Ergebnisse

Reaktion der humanen Patientenseren mit SsGesamtantigen im ELISA

Die IgG- und IgM-Titer der Skabies-positiven Humanseren waren, bevor sie für diese Arbeit bereitgestellt wurden, von der Afosa GmbH ermittelt worden. Trotzdem wurden die Seren, wie auch die Negativseren, erneut im ELISA mit Gesamtantigen von S. scabiei var. suis getestet. Diese ELISAs wurden unter den Bedingungen wie auch alle folgenden ELISAs unter Verwendung der rekombinanten Antigene durchgeführt, so dass ein direkter Vergleich möglich war. Die Ergebnisse dieser ELISAs korrelieren nicht mit den von der Afosa GmbH ermittelten Titern (p > 0.05) (s. Punkt 2.1.8). Vermutlich ist dies auf die unterschiedlichen Bedingungen in der Versuchsdurchführung zurückzuführen. Des Weiteren wurden die Ergebnisse nicht um einen Kontrollwert korrigiert, wie es bei der Afosa GmbH der Fall war. Aus Abb. 2 ist deutlich ersichtlich, dass die Negativseren einen hohen Hintergrund aufwiesen, während einige Positiv-Seren keine eindeutig positive Reaktion zeigen. Der Mittelwert der Positivseren beträgt OD_450/6300.464 (± 0.133), während sich der der Negativseren auf OD_450/6300.311 (± 0.151) beläuft. Es bestanden signifikante Differenzen zwischen den Ergebnissen der Positiv- und denen der Negativseren (p = 0.002). Eine verlässliche Serodiagnostik mit Gesamtantigen ist allerdings auf Grund der hohen Werte der meisten Negativseren unter diesen Umständen nicht möglich.

Abb. 2: ELISA mit Gesamtantigen von S. scabiei var. suis unter Verwendung von Skabies-positiven und -negativen Patientenseren. Bei den Seren KT4 bis L46 handelt es sich um Seren von erkrankten Patienten, während die Seren S1 bis S20 von gesunden Kontrollpersonen stammen.

Reaktion der Schweineseren mit SsGesamtantigen im ELISA

Die IgG-Titer der Schweineseren, die auf ihre Reaktion mit den rekombinanten Antigenen getestet werden sollten, wurden vorab im Sarcoptes-ELISA 2001^®ermittelt. Die Tiere, von denen die Seren stammten, waren vorher als eindeutig Räude-positiv identifiziert worden. Das bedeutet, dass hier keine Seren von fraglich Räude-positiven Tieren eingesetzt wurden, bei denen eine Diagnose mit SsGesamtantigen bekanntlich schwierig sein kann. Die Grenzwerte liegen in diesem Test bei < 16 für eine Räude-negative Diagnose, 16-24 für eine fragliche und > 24 für eine Räude-positive Diagnose. Die Titer wurden in Form von Indizes, wie vom Hersteller vorgegeben, angegeben (s. Abb. 3). Die in Abb. 3 dargestellten Seren wurden, auf Grund der eindeutigen Diagnose eines Räudemilben-Befalls bzw. der Räudefreiheit, in den nachfolgenden ELISAs mit rekombinantem Antigen verwendet.

Abb. 3: Index der im ELISA mit rekombinanten Antigenen verwendeten Schweineseren. Die Seren WB1 bis WB23 stammen von Räude positiven-Schweinen, während die Seren 000613/2 bis einschließlich 000425/14 Seren von Räude-negativen Schweinen sind.

Reaktion der humanen Patientenseren mit SsGesamtantigen im Western Blot

Im Vorfeld wurde ein Western Blot unter Verwendung von Gesamtantigen der Sarcoptes-Milben und der Skabies-positiven und -negativen Seren sowie derer von Hausstaubmilbenallergikern durchgeführt. Dieser Versuch diente der Detektion von Sarcoptes-spezifischen Banden, um eine Vorstellung von der Größe der gesuchten Proteine zu erhalten. Es konnten allerdings keine prominenten Banden ermittelt werden, die von den meisten Seren Skabies-positiver Patienten, nicht aber von den negativen, erkannt wurden.

Antikörperantwort der Patienten gegen deglykosiliertes SsGesamtantigen

Vor der Konstruktion einer Expressions-Genbank sollte ermittelt werden, ob sich ein prokaryotisches System, in dem posttranslationale Modifikationen unterbleiben, für die Expression immunreaktiver Antigene von S. scabiei eignete. Zu diesem Zweck wurde das Gesamtantigen deglykosiliert, und unter Verwendung dieses behandelten Antigens wurden die IgG-Reaktionen Skabies-positiver Patientenseren im ELISA gestestet. Auf diese Weise konnte ermittelt werden, ob die Antikörperantwort der Patienten gegen Zuckergruppen der Proteine gerichtet ist. Hier kamen die Humanseren L26, L12 und L48 zum Einsatz, die im ELISA mit Gesamtantigen eine hohe Reaktion gezeigt hatten. Der ELISA mit dem deglykosilierten Gesamtantigen ergab, dass die Antikörperantwort der Skabies-Patienten überwiegend gegen die Polypeptidkette des Milbenproteins gerichtet und unabhängig von der Glykosilierung der Proteine ist (s. Abb. 4). Der 24-4 Antikörper wurde hier als Positivkontrolle eingesetzt da er nur mit der glykosilierten Chitinase dritter Larven (L3) von A. viteae reagiert. Unter Verwendung dieses Antikörpers war keine Reaktion mit dem deglykosilierten Gesamtantigen der L3 von A. viteae detektierbar.

Abb. 4: ELISA mit deglykosiliertem und glykosiliertem Gesamtantigen von S. scabiei var. suis . Nach Deglykosilierung des Antigens wurde ein ELISA unter Verwendung von Skabies-positivem und –negativem Serum durchgeführt. Als Positivkontrolle diente der 24-4 Antikörper, der nur mit der glykosilierten Chitinase der dritten Larven (L3) von A. vitae, nicht aber mit der deglykosilierten reagiert.

Isolierung der Gesamt-RNA aus Sarcoptes scabiei
Aus etwa 20 mg kryozertrümmerten Milben konnten in einem ersten Extraktionsschritt (in 30 μl RNAse freiem dest. H₂0) bis zu 46 μg Gesamt-RNA isoliert werden. Die Darstellung der 18 S und der 28 S RNA im Bioanalyzer ergab, dass die RNA keiner sichtbaren Degradierung unterlegen war (s. Abb. 5). Auch die Analyse auf dem Formaldehyd-Agarosegel zeigt nur eine geringe Degradierung der RNA, die wahrscheinlich auf den Lauf der RNA im Gel zurückzuführen ist.

Die in Abb. 5 dargestellte Gesamt-RNA wurde für die Erstellung der cDNA-Phagen-Bank eingesetzt.

Abb. 5: Darstellung der Gesamt-RNA von S. scabiei im Bioanalyzer (links) und im Ethidiumbromid gefärbten Formaldehyd-Agarosegel (rechts). Die links dargestellte RNA setzt sich aus den im Gel (rechts) aufgetrennten Isolaten (Spur 1-5) zusammen.

cDNA-Phagen-Bank in λTriplEx2
Die cDNA-Bankvon S. scabiei var. suis wurde in dem Phagen λTriplEx2 von der Firma CLONTECH (Heidelberg) synthetisiert. Der Titer der nicht amplifizierten Bank betrug 4.0 x 10⁶ pfu/ml, während sich der der von der Firma amplifizierten Bank auf > 10⁹ pfu/ml belief. 85% der Klone in der cDNA-Bank waren rekombinant und diese enthielt 2.4 x 10⁶ unabhängige Klone. Die durchschnittliche Größe der Insertionen belief sich auf 1.3 kb, wobei sich diese Größen in der Ordnung zwischen 0.5 und 3.0 kb bewegten.

Immunoscreening
Für die Charakterisierung immunreaktiver Antigene von S. scabiei wurden 3.5 x 10 ⁵ rekombinante Phagen auf ihre Reaktion mit dem Serum von zehn Skabies-positiven Patienten überprüft. 61 Phagenklone, die mit dem Serum reagierten, wurden in mehreren Klonierungsschritten isoliert und aus dem Phagen exzisiert.
Insertionsgrößen der isolierten immunreaktiven Klone
Nach der in vivo-Exzision der Plasmide wurden die Größen der Insertionen mittels einer PCR mit plasmidspezifischen Primern ermittelt. Gleichzeitig diente diese PCR der Überprüfung der Klonalität des isolierten Phagen. Die Größe der Insertionen der Klone betrug zwischen ca. 560 und 2460 bp (s. Abb. 6).

Abb. 6: Beispielhafte Darstellung der Insertionsgrößen von isolierten immunreaktiven Klonen. Die Insertionen wurden mittels einer PCR mit phagenpezifischen Primern amplifiziert. Eine einzelne Bande wurde als Indiz für die Klonalität des jeweiligen isolierten Phagenklons gewertet.

Auswahl von Sarcoptes-spezifischen Klonen
Nach der Isolierung der 61 immunreaktiven Klone sollten diese auf ihre Spezifität getestet werden. Zunächst war geplant, diese Spezifität durch ein relativ einfaches und zeitsparendes Verfahren, bei dem alle Klone parallel untersucht werden können, zu ermitteln. Zu diesem Zweck wurden die Lysate der induzierten rekombinanten Phagen direkt auf eine Nitrozellulosemembran pipettiert. Anschließend wurden die Antigene im Western Blot auf ihre spezifische Reaktivität mit dem Serum Skabies-positiver Patienten im Vergleich zu dem von drei negativen Kontrollpersonen sowie dem von sieben Hausstaubmilbenallergikern getestet. Die unspezifische Hintergrundsreaktion mit E. coli-Protein, das in dem Phagenlysat vorhanden war, war trotz der Präabsorption der Seren mit E. coli-Lysat so dominant, dass keine spezifische Reaktivität des positiven Serums ermittelt werden konnte. Das gleiche Ergebnis erbrachte der Versuchsansatz, die Lysate der Phagenklone auf einen E. coli-Rasen aufzutropfen, die Gene mittels einer IPTG-getränkten Nitrozellulosemembran zur Expression zu bringen, und die Reaktivität der Seren mit den auf die Membran transferierten Proteinen im Western Blot zu testen.

Aus diesem Grund wurden die Plasmide aus den Phagen exzisiert und für eine Expression der Gene aus E. coli BM25.8 in E. coli XL1Blue transformiert. Nach einer Induktion aller Klone mit 1 mM IPTG wurde das im SDS-Gel aufgetrennte Protein im Western Blot auf eine spezifische Reaktion mit den jeweiligen Seren getestet. Auf Grund der Bandenauftrennung konnte eine Reaktion des Serums spezifischen Banden, die nach Induktion zusätzlich auftraten wurden, zugeordnet werden. Hier wurden nur die Seren Skabies-positiver und -negativer Patienten verwendet, da zunächst lediglich eine grobe Auswahl der Klone getroffen werden sollte (s. Abb. 7).

Anhand dieses Versuchsansatzes wurden sieben Klone identifiziert, die im Western Blot ausschließlich eine Reaktion mit dem Serum der Skabies-Patienten zeigten. Die anschließende Sequenzierung zeigte, dass es sich hierbei, abgesehen von einem Klon (Ss-37), ausschließlich um homologe Klone handelte, die sich durch eine hochrepetitive zentrale Region auszeichneten. Dieser Bereich setzt sich hauptsächlich aus den Nukleotiden Adenin (A) und Guanin (G) (GA-repetitiv genannt) zusammen, deren offener Leserahmen (ORF) überwiegend für die Aminosäuren Glutamat (E) und Lysin (K) kodiert. Die Proteine dieser Klone werden im Folgenden „KE-reiche Antigene“ genannt.

Abb. 7: Darstellung von sechs der sieben im Western Blot identifizierten Sarcoptes -spezifischen immunreaktiven Klone. Die spezifischen Banden, die eine Reaktivität mit dem Serum aufwiesen, sind markiert (A: Skabies-positives Sammelserum). Eine Reaktion mit dem Sammelserum gesunder Personen (B) ist im Western Blot (rechts) nicht detektierbar. Für alle hier markierten Klone ergab die Sequenzierung eine homologe Sequenz, die sich durch eine hochrepetitive Zentralregion auszeichnet. Ein weiterer Klon (Ss-37), der im Western Blot nur mit dem positiven Serum reagierte, ist hier nicht dargestellt.

Auf Grund der hohen Frequenz dieser für „KE-reiche Antigene“-kodierenden Sequenzen, wurde eine DNA-Hybridisierung (s. Punkt 3.9.2.4.1) mit allen bis zu diesem Zeitpunkt unbekannten Klonen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde eine Sonde aus konservierten Bereichen der hier identifizierten Sequenzen verwendet. Es wurden 20 weitere Klone identifiziert, die ebenfalls Sequenzen enthielten, die für „KE-reiche Antigene“ kodieren.

Unter den oben beschriebenen Versuchsbedingungen wurden nicht alle Gene exprimiert, und so wurden anschließend zehn weitere Klone, für die die DNA-Hybridisierung keine Sequenz ergeben hatte, die für „KE-reiche Antigene“ kodiert, ausgewählt. Diese Klone hatten im Immunoscreening eine deutliche, positive Reaktion gezeigt. Die Klone wurden sequenziert, in Expressionsvektoren kloniert und erst nach Aufreinigung der Proteine auf ihre Skabies-Spezifität getestet. Die durch Sequenzierung oder DNA-Hybridisierung identifizierten Klone sind in Tab. 3 dargestellt.

Sequenz

Anzahl der Klone

%

durch BLASTX-Analyse ermittelte Homologien

E-Wert

Treffer in der EST-Datenbank

von S. scabiei

1

1

1.6

Dehydrogenase/Reduktase (A. aegypti)

6e^-37

0

2

1

1.6

Titin (D. melanogaster)

5e^-14

1

3

2

3.2

keine Homologie

-

1

4

2

3.2

Tyrosin-spez. Protein einer Phosphatase-

Familie (C. elegans)

e^-19

0

5

1

1.6

SMIPP-S (S. scabiei)

8e^-92

0

6

3

4.9

ovarielle, Fibroin-ähnliche Substanz-2 (C. carpio)

2e^-64

17

7

1

1.6

keine Homologie

-

0

8

1

1.6

ovarielle, Fibroin-ähnliche Substanz-4 (C. carpio)

1e^-45

4

9

1

1.6

Kettin (D. melanogaster)

2e^-09

0

10

1

1.6

keine Homologie

-

0

11

26

42.6

hypothetisches Protein (P. falciparum)

2e^-47

0

Summe:

40

Tab. 3: Darstellung der Homologien der bekannten, im Immunoscreening identifizierten Klone. Von den hier gezeigten Klonen wurden die Sequenzen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 8 sowie einer der unter Sequenz 11 zusammengefassten Klone erfolgreich exprimiert und das rekombinante Protein aufgereinigt.

Der Abgleich der Sequenzen mit den Daten aus der öffentlichen Datenbank (Genbank) ergab, dass keine kontaminierenden Sequenzen vom Schwein isoliert worden waren.

Charakterisierung, Expression und Aufreinigung der immunreaktiven Antigene
Die Sequenzen aller sequenzierten Klone wurden durch eine BLAST-Analyse mit bekannten, öffentlich zugänglichen Nukleotid- und Proteinsequenzen verglichen (Genbank). Unter Verwendung der BLASTN-Analyse wurden Homologien zwischen den Nukleotidsequenzen ermittelt, während Proteinsequenzen durch den Gebrauch der BLASTP-Analyse untereinander abgeglichen wurden. In der BLASTX-Analyse hingegen wurden sowohl die hier ermittelten Nukleotidsequenzen als auch die in der öffentlichen Datenbank in allen drei Leserahmen übersetzt und zwischen diesen Aminosäuresequenzen Homologien ermittelt. Diverse Antigene wurden identifiziert, die repetitive Domänen enthalten. Nach diesem Kriterium sind die Antigene in der folgenden Charakterisierung gruppiert. Alle Positionsangaben beziehen sich, sofern nicht anders angegeben, auf die vollständigen Sequenzen in dem Plasmid pTriplEx2.

Die Expression der rekombinanten Antigene wurde mittels des Western Blots mit anti-His- bzw. anti-GST-Antikörpern (Daten nicht gezeigt) nachgewiesen.
Antigene ohne repetitive Domänen Klon Ss-4
Die BLASTX-Analyse ergab für den Klon Ss-4 Homologien (E-Wert6e^-37) zu einer Dehydrogenase/Reduktase von Aedes aegypti (Acc. No.: AY064123.1). An Position 105 befindet sich das Start- und an Stelle 915 ein Stop-Codon. Die Strukturanalyse zeigte kaum potenzielle Epitope. Eine Anhäufung von Aminosäuren, deren Struktur auf eine Immunogenität hinweisen könnte, tritt nicht auf (s. Abb. 9).

Das Fragment vom Start bis hin zum Stop-Codon ist 814 bp lang und der offene Leserahmen (ORF) kodiert für ein Protein von 271 Aminosäuren. Das errechnete Molekulargewicht des Proteins liegt bei 29.3 kDa und der pI-Wert beträgt 6.51. Im SDS-Gel zeigte das Protein mit Histidin-Anhang im Vergleich zu dem Standard ein Molekulargewicht von etwa 30 kDa (s. Abb. 8).

Die Sequenz des Klons Ss-4 wurde in das Expressionsplasmid pQE-30 (QIAGEN) kloniert, und das Gen konnte durch die Zugabe von 0.1 mM IPTG exprimiert werden. Das rekombinante Protein wurde durch die Lyse der Bakterien in 6 M Harnstoff (s. Punkt 2.2.2.23.2.1) aus diesen gelöst. Die Aufreinigung des Proteins erfolgte über die Bindung des Histidin-Anhangs an die Ni-NTA-Matrix. Die Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 hatte die Elution des Proteins zur Folge (s. Abb. 8).

Abb. 8: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-4 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein konnte durch Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 von der Matrix eluiert werden.

Abb. 9: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-4. Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilie, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.
Klon Ss-7
Der Datenbankabgleich des Klons Ss-7 ergab in der BLASTX-Analyse unter Berücksichtigung geringer Komplexizität der Sequenz Homologien zu dem Titin von Drosophila melanogaster (Acc. No.: DAA00021; E-Wert 5e^-14). In der BLASTN-Analyse anhand der EST-Datenbank konnten Homologien zu einem Klon von S. scabiei (Acc. No.: BM522179.1; E-Wert e^-166) ermittelt werden. Der hier vorliegende Klon umfasst allerdings 328 bp mehr am 5´-Ende der Sequenz. Nach der Strukturanalyse beinhaltet das rekombinante Protein eine Reihe potenzieller Epitope. In diesen Bereichen treffen auch die Kriterien der erhöhten Proteinflexibilität, Hydrophilie und damit der Exponiertheit an der Oberfläche sowie die geringe Wahrscheinlichkeit einer ß-Faltblattstruktur zu (s. Abb. 10). Die polaren und damit epitopbestimmenden Aminosäuren Glutamat (19.69%) und Lysin (20.08%) sind verhältnismäßig häufig vertreten. Die Sequenz beinhaltet weder ein Start- noch ein Stop-Codon, so dass das Fragment am 5´-Ende ab Position 29 und am 3´-Ende stromaufwärts des vermeintlichen Poly-A-Anhangs kloniert wurde (s. Punkt 7.4.2). Das klonierte Fragment ist 724 bp lang und der offene Leserahmen kodiert für ein Protein von 241 Aminosäuren. Das errechnete Proteingewicht beträgt 27.3 kDa und der pI-Wert liegt bei 4.42. Inklusive des Histidin-Anhangs zeigte das Protein im SDS-Gel im Vergleich zu dem Standard ein Molekulargewicht von 62 kDa (s. Abb. 11), was darauf hinweist, dass das Protein hier als Dimer vorliegt.

Die Sequenz des Klons Ss-7 wurde in das Expressionsplasmid pQE-32 (QIAGEN) kloniert, und eine Genexpression wurde durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Das rekombinante Protein konnte unter nativen Bedingungen (s. Punkt 2.2.2.23.2.1) aus den Zellen extrahiert werden. Die Aufreinigung erfolgte durch Bindung des Proteins über den Histidin-Anhang an die Ni-NTA-Matrix und die anschließende Absenkung des pH-Wertes im Elutionspuffer von pH 5.9 auf pH 4.1 (s. Abb. 11).

Abb. 10: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-7 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilie, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.

Abb. 11: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-7 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein konnte durch die Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.1 von der Matrix eluiert werden.
Klon Ss-17
Der Klon Ss-17 zeigte in dem Abgleich mit der Expressed-Sequence-Tag (EST)-Datenbank Homologien (E-Wert: 0) zu dem Klon ESSU0292 (Acc. No.: BG817870) von S. scabiei. Der in dieser Arbeit identifizierte Klon umfasst allerdings 271 bp mehr am 5´-Bereich der Sequenz und beinhaltet ebenfalls den nicht translatierten Bereich (UTR) am 3´-Ende bis hin zum Poly-A-Anhang. An Position 63 folgt auf zwei Stop-Codons ein Start-Codon und an Position 744 das Stop-Codon. Es konnten keine signifikanten Homologien zu hypothetischen oder bereits charakterisierten Proteinen in der BLASTN-Analyse ermittelt werden. Eine BLASTP-Analyse ergab für dieses Protein Übereinstimmungen mit einer Protein Kinase C-konservierten Region verschiedener hypothetischer oder unbekannter Proteine (E-Wert 0.004). Die Strukturanalyse zeigte für dieses Protein wenige Epitope mit potenziell erhöhtem Antigenitätsindex (s. Abb. 12). Anhäufungen von bestimmten Aminosäuren, die zu dessen Erhöhung beitragen, liegen nicht vor. Für das vorliegende Protein wurde eine Signalsequenz vorhergesagt (SignalP V2.0 World Wide Web Server). Auf Grund der Tatsache, dass Signalsequenzen bei der rekombinanten Expression stören können, wurde das Gen stromabwärts der vorhergesagten Spaltungsstelle, die zwischen den ab dem Start-Codon gezählten Aminosäuren 18 (A) und 19 (Y) liegt, kloniert (s. Punkt 7.4.4). Das klonierte Fragment hat eine Größe von 628 bp und der ORF kodiert für ein Protein von 209 Aminosäuren. Das errechnete Proteingewicht liegt bei 23.3 kDa und der pI-Wert beträgt 9.36. Im SDS-Gel zeigte das Protein mit Histidin-Anhang im Vergleich zum Standard ein Molekulargewicht von etwa 27 kDa (s. Abb. 13). In dem hier durchgeführten Immunoscreening wurde ein weiterer Klon (Ss-130b) identifiziert, der ebenfalls Homologien (E-Wert: 9e^-73) zu dem Klon ESSU0292 von S. scabiei zeigte. Allerdings ist dieser Klon im Vergleich zu dem Klon Ss-17 am 5´-Ende der Sequenz um 286 bp verkürzt.

Die Nukleotidsequenz des Klons Ss-17 wurde für die Genexpression in das Plasmid pQE-30 (QIAGEN) kloniert. Die Genexpression konnte durch die Zugabe von 0.5 mM IPTG induziert werden. Das rekombinante Protein wurde nur durch eine Lyse mit 6 M Guanidinium aus den Bakterien gelöst (s. Punkt 2.2.2.23.2.1). Die Elution des an die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN) gebundenen Proteins erfolgte ebenfalls durch die Absenkung des pH-Wertes im Elutionspuffer von pH 5.9 auf pH 4.5 (s. Abb. 13).

Abb. 12: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-17 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilität, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.

Abb. 13: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-17 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein konnte durch Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 von der Matrix eluiert werden.
Klon Ss-37 Sequenzcharakterisierung und Aufreinigung des Proteins
Der Datenbank-Abgleich des Klons Ss-37 ergab in der BLASTX-Analyse Homologien zu einem der SMIPP-S (Scabies Mite Inactivated Protease Paralogues) von S. scabiei var. hominis (Acc. No.: AAR14083.1; E-Wert 8e^-82). Eine weitere bedeutende Homologie besteht zu dem Allergen Derf III von D. farinae, einer Serin-Protease (E-Wert 2e^-15). Das Protein SMIPP-S von S. scabiei, wie auch andere dieser Multigenfamilie werden als katalytisch inaktiv eingestuft, da sie keine intakte katalytische Triade enthalten (Holt et al. 2003). Das von den Autoren beschriebene Protein beinhaltet eine Signalsequenz, die allerdings in dem in dieser Arbeit isolierten Klon fehlt. Ein potenzielles Start-Codon ist zwar an Position 3 vorhanden, aber der Datenbank-Abgleich zeigt, dass in dem vollständigen Gen ein weiteres Start-Codon, das in dieser Sequenz nicht vorhanden ist, weiter stromaufwärts existiert. Das Stop-Codon befindet sich in der Sequenz an Position 606. Wie allen SMIPPs fehlt auch dem identifizierten Klon Ss-37 das aktive Serin im katalytischen Zentrum, das hier durch ein Glutamat ersetzt ist. Die katalytische Triade (H, D und S) in dem Klon Ss-37 ist nicht intakt. Vier der sechs konservierten Cysteine fehlen in dem Klon Ss-37, darunter auch die beiden das aktive Serin flankierenden (s. Abb. 14).

Abb. 14: Alignment der Aminosäuresequenzen einer vermeintlich aktiven (Sar s 3) und einem inaktiven Serin-Protease Paralog (SMIPP) von S. scabiei sowie der des Klons Ss-37. Die grünen Boxen markieren die Positionen, an denen konservierte Cysteine und die Aminosäuren, die entscheidend für die katalytische Aktivität und Spezifität des aktiven Proteins sind, in den inaktiven Proteinen durch andere Aminosäuren ersetzt sind. Die roten Boxen hingegen markieren die auch in den inaktiven Proteinen konservierten Cysteine.

In dem rekombinanten Protein sind wenige Epitope mit erhöhtem Antigenindex vorhanden. Das Antigen zeichnet sich auch nicht durch die Anhäufung spezieller Aminosäuren mit erhöhtem immunogenen Potenzial aus (s. Abb. 15).

Das ab Position 19 klonierte Fragment ist 591 bp lang, während das Protein aus 197 Aminosäuren besteht. Das errechnete Proteingewicht beträgt 21.4 kDa und der pI-Wert beläuft sich auf 5.18. Das rekombinante Protein mit Histidin-Anhang zeigte im SDS-Gel im Vergleich zum Standard ein Molekulargewicht von etwa 30 kDa (s. Abb. 16).

Die Nukleotidsequenz des Klons Ss-37 wurde für eine Expression des Genfragmentes in das Plasmid pQE-32 (QIAGEN) kloniert. Eine Genexpression konnte durch die Zugabe von 0.1 mM IPTG induziert werden. Auch dieses rekombinante Protein wurde nur durch eine Lyse der Bakterienzellen in 6 M Guanidinium in den Überstand entlassen (s. Punkt 2.2.2.23.2.1). Nach Bindung an die Ni-NTA-Matrix erfolgte die Elution des Proteins durch die Absenkung des pH-Wertes im Elutionspufffer von pH 5.9 auf pH 4.5 (s. Abb. 16).

Antigenität

Abb. 15: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-37. Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilie, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.

Abb. 16: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-37 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein wurde durch Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 von der Matrix eluiert.

Zusammenfassend ist zu sagen, dass nur für eines der Proteine, die keine repetitiven Domänen enthalten, ein erhöhter Antigenindex vorausgesagt wird.
Antigene mit repetitiven Domänen Klon Ss-23
Der Klon Ss-23 zeigte im Datenbank-Abgleich (BLASTX unter Berücksichtigung geringer Komplexizität) eine Homologie zu der vorausgesagten Aminosäuresequenz eines Tyrosin-spezifischen Proteins einer Phosphatase-Familie (E-Wert 1e^-19, Acc. No.: NP_497450). Die vorliegende Sequenz beinhaltet in diesem Leserahmen stromabwärts mehrerer Stop-Codons an Stelle 172 ein Methionin. Dieses wurde hier als Start-Codon interpretiert, obwohl die Sequenz stromaufwärts der erwähnten Stop-Codons bereits zwei Start-Codons beinhaltet. Auch für dieses Protein wurde eine Signalsequenz (SignalP V2.0 World Wide Web Server) mit einer Spaltungsstelle zwischen den Aminosäuren 21 (A) und 22 (K), gezählt ab dem vermeintlichen Start-Codon, vorhergesagt, so dass das Gen stromabwärts dieser Spaltungsstelle kloniert wurde (s. Punkt 7.4.6). Stromaufwärts des Poly-A-Anhangs existiert kein Stop-Codon, so dass die Sequenz des Rückwärtsprimers für die Klonierung von der Sequenz direkt vor dem Poly-A-Anhang abgeleitet wurde. Das Protein inklusive der Signalsequenz beinhaltet einen hohen Anteil sowohl basischer Aminosäuren (29.47% Lysin (K) und 12.56% Histidin (H)), als auch der unpolaren Aminosäure Prolin (P) (17.87%). Das Protein weist einige repetitive Domänen auf (s. Abb. 17).

Abb. 17: Repetitive Domänen in dem Protein des Klons Ss-23.Die Domänen sind farblich (rot und blau) gekennzeichnet.

Die Strukturanalyse sagt für dieses rekombinante Protein diverse Epitope mit erhöhtem Antigenitätsindex voraus. Umkehrungen in der Polypeptidkette, bedingt durch den hohen Anteil des Prolins, sind auffällig. Der Vorhersagewert für die Hydrophilie und damit einer hohen Oberflächenwahrscheinlichkeit sowie der der Flexibilität dieser Bereiche tragen zu dem Antigenitätsindex bei (s. Abb. 18).

Abb. 18: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-23 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilität, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.

Das klonierte Fragment hat eine Größe von 624 bp und der ORF umfasst ein Protein von 208 Aminosäuren. Im späteren Verlauf dieser Arbeit wurde ein weiterer Klon identifiziert, dessen Sequenz mit der des vorliegenden Klons Ss-23 übereinstimmt, allerdings geringfügige Abweichungen, u. a. ein Stop-Codon vor dem Poly-A-Anhang, am 5´-Ende aufweist. Das errechnete Proteingewicht des Klons Ss-23 liegt bei 20 kDa und der pI-Wert beträgt 12.96. Im SDS-Gel zeigte das Protein mit Histidin-Anhang im Vergleich zu dem Standard ein Molekulargewicht von etwa 19 kDa (s. Abb. 19). Die Nukleotidsequenz des Klons Ss-23 wurde für eine Expression des Gens in das Plasmid pQE-30 (QIAGEN) kloniert. Eine Genexpression konnte nach der Zugabe von 1 mM IPTG beobachtet werden. Das rekombinante Protein wurde nur durch eine Lyse der Bakterien in 6 M Guanidinium in den Überstand entlassen (s. Punkt 2.2.2.23.2.1). Nach der Bindung an die Ni-NTA-Matrix wurde das Protein durch die Absenkung des pH-Wertes im Elutionspuffer von pH 5.9 auf pH 4.5 eluiert (s. Abb. 19).

Abb. 19: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-23 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein wurde durch Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 von der Matrix eluiert.
Klon Ss-97
Der Klon Ss-97 zeigte im Datenbank-Abgleich (BLASTN) Homologien zu diversen cDNA-Sequenzen von S. scabiei var. hominis. Der E-Wert beträgt z. B. 0 in einem Alignment mit dem Klon ESSU0100 (Acc. No.: BG817678). Eine BLASTX-Analyse mit dem Klon Ss-97 ergab eine Homologie zu einer ovariellen, Fibroin ähnlichen Substanz 2 von Cyprinus carpio (E-Wert: 2e^-64; Acc. No.: AAG25717.1). Auf vier Stop-Codons in der Sequenz folgt an Position 112 ein Start-Codon. Ein terminales Stop-Codon fehlt in der vorliegenden Sequenz. Auch für dieses Protein wurde eine Signalsequenz (SignalP V2.0 World Wide Web Server) mit einer Spaltungsstelle zwischen den auf das Start-Methionin folgenden Aminosäuren an Position 22 (Q) und 23 (K) vorhergesagt, auf Grund dessen das Gen stromabwärts dieser Spaltungsstelle kloniert wurde (s. Punkt 7.4.8). Die Sequenz weist einige repetitive Domänen auf (s. Abb. 20).

Abb. 20: Repetitive Domänen im Protein des Klons Ss-97 . Einige repetitive Domänen sind farblich (rot, blau und schwarz) markiert.

Das klonierte Fragment ist 861 bp lang und das Protein setzt sich aus 287 Aminosäuren zusammen. Das errechnete Proteingewicht beläuft sich auf 29.3 kDa und der pI-Wert liegt bei 9.59. Im SDS-Gel zeigte das rekombinante Protein im Vergleich zu dem Standard ein Molekulargewicht von lediglich etwa 19 kDa (s. Abb. 22). Der Anteil der unpolaren Aminosäure Glycin (35.45%) und der polaren Aminosäure Glutamat (15.76%) in dem gesamten Protein inklusive der Signalsequenz ist auffallend hoch. Besonders auffällig sind in diesem Zusammenhang die hohe Wahrscheinlichkeit der Umkehrungen innerhalb der Polypeptidkette, bedingt durch das häufige Auftreten der Aminosäure Glycin, sowie der hohe Flexibilitätsindex. Diese Zusammensetzung trägt zu einem theoretisch erhöhten Antigenitätsindex der Epitope bei (s. Abb. 21).

Abb. 21: Strukturanalyse bezüglich der Immunogenität des Proteins von Klon Ss-97 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilität, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.

Die Nukleotidsequenz des Klons Ss-97 wurde in das Expressionsplasmid pQE-30 (QIAGEN) kloniert. Die Genexpression konnte durch die Zugabe von 1 mM IPTG induziert werden. Auch dieses rekombinante Protein wurde nur nach einer Lyse der Bakterien mit 6 M Guanidinium in den Überstand entlassen (s. Punkt 2.2.2.23.2.1). Das Protein wurde dann durch die Absenkung des pH-Wertes im Elutionspuffer von pH 5.9 auf pH 4.3 von der Matrix eluiert (s. Abb. 22).

Abb. 22: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-97 über die Ni-NTA-Matrix (QIAGEN). Das Protein wurde durch Absenkung des pH-Wertes von pH 5.9 auf pH 4.5 von der Matrix eluiert.

In dem in dieser Arbeit durchgeführten Immunoscreening wurden zwei weitere Klone identifiziert, die Homologien zu dem Klon BG817678 zeigen.
Klon Ss-134
Der Klon Ss-134 zeigt in der BLASTN-Analyse eine Homologie (E-Wert 0.0) zu einem EST-Klon von S. scabiei (Acc. No.: BM276606). Allerdings beinhaltet der hier vorliegende Klon die UTR-Region bis hin zum Poly-A-Anhang sowie 278 bp am 5´-Ende der Sequenz, die in dem Klon aus der Datenbank fehlen. Bei dem hier vorliegenden Klon war kein eindeutiges Start-Codon ermittelbar. In der Sequenz tritt zunächst ein potenzielles Start-Codon auf, auf das allerdings mehrere Stop-Codons folgen. An Position 320 ist dann ein weiteres Start-Codon vorhanden, welches hier auch als solches gewertet wurde, trotzdem es stromabwärts eines potenziellen Start-Codons und mehreren Stop-Codons liegt. Ein Datenbank-Abgleich (BLASTX unter Berücksichtigung geringer Komplexizität) ergab, dass in diesem Leserahmen ebenfalls Homologien zu einer ovariellen, Fibroin ähnlichen Substanz 4 von C. carpio (Acc. No.: AAG25719) mit einem E-Wert von 1e ^-45 besteht. Auf Grund dieser Homologie wurde dieser Leserahmen mit dem erwähnten Start-Codon gewählt. Ein Stop-Codon liegt in diesem Leserahmen an Position 1304. Auch diese Sequenz beinhaltet einige repetitive Domänen (s. Abb. 23).

Abb. 23: Repetitive Domänen in dem Protein des Klons Ss-134 . Die Domänen sind farblich (rot und blau) dargestellt.

Der Anteil an polaren Aminosäuren (32.22% Glycin und 17.33% Glutamin) ist in diesem Protein außerordentlich hoch. Der Bereich, in dem sich die Glycine häufen, ist durch die potenzielle Umkehrung der Polypeptidkette (s. Abb. 24) gekennzeichnet. Diese Umkehrungen und das Vorhandensein der polaren Aminosäuren tragen zu der Erhöhung des Antigenindexes dieses Bereiches bei. Die Wahrscheinlichkeit der Exponiertheit durch einen erniedrigten Hydrophilieindex ist in diesem Bereich gering, während der Flexibilitätsindex erhöht ist.

Das klonierte Fragment umfasst 971 bp und kodiert für ein Protein mit dem Molekulargewicht von 32.8 kDa und der pI-Wert liegt bei 8.45. Dieses Gen konnte nicht exprimiert werden.

Abb. 24: Potenzielle Immunogenität des Proteins von Klon Ss-134 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilität, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.

„KE-reiche Antigene“-kodierende Klone DNA-Hybridisierung
Die Sequenzierung der Klone, die im ersten Schritt des Auswahlverfahrens für „Sarcoptes-spezifische Klone“ (s. Punkt 3.8) identifiziert worden waren, ergab eine hohe Frequenz der Klone, die für „KE-reiche Antigene“ kodieren. Auf Grund dessen wurde eine DNA-Hybridisierung mit allen bislang unbekannten Klonen durchgeführt, so dass weitere, derartige Klone identifiziert werden konnten, ohne dass eine Sequenzierung vorgenommen werden musste.

Die DNA-Hybridisierung (s. Abb. 25) ergab, dass 23 der 34 Klone, die in der amplifizierten Bank gefunden wurden, die Sequenzen enthalten, die sich durch einen zentralen GA-repetitiven Bereich auszeichnen, und deren Proteine hier „KE-reiche Antigene“ genannt werden. Dagegen befinden sich nur drei dieser Klone unter den insgesamt 27 isolierten aus der nicht amplifizierten Bank. Auf Grund dieser Diskrepanz ist anzunehmen, dass diese Klone während der Amplifikation der Bank überproportional vermehrt worden sind. Diese Klone sind insgesamt 26 Mal (42.6%) während des Immunoscreening isoliert worden. Dies lässt auf eine hohe Immunreaktivität der Proteine schließen.

Abb. 25: DNA-Hybridisierung mit den im Immunoscreening isolierten Klonen unter Verwendung der GA-repetitiven Sonde. An Position C4 wurden die Positivkontrolle und an Position D4 die Negativkontrolle aufgetragen. Position E2 zeigt eine positive Reaktion der Sonde mit dem Klon, während alle weiteren hier dargestellten Klone als negativ bewertet wurden.
Sequenzanalyse
Für die Klone, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren, waren keine Homologien zu bereits charakterisierten Proteinen in der BLASTX-Analyse ermittelbar. Es bestehen allerdings Homologien zu einem hypothetischen Protein von Plasmodium falciparum (Acc. No.: NP_700900). Der E-Wert war hier variabel (für Klon Ss-14 beträgt er 2e ^-47 ), abhängig davon, welcher Klon in der Analyse eingesetzt wurde. Die BLASTN-Analyse unter Verwendung der EST-Datenbank ergab Homologien zu einer Sequenz aus der cDNA von teilweise sporulierten Oozysten des Protozoen Toxoplasma gondii (Acc. No.: BM131944). Auch hier war der E-Wert abhängig davon, welcher der Klone, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren, in der BLAST-Analyse eingesetzt wurde. Für den Klon Ss-14 betrug er beispielsweise 2e ^-25 . Bei den Sequenzanalysen wurde die geringe Komplexizität der Klone berücksichtigt.

Es wurden insgesamt 12 Klone sequenziert, die die besagten „KE-reichen Antigene“-kodierenden Sequenzen enthalten. Aus den Sequenzierungen wurde ersichtlich, dass diese Klone trotz hoher Konservierung auch Abweichungen untereinander aufweisen. Allen Klonen ist ein zentraler GA-repetitiver Bereich gemein, deren ORF für die Aminosäuren Glutamat (E) und Lysin (K) kodiert. Die Länge dieses Bereiches variiert zwischen einigen Klonen; z. B. unterscheidet sich der Klon Ss-10 durch einen erheblich längeren, und der Klon Ss-20 durch einen kürzeren repetitiven Bereich von den übrigen Klonen (s. Abb. 27). Auch die Länge der 5´- und 3´-Bereiche variiert zwischen den unterschiedlichen Isolaten (s. Abb. 27).

Die Sequenzierung konnte keinen Aufschluss darüber geben, ob die isolierten Klone vollständige 5´-Enden enthielten, und es sich bei dem in Abb. 27 markierten Start-Codon um den tatsächlichen Translationsstart handelte. Für die Ermittlung der Translations-Startposition wurde zunächst eine PCR mit der cDNA-Bank unter Verwendung phagenspezifischer Vorwärts- und sequenzspezifischen Rückwärtsprimer für die Klone Ss-14 und Ss-18 durchgeführt. Die Sequenzierung der amplifizierten Fragmente ergab keinen weiteren Aufschluss über den 5´-Bereich der Sequenzen, als es durch die bereits isolierten, sequenzierten Klone möglich war.

Mittels der RACE-Analyse wurden unter Verwendung des Rückwärtsprimers GArep5´RACE-R, der in einer konservierten Region der sequenzierten repetitiven Sequenzen band, Fragmente der Größe von etwa 250 bp aus der cDNA amplifiziert. Die Klonierung dieses DNA-Schmiers und die anschließende Sequenzierung von fünf verschiedenen Klonen zeigten, dass sich hinter den in Abb. 26A markierten etwa 250 bp großen Amplifikaten vier verschiedene Amplifikate mit kleinen Größenunterschieden verbargen. Es handelte sich allerdings nur bei einem 253 bp-Fragment um die spezifische Amplifikation des 5´-Endes der gesuchten Sequenz. In dieser Sequenz wurde das in Abb. 27 markierte Start-Codon bestätigt. Eine Kozak-Sequenz war allerdings nicht identifizierbar. Die Sequenzierung des etwa 760 bp großen Fragmentes ergab eine unspezifische Amplifikation einer Sarcoptes-Sequenz (Genbank Acc. No. BM276587.1). Die PCR, die mit dem Rückwärtsprimer RACE5´-Ss18R durchgeführt wurde, sollte das 5´-Ende der Sequenz, das aus dem Klon Ss-18 abgeleitet werden konnte, aus der Gesamt-cDNA vollständig amplifizieren. Die Sequenzierung des in Abb. 26B markierten etwa 100 bp großen Fragmentes ergab ebenfalls ein unspezifisches Produkt, deren Sequenz mit keiner Sarcoptes-Sequenz in der öffentlichen Datenbank übereinstimmte.

Abb. 26: Amplifikation der 5´-Enden der für „KE-reiche Antigene“ kodierenden Sequenzen mittels der RACE-PCR. A: Darstellung der Fragmente im Agarosegel, die unter Verwendung eines Rückwärtsprimers, der eine konservierte Region aller bekannten für „KE-reiche Antigene“ kodierenden Klone repräsentiert, amplifiziert wurde. B: Darstellung des Fragmentes im Agarosegel, das unter Verwendung eines Ss-18-spezifischen Primers amplifiziert wurde. Hierbei handelt es sich um ein unspezifisches Produkt C: Die Sequenzierung eines der Fragmente (253 bp) aus A ergab die dargestellte Sequenz. Bei dem hier markierten Start-Codon handelt es sich um dasselbe, wie bei dem in Abb. 27 markierten.

In den Klonen Ss-15, Ss-18, Ss-73 und Ss-82 ist jeweils ein Stop-Codon vorhanden, das in der Abb. 27 in Form eines Sternchens markiert ist, während dieses bei den anderen sequenzierten Klonen fehlt. Die Klone Ss-14 und Ss-18 wurden für eine Aufreinigung des rekombinanten Antigens in Expressionsvektoren kloniert. Lediglich der Klon Ss-18 konnte in dem System pET-41(+) erfolgreich exprimiert und das Protein aufgereinigt werden.

Abb. 27: Alignment der Aminosäuresequenz von den sequenzierten, für „KE-reiche Antigene“ -kodierenden Klonen. Die Box an Position 13 (grün) markiert das putative Start-Codon der Klone. Stop-Codons werden in roten Boxen indiziert.
Strukturanalyse
Die Strukturanalyse des Proteins von Klon Ss-14 wurde stellvertretend für die für „KE-reichen Antigene“-kodierenden Klone durchgeführt (s. Abb. 28). Diese ergab einen erhöhten Antigenindex für die repetitive Region. Die Region zeichnet sich durch eine Hydrophilie sowie durch eine Flexibilität der Aminosäuren aus. Auf Grund der Hydrophilie besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit, dass diese Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls exponiert sind. Für diesen Bereich wird außerdem die Ausbildung einer α-Helix vorhergesagt. Der Klon Ss-14 ist im Vergleich zu z. B. dem Klon Ss-62 am 5´-Ende verkürzt. Die Sequenz des Klons Ss-62 beinhaltet ein Signalpeptid, dessen Spaltstelle zwischen den Aminosäuren Alanin (A) und Asparagin (N) an Position 34/35 liegt.

Abb. 28: Strukturanalyse des kompletten Proteins von Klon Ss-14 . Dargestellt sind die Vorhersagen für den Antigen-Index, die Hydrophilität, die Flexibilität und Exponiertheit bestimmter Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls sowie die Sekundärstruktur. Die Werte wurden mittels des Programms MacVector (Accelrys) ermittelt.
Klon Ss-14
Das für die Genexpression klonierte Fragment von Ss-14, in dem weder ein Start- noch ein Stop-Codon zu identifizieren waren, umfasst 997 bp. Der ORF bis hin zum Poly-A-Anhang kodiert für ein Protein mit einem Gewicht von 40.3 kDa und der pI-Wert liegt bei 5.45.

Die Aminosäuren Glutamat (23.82%) und Lysin (27.35%) sind auffallend häufig vertreten. Dieses Gen konnte in dem System pQE exprimiert, aber das rekombinante Protein nicht aufgereinigt werden. Nach einer Klonierung in die Vektoren pET-28 und pET-41a (+) wurde keine Expression detektiert.
Klon Ss-18
In dem Klon Ss-18 befindet sich an Position 728 ein Stop-Codon, allerdings fehlt in dieser Sequenz ein Start-Codon. Das für die Expression klonierte Fragment beinhaltet 658 bp und kodiert für ein Protein mit einem Molekulargewicht von 27 kDa. Der pI-Wert beträgt 5.65. Der Anteil von Glutamat (31.96%) sowie der von Lysin (37.44%) und ist auch hier auffallend hoch. Wie alle anderen für die „KE-reichen Antigene“-kodierenden Klone enthält auch der Klon Ss-18 repetitive Domänen (s. Abb. 29).

Abb. 29: Repetitive Domänen in dem Protein des Klons Ss-18 . Der Klon ist stellvertretend für die anderen Klone, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren, dargestellt, bei denen sich die Domänen entsprechend der Sequenz von den hier dargstellten unterscheiden. Hier sind zwei unterschiedliche Domänen (rot und blau markiert) gezeigt.

Das Gen wurde in dem Expressionsystem pET-41a (+) durch die Zugabe von 1 mM IPTG als GST-Fusion-protein exprimiert. Im Vergleich zu dem Größenstandard beträgt das Molekulargewicht dieses Fusionsproteins etwa 70 kDa (s. Abb. 30). Das Protein konnte auf Grund der Fusion mit dem löslichen GST unter nativen Bedingungen (s. Punkt 2.2.2.23.2.1) aus den Bakterienzellen extrahiert werden. Nach Bindung an die Glutathion-Sepharose-Matrix wurde das Protein durch die Zugabe von reduziertem Glutathion von dieser eluiert (s. Abb. 30).

Abb. 30: Aufreinigung des Proteins von Klon Ss-18 /GST über die Glutathione Sepharose® 4B-Matrix (Pharmacia). Das Protein wurde durch die Zugabe von red. Glutation von der Matrix eluiert.

Die Klone, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren, wurden häufig isoliert, und diese Tatsache ließ auf eine hohe Immunogenität der Proteine schließen. Aus diesem Grund wurden weitere Untersuchungen zur Charakterisierung dieser Antigene unternommen.
Detektion der für die „KE-reichen Antigene“-kodierenden Gene in S. scabiei und D. pteronyssinus
In den Hausstaubmilben konnten mittels der Reversen Transkription der mRNA und anschließender PCR keine Transkripte der Gene detektiert werden, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren. Eine Southern-Blot Analyse mit der gDNA sowohl von S. scabiei als auch von D. pteronyssinus wurde durchgeführt, um die Spezifität dieser Sequenzen für die Sarcoptes-Milben zu überprüfen. Des Weiteren diente dieser Versuch der Ermittlung der Kopienanzahl des „KE-reicher Antigene“-kodierenden Gens in S. scabiei.

Wie auch mittels der PCR konnte durch die Southern Blot-Analyse kein für „KE-reiche Antigene“-kodierendes Gen in den Hausstaubmilben nachgewiesen werden. In den Sarcoptes-Milben wiederum konnte nur eine Kopie dieses für die Milben spezifischen Gens, sowohl in der mit EcoRI als auch in der mit HindIII geschnittenen gDNA, detektiert werden (s. Abb. 31).

Abb. 31: Southern Blot Analyse zur Detektion der „KE-reichen Antigene“-kodierenden Sequenzen im Genom von S. scabiei (S.s.) und D. pteronyssinus (D. pt.).Im Gegensatz zu S. scabiei ist bei D. pteronyssinus kein Gen nachweisbar, das für die „KE-reichen Antigene“ kodiert. Bei S. scabiei wurde von diesem Gen eine Kopie nachgewiesen.

In der gDNA, die mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten wurde, ist eine Bande auf der Höhe von ca. 3.4 kb sichtbar, während diese in der mit HindIII geschnittenen gDNA nur eine Größe von etwa 900 bp aufweist. Der Grund für die verkürzte Sequenz liegt vermutlich in einer unbekannten HindIII-Schnittstelle in einem Intron. Die Sonde, die hier verwendet wurde, bindet im 5´-Bereich des Gens.
Nachweis der „KE-reichen Antigene“ in SsGesamtantigen
Die Anzahl der exprimierten Transkripte, die für die „KE-reichen Antigene“ kodieren, sollte ermittelt werden. Zu diesem Zweck waren BALB/c-Mäuse mit dem rekombinanten Protein von Klon Ss-18/GST immunisiert worden. Dieses Antiserum(α-Ss-18/GST) wurde im Western Blot, unter Verwendung des Gesamtantigens der Sarcoptes-Milben, eingesetzt. In einem 10%igen SDS-Gel wurden fünf Banden identifiziert, die mit dem Positiv-, nicht aber mit dem Negativserum oder dem der Mäuse, die mit reinem GST immunisiert worden waren, reagierten (s. Abb. 32). Die Größe dieser „KE-reichen Proteine“ bewegte sich zwischen etwa 45 kDa und 55 kDa.

Abb. 32: Western Blot mit SsGesamtantigen zum Nachweis der „KE-reichen Antigene“.Mittels des α-Ss-18/GST-Serums wurden fünf Proteinbanden detektiert.
Lokalisation der „KE-reichen Antigene“ in S. scabiei
Für eine weitere Charakterisierung der „KE-reichen Antigene“ wurde aus diesen die Aminosäuresequenz dreier Bereiche, aus dem N- und C-Terminus sowie der zentralen KE-reichen Region, abgeleitet. Anhand dieser Sequenz wurden drei Peptide synthetisiert. Diese Peptide wurden an das Trägerprotein KLH gekoppelt und damit BALB/c-Mäuse immunisiert, um deren Serum in immunhistochemischen Untersuchungen einsetzen zu können. Durch die Antikörperreaktion mit Epitopen aus dem nativen Protein in der Milbe sollte eine Lokalisierung der Proteine ermöglicht werden.
Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit KLH-gekoppelten Peptiden
Der Ellmann´s Assay zur Ermittlung der Kopplungseffizienz von den Peptiden an das KLH ergab, dass nach der Inkubation der Peptide mit dem KLH keine freien Sulfhydrylgruppen mehr detektierbar waren, was auf eine Kopplungseffizienz von 100% hinweist.

Die Immunantwort der BALB/c-Mäuse, die mit den synthetischen Peptiden A2, B2 und D2 immunisiert worden waren, wurde im ELISA mit einem anti-IgG-konjugierten Antikörper gemessen. Als Antigen wurden hier die ungekoppelten Peptide verwendet, so dass eine Reaktion gegen das Peptid und nicht gegen das KLH nachgewiesen wurde. Bei allen Mäusen konnten Antikörperantworten gegen die jeweiligen Peptide, mit denen sie immunisiert worden waren, verzeichnet werden. Die Ergebnisse sind in Tab. 4 dargestellt.

Maus 1

Maus 2

Maus 3

Maus 4

Maus 5

Maus 6

Maus 7

Maus 8

Maus 9

Peptid A2

0.89

(± 0.065)

0.942

(± 0.02)

0.269

(± 0)

-

-

-

-

-

-

Peptid B2

-

-

-

0.864

(± 0)

1.083

(± 0.02)

0.808

(± 0.09)

-

-

-

Peptid D2

-

-

-

-

-

-

1.134

(± 0.05)

0.892

(±0.01)

0.76

(± 0.01)

Tab. 4: Antikörperantworten der mit den synthetischen Peptiden immunisierten BALB/c-Mäuse gegen die jeweiligen Peptide. Die Immunantwort wurde mittels eines anti-IgG-Konjugates im ELISA ermittelt und in den Wellenlangen OD_450/630gemessen. In Klammern sind die Standardabweichungen angegeben. Die Verdünnung der eingesetzten Seren betrug hier 1/200.

Es wurde außerdem ein ELISA mit KLH als Antigen durchgeführt. Es konnte bei keinem der neun Seren eine Immunantwort gegen das KLH detektiert werden.

Ein ELISA mit Gesamtantigen von S. scabiei ergab keine deutliche Reaktion der Seren der neun Mäuse. Lediglich das Serum der Maus 1, die mit dem Peptid A2 immunisiert worden war, zeigte reproduzierbar bei unterschiedlichen Serumkonzentrationen eine etwa vierfach so starke Reaktion, wie bei den Seren gegen die beiden anderen Peptide. Die Reaktion gegen das Peptid A2 lag hier allerdings nicht höher als OD_450/6300.05 (s. Tab. 5).

Maus 1

Maus 2

Maus 3

Maus 4

Maus 5

Maus 6

Maus 7

Maus 8

Maus 9

Peptid A2

0.045

(± 0.005)

0.02

(± 0)

0.006

(± 0.002)

-

-

-

-

-

-

Peptid B2

-

-

-

0.012

(± 0)

0.011

(± 0)

0.013

(± 0.002)

-

-

-

Peptid D2

-

-

-

-

-

-

0.008

(± 0.01)

0.007

(±0)

0.011

(± 0)

Tab. 5: Antikörperantworten der mit den synthetischen Peptiden immunisierten BALB/c-Mäuse gegen Ss Gesamtantigen. Die Immunantwort wurde mittels eines anti-IgG-Konjugates im ELISA ermittelt und in den Wellenlangen OD_450/630gemessen. In Klammern sind die Standardabweichungen angegeben. Die hier dargestellten Werte wurden anhand einer Serumverdünnung von 1/50 ermittelt.

Der Western Blot mit dem aufgetrennten Protein des Klons Ss-14 exprimiert in pTriplEx ergab lediglich eine Reaktion der Seren von Maus 1 und 2, die mit dem Peptid A2 immunisiert worden waren (s. Abb. 33). Wie aus Tab. 4 ersichtlich wird, war der gemessene Wert der Antikörperantwort gegen das Peptid A2 von Maus 3 auch um das etwa 3.6fache geringer als der der beiden anderen Mäuse. Alle drei Seren der Mäuse, die gegen das Peptid D2 immunisiert worden waren, erkannten das rekombinante Protein von Klon Ss-14 (s. Abb. 33). Keine Reaktion war hingegen mit dem α-Peptid-B2-Serum detektierbar. Diese Domäne war den Antikörpern offensichtlich nicht zugänglich.

Abb. 33: Detektion des rekombinanten Protein von Klon Ss-14 durch die Seren der mit den Peptiden A2, B2 und D2 immunisierten BALB/c-Mäuse Western Blot. M: Marker. Die Spuren 1-9 stellen jeweils die Reaktion der Seren von den immunisierten Tieren dar (Spur 1-3: Tier 1-3 immunisiert mit Peptid A2; Spur 4-6 Tier 1-3 immunisiert mit Peptid B2; Spur 7-9 Tier 1-3 immunisiert mit Peptid D2; Spuren 10-18: Reaktionen der korrespondierenden 0-Seren). Die Pfeile markieren die jeweiligen positiven Reaktionen.

Der Western Blot mit Gesamtantigen von S. scabiei ergab hingegen keine Reaktion der Seren. Der Grund dafür könnte in der geringen Konzentration dieser Proteine im SsGesamtantigen, das in der Western Blot-Analyse verdünnt wurde, liegen. Auf Grund der Reaktion im Western Blot mit dem rekombinanten Protein von Klon Ss-14 und des äußerst gering erhöhten Wertes im ELISA wurde das Serum der BALB/c-Maus 1, die mit dem Peptid A2 immunisiert worden war, für die folgenden imunhistochemischen Untersuchungen verwendet.
Immunhistochemische Versuche zur Lokalisation der „KE-reichen Antigene“ in S. scabiei
Die Gefrierschnitte wurden mit Sarcoptes-Milben durchgeführt, die im Vorfeld nicht nach Geschlecht getrennt worden waren. Anhand der Schnitte ist nicht nachzuvollziehen, um welches Geschlecht es sich bei den Individuen handelt, in denen im Folgenden die beschriebene Struktur detektiert wurde.
Detektion mit FITC-markierten Antikörpern
Für eine Lokalisation der immunreaktiven repetitiven Proteine in den Sarcoptes-Milben wurde zunächst versucht, diese mittels FITC-markierter Antikörper in Gefrierschnitten zu detektieren. Auf diese Weise wurde im posterioren Teil des Opisthosomas der Sarcoptes-Milben eine paarige Struktur markiert (s. Abb. 34). Diese paarige Struktur konnte allerdings in diesen Schnitten, auf Grund der geringen Vergrößerung im Lichtmikroskop, nicht näher charakterisiert werden. In Milben, die ein Ei enthielten und damit eindeutig als Weibchen identifiziert werden konnten, wurde diese Struktur nicht detektiert.
Detektion mit Peroxidase-markierten Antikörpern
Mittels der Peroxidase-markierten Antikörper konnte die paarige Struktur in den Kryoschnitten der Sarcoptes-Milben nicht detektiert werden. Trotz der Inaktivierung der endogenen Peroxidase traten hier hohe unspezifische Hintergrundsreaktionen auf, so dass eine Identifizierung der Struktur nicht möglich war.
Methylenblaufärbung von S. scabiei-Semidünnschnitten
Die Methylenblaufärbung der Semidünnschnitte von Sarcoptes-Milben zeigt eine paarige Struktur im posterioren Teil des Opisthosomas (s. Abb. 35). Die Form und Position dieser Struktur entsprach der, die mit den FITC-markierten Antikörpern in den Gefrierschnitten detektiert wurde. Allerdings konnte diese Struktur auch hier nicht näher charakterisiert werden. Auf Grund der ähnlichen Form und Position wurde die hier ermittelte Struktur in elektronenmikroskopischen Aufnahmen näher untersucht.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen
Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen der paarigen Struktur, die in den Methylenblau-gefärbten Schnitten sichtbar wurde, ließen nähere Rückschlüsse über ihre Identität zu. Anhand dieser Aufnahmen kann man annehmen, dass es sich hier um die Hoden der Sarcoptes Milben handelt. In diesem Bereich werden verschiedene Nuklei sichtbar, die nach einer weiteren Teilung in das nächste Stadium der Spermatogenese übergehen (s. Abb. 36; persönliche Mitteilung Dr. G. Brennan, Queens University Belfast).

Die in Abb. 36 markierte Region zeigt einen Teil der paarigen Struktur, die mittels der Methylenblaufärbung sichtbar wurde. Auf Grund der Tatsache, dass es sich auch hierbei um ein paariges Organ handelt und die Position dieser Struktur in etwa der der durch die FITC-markierten Struktur enspricht, wurde vermutet, dass es sich hier um ein und dasselbe Organ handelt. Allerdings konnte die Identität nicht geklärt werden, da zu diesem Zweck elektronenmikroskopische Aufnahmen mit parallelen Immunogoldfärbungen in einem Individuum nötig sind.

Abb. 34: Lokalisation der immunreaktiven „KE-reichen Antigene“: Immunhistochemische Detektion einer paarigen Struktur im posterioren Teil des Opisthosomas von S. scabiei var . bovis. A: Unter Verwendung eines gegen das repetitive Peptid A2 gerichteten BALB/c-Serums und eines FITCmarkierten Antikörpers konnte die markierte Struktur in Gefrierschnitten von den Milben nachgewiesen werden. B: Lichtmikroskopische Aufnahme der untersuchten Milbe C: Übereinander gelegte Bilder aus A und B D: Anhand eines negativen Kontrollserums wurde diese Struktur in dem darauffolgenden Gefrierschnitt nicht detektiert.

Abb. 35: Methylenblaufärbung eines Semidünnschnittes von S. scabiei. Pfeile markieren ein paariges Organ im posterioren Opisthosoma einer Milbe unbekannten Geschlechts. a: abgetrennter Kopf, b: braune Bestandteile: Fettzellen, c: Struktur wird in den folgenden Schnitten unpaar, d: Anus

Abb. 36: Elektronenmikroskopische Aufnahme der paarigen Struktur aus Abb. 35 in einem darauffolgenden Schnitt.B: Feindarstellung der in A dargestellten Struktur. a: Proteinansammlungen, b: Nuklei

Ziel dieser Arbeit war es, rekombinante Antigene zu identifizieren, mittels derer eine kostengünstige aber zuverlässige und hochspezifische Serodiagnostik der Sarcoptes-Infektion ermöglicht wird. Die Antigene sollten sowohl auf ihr immundiagnostisches Potenzial bei einer Krätze-Infektion beim Menschen als auch auf das bei einer Räude-Infektion beim Tier überprüft werden. Ein ELISA mit SsGesamtantigen unter Verwendung von Humanseren (s. Abb. 2) zeigte, dass die Serodiagnose von Sarcoptes-Infektionen beim Menschen unter den gewählten Umständen nicht möglich ist.

Im Folgenden sind die serologischen Ergebnisse, die unter Verwendung der in dieser Arbeit isolierten rekombinanten Antigene erzielt wurden, dargestellt.

Immundiagnostisches Potenzial der rekombinanten Antigene
Ein ELISA unter Einsatz aller rekombinanten Antigene wurde durchgeführt, um die Spezifität dieser Antigene zu testen. Es wurden parallel Seren von Sarcoptes-positiven und -negativen Personen bzw. Schweinen eingesetzt. In den dargestellten Versuchen wurden die Seren in einer Verdünnung 1/200 eingesetzt, die sich auch hier als optimal erwiesen hatte. Insgesamt war eine extrem hohe Hintergrundsreaktion bei den Schweineseren zu beobachten. Die Vermutung, dass es sich dabei um eine Reaktion gegen E. coli-Protein, das in den Eluaten des rekombinanten Proteins vorhanden sein konnte, handelte, liegt nahe. Allerdings führte auch eine Präabsorption der Schweineseren mit E. coli-Protein zu keiner Reduktion dieser Hintergrundsreaktion.

Das Humanserum S17, das mit allen Antigenen eine überdurchschnittlich hohe Reaktion zeigte, stammte nachweislich von einem Hausstaubmilbenallergiker.
Klon Ss-4
Der Mittelwert der Reaktion der Sarcoptes-positiven Humanseren mit dem Antigen von Klon Ss-4 lag bei OD_450/6300.559 (± 0.133), während er für die Negativseren OD_450/6300.364 (± 0.124) betrug (s. Abb. 37). Es bestanden signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen der Positiv- und der Negativseren (p < 0.001). Die Ergebnisse korrelierten mit den Werten, die mittels des ELISA bei Gebrauch des Gesamtantigens ermittelt wurden (r = 0.721, p = 0.0).

Der Mittelwert der positiven Schweineseren lag bei OD_450/630 0.29 (± 0.102) und der der Negativseren bei OD_450/6300.27 (± 0.098) (s. Abb. 38). Hier konnte im Gegensatz zu den Humanseren keine signifikanten Differenzen zwischen den Ergebnissen der Positiv- und Negativseren ermittelt werden (p = 0.514). Auch eine Korrelation zwischen diesen Werten und denen aus dem Sarcoptes-ELISA 2001^® (Afosa GmbH) existierte nicht (r = 0.276, p = 0.084).

Abb. 37: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen von Klon Ss-4 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.

Abb. 38: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen von Klon Ss-4 . Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
KlonSs-7
Der Mittelwert der Reaktion der Sarcoptes-positiven Seren mit dem Antigen des Klons Ss-7 lag bei OD_450/6300.587 (± 0.15), während er für die Negativseren OD_450/6300.305 (± 0.201) betrug (s. Abb. 39). Für dieses Antigen bestanden signifikante Differenzen zwischen den Ergebnissen der Positiv- und der Negativseren (p < 0.001). Die hier ermittelten Werten korrelierten mit denen aus dem ELISA mit Gesamtantigen (r = 0.438, p = 0.005).

Der Mittelwert der positiven Schweineseren belief sich auf OD_450/6300.342 (± 0.159) während der der Negativseren OD_450/6300.219 (± 0.099) betrug (s. Abb. 40). Signifikanten Differenzen zwischen den Werten der Positiv- und Negativseren lagen vor (p = 0.024). Es bestand eine Korrelation zwischen diesen Werten und denen aus dem Sarcoptes-ELISA 2001^® (Afosa GmbH) (r = 0.406, p = 0.01).

Abb. 39: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen von Klon Ss-7 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.

Abb. 40: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen von Klon Ss-7 . Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
Klon Ss-17
Der Mittelwert der Reaktion der Sarcoptes-positiven Humanseren mit dem Antigen von Klon Ss-17 lag bei OD_450/6300.541 (± 0.156), während er für die Negativseren OD_450/630 0.284 (± 0.141) betrug (s. Abb. 41). Es bestanden signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen der Negativ- und der Positivseren (p = < 0.001). Eine Korrelation zwischen diesen und den Werten aus dem ELISA mit Gesamtantigen konnte ermittelt werden (r = 0.789, p = 0.0).

Im Gegensatz dazu konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Reaktionen der Räude-positiven und -negativen Schweineseren detektiert werden (p = 0.076). Der Mittelwert der erkrankten Tiere betrug OD_450/6300.379 (± 0.099), und der der gesunden Tiere belief sich auf OD_450/6300.329 (± 0.076) (s. Abb. 42). Die Werte korrelierten mit den Ergebnissen aus dem Sarcoptes-ELISA 2001^® (Afosa GmbH) (r = 0.488, p = 0.0015).

Abb. 41: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen von Klon Ss-17 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.

Abb. 42: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen von Klon Ss-17. Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
Klon Ss-18
Die mittlere Reaktivität der positiven Humanseren gegen das Fusionsprotein von Klon Ss-18/GST lag bei OD_450/630 0.413 (± 0.103), die der Negativseren hingegen betrug OD_450/630 0.19 (± 0.064) (s. Abb. 43). Zwischen den Werten der Positiv- und Negativseren waren signifikante Unterschiede zu verzeichen (p = < 0.001). Die Werte korrelierten mit den Ergebnissen aus dem ELISA mit Gesamtantigen (r = 0.487, p = 0.001). Wurde allerdings die Reaktion gegen reines GST von dieser Reaktion subtrahiert, zeigte sich, dass die Hintergrundsreaktion gegen das GST derartig hoch war, dass keine spezifische Reaktion mit dem rekombinanten Ss-18 detektierbar war. Es konnte auch keine Korrelation zwischen den hier und denen aus dem ELISA mit Gesamtantigen ermittelten Werten detektiert werden (r = -0.018, p = 0.91).

Die Mittelwerte lagen hier bei OD_450/630 0.008 (± 0.024) für die Positiv- und bei OD_450/630 0.001 (± 0.003) für die Negativseren (s. Abb. 44). Es waren keinerlei signifikante Differenzen zu ermitteln (p = 0.913).

Der Mittelwert der Reaktivität der Sarcoptes-positiven Schweineseren gegen das Fusionsprotein des Klons Ss-18/GST betrug OD450/630 0.388 (± 0.124). Der Mittelwert der Negativseren belief sich dagegen auf OD450/630 0.285 (± 0.121) (s. Abb. 45). Es bestanden signifikante Differenzen zwischen den Werten der Positiv- und den der Negativseren (p = 0.011). Auch eine Korrelation zwischen diesen Werten und denen aus dem Sarcoptes-ELISA 2001® (Afosa GmbH) existierte (r = 0.598, p = 0.0). Nach einer Subtraktion der Werte, die die jeweiligen Seren gegen reines GST-Protein gezeigt hatten, lag der Wert der Positivseren bei OD450/630 0.153 (± 0.12) und der der Negativseren bei OD450/630 0.045 (± 0.094) (s. Abb. 46). Auch hier waren signifikante Differenzen (p = < 0.001) zwischen den Ergebnissen der Positiv- und Negativseren zu verzeichnen, und ebenso korrelierten die Werte mit denen aus dem Sarcoptes-ELISA 2001® (Afosa GmbH) (r = 0.669, p = 0.0).

Abb. 43: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen von Klon Ss-18 /GST als GST-Fusionsprotein. Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.

Abb. 44: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen von Klon Ss-18/GST als GST-Fusionsprotein abzüglich der Reaktion gegen reines GST.Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, die Seren S1 bis einschließlich S20 sind Seren gesunder Personen. Die Reaktion im ELISA gegen reines GST wurde von der Reaktion gegen das Fusionsprotein subtrahiert.

Abb. 45: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen von Klon Ss-18 /GST als GST-Fusionsprotein. Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.

Abb. 46: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen von Klon Ss-18 /GST als GST-Fusionsprotein abzüglich der Reaktion gegen reines GST. Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine. Die Reaktion im ELISA gegen reines GST wurde von der Reaktion gegen das Fusionsprotein subtrahiert.

Sowohl die Human- als auch die Schweineseren wurden mit GST präabsorbiert, um GST-spezifische Antikörper zu entfernen und damit unspezifische Reaktionen im ELISA zu verringern. Allerdings führte auch diese Präabsorption, wie die mit dem E. coli-Protein, zu keiner wesentlichen Verminderung der Hintergrundsreaktion.
Klon Ss-23
Die mittlere Reaktivität der positiven Humanseren mit dem Antigen des Klons Ss-23 lag bei OD_450/630 0.379 (± 0.134), während die der negativen Seren OD_450/630 0.15 (± 0.062) betrug (s. Abb. 47). Auch hier bestanden signifikante Differenzen zwischen den Ergebnissen mit den Positiv- und den Negativseren (p = < 0.001). Es konnte eine Korrelation zwischen diesen und den Ergebnissen im ELISA mit Gesamtantigen ermittelt werden (r = 0.57, p = 0.0).

Der Mittelwert der Seren der Sarcoptes-infestierten Schweine betrug OD_450/630 0.319 (± 0.141); der Mittelwert der gesunden Tiere lag bei OD_450/630 0.294 (± 0.099) (s. Abb. 48). Auch hier waren für die Schweineseren keine signifikanten Differenzen zwischen den Positiv- und Negativseren zu ermitteln (p = 0.865). Eine Korrelation zwischen diesen Ergebnissen und denen aus dem Sarcoptes-ELISA 2001^®(Afosa GmbH) bestand nicht (r = 0.087, p = 0.59).

Abb. 47: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen des Klons Ss-23 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.

Abb. 48: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen des Klons Ss-23 . Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
Klon Ss-37
Der Mittelwert der Reaktion der Skabies-positiven Patientenseren mit dem Antigen von Klon Ss-37 betrug OD_450/630 0.466 (± 0.088), wohingegen sich der der gesunden Patienten auf OD_450/630 0.166 (± 0.076) belief (s. Abb. 49). Signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen der Positiv- und der Negativseren bestanden (p = < 0.001). Ebenso existierte eine Korrelation zwischen diesen Ergebnissen und denen aus dem ELISA mit Gesamtantigen (r = 0.588, p = 0.0).

Die Ergebnisse mit den positiven Schweineseren ergaben einen Mittelwert von OD_450/630 0.311 (± 0.08), und die der negativen Seren einen Mittelwert von OD_450/630 0.252 (± 0.059) (s. Abb. 50). Es lagen signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen der Positiv- und Negativseren vor (p = 0.016), und die Werte korrelierten mit denen aus dem Sarcoptes-ELISA 2001^® (Afosa GmbH) (r = 0.427, p = 0.006).

Abb. 49: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen des Klons Ss-37 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, bei den Seren S1 bis einschließlich S20 handelt es sich um Seren gesunder Personen.

Abb. 50: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen des Klons Ss-37 . Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.
Klon Ss-97
Die mittlere Reaktivität der Sarcoptes-positiven Patientenseren betrug OD_450/630 0.443 (± 0.095), wohingegen sich die der Seren von den gesunden Patienten auf OD_450/630 0.319 (± 0.063) belief (s. Abb. 51). Es bestanden signifikante Differenzen zwischen den Reaktionen der Positiv- und der Negativseren (p = < 0.001). Eine Korrelation zwischen diesen Werten und denen aus dem ELISA mit Gesamtantigen war ebenfalls detektierbar (r = 0.517, p = 0.0).

Der Mittelwert der Seren der Sarcoptes-infestierten Schweine betrug OD_450/630 0.348 (± 0.112). Der Mittelwert der gesunden Tiere lag bei OD_450/630 0.208 (± 0.045) (s. Abb. 52). Auch für die Schweineseren waren signifikante Differenzen zwischen den Positiv- und Negativseren zu verzeichnen (p = < 0.001). Eine Korrelation zwischen diesen und den Ergebnissen aus dem Sarcoptes-ELISA 2001^® (Afosa GmbH) bestand (r = 0.671, p = 0.0).

Abb. 51: ELISA mit einzelnen Humanseren und dem Antigen des Klons Ss-97 . Die Seren KT4 bis einschließlich L46 sind Seren Sarcoptes-positiver Patienten, die Seren S1 bis einschließlich S20 sind Seren gesunder Personen.

Abb. 52: ELISA mit einzelnen Schweineseren und dem Antigen des Klons Ss-97 . Die Seren BW1 bis einschließlich poskontrol sind Seren Sarcoptes-positiver Schweine, die Seren 13 2 bis einschließlich 25 14 sind Seren gesunder Schweine.

Für eine Übersicht sind die Ergebnisse aus den ELISAs mit den rekombinanten Antigenen und den verschiedenen Seren in Tab. 6 dargestellt.

Tab. 6: Übersicht der Ergebnisse aus den ELISAs mit den rekombinanten Antigenen. A:ELISA mit Humanseren B: ELISA mit Schweineseren