Charakterisierung rekombinanter immunreaktiver Antigene der Krätzmilbe Sarcoptes scabiei

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Dipl.-Biol. Carola Kuhn
geb. von Witzendorff, geb. 30.04.1972 in Hannover

Präsident der Humboldt-Universität
Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. T. Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. R. Lucius
2. Prof. T. Schnieder
3. Prof. W. Presber

Tag der mündlichen Prüfung: 15.04.2005

Diese Arbeit wurde im Rahmen eines von der Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen „Otto von Guericke“ (AiF) geförderten Projektes (Förderungskennzeichen KF 0185602KUL1) durchgeführt.

Zusammenfassung

Die parasitische Milbe Sarcoptes scabiei, die im Stratum corneum ihres Wirtes lebt, ist weit verbreitet. Eine zuverlässige Diagnose mittels herkömmlicher Techniken ist unzulänglich. Serologische Tests unter Verwendung von Gesamtantigen sind aufwändig und teuer in der Herstellung, und Kreuzreaktionen mit freilebenden Milben können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Von dem Einsatz spezifischer rekombinanter Antigene ist eine Verbesserung der Serodiagnostik zu erwarten.

In dieser Arbeit wurde eine cDNA-Bank aller Entwicklungsstadien von S. scabiei var. suis erstellt. Unter Verwendung eines humanen Skabies-positiven Sammelserums wurden 61 rekombinante immunreaktive Klone von S. scabiei isoliert, und das Protein von sieben dieser Klone als Diagnostikkandidaten wurde aufgereinigt. Die identifizierten Sequenzen zeichnen sich z. T. durch das Vorhandensein repetitiver Bereiche aus. Die rekombinanten Proteine wurden im ELISA unter Verwendung von Human- und Schweineseren auf ihre Sensitivität geprüft. Die Antigene zeigten signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen mit den humanen Positiv- bzw. Negativseren, während dies bezüglich der Reaktion mit den porzinen Seren, nur für vier der Antigene der Fall war. Unspezifische Reaktionen mit E. coli-Protein sowie GST bei einem als Fusionsprotein exprimierten Antigen erwiesen sich als störend.

42.6% der isolierten Klone enthalten eine repetitive zentrale Region, deren offener Leserahmen hauptsächlich für die Aminosäuren Glutamat und Lysin kodiert. Obwohl sie große Homologien aufweisen, unterscheiden sich die Transkripte sowohl im zentralen Bereich als auch am 3´-Ende voneinander. Mittels der Southern Blot-Analyse konnte in Sarcoptes nur eine Genkopie detektiert werden, während dieses Gen in Dermatophagoides-Milben nicht nachgewiesen werden konnte. Auf Grund der Spezifität des Antigens für die parasitischen Milben könnte dieses Antigen für die Serodiagnostik besonders geeignet sein. Anhand von immunhistochemischen Untersuchungen wurden entsprechende Proteine in einer Organstruktur, bei der es sich vermutlich um die Hoden der Milben handelt, detektiert.

In dieser Arbeit wurden rekombinante Antigene für die Serodiagnostik der Sarcoptes-Infektion bereitgestellt. Es wurde gezeigt, dass das Expressionssystem E. coli als Produktionssystem rekombinanter Antigene für die Serodiagnostik von Sarcoptes-Infektionen möglicherweise ungeeignet ist.

Eigene Schlagworte: Sarcoptes scabini, rekombinante Antigene, ELISA, Diagnose

Summary

The parasitic mite Sarcoptes scabiei, which lives in the Stratum corneum of the host, is prevalent worldwide. Reliable diagnosis using conventional methods is unsatisfying. Serological tests using the total antigen are labour intensive and expensive to produce, and moreover there exist unspecific crossreactions against house dust mites, which lead to false positive results. We expect an improvement of serological diagnosis using specific recombinant antigens of the Sarcoptes-mites.

In this work, we constructed a cDNA-library of all stages from S. scabiei var. suis. Using scabies-positive pooled human sera, we isolated 61 recombinant immunoreactive clones and purified the protein of seven clones as potential candidates for diagnosis. The identified sequences are partially characterized by the presence of repetitive domains. The recombinant proteins were tested for their sensitivity in the ELISA, using positive and negative human- and porcine sera. There exist significant differences between the reactions of the positive and negative sera for all the seven antigens using human sera. In contrast, with the porcine sera, significant difference could be detected only in four antigens. Reactions against of E. coli-protein and the GST in the fusionprotein caused problems of unspecific background.

42.6% of the isolated clones contain a repetitive central region, and the ORF mainly encodes the aminoacids glutamate and lysine. Altough there exist high homologies, the sequences of the transcripts differ in the central region and at the 3´-end. By southern blot analysis we could show one copy of the gene, while it was not detected in the genome of the free-living Dermatophagoides-mites. As for the specificity for the parasitic mites, the antigens might be good candidates for immunodiagnosis. In immunohistochemical studies the proteins were detected in a paired structure in the posterior part of the mites opisthosoma, which might be the testis.

In this study, recombinant antigens of S. scabiei were produced and tested for the use in immunodiagnosis. It was shown, that the E. coli-expression system might be unsuitable for the production of recombinant antigens for their use in immunodiagnosis of Sarcoptes-infections.

Eigene Schlagworte: Sarcoptes scabiei, recombinant antigens, ELISA, Einleitung

Inhaltsverzeichnis

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06.06.2005