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1  Einleitung

Die adäquate Funktion einer Zelle ist von einer konstanten und ausreichenden Versorgung mit metabolischer Energie abhängig. Dies gilt allgemein für alle Zellen und trifft demzufolge auch für mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) zu, die in dieser Arbeit untersucht werden. Mit bis zu 90% der PBMC stellen die Lymphozyten die größte Fraktion dar. Der restliche Anteil besteht aus Granulozyten und Monozyten.

Lymphozyten spielen eine bedeutende Rolle für den Ablauf von Immunreaktionen. Normalerweise sind sie für die erworbene (adaptive) Immunität verantwortlich und dienen der Abwehr von Mikroorganismen. Desweiteren wurde erkannt, daß sie an der Bekämpfung tumorös entarteter Zellen beteiligt sind. [Janeway et al. 1997] Sie nehmen aber auch, infolge fehlgesteuerter Immunreaktionen, eine zentrale Stellung im Rahmen vieler entzündlich-rheumatischer Autoimmunerkrankungen ein. Die Lymphozyten benötigen die produzierte Energie zunächst einmal für ihre zelleigenen Funktionen, insbesondere für den Kationentransport und die Makromolekülsynthese. Diese Prozesse sind u.a. zur Regulierung des Zellvolumens und des Zellwachstums notwendig. Desweiteren haben Lymphozyten einen Energiebedarf für immunspezifische Aufgaben. Dazu zählen unter anderem der Energieverbrauch durch Zytokinese, Aktivierungsvorgänge, Antikörpersynthese oder auch Zytotoxizität. Granulozyten und Monozyten benötigen ebenfalls neben ihrem Energiebedarf für zelleigene Funktionen auch Energie für immunspezifische Aufgaben. Sie verbrauchen Energie für Migrationsprozesse, Phagozytose oder auch für die Antigenverarbeitung und -präsentation. [Buttgereit et al. 2000]

Die Arbeitshypothese lautete daher, daß der Energieverbrauch einer Zelle als Maß für deren Aktivität gilt. Es wird angenommen, daß diese Aussage vor allem für Lymphozyten zutrifft, da sie eine Zentralstellung im Ablauf von Immunreaktionen bei entzündlich-rheumatischen Erkrankungen spielen und deren Aktivitätsniveau stark veränderlich ist.

Die Energie wird hauptsächlich im Mitochondrium gebildet und der Zelle in Form von ATP bereitgestellt. ATP fungiert innerhalb der Zelle als Energieüberträger. Die Atmungskette, ein in den Mitochondrien lokalisiertes Multienzymsystem, katalysiert über hintereinander geschaltete Redoxprozesse den Aufbau eines elektrochemischen Gradienten, dessen Freie Enthalpie durch die ATP-Synthase zur Bildung von ATP genutzt wird. Die ATP-Menge reicht meist nur für wenige [Seite 6↓]Minuten aus, um den Energiebedarf zu decken. ATP wird damit ständig unter Energiefreisetzung zu ADP und Phosphat hydrolysiert und wieder regeneriert. [Voet et al. 1992]

Der Zelle stehen grundsätzlich zwei Möglichkeiten der Energiegewinnung zur Verfügung: Die Atmung und die Glykolyse. Der weitaus wichtigere Weg für die Zelle ist die Atmung, der oxidative Abbau von Substraten über die Atmungskette. Die dabei erzeugte Freie Enthalpie wird direkt der ATP-Synthase (ATPase) zugeführt, die aus ADP und Phosphat ATP bildet. Dieser Prozeß findet unter aeroben Bedingungen statt und wird Oxidative Phosphorylierung genannt. Bei der Veratmung von 1 Mol Glukose produziert die Zelle 38 Mol ATP. Da dieser Prozeß fest an die Synthese von ATP gebunden ist, spricht man auch von gekoppelter Atmung.

Die zweite Möglichkeit einer Zelle Energie zu gewinnen, ist die Glykolyse. Sie findet hauptsächlich unter anaeroben Bedingungen statt und liefert nur 2 Mol ATP pro Glukosemolekül. Infolgedessen hat sie eine deutlich geringere Effizienz. Desweiteren ist die Glykolyse im Normalgewebe unter aeroben Bedingungen durch die Atmung nahezu vollständig unterdrückt (Pasteur-Effekt). Sie läßt sich in vitro zusätzlich weitgehend verhindern, indem man dem Inkubationsmedium keine oder wenig Glukose und nur wenig Phosphat zusetzt. [Buttgereit et al. 1996; Voet et al. 1992]

Der gekoppelte Sauerstoffverbrauch läßt sich näherungsweise mit Oligomycin bestimmen. Oligomycin unterbricht die Übertragung der Freien Enthalpie des Elektronentransports auf die ATP-Synthase. Der ungekoppelte Sauerstoffverbrauch ist hauptsächlich vom Protonenleak verursacht. Er entspricht dem Protonenfluß im Mitochondrium, der unter Umgehung der ATP-Synthase erfolgt. Dieser Prozeß trägt damit nicht zur ATP-Bildung bei. [Buttgereit et al. 1996] Das Protonenleak wirkt an der Regulation der Wärmeproduktion, des zellulären Stoffwechsels, der Reduktion von schädlichen freien Radikalen und der Erzeugung von Redoxäquivalenten mit. Der extramitochondriale Sauerstoffverbrauch ist so gering, daß er vernachlässigt werden kann. [Rolfe et al. 1997]


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Abbildung 1: Der zelluläre Energiestoffwechsel[Buttgereit et al. 2000]

Eine Quantifizierung und (oder) Bilanzierung des zellulären Energiestoffwechsels erfolgte erstmals an Kaninchenretikulozyten [Siems et al. 1984], später dann auch an Ehrlich-Ascites-Tumorzellen der Maus [Müller et al. 1986], an Schweine- und Rattenlymphozyten [Buttgereit et al. 1991, 1992] und an humanen Zellen, die als periphere mononukleäre Zellen des Blutes (PBMC) aus Buffy coats zur Verfügung standen [Schmid et al. 2000].

Grundlage für die Bilanzierung war die Annahme, daß sich die im Medium befindlichen Zellen metabolisch im Fließgleichgewicht (steady state) und damit in einem energetisch stabilen Zustand befinden. Unter diesen Bedingungen wird in den Mitochondrien der PBMC nur so viel ATP produziert, wie für die Stoffwechselprozesse nötig ist. Die ATP-Bildung entspricht dem ATP-Verbrauch. Da wir unter unseren experimentellen Bedingungen die Glykolyse nahezu ausgeschlossen haben, errechnet sich die ATP-Bildung nur noch aus der gekoppelten Atmung. Das gebildete ATP wird durch verschiedenste Stoffwechselprozesse verbraucht. Der Umfang des Verbrauchs durch die einzelnen Prozesse kann direkt oder indirekt bestimmt werden. In dieser Arbeit wird die indirekte Methode verwendet. Dabei werden Hemmstoffe, die in selektiver Weise einzelne ATP-verbrauchende Prozesse blockieren, eingesetzt. Die daraus resultierende adäquate Verminderung der ATP-Bildung kann über die Verminderung des Sauerstoffverbrauchs durch die oxidative Phosphorylierung erfaßt werden. Die Messung des Sauerstoffverbrauchs [Seite 8↓]geschieht über kurze Inkubationszeiten im Minutenbereich amperometrisch mit der Clark-Elektrode.

In vorangegangenen Untersuchungen wurden in humanen PBMC aus Buffy coats die Na+K+-ATPase, die Ca2+-ATPase, die Protein- und DNA/RNA-Synthese und das Protonenleak als hauptenergieverbrauchende Prozesse erkannt. [Schmid et al. 2000]Mit ihnen ließ sich in stimulierten PBMC ca. 63% des Energieverbrauchs spezifischen Prozessen zuordnen. Dies unterstreicht die essentielle Bedeutung für die Funktion und das Überleben von Zellen, hier insbesondere für Lymphozyten. Ausgehend von der Kenntnis der elementaren Bedeutung dieser Prozesse innerhalb des Energiestoffwechsels, werden die genannten ATP-verbrauchenden Prozesse auch in dieser Arbeit untersucht. Sie werden damit erstmalig an PBMC von Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen bestimmt und vergleichend zu denen von Probanden betrachtet.

Die Annahme, daß der Energieverbrauch einer Zelle deren Aktivität widerspiegelt, wurde zusätzlich experimentell durch Untersuchungen an Rattenthymozyten [Buttgereit et al. 1992] und später an humanen PBMC aus Buffy coats [Schmid et al. 2000] bestätigt. Beide Autoren zeigten, daß der Sauerstoffverbrauch ein Maß für die ATP-Bildung in ruhenden und stimulierten Lymphozyten ist. Es wurde der Sauerstoffverbrauch dieser Zellen unter ruhenden Bedingungen und nach mitogener Stimulation mit Con A verglichen. In den Arbeiten zeigte sich, daß nach Stimulation der Gesamtsauerstoffverbrauch deutlich zunahm. Um die sich dahinter verbergenden Prozesse zu identifizieren, wurde der Verbrauch des Sauerstoffs durch die Na+K+-ATPase, Ca2+-ATPase, Proteinsynthese und DNA/RNA-Synthese bestimmt. In diesen Arbeiten stellte sich heraus, daß die Ca2+-ATPase und DNA/RNA-Synthese nach Stimulation überhaupt erst angeschaltet werden und die Na+K+-ATPase sowie die Proteinsynthese einen erhöhten absoluten und relativen Energieverbrauch hatten. Den bioenergetisch ruhenden Rattenthymozyten konnten etwa 50%, den stimulierten etwa 80%, des ATP-Verbrauchs zugeordnet werden. [Buttgereit et al. 1992]

Schlußfolgernd aus diesen Experimenten stellen sich folgende zentrale Fragen:

Sind die Ergebnisse auch auf PBMC entzündlich-rheumatisch erkrankter Patienten anwendbar? Reflektiert sich die Krankheit oder Krankheitsaktivität eines Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung auf zellulärer Ebene in einer Änderung des Energiestoffwechsel der PBMC? Haben eventuell erfaßbare Unterschiede eine Bedeutung für die Diagnostik und Therapie dieser Erkrankungen?


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Entzündlich-rheumatische Erkrankungen kommen mit einer Häufigkeit von 1-2% in der Bevölkerung vor. Zu ihnen gehören die relativ häufige Rheumatoide Arthritis und die Polymyalgia rheumatica, aber auch seltenere Erkrankungen, wie beispielsweise der Systemische Lupus Erythematodes, die Sklerodermie oder das Sjögren-Syndrom. Bei diesen Krankheiten handelt es sich um entzündliche Systemerkrankungen, die sich nicht nur am Bewegungsapparat, sondern auch an einer Vielzahl von Organen und Geweben manifestieren können. Bei der Entstehung dieser Erkrankungen spielen eine genetische Disposition und Autoimmunmechanismen eine große Rolle. Normalerweise reagiert ein Organismus nicht gegen seine eigenen Gewebsbestandteile, er ist ihnen gegenüber tolerant. Aber nach Durchbrechen dieser Toleranz, können infolge fehlgeleiteter Immunreaktionen Autoimmunerkrankungen entstehen. Die spezifisch adaptative Immunantwort wird gegen körpereigene Antigene ausgelöst und unterhalten. Autoimmunerkrankungen sind gekennzeichnet durch das Auftreten von Autoantikörper-produzierenden B-Lymphozyten und (oder) autoreaktiven zytotoxischen T-Lymphozyten.

Die Verläufe dieser Autoimmunerkrankungen sind in der Regel sehr variabel, vielgestaltig und nicht selten einzigartig für jeden Patienten. Es gibt Phasen, in denen sie ruhen, latent vorhanden sind oder auch sehr aktiv und aggressiv verlaufen. Die Krankheitsaktivität ist sehr veränderlich. Das bedeutet, daß sich eine Einschätzung der Prognose oftmals sehr schwierig gestaltet oder überhaupt nicht möglich ist. [Silman & Symmons et al. 1995] Dieser Tatbestand ist, durch die sich daraus ergebende Ungewißheit, für Patienten und Ärzte schwer zu handhaben. Damit kommt der Früherkennung einer beginnenden oder sich ändernden Krankheitsaktivität große Bedeutung zu. Das Behandlungsziel besteht in der frühen Intervention, um damit Schäden autoaggressiver Reaktionen zu begrenzen. Die Einschätzung von Krankheitsaktivität erfolgt anhand von klinischen Beschwerden und laborchemischen Parametern entsprechend der Erkrankung. In beiden Fällen kann es Probleme geben. Zum einen sind die klinischen Beschwerden oft unspezifisch, zum anderen überlappen sich die Beschwerdebilder einzelner Erkrankungen, so daß sich nicht selten die genaue Diagnose erst im Krankheitsverlauf herauskristallisiert. Drittens mangelt es noch bei vielen Erkrankungen an spezifischen Parametern und diagnostischen Tests, die Krankheitsaktivität nachweisen. Laborchemisch wird nach unspezifischen und spezifischen Entzündungs- bzw. Erkrankungsparametern gesucht. Zu den spezifischen Parametern gehören u.a. Rheumafaktoren und spezielle Autoantikörper. Zu den unspezifischen Entzündungsparametern zählen die Blutsenkungsgeschwindigkeit (BSG), Akut-Phase-Proteine wie das C-reaktive Protein (CRP), Gerinnungs- und Komplement-Proteine, Alpha 1- und Alpha 2-Makroglobuline. Desweiteren sind Verschiebungen im Blutbild und der Serumeiweißelektrophorese relevant. Aus Erfahrungen weiß man, wie sich genannte Parameter bei bestimmten Krankheiten tendenziell ändern.


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Für einige rheumatische Erkrankungen gibt es inzwischen international anerkannte Kriterien zur Einschätzung von Schwere und Krankheitsaktivität, z.B. für den Systemischen Lupus Erythematodes den ECLAM-Score (European consensus lupus activity measurement). [Vitali et al. 1992] Solche Kriterien existieren aber nicht für alle rheumatischen Erkrankungen, so daß bei selteneren Erkrankungen die Einordnung uneinheitlich und schwierig bleibt.

All dies zeigt, wie problematisch es sein kann, Krankheitsaktivität zu erkennen, einzuschätzen und von nicht autoimmun bedingten Beschwerden, wie z.B. degenerativen Veränderungen, abzugrenzen.

Ableitung der Aufgabenstellung

Ausgehend von den genannten Tatsachen werden in dieser Arbeit erstmals folgende Fragen gestellt:

Treffen die Aussagen zur Zellaktivität, die an ruhenden und stimulierten Rattenthymozyten sowie humanen PBMC aus Buffy coats gewonnen wurden, ebenfalls auf aus Vollblut einer gesunden Population frisch präparierter PBMC zu?

Besteht eine Korrelation bioenergetischer Daten zu physiologischen und klinischen Zuständen? Sind die Ergebnisse ruhender Lymphozyten mit denen aus Vollblut gesunder Probanden vergleichbar?

Sind die Ergebnisse stimulierter Lymphozyten mit denen aus Vollblut entzündlich-rheumatisch erkrankter Patienten vergleichbar?

Unterscheidet sich das bioenergetische Profil von PBMC einer gesunden Population von dem der Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen?

Unterscheidet sich das bioenergetische Profil im Gesamtsauerstoffverbrauch, in der Stimulierbarkeit und (oder) hinsichtlich der sauerstoffverbrauchenden Prozesse?

Welchen Einfluß hat eine Glukokortikoidtherapie?


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Zur Beantwortung dieser Fragen haben wir die Versuchsgruppen wie folgt geplant:

  1. eine Gruppe gesunder Probanden mit einem intakten Immunsystem,
  2. eine Gruppe von Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Autoimmunerkrankung, die derzeitig inaktiv ist,
  3. eine Gruppe von Patienten, mit einer entzündlich-rheumatischen Autoimmunerkrankung, die derzeitig aktiv ist, mit Untersuchungen sowohl vor als auch nach Therapiebeginn, und
  4. als Kontrollgruppe, eine Gruppe von Patienten ohne bekannte Autoimmunerkrankung, aber mit einer aktiven Infektionskrankheit vor Therapiebeginn.

Bei den ersten zwei Gruppen nehmen wir ein nicht-aktiviertes Immunsystem an, bei den letzteren vermuten wir ein aktiviertes. Änderungen im Energiestoffwechsel entzündlich-rheumatisch erkrankter Patienten müßten durch fehlgeleitete Immunprozesse ausgelöst sein. Dagegen dürften sie bei Patienten mit einer Infektionskrankheit aus Prozessen zur gezielten Abwehr der entsprechenden Infektion resultieren. Wir vermuten daher, daß es Unterschiede im Energiestoffwechsel der PBMC beider Gruppen geben könnte. Durch die vergleichende Betrachtung beider Gruppen sollen mögliche Unterschiede herausgearbeitet werden.

Zusammenfassend formuliert soll die vorliegende Arbeit feststellen, ob sich aus den Untersuchungen charakteristische Veränderungen im Energiestoffwechsel aus Vollblut präparierter PBMC von Patienten erkennen lassen, die in Abhängigkeit vom Aktivitätsniveau entzündlich-rheumatischer Erkrankungen auftreten.

Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit Untersuchungen des Einflusses von Glukokortikoiden auf die Expression der cAMP-spezifischen PDE in humanen PBMC. Glukokortikoide wirken auf das Immunsystem antiinflammatorisch, immunsuppressiv, antiallergisch und antiproliferativ. [Hatz et al. 1998] Man geht davon aus, daß Glukokortikoide ihre Wirkungen über drei verschiedene Mechanismen vermitteln. [Buttgereit et al. 1998; Wehling et al. 1997] Dazu zählen die sehr gut erforschten genomische Wirkungen. Hierbei durchwandern die Glukokortikoide als lipophile Substanzen die Zellmembran und binden an einen zytosolischen Glukokortikoidrezeptor. Nach Bindung des Glukokortikoid-Rezeptorkomplexes an spezifische Stellen der DNA, kommt es zur Beeinflussung der Transkriptionsrate verschiedener Proteine. Aus dieser [Seite 12↓]resultiert letztendlich eine Expressionssteigerung, aber auch Inhibierung spezifischer Gene. Dabei kommt es z.B. zur gesteigerten Synthese des antiinflammatorisch wirkenden Lipocortin-1 [Goulding et al. 1993], zur verminderten Expression von z.B. gelenkzerstörenden Enzymen wie Kollagenase und Stromelysin oder proinflammatorischer Zytokine wie IL-6 und TNF-α. [Hatz et al. 1998]Darüber hinaus haben Glukokortikoide nicht-genomische Wirkungen, die man in spezifische und unspezifische unterteilt. Die nicht-genomischen Wirkungen entstehen ohne primäre Einbeziehung des Genoms, d.h. ohne primäre Beeinflussung der Transkription und Translation. [Schmid et al. 2000] Man geht davon aus, daß die innerhalb von wenigen Minuten auftretenden spezifischen nicht-genomischen Wirungen über membranständige Glukokortikoidrezeptoren vermittelt werden. Auf die Existenz dieser Rezeptoren weisen verschiedene Befunde hin. [Moore et al. 1994; Trueba et al. 1991; Edwardson et al. 1974] Dagegen treten die unspezifischen nicht-genomischen Wirkungen innerhalb von Sekunden bei höheren Glukokortikoiddosen auf. Bei ihnen kommt es, vermutlich über eine Interkalierung der Glukokortikoide in der Zellmembran, zu einem veränderten Kationenfluß und damit zur Beeinflussung des Energiestoffwechsels. [Buttgereit et al. 1997, 1993]

Neben der Beeinflussung der Zellmembranen läßt es sich nicht ausschließen, daß es noch andere Wirkungsmechanismen der Glukokortikoide gibt, die hemmend in die antigen-induzierte intrazelluläre Signalkaskade eingreifen und damit eine Aktivierung der Zellen verhindern. Es konnte gezeigt werden, daß in Anwesenheit von Glukokortikoiden die Konzentration von zyklischen 3`,5`-Adenosinmonophosphates (cAMP) innerhalb weniger Minuten in ruhenden Zellen ansteigt. [Wertenauer 2000] Zyklisches AMP spielt als second messenger eine zentrale Rolle in der hormonalen Regulation des Zellstoffwechsels. Es wird unter Einwirkung der Adenylatzyklase gebildet und durch eine spezifische Phosphodiesterase (PDE) abgebaut. Intrazelluläres cAMP ist ein bedeutender Regulator lymphozytärer Aktivität. [Banner et al. 1999; Ekholm et al. 1999; Seth et al. 1997] Mehrfach wurde für cAMP-erhöhende Substanzen ein immunsuppressives Potential nachgewiesen. Eine erhöhte cAMP-Konzentration kann aus einer Aktivierung der Adenylatzyklase und (oder) aus einer Hemmung der cAMP abbauenden PDE resultieren. [Banner et al. 1999; Hermsdorf et al. 1999; Conti et al. 1995] Das erhöhte cAMP könnte seinerseits die rezeptorvermittelte Signalkaskade blockieren und den Anstieg von Inositoltriphosphat und der intrazellulären Calziumkonzentration hemmen. [Eyster et al. 1998; Tamir et al. 1996; Conti et al. 1995] Bis heute ist der Zusammenhang, der zwischen einer Erhöhung des cAMP und Inkubation mit Glukokortikoiden besteht, ungeklärt. Es gibt aber Hinweise darauf, daß ein verminderter [Seite 13↓]Abbau von cAMP durch die Phosphodiesterase ursächlich ist. [Hermsdorf et al. 1999; Yingling et al. 1994; Elks et al. 1984]

Ziel dieser Arbeit ist es, mittels einer semiquantitativen PCR den Einfluß von Glukokortikoiden auf die Expression der cAMP-spezifischen PDE in PBMC zu untersuchen. Dazu wird die Menge an RNA-Sequenzen, die für die cAMP-spezifische PDE kodieren, vor und nach Inkubation mit einem Glukokortikoid bestimmt und verglichen.


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30.09.2004