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3  Ergebnisse

3.1 PBMC-Energiestoffwechsel von Probanden im Vergleich zu Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen

3.1.1 Gesamtsauerstoffverbrauch der PBMC im Vergleich zwischen den Gruppen

3.1.1.1 Probanden

Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war es, erstmalig den Normalbereich für den Gesamtsauerstoffverbrauch von humanen, frisch aus Vollblut präparierten PBMC im Ruhezustand zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden gesunde Probanden beiderlei Geschlechts untersucht, um eventuell vorhandene, geschlechtsspezifische Unterschiede nicht zu übersehen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3: Gesamtsauerstoffverbrauch ruhender PBMC von weiblichen und männlichen Probanden. Die MW wurden als Balken eingezeichnet.

Demnach betrug der Gesamtsauerstoffverbrauch der PBMC weiblicher Probanden 3,84 ± 0,14 nmol O2/min/107 Zellen (n=15) und bei den männlichen Probanden 3,85 ± 0,14 nmol O2/min/107 Zellen (n=15). Alle Angaben erfolgen in MW ± SEM. Der Unterschied zwischen beiden Gruppen ist statistisch nicht signifikant (p=0,971).Aus diesem Grund wurden im weiteren weibliche und männliche Probanden zu einer Gruppe zusammengefaßt, und es wurde für die folgenden [Seite 42↓]Experimente keine getrennte Betrachtung der Geschlechter mehr vorgenommen. Die PBMC gesunder Probanden im Alter zwischen 20-30 Jahren haben demnach einen Gesamtsauerstoffverbrauch von 3,84 ± 0,1 nmol O2/min/107 Zellen (n=30).

3.1.1.2 Patienten

Wir stellten uns nun die Frage, ob es Unterschiede im Gesamtsauerstoffverbrauch von PBMC zwischen Probanden und Patienten gibt. Zu diesem Zweck wurden zunächst Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung untersucht. Die Patienten hatten entsprechend den schon beschriebenen Kriterien entweder eine inaktive oder aktive Erkrankung. Die Patientengruppen setzten sich aus weiblichen wie auch männlichen Erkrankten zusammen. Zusätzlich wurde eine Kontrollgruppe von Patienten mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn untersucht. In der Abbildung 4 sind die erhaltenen Ergebnisse dargestellt. Als Vergleichskolumne wurde die Gruppe der gesunden Probanden in die Abbildung mit aufgenommen.

Abbildung 4: Gesamtsauerstoffverbrauch von Probanden und Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv, aktiv) bzw. mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn. Angegeben sind die MW und Anzahl der untersuchten Probanden und Patienten. Der SEM wurde eingezeichnet.


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Bei PBMC von Probanden lag ein Gesamtsauerstoffverbrauch von 3,84 ± 0,1 nmol O2/min/107 Zellen vor. Somit zeigte sich, daß die Atmung von PBMC bei Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung mit 4,18 ± 0,28 nmol O2/min/107 Zellen (n=16) etwas zunimmt, aber nicht signifikant höher als bei Probanden ist (p=0,157).

Bei Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung war der Gesamtsauerstoffverbrauch der PBMC mit 4,82 ± 0,33 nmol O2/min/107 Zellen (n=12) noch höher. Dieser Unterschied ist gegenüber der Gruppe der Probanden statistisch signifikant (p<0,001), nicht jedoch gegenüber der Gruppe der Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung (p=0,140).

Wir stellten uns die Frage, ob dieser erhöhte Gesamtsauerstoffverbrauch bei Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung durch die Therapie beeinflußt wird. Aus diesem Grund wurden alle Patienten mit einer aktiven Erkrankung auch im Verlauf unter Glukokortikoidtherapie untersucht. Wie in der Abbildung 4 zu sehen ist, kommt es nach einer 4-5 tägigen Behandlung mit Glukokortikoiden mit 3,84 ± 0,27 nmol O2/min/107 Zellen zu einem signifikanten Rückgang des Gesamtsauerstoffverbrauchs der PBMC (p=0,049). Als Vergleich, zu den in der vorliegenden Arbeit schwerpunktmäßig untersuchten Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung, wurden orientierend im Sinne einer Pilotstudie, auch 5 Patienten mit einer aktiven Infektionskrankheit vor Therapiebeginn untersucht. Die PBMC von Patienten mit einer akuten Infektion hatten einen Gesamtsauerstoffverbrauch von 5,1 ± 0,29 nmol O2/min/107 Zellen (n=5). Im Vergleich zu den anderen untersuchten Gruppen ist er am höchsten. Der Gesamtsauerstoffverbrauch der PBMC von Patienten mit einer Infektion ist gegenüber Probanden statistisch signifikant höher (p<0,001) und ohne signifikanten Unterschied zu Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung vor Therapiebeginn (p=0,591).

Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß der Gesamtsauerstoffverbrauch von PBMC gesunder Probanden den Verbrauch unter physiologischen Bedingungen darstellt. PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung haben offenbar einen etwas höheren Energiebedarf gegenüber Probanden. Dieser spiegelt sich in einem leicht erhöhtem Gesamtsauerstoffverbrauch wider. PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung haben den höchsten Gesamtsauerstoffverbrauch innerhalb der Gruppe der entzündlich-rheumatisch Erkrankten. Nach Therapie und Supprimierung der Krankheitsaktivität nimmt dieser wieder ab. Den größten Gesamtsauerstoffverbrauch überhaupt haben in unseren Untersuchungen PBMC von Patienten mit einer akuten Infektion.


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Wir schlußfolgern aus diesen Ergebnissen, daß der Sauerstoffverbrauch humaner, aus Vollblut präparierter PBMC von Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen offenbar den Aktivitätszustand der Erkrankung reflektiert. Diese Aussage scheint ebenfalls bei Aktivierung von Immunzellen durch eine Infektion zuzutreffen.

3.1.2 Stimulierbarkeit der PBMC im Vergleich zwischen den Gruppen

Im weiteren wurde die Frage nach der Reaktionsfähigkeit der PBMC auf eine definierte Stimulation aufgeworfen. Um die Reaktion auf eine antigene Stimulation zu simulieren, haben wir mit dem Mitogen Con A gearbeitet. Dabei wurde stets die gleiche Menge Con A verwendet und es wurde immer nach einer 2,9 minütigen Stimulation die Atmung gemessen. Im Unterschied zum Antigen kommt es beim Mitogen zu einer sehr stark ausgeprägten polyklonalen Stimulation, die mit der Sauerstoffelektrode exakt quantifizierbar ist. Die Stimulierung mit Con A hatte in allen Gruppen einen signifikant erhöhten Sauerstoffverbrauch der PBMC zur Folge (p≤0,001). Dieser ist in der Abbildung 5 dargestellt.

Die PBMC der Gruppe der Probanden hatten einen Sauerstoffverbrauch von 5,87 ± 0,17 nmol O2/min/107 Zellen, die der Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung von 6,33 ± 0,48 nmol O2/min/107 Zellen. Bei der Gruppe mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung betrug er vor der Therapie 6,33 ± 0,43 nmol O2/min/107 Zellen und nach der Therapie 5,66 ± 0,58 nmol O2/min/107 Zellen. PBMC von Patienten mit einer akuten Infektion hatten nach Stimulation einen Sauerstoffverbrauch von 8,00 ± 0,67 nmol O2/min/107 Zellen.


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Abbildung 5: Sauerstoffverbrauch der PBMC von Probanden und Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv, aktiv) bzw. mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn nach Stimulation mit Con A. Angegeben sind die MW und die Anzahl der untersuchten Probanden und Patienten. Der SEM wurde eingezeichnet.

Von besonderer Bedeutung ist die Differenz zwischen dem Gesamtsauerstoffverbrauch ruhender und dem stimulierter PBMC. Sie beschreibt die Stimulierbarkeit bzw. den absoluten Stimulationseffekt und entspricht dem Betrag, um den die Zellen unter unseren standardisierten Bedingungen ihren Sauerstoffverbrauch steigern können. Der Sauerstoffverbrauch nach Con A Stimulation ist in der Abbildung 6 als Absolutbetrag in nmol O2/min/107 Zellen und in der Abbildung 7 prozentual bezogen auf den basalen Gesamtsauerstoffverbrauch wiedergegeben. Aufgrund des verschieden hohen basalen Gesamtsauerstoffverbrauchs in den Gruppen, haben wir die prozentuale Stimulierbarkeit als beschreibenden Parameter zusätzlich angegeben. Wir können damit innerhalb der Gruppen die unterschiedliche Fähigkeit, den Sauerstoffverbrauch auf einen definierten Stimulus zu erhöhen, deutlicher aufzeigen.


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Abbildung 6: Con A-Stimulierbarkeit in nmol O2/min/107 Zellen von Probanden und Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv, aktiv) bzw. mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn. Angegeben sind die MW und die Anzahl der untersuchten Probanden und Patienten. Der SEM wurde eingezeichnet.

In der Gruppe der Probanden nahm der O2-Verbrauch um 2,03 ± 0,1 nmol O2/min/107 Zellen zu. Diese Zunahme entspricht einem Plus um 52,8 % bezogen auf den basalen Gesamtsauerstoffverbrauch.

Bei Patienten mit einer inaktiven entzündlich - rheumatischen Erkrankung wurde durch Con A eine signifikante Steigerung um 2,15 ± 0,28 nmol O2/min/107 Zellen hervorgerufen. Das entspricht einem Zuwachs um 52,0 % verglichen mit dem basalen Gesamtsauerstoffverbrauch. Die PBMC der Patienten mit einer inaktiven entzündlich - rheumatischen Erkrankung hatten zwar einen etwas höheren basalen Gesamtsauerstoffverbrauch, unterschieden sich aber weder absolut (p=0,602) noch prozentual (p=0,893) signifikant in ihrer Stimulierbarkeit von der Gruppe der Probanden. Die PBMC beider Gruppen sind somit unter unseren experimentellen Bedingungen in gleicher Weise in der Lage, ihren Gesamtsauerstoffverbrauch zu erhöhen.


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Abbildung 7: Con A-Stimulierbarkeit in % von Probanden und Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv, aktiv) bzw. mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn. Angegeben sind die MW und die Anzahl der untersuchten Probanden und Patienten. Der SEM wurde eingezeichnet.

Im Gegensatz dazu wurde der Sauerstoffverbrauch bei PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung vor Therapiebeginn durch Con A nur noch um 1,51 ± 0,33 nmol O2/min/107 Zellen gesteigert. Dies entsprach einem Zuwachs um nur 33,0 % verglichen mit dem Basalwert. Diese Werte sind absolut (p=0,044) und prozentual (p= 0,001) signifikant niedriger als bei Probanden. Verglichen mit den Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung ist diese Änderung statistisch jedoch absolut (p=0,136) und prozentual ohne Signifikanz (p=0,056), wenngleich der prozentuale Wert auf einen deutlichen Unterschied hinweist.

Nach der Glukokortikoidtherapie wurde der Sauerstoffverbrauch durch Con A um 1,82 ± 0,34 nmol O2/min/107 Zellen gesteigert, was ausgehend vom Basalwert einer Stimulierung von 45,0% entspricht. Damit nahm die Stimulierbarkeit bedingt durch die Glukokortikoidtherapie wieder zu, wenn auch nicht signifikant (p=0,418 / p=0,090).

Bei den zum Vergleich untersuchten PBMC von Patienten mit einer akuten Infektion wurde durch Con A eine signifikante Steigerung des Sauerstoffverbrauchs um 2,90 ± 0,49 nmol O2/min/107 Zellen hervorgerufen (n=5). Prozentual entsprach dies einer Stimulierung von 56,6%. [Seite 48↓]Damit reagieren die PBMC von Patienten mit einer akuten Infektion sowohl absolut als auch prozentual am stärksten auf einen definierten Stimulus verglichen mit allen anderen Gruppen in unserer Untersuchung. Der absolute Unterschied ist bezüglich den Probanden (p=0,005) und Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung (p=0,026) signifikant verschieden. Prozentual unterscheidet sich die Stimulierbarkeit jedoch nicht signifikant gegenüber den Probanden (p=0,500) und Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung (p=0,059).

Für diese Untersuchungen läßt sich zusammenfassend feststellen, daß sich die Stimulierbarkeit der PBMC bei Probanden und bei Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung in etwa gleich verhält. Bei den PBMC von Patienten mit einer aktiven-entzündlich rheumatischen Erkrankung ist sie deutlich und statistisch signifikant vermindert, nimmt aber nach Behandlung mit Glukokortikoiden wieder zu. Bei den untersuchten PBMC von Patienten mit einer akuten Infektion ist die Stimulierbarkeit am größten. Im Gegensatz dazu ist diese bei den Patienten mit einer aktiven-entzündlich rheumatischen Erkrankung am geringsten ausgefallen. Damit verhält sich die Stimulierbarkeit in beiden Gruppen anscheinend gegensätzlich.

Unsere Ergebnisse zeigen, daß sich offenbar auch aus der Stimulierbarkeit eine Aussage zur Aktivität entzündlich-rheumatischer Erkrankungen ableiten läßt. Die Daten belegen, daß mit zunehmender Aktivität der entzündlich-rheumatischen Erkrankung die Fähigkeit zur Stimulierung abnimmt.


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3.1.3  Hauptenergieverbrauchende Prozesse in ruhenden PBMC

3.1.3.1 Probanden

Aus den genannten Ergebnissen wurde deutlich, daß sich der Gesamtsauerstoffverbrauch der PBMC zwischen den einzelnen Gruppen unterscheidet. Bioenergetisch gesehen ist der Sauerstoffverbrauch ein umfassender Parameter, der nur eine grobe Auskunft über den Energiestoffwechsel gibt. Hinter ihm verbergen sich die ungekoppelte Atmung, der extramitochondriale Sauerstoffverbrauch und vor allem die verschiedenen energieverbrauchenden Prozesse. Zur Quantifizierung dieser Prozesse wurde das bioenergetische Profil von ruhenden PBMC erstellt. Dazu haben wir nach der im Material und Methoden-Teil beschriebenen Vorgehensweise den Verbrauch durch die Na+K+-ATPase, Ca2+-ATPase, Proteinsynthese und DNA/RNA-Synthese bestimmt, weil diese Prozesse aus früheren Untersuchungen als Hauptenergieverbraucher bekannt sind. [Schmid et al. 2000; Buttgereit et al. 1992, 1991] Wir haben die PBMC im Ruhezustand von Probanden und Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung bilanziert, während uns für die Untersuchungen der PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung nicht ausreichend Zellen zur Verfügung standen. Eine Bilanzierung von mitogen-stimulierten PBMC führten wir dagegen in allen Gruppen durch.

Wir bestimmten zuerst die hauptenergieverbrauchenden Prozesse in ruhenden Zellen bei Probanden. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 8 dargestellt. Der Gesamtsauerstoffverbrauch ruhender PBMC von Probanden betrug in dieser Experimentreihe 3,74 ± 0,13 nmol O2/min/107 Zellen (n=30) und ist somit ohne signifikanten Unterschied zu dem weiter vorn beschriebenen Wert für die Gesamtpopulation von 3,84 ± 0,1 nmol O2/min/107 Zellen (p=0,496). Die Na+K+-ATPase verbrauchte unter diesen Bedingungen 0,25 ± 0,15 nmol O2/min/107 Zellen (6,7%) und die Proteinbiosynthese 0,33 ± 0,18 nmol O2/min/107 Zellen (8,8%). Beide Prozesse zusammengefaßt ergeben einen Anteil von 0,58 nmol O2/min/107 Zellen (15,5%) am Gesamtsauerstoffverbrauch. Aufgrund dessen waren sie die wesentlichen energieverbrauchenden Prozesse in ruhenden PBMC der Probanden.

Die Hemmstoffe Lanthan und Actinomycin D rufen in ruhenden Zellen keine signifikante Hemmung des Sauerstoffverbrauchs vor. Daraus ist zu schlußfolgern, daß unter diesen Bedingungen weder die Ca2+-ATPase noch die DNA/RNA-Synthese von meßbarer bioenergetischer Bedeutung sind. Für Lanthan wurde sogar eine Steigerung des Sauerstoffverbrauchs beobachtet. Die Ursache für diesen Effekt ist bisher unklar.


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Abbildung 8: Sauerstoffverbrauch für ATP-verbrauchende Prozesse in ruhenden PBMC von Probanden (n=30). Dargestellt sind die MW. Die Standardabweichung wurde eingezeichnet.

Neben dem Sauerstoffbedarf der genannten ATP-Verbraucher wird in PBMC zusätzlich auch Sauerstoff für das Protonenleak und andere extramitochondrial gelegene Prozesse verbraucht. Dieser Verbrauch wird auch als ungekoppelte Atmung bezeichnet. Er wurde bereits früher in unserem Labor für ruhende PBMC mit einem prozentualen Bedarf von 16,85% bestimmt. [Schmid et al. 2000] Auf diese Untersuchungen angewandt errechnet sich ein Bedarf von etwa 0,63 nmol O2/min/107 Zellen.

Zusammenfassend können wir mit unseren Untersuchungen in PBMC von gesunden Probanden insgesamt 15,5% des Gesamtsauerstoffverbrauchs ATP-verbrauchenden Prozessen zuordnen. Das sind 0,58 nmol O2/min/107 Zellen und ergibt sich aus einem Verbrauch für die Na+K+-ATPase und Proteinsynthese. Hinter den verbleibenden 3,16 nmol O2/min/107 Zellen (84,5%) verbergen sich der ungekoppelte und der extramitochondriale Sauerstoffverbrauch sowie der Sauerstoffverbrauch, um die ATP-Bereitstellung für andere Prozesse zu sichern.


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3.1.3.2  Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung

Im weiteren wurden PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung unter ruhenden Bedingungen untersucht. Ihr leicht erhöhter Gesamtsauerstoffverbrauch ließ auf eine erhöhte Aktivität schließen. Somit stellte sich die Frage, ob diese Tatsache einen veränderten Umfang der einzelnen energieverbrauchenden Prozesse reflektiert. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 9 dargestellt.

Abbildung 9: Sauerstoffverbrauch für ATP-verbrauchende Prozesse in ruhenden PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung (n=15). Dargestellt sind die MW. Die Standardabweichung wurde eingezeichnet.

Der Gesamtsauerstoffverbrauch ruhender PBMC betrug in dieser Experimentreihe 4,29 ± 0,34 nmol O2/min/107 Zellen. Er ist damit ohne signifikanten Unterschied zu dem weiter vorn beschriebenen Wert von 4,18 ± 0,28 nmol O2/min/107 Zellen für die Gesamtpopulation der Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung (p=0,811).

Die Na+K+-ATPase wies unter diesen Bedingungen einen Sauerstoffverbrauch von 0,33 ± 0,46 nmol O2/min/107 Zellen (7,7%) auf. Die Proteinsynthese verbrauchte 0,38 ± 0,26 nmol O2/min/107 Zellen (8,9%). Beide Prozesse zusammengefaßt ergeben einen Anteil von 0,71 nmol O2/min/107 Zellen (16,6%) am Gesamtsauerstoffverbrauch und sind auch hier die wesentlichen energieverbrauchenden Prozesse in ruhenden PBMC. Die Na+K+-ATPase (p=0,410) und Proteinsynthese (p=0,428) unterscheiden sich in ihrem Verbrauch nicht signifikant zu den der Proban[Seite 52↓]den. Die Hemmstoffe Lanthan und Actinomycin D rufen in ruhenden PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung ebenfalls keine signifikante Hemmung des Sauerstoffverbrauchs hervor. Daher scheinen die Ca2+-ATPase und die DNA/RNA-Synthese auch hier nicht von meßbarer bioenergetischer Bedeutung zu sein. Für Lanthan wurde eine Steigerung des Sauerstoffverbrauchs beobachtet, deren Ursache noch ungeklärt ist.

Zusammenfassend können wir in PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung insgesamt 16,6% des Gesamtsauerstoffverbrauchs ATP-verbrauchenden Prozessen zuordnen. Das sind 0,71 nmol O2/min/107 Zellen und ergibt sich aus einem Verbrauch für die Na+K+-ATPase und Proteinsynthese. Hinter den verbleibenden 3,58 nmol O2/min/107 Zellen (83,4%) verbergen sich unter anderem der ungekoppelte und der extramitochondriale Sauerstoffverbrauch. Auf diese Untersuchungen angewandt, errechnet sich ein Bedarf von etwa 0,72 nmol O2/min/107 Zellen. Weiterhin besteht ein Bedarf für bisher unbekannte Prozesse. Aus dem Gesagtem ergibt sich kein wesentlicher Unterschied zu den für Probanden gefundenen Ergebnissen.

3.1.3.3 Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung und aktiven
Infektion

Für die Untersuchung ruhender PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung und Infektion standen nur bei wenigen Patienten noch ausreichend Zellen zur Verfügung. Orientierende Untersuchungen waren ohne richtungsweisende Unterschiede zu den Ergebnissen die wir bei den Probanden bzw. Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung gefunden haben.

3.1.3.4 Zusammenfassung

Schlußfolgernd ist festzustellen, daß sich PBMC von gesunden Probanden und Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung unter ruhenden Bedingungen, hinsichtlich der hauptenergieverbrauchenden Prozesse, qualitativ und prozentual nicht signifikant voneinander unterscheiden. In beiden Fällen sind als Hauptenergieverbraucher die Na+K+-ATPase und die Proteinsynthese zu identifizieren, während der ATP-Verbrauch für die Ca2+-ATPase und die DNA/RNA-Synthese nicht nachweisbar war. Der prozentual nicht zuzuordnende Sauerstoffverbrauch ist in beiden Gruppen fast identisch.


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3.1.4  Hauptenergieverbrauchende Prozesse in mitogen-stimulierten PBMC

3.1.4.1 Probanden

Die Ergebnisse haben gezeigt, daß sich die Stimulierbarkeit der PBMC zwischen den einzelnen Gruppen deutlich voneinander unterscheidet. Nach Untersuchung des bioenergetischen Profils von ruhenden PBMC, stellte sich die Frage, welche Unterschiede sich hinter der unterschiedlichen Stimulierbarkeit in den energieverbrauchenden Prozessen verbergen. Dazu haben wir nach der gleichen Methode den Verbrauch durch die Na+K+-ATPase, Ca2+-ATPase, Proteinsynthese und DNA/RNA-Synthese bestimmt. Diese Prozesse sind aus früheren Untersuchungen unter Con A Stimulation als Hauptenergieverbraucher bekannt. [Schmid et al. 2000; Buttgereit et al. 1991, 1992] Während ruhende PBMC nur von Probanden und Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung bilanziert wurden, erfolgte dagegen eine Bilanzierung von mitogen-stimulierten PBMC in allen Gruppen.

Im Kapitel 3.1.2 ist dargestellt, daß der Sauerstoffverbrauch unter Con A-Stimulation in allen Gruppen signifikant zunimmt. Im Anschluß daran wurde der Sauerstoffverbrauch nach mitogener Stimulation, durch Einsatz der selektiven Hemmstoffe, mit der beschriebenen Technik untersucht. Die Abbildung 10 zeigt die Ergebnisse für PBMC von Probanden. Vergleichend sind Daten ruhender PBMC von Probanden angegeben.

Der Sauerstoffverbrauch der Na+K+-ATPase und Proteinsynthese war absolut und relativ erhöht. Für die Ca2+-ATPase und DNA/RNA-Synthese war nach Stimulation überhaupt erst ein Sauerstoffverbrauch meßbar. Der Anteil der anderen ATP-verbrauchenden Prozesse nahm nach Stimulation ab. Während man ruhenden PBMC von Probanden nur etwa 15,5% ihres Sauerstoffverbrauchs ATP-verbrauchenden Prozessen zuordnen kann, sind es bei stimulierten PBMC 68,5%. Damit bestätigen die an PBMC von Probanden gewonnenen Ergebnisse die Beobachtungen, welche an PBMC aus Buffy coats und an Rattenthymozyten gewonnen wurden. [Schmid et al. 2000; Buttgereit et al. 1991, 1992]


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Abbildung 10: Aufteilung des absoluten Sauerstoffverbrauchs ruhender und stimulierter PBMC von Probanden (n=30). Angegeben sind die MW.

Nach Stimulation entfielen anteilmäßig auf die Na+K+-ATPase 0,94 ± 0,31 nmol O2/min/107 Zellen (16,01%), auf die Proteinsynthese 1,29 ± 0,46 nmol O2/min/107 Zellen (22%), auf die Ca2+-ATPase 1,23 ± 0,52 nmol O2/min/107 Zellen (21%) und auf die DNA/RNA-Synthese 0,56 ± 0,32 nmol O2/min/107 Zellen (9,5%). Der Verbrauch dieser Prozesse zusammen beträgt 4,02 nmol O2/min/107 Zellen. Demnach können 1,85 nmol O2/min/107 Zellen nicht zugeordnet werden. Das sind ca. 31,5% des Gesamtsauerstoffverbrauches unter Stimulation. Dahinter verbergen sich sowohl der ungekoppelte Sauerstoffverbrauch als auch das Protonenleak. Für den ungekoppelte Sauerstoffverbrauch wurde früher in unserem Labor ein Bedarf von 10,75% in stimulierten humanen PBMC bestimmt. [Schmid 2000] Daraus resultiert ein anteiliger Bedarf von etwa 0,63 nmol O2/min/107 Zellen. Berücksichtigt man diesen Verbrauch zusätzlich, so verringert sich der nicht zu identifizierende Sauerstoffverbrauch auf etwa 1,22 nmol O2/min/107 Zellen.


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3.1.4.2  Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung

Im weiteren wurden die Patienten mit einer inaktiven bzw. aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung, vor und nach Therapie, hinsichtlich des Sauerstoffverbrauchs durch die einzelnen Prozesse (Na+K+-ATPase, Ca2+-ATPase, Proteinsynthese und DNA/RNA-Synthese) unter mitogener Stimulation untersucht. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 11 dargestellt. Die Daten der Probanden wurden als Vergleich mit in die Abbildung aufgenommen.

Bei Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung entfielen anteilmäßig auf die Na+K+-ATPase 0,7 ± 0,79 nmol O2/min/107 Zellen (11,1 %), auf die Ca2+-ATPase 1,25 ± 1,05 nmol O2/min/107 Zellen (19,8 %), auf die Proteinsynthese 1,36 ± 0,87 nmol O2/min/107 Zellen (21,5 %) und auf die DNA/RNA-Synthese 0,37 ± 0,56 nmol O2/min/107 Zellen (5,8%). Zusammengefaßt können damit den hier bestimmten hauptenergieverbrauchenden Prozessen 3,68 nmol O2/min/107 Zellen an Sauerstoffverbrauch zugeordnet werden. 2,65 nmol O2/min/107 Zellen sind nicht identifizierbar. Das entspricht einem Wert von ca. 41,9%. Die PBMC unterscheiden sich nicht signifikant hinsichtlich ihres Sauerstoffbedarfes, durch die einzelnen Hauptenergieverbraucher, von den Probanden (p>0,05).

Bei Patienten mit einer aktiven Erkrankung vor Therapie entfielen anteilmäßig auf die Na+K+-ATPase 0,54 ± 0,60 nmol O2/min/107 Zellen (8,5%), auf die Ca2+-ATPase 0,75 ± 0,81 nmol O2/min/107 Zellen (11,8%), auf die Proteinsynthese 0,98 ± 0,74 nmol O2/min/107 Zellen (15,5%) und auf die DNA/RNA-Synthese 0,24 ± 0,32 nmol O2/min/107 Zellen (3,8%). Damit können 2,51 nmol O2/min/107 Zellen zugeordnet werden. 3,82 nmol O2/min/107 Zellen sind nicht zu identifizieren. Das entspricht einem Wert von ca. 60,3%.

Der Sauerstoffbedarf der Na+K+-ATPase (p=0,007), Ca2+-ATPase (p=0,032) und DNA/RNA-Synthese (p=0,011) ist signifikant geringer, als bei Probanden. Für den Verbrauch durch die Proteinsynthese konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (p=0,108). Die Unterschiede zu den Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung sind in allen Fällen nicht signifikant (p>0,05).


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Abbildung 11: Aufteilung des absoluten Sauerstoffverbrauchs stimulierter PBMC von Probanden (n=30) und Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv n=16, aktiv vor und nach Therapie n=12) und Infektion (n=5). Angegeben sind die MW.

Nach Therapie entfielen anteilmäßig auf die Na+K+-ATPase 0,45 ± 0,88 nmol O2/min/107 Zellen (8,0%), auf die Ca2+-ATPase 1,03 ± 1,02 nmol O2/min/107 Zellen (18,2%), auf die Proteinsynthese 0,97 ± 0,93 nmol O2/min/107 Zellen (17,1%) und auf die DNA/RNA-Synthese 0,39 ± 0,71 nmol O2/min/107 Zellen (6,9%). Damit können 2,84 nmol O2/min/107 Zellen zugeordnet werden. 2,82 nmol O2/min/107 Zellen sind nicht identifizierbar. Das entspricht einem Wert von 49,8%. Die aufgetretenen Änderungen sind jedoch im Vergleich zum Zeitpunkt vor Therapiebeginn statistisch nicht signifikant (p>0,05).


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3.1.4.3  Zusammenfassung

Aus diesen Ergebnissen ergeben sich für den Sauerstoffverbrauch, der hier untersuchten hauptenergieverbrauchenden Prozesse in mitogen-stimulierten PBMC von Patienten mit entzündlich-rheumatisch Erkrankungen im Vergleich zu Gesunden folgende Schlußfolgerungen:

1. Der Sauerstoffverbrauch für die Na+K+-ATPase, Ca2+-ATPase, Proteinsynthese sowie DNA/RNA-Synthese ist bei aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankungen in mitogen-stimulierten PBMC im Vergleich zu untersuchten Zellen der Kontrollgruppe der Probanden vermindert.

Der absolute Bedarf der Hauptenergieverbraucher am Gesamtsauerstoffverbrauch ist in PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung gegenüber Probanden nicht signifikant verändert. Dagegen ist er bei PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung vor Therapie für die Na+K+-ATPase, Ca2+-ATPase und DNA/RNA-Synthese signifikant und für die Proteinsynthese nicht signifikant vermindert. Nach Therapie und damit Verminderung der Entzündungsaktivität nahm der Verbrauch durch die Ca2+-ATPase, Proteinsynthese sowie DNA/RNA-Synthese nicht signifikant zu. Der Verbrauch durch die Na+K+-ATPase nahm weiterhin ab.

In der Summe erreichten diese Prozesse nicht die Höhe des Verbrauchs, als bei PBMC von Probanden und Patienten mit einer inaktiven Erkrankung.

2. Mit zunehmender Krankheitsaktivität nimmt der Sauerstoffverbrauch für solche Prozesse zu, die nicht zu den Hauptenergieverbrauchern gehören.

Die typischen Haupt-ATP-Verbraucher verwenden nach Stimulation bei Probanden etwa 4,02 nmol O2/min/107 Zellen (68,5%) der Energie. Bei Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung werden durch sie nur 3,68 nmol O2/min/107 Zellen (58,1%) und bei einer aktiven Erkrankung vor Therapie nur noch 2,51 nmol O2/min/107 Zellen (39,7%) der Energie verstoffwechselt. Nach Therapie nimmt ihr Verbrauch mit 2,84 nmol O2/min/107 Zellen (50,2%) wieder zu. In der Abbildung 12 ist der Sauerstoffverbrauch durch die 4 untersuchten Hauptenergieverbraucher vergleichend zu anderen sauerstoffverbrauchenden Prozessen einschließlich der ungekoppelten Atmung dargestellt. Da der Verbrauch für die ungekoppelte Atmung in unserem Labor mit ca. 10,75% bestimmt wurde, können wir diesen für die einzelnen [Seite 58↓]Gruppen näherungsweise errechnen. In der Abbildung 13 ist der uns bekannte Verbrauch der Hauptenergieverbraucher einschließlich ungekoppelter Atmung, vergleichend zu dem Verbrauch anderer, durch uns nicht bestimmbarer Prozesse, dargestellt.

Abbildung 12: Sauerstoffbedarf der Hauptenergieverbraucher vergleichend zum Umfang der ungekoppelten Atmung und anderer sauerstoffverbrauchender Prozesse mitogen-stimulierter PBMC von Probanden (n=30), sowie Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv n=16, aktiv vor und nach Therapie n=12) oder Infektion (n=5).


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Abbildung 13: Sauerstoffbedarf der Hauptenergieverbraucher, einschließlich des errechneten ungekoppelten Sauerstoffverbrauchs von 10,75%, vergleichend zum Umfang der anderen sauerstoffverbrauchenden Prozesse mitogen-stimulierter PBMC von Probanden und Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen oder Infektionen.

Damit läßt sich aus den Ergebnissen dieser Arbeit ableiten, daß sich die Aktivität entzündlich - rheumatischer Erkrankungen offenbar im PBMC Energiestoffwechsel reflektiert.

Kennzeichnend für Krankheitsaktivität ist der Anstieg von Prozessen, die nicht zu den Hauptenergieverbrauchern gehören.


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3.1.4.4  Patienten mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn

Bei Patienten mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn entfielen auf die Na+K+-ATPase 0,98 ± 1,21 nmol O2/min/107 Zellen (12,3%). Dieser Wert ist ohne signifikanten Unterschied zu dem der Probanden (p=0,913). Die Streuung der einzelnen Werte ist, allerdings im Unterschied zu allen anderen Gruppen, sehr groß. So konnte bei 2 Patienten kein signifikanter Verbrauch bestimmt werden, während er bei den anderen 3 Patienten mit 1,69 / 2,16 und 1,71 nmol O2/min/107 Zellen deutlich höher, als in den anderen Gruppen, war.

Ähnlich verhielt es sich bei dem Sauerstoffverbrauch durch die Ca2+-ATPase. Es wurde in dieser Gruppe ein Verbrauch von 1,32 ± 0,92 nmol O2/min/107 Zellen (16,5%) bestimmt. Dieser Wert liegt im Bereich des für PBMC von Probanden bestimmten und unterscheidet sich nicht signifikant von diesen (p=0,753). Ein signifikanter Sauerstoffverbrauch war in allen Fällen nachweisbar, ebenfalls mit einer hohen Streubreite. So betrugen die einzelnen Werte 2,15 / 0,32 / 2,05 / 0,32 und 1,76 nmol O2/min/107 Zellen.

Auf die Proteinsynthese entfielen durchschnittlich 1,58 ± 0,75 nmol O2/min/107 Zellen (19,8%). Dieser Wert ist nicht signifikant höher (p=0,236) als der Wert, der für PBMC von Probanden ermittelt wurde. Die Werte der fünf untersuchten Patienten betrugen 2,06 / 1,06 / 2,24 / 0,52 und 2,02 nmol O2/min/107 Zellen und weisen eine große Streuung auf.

Für die DNA/RNA-Synthese wurde ein durchschnittlicher Verbrauch von 0,78 ± 0,73 nmol O2/min/107 Zellen ermittelt (9,8%). Somit ist auch dieser Wert höher, aber ohne signifikanten Unterschied (p=0,253) zu dem der für PBMC von Probanden ermittelt wurde. Bei einem Patienten konnte kein signifikanter Sauerstoffverbrauch bestimmt werden und in den anderen Fällen betrug er 1,54 / 0,26 / 1,32 und 0,99 nmol O2/min/107 Zellen. Die Ergebnisse wurden bereits in der Abbildung 3.10 dargestellt. In dieser Gruppe sind 4,66 nmol O2/min/107 Zellen des Sauerstoffverbrauchs den Hauptenergieverbrauchern zuzuordnen. 3,34 nmol O2/min/107 Zellen sind nicht identifizierbar. Das entspricht einem Wert von ca. 41,7%.

Vergleichend zu den Hauptenergieverbrauchern von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung lassen sich ebenfalls keine signifikanten Unterschiede ableiten (p>0,05). Die Ergebnisse sind auf Grund der kleinen Zahl der untersuchten Patienten und großen Streubreite mit Zurückhaltung zu bewerten, berechtigen aber doch zur Ableitung der zuvor genannten Schlußfolgerungen. Hier müssen weitere Untersuchungen folgen.


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3.2  Glukokortikoideffekt auf die Expression der cAMP-spezifische PDE in humanen PBMC

3.2.1 Isolierung und Gelanalyse der Gesamt-RNA

Nachdem die RNA isoliert wurde, erfolgte eine qualitativ-optische Überprüfung der Proben mittels gelelektrophoretischer Auftrennung in einem 1 %igen Agarosegel. Die Abbildung 14 zeigt exemplarisch die zu erwartenen 18 S- und 28 S-rRNA-Banden.

Abbildung 14: Auftrennung der isolierten Gesamt-RNA einer Probe in einem 1%igen Agarosegel.

Anschließend erfolgte stets eine photometrische Reinheits- und Ausbeutebestimmung der gewonnenen RNA. Für die Konzentrationsberechnung wurde das mittlere Absorptionsmaximum bei 260 nm herangezogen. Der Reinheitsfaktor errechnete sich über den Quotienten A 260 / A 280. Die spektralphotometrische Auswertung ergab für alle extrahierten RNA-Proben einen Reinheitsfaktor von > 1,7.


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3.2.2  Einfluß von Glukokortikoiden auf die cAMP-spezifische PDE

3.2.2.1 Einfluß von Prednyliden und Dexamethason auf die cAMP-spezifische PDE

Es wurde der Einfluß von Prednyliden und Dexamethason auf die cAMP-spezifische PDE-Expression in PBMC mittels semiquantitativer PCR untersucht. Dazu wurden die PBMC vor Isolierung ihrer Gesamt-RNA mit und ohne Glukokortikoid für die verschiedenen Zeiten inkubiert. Die PBMC-Inkubation erfolgte für Prednyliden für 5, 30, 60, 90 und 120 Minuten und mit Dexamethason für 5, 60 und 120 Minuten.

Die Abbildung 15 zeigt exemplarisch die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte, bei einer Inkubationsdauer von 5, 30, 60, 90 und 120 Minuten für Prednyliden, im Vergleich zu Proben ohne Prednylideninkubation in einem 1 %igem Agarosegel. Für die GAPDH-Sequenzen ist der 28. Zyklus aufgetragen. Für die cAMP-spezifischen PDE-Sequenzen der 34. Zyklus. Um auf eine vergleichbare Effizienz der Amplifikation beider Primerpaare schließen zu können, wurden stets die Zyklen ausgewählt, die im linearen Bereich der PCR lagen und damit zum Vergleich der Proben verwendbar waren. Zu diesen Bedingungen wurden 3 PCR durchgeführt. Die Auswertung erfolgte stets als Doppelbestimmung aus 2 Gelen.

Abbildung 15: Gel mit den Banden der GAPDH nach dem 28.Zyklus und der cAMP-spezifischen PDE nach dem 34. Zyklus bei 800 bp. Aufgetragen sind jeweils hintereinander die Proben für 5, 30, 60, 90 und 120 min. In der oberen Reihe sind die Poben mit Prednylideninkubation und in der unteren Reihe ohne Prednylideninkubation zu sehen.


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Nach Auftrennung der PCR-Produkte im Agarosegel erfolgte die densitometrische Auswertung der ethidiumbromidgefärbten Banden und ein Abgleich auf die GAPDH-Sequenzen. Anschließend wurden die Mengen, die für die cAMP-spezifischen PDE-Sequenzen kodieren, zwischen den Proben mit und ohne Glukokortikoidinkubation sowie im Zeitverlauf verglichen. Dabei konnte keine signifikante Änderung der Expression der cAMP-spezifischen PDE zwischen den Proben mit und ohne Glukokortikoidinkubation nachgewiesen werden. Desweiteren ergab sich unter Glukokortikoidinkubation keine signifikante Änderung im Zeitverlauf über 120 Minuten. Dieses Ergebnis konnte im selben Zellansatz mit 2 weiteren PCR reproduziert werden. Die Inkubation der PBMC mit dem Glukokortikoid Dexamethason für 5, 60 und 120 min erfolgte in 2 weiteren Zellansätzen mit je 2 PCR. Sie ebenfalls ohne Effekt auf die Expression der cAMP-spezifischen PDE.

3.2.3 Spezifitätsnachweis

Um Hinweise auf die Spezifität der PCR zu erhalten, wurden die PCR-Produkte mit Restriktionsendonukleasen verdaut. In der Tabelle 4 sind die PCR-Produkte, ihre Länge in Basenpaaren, die verwendeten Restriktionsendonukleasen, sowie die Länge der größten resultierenden Fragmente in Basenpaaren aufgeführt. In der Abbildung 16 sind die amplifizierten PCR-Produkte sowie die durch den Verdau entstandenen DNA-Fragmente dargestellt. Da die PCR-Produkte und Restriktionsfragmente die vorausgesagten Längen aufweisen, legt das die Spezifität der für beide Primerpaare durchgeführten PCR nahe.

Tabelle 4: PCR-Produkte, verwendete Restriktionsendonukleasen sowie Längen der PCR-Produkte und Restriktionsfragmente in Basenpaaren (bp)

PCR-Produkte

Amplifikatlänge

(in bp)

Restriktionsenzyme

Fragmentlängen

(in bp)

cAMP-spezifische

PDE

730

Pst I

Ncol

178 / 552

307 / 423

GAPDH

797

Hind III

Hinf I

601 / 196

277 / 211 / 161


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Abbildung 16: Auftrennung der DNA-Fragmente nach der Verdauung mit Restriktionsendonukleasen zum Spezifitätsnachweis der PCR. Auf den Spuren 2-4 sind die Restriktionsfragmente des GAPDH durch Hind III und Hinf I sowie das unverdaute Produkt der GAPDH dargestellt. Auf den Spuren 5-7 sind die Restriktionsfragmente der cAMP-spezifischen PDE durch Pst I und Nco I sowie das unverdaute Produkt der cAMP-spezifischen PDE aufgetragen. In der Spur 1 und 8 befindet sich zur Orientierung der DNA Molecular Weight Marker IV. (La Roche, Mannheim, Deutschland)


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30.09.2004