verlängern bzw. Kürzen der Exons (Übersicht Cartegni et al. 2002). Die Komplexität des Proteoms wird auf diese Weise stark erhöht.

Das Editieren der RNA ist ein weiterer Prozess, bei dem die genetische Information des Primärtranskriptes geändert wird. Hier wird zwischen der Insertion bzw. Deletion und der Änderung von Nukleotiden unterschieden, bei denen es zum Teil zu einer Änderung des offenen Leserahmens kommt. Besonders in der mitochondrialen RNA von Trypanosomen ist dieser Mechnismus detailliert beschrieben worden (Harris et al. 1990, Adler et al. 1991, Übersicht Hajduk et al. 1997). Der Vorgang des RNA-Editierens erfolgt meistens vor dem des RNA-Spleißens. Durch z. B. das Einfügen neuer Spleißstellen kann das RNA-Editieren Einfluss auf den Spleißvorgang haben und eventuell den offenen Leserahmen verändern (Rueter et al. 1999). In Ratten wurden vier ADAR2 Transkripte, die durch gewebespezifisches alternatives Spleißen entstehen, identifiziert (Rueter et al. 1999). Von den in dieser Arbeit isolierten Klonen unterscheidet sich z. B. der Klon Ss-10 durch das Vorhandensein eines Fragmentes [Seite 161↓]im zentralen repetitiven Bereich von den anderen Klonen, denen dieses fehlt. In den Klonen Ss-20 und Ss-82 ist der zentrale Bereich hingegen extrem kurz (s. Abb. 27). Gleiches gilt für den nicht repetitiven 3´-Bereich, der in dem Klon Ss-10 vor dem vermeintlichen Poly-A-Anhang fehlt. Den Klonen Ss-3, -14, -82, und -122 ist das Auftreten eines langen Bereiches am 3´-Ende der Sequenz gemein, allerdings treten hier auch wieder Unterschiede in den repetitiven Bereichen der verschiedenen Transkripte auf. Der Leserahmen in den hier isolierten Klonen unterscheidet sich nicht. Eine genaue Aussage über das alternative Splicing und das Redigieren der RNA der hier vorliegenden repetitiven Transkripte wäre allerdings nur durch die Analyse der genomischen Sequenz des Gens möglich.

Bei Arthropoden sind die Vorgänge des „alternativen Spleißens“ und des „RNA-Editierens“ für verschiedene Gene von Drosophila beschrieben worden (Semenov und Pak 1999, Übersicht Cartegni 2002, Peters et al. 2003).

Eine gewebespezifische Modifikation der verschiedenen Transkripte ist hier nicht zu erwarten. Das repetitive Protein wurde in den Sarcoptes-Milben nur in einer paarigen Struktur im posterioren Opisthosoma nachgewiesen (s. Punkt 3.9.2.4.8.2).

In der Western Blot-Analyse wurden mittels eines Mäuse-Serums, das gegen das Protein des Klons Ss-18/GST gerichtet war, fünf Proteinbanden detektiert. Im Hinblick auf die Anzahl der verschiedenen Transkripte, die hier isoliert wurden, ist die Anzahl der Proteine gering. Es ist aber, auf Grund der überwiegend ähnlichen Größen der Transkripte, wahrscheinlich, dass sich hinter diesen fünf Proteinbanden weitere Proteine der gleichen oder ähnlichen Größe verbergen. Diese können allerdings in einem nur 10%igen, eindimensionalen SDS-Gel nicht voneinander unterschieden werden.

Eine andere Ursache für die verminderte Proteinanzahl im Vergleich zu der der Transkripte könnte die posttranskriptionale Genregulation im Cytoplasma sein, bei der die mRNA, kontrolliert durch verschiedenste Mechanismen, abgebaut werden kann (Übersicht Brennan und Steitz 2001). Die Stabilisierung oder Destabilisierung einer mRNA stellt einen wichtigen Kontrollpunkt der Genexpression dar, bei der die kodierende Information der RNA nicht mehr geändert wird. Für die vorliegenden Sequenzen würde dies bedeuten, dass die Transkripte, die in vivo keine Proteine [Seite 162↓]ausbilden, nur durch die Klonierung in den Expressionsvektor exprimiert wurden. Iarovaia et al. (2001) berichten von Alpha-Globin-Genen, die zwar in Leukämiezellen von Hühnern voll transkribiert werden, deren mRNAs aber in dem perinukleären Bereich akkumulieren und in den nicht differenzierten Zellen temporär zurückgehalten werden. Es liegen allerdings keine Berichte darüber vor, dass ein Organismus nur eine Genkopie eines bestimmten Gens ausbildet, diverse Transkripte entwickelt, um dann wieder eine geringe Anzahl dieser Transkripte zu exprimieren, so wie es für die hier beschriebenen Transkripte der Fall zu sein scheint.

Interessanterweise konnte das für die „KE-reichen Antigene“-kodierende Gen in den freilebenden Hausstaubmilben (D. pteronyssinus) nicht nachgewiesen werden. Dieses ist umso überraschender, da die Dermatophagoides-Milben, wie auch die Sarcoptes-Milben, zu der Gruppe der Astigmata gehören und damit in enger Verwandtschaft zueinander stehen. Das Gen, das für die „KE-reichen Antigene“ kodiert ist folglich spezifisch für die parasitischen Milben, allerdings bleibt nachzuweisen, ob dieses auch im Vergleich zu anderen parasitischen Milben der Gruppe der Astigmata, wie Psoroptes sp. oder Chorioptes sp., gilt. Sollte sich das repetitive Protein als diagnostisches Antigen erweisen, sollten hier zumindest Kreuzreaktionen mit Hausstaubmilbenantigen keine Rolle spielen, welche in der Sarcoptes-Diagnostik ein bedeutendes Problem darstellen (Übersicht Arlian 1996). Auch das Hausstaubmilbenallergikerserum S17 reagiert, im Vergleich zu den anderen Antigenen, verhältnismäßig niedrig mit diesem Antigen. Die Hintergrundsreaktion könnte auf die Reaktion mit dem GST zurückzuführen sein.

4.6.2 Lokalisierung der „KE-reichen Antigene“

Für die Lokalisierung der „KE-reichen Antigene“ in der Sarcoptes-Milbe wurden Peptide aus dem N- und C-Terminus sowie der zentralen Region des Proteins synthetisiert. Die Aminosäuresequenz dieser Peptide wurde mit Sequenzen aus öffentlichen Datenbanken abgeglichen, um Kreuzreaktionen mit anderen Proteinen zu vermeiden. Nur das α-PeptidA2-Serum zeigte im ELISA sehr geringe Reaktion mit dem Gesamtantigen der Sarcoptes-Milben, so dass lediglich das Serum der BALB/c-[Seite 163↓]Mäuse, die gegen dieses Peptid aus der zentralen Region der Proteine immunisiert worden waren, für die Immunhistochemie verwendet werden konnte. In den lichtmikroskopischen Aufnahmen der Gefrierschnitte konnte mittels der FITC-markierten Antikörper eine paarige Struktur im posterioren Teil des Opisthosomas detektiert werden, die nur mit dem Serum der immunisierten BALB/c-Mäuse, nicht aber mit dem Negativserum reagierte (s. Abb. 34). Die Milben, die für diese Aufnahmen verwendet wurden, waren im Vorfeld nicht nach Männchen und Weibchen getrennt worden, so dass eine Aussage über das Geschlecht der markierten Milben nicht möglich war. Auffallend war aber, dass in den Milben, die ein Ei im Uterus trugen, und damit eindeutig als Weibchen zu identifizieren waren, die paarige Struktur nicht detektiert wurde. Vorausgesetzt, dass es sich bei den identifizierten Proteinen nicht um stadienspezifisch exprimierte Gene handelt, war dies ein erster Hinweis darauf, dass es sich bei der Struktur um ein Organ der männlichen Milben handelte. Mittels der Peroxidase-markierten Antikörper konnten auf Grund hoher Hintergrundsreaktionen keine spezifischen Strukturen detektiert werden. In Semidünnschnitten mit anschließender Methylenblaufärbung (s. Abb. 35) wurde in einem Individuum unbekannten Geschlechts ebenfalls ein paariges Organ sichtbar, dessen Struktur und Inhalt in den elektronenmikroskopischen Aufnahmen (s. Abb. 36) auf Hoden hinweisen könnte (persönliche Mitteilung Dr. G. Brennan, Queens University Belfast). Die Hoden der Astigmata sind paarig und die Spermatozoen wie bei allen Acari vom aflagellaten Typ (Evans 1992). Zumindest die paarigen Hoden betreffend würde dies für die in den Semidünnschnitten mit anschließender Methylenblaufärbung identifizierte Struktur zutreffen. Spermien konnten bislang nicht identifiziert werden. Für die Aufklärung der paarigen Struktur in ein und demselben Individuum wurden Milben nach Geschlecht getrennt, indem Männchen als kleiner als die Weibchen und dunkler als die Nymphen identifiziert wurden (Walton et al. 2004). Zum jetzigen Zeitpunkt werden Immunogoldmarkierungen anhand des α-PeptidA2- sowie des α-Ss-18/GST-Serums und anschließender Elektronenmikroskopie mit den separierten Milben unternommen. Eier sowie Sekrete aus den Geschlechtsorganen der Milben gelten als antigenwirksame Bestandteile bei einer Sarcoptes-Infektion (Matthes et al. 1992, Arlian et al. 2000). Es handelt sich hierbei um Komponenten, die in jedem Fall, nicht erst durch das Absterben des Parasiten, in Kontakt mit dem Wirt treten. Sollte es sich [Seite 164↓]bei den Antigenen tatsächlich um Proteine aus dem Geschlechtssystem der männlichen Milben handeln, könnte dieses auf Grund der permanenten Konfrontation des Wirts-Immunsystems ein weiterer Hinweis darauf sein, dass es sich hierbei im Proteine handelt, die der Immunevasion der Milben dienen. Antigene, die dem Wirt nicht ständig präsentiert werden, können in der Immunevasion keine bedeutende Rolle einnehmen.

Abschließend ist zu bemerken, dass die „KE-reichen Antigene“ sowohl in der Milbenvarietät des Schweines (Immunoscreening) als auch in der des Rindes (Immunlokalisation) nachgewiesen werden konnten. Durch die Isolierung der Klone mittels der Humanseren wurden auch im Menschen Antikörper gegen diese Antigene ermittelt, was darauf hinweist, dass die „KE-reichen Antigene“ ihrem Wirt auch von S. scabiei var. hominis präsentiert werden. Auf Grund des weiten Spektrums könnten sich diese Antigene, sofern sich auch in den anderen Wirten Antikörper nachweisen lassen, als Diagnostikkandidat sowohl für Skabies-Infektionen beim Menschen als auch für Räude-Infektionen bei diversen Tieren eignen.


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06.06.2005