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4  Diskussion

4.1 PBMC-Lymphozyten

Für die Untersuchungen dieser Arbeit wurden humane, aus Vollblut präparierte, periphere mononukleäre Zellen des Blutes (PBMC) verwendet. Diese setzen sich aus mindestens 80-90% Lymphozyten zusammen. Der restliche Anteil der PBMC besteht aus Granulozyten und Monozyten. Es wurde bewußt auf eine Zellseparierung verzichtet, da als Voraussetzung für eine optimale Stimulierung von T-Lymphozyten notwendige Zell-Zell-Kontakte zwischen den einzelnen PBMC-Fraktionen beschrieben wurden [Zempleni et al. 1999; Karlsson et al. 1997; Meskini et al. 1992].

Die Lymphozyten lassen sich in die Fraktionen der T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Natürliche-Killer-Zellen (NK-Zellen) unterteilen. In der Regel haben die mit ca. 75% vorkommenden T-Lymphozyten den größten Anteil, gefolgt von B-Lymphozyten mit ca. 15% und NK-Zellen mit ca. 10% [Janeway et al. 1997; Hatz et al. 1998]. Daraus ergibt sich, daß unsere hergestellte Zellsuspension zum überwiegenden Teil T-Lymphozyten enthielt.

T-Lymphozyten sind Vermittler der zellulären Immunität. Sie stammen von pluripotenten Zellen des Knochenmarks ab. Vorläufer T-Zellen wandern in den Thymus aus und werden dort immunologisch geprägt. Im wesentlichen unterscheidet man sie durch die Expression von Corezeptoren des CD3+ T-Zell-Rezeptorkomplexes in CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxische T-Zellen. Die CD4+-Zellen regen B-Lymphozyten zur Antikörperbildung an. Desweiteren fördern sie die Produktion spezieller Mediatorstoffe (z.B. INF-γ) und die zytotoxische Aktivität von CD8+ -Zellen, NK-Zellen und Makrophagen. Sie spielen damit eine zentrale Rolle bei entzündlichen, bakteriellen und parasitären Immunantworten. CD8+-Zellen vermitteln ihre Immunantwort durch zellmembranzerstörende Perforine oder auch durch Auslösung von Apoptose. Ihre Bedeutung liegt vor allem in der Abwehr viraler Infektionen und in der Bekämpfung von Tumoren.

B-Lymphozyten reifen ein Leben lang im Knochenmark und sind für die spezifisch humorale und sekundäre Abwehr zuständig. Nach Kontakt mit Antigenen können sie sich in Antikörper- sezernierende Plasmazellen umwandeln.

NK-Zellen sind lymphatische Nicht-T-Nicht-B-Zellen und auf die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität spezialisiert. [Janeway et al. 1997]


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4.2  Energiestoffwechsel in ruhenden PBMC

4.2.1 Gesamtsauerstoffverbrauch

Die anhand des Untersuchungsmodells gewonnenen Ergebnisse sind von den gewählten Versuchsbedingungen (Temperatur, Zeit der Äquibrilierung mit Sauerstoff), vom Inkubationsmedium der Zellen, d.h. den zugegebenen Substraten wie Aminosäuren und Glukose, sowie von der Menge der eingesetzten Hemmstoffe abhängig. Die genannten Versuchsbedingungen sind in der Vergangenheit an verschiedenen Zellsystemen getestet und optimiert worden und kamen so für die Untersuchungen in dieser Arbeit zur Anwendung. [Schmid et al. 2000; Buttgereit et al. 1992, 1991; Müller et al. 1986]

In dieser Arbeit wurde erstmalig der Normalbereich für den Gesamtsauerstoffverbrauch von frisch aus Vollblut präparierten PBMC bei Probanden bestimmt. Dabei konnte festgestellt werden, daß es zwischen männlichen und weiblichen Probanden keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Gesamtsauerstoffverbrauchs gibt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen darüber hinaus, daß die PBMC von gesunden Probanden den geringsten Gesamtsauerstoffverbrauch haben. Dieser erhöht sich bei PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung und nimmt weiter bei PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung zu. PBMC von Patienten mit einer aktiven Infektion vor Therapiebeginn haben in unseren Untersuchungen den höchsten Gesamtsauerstoffverbrauch aller Gruppen.

Damit gelang es anhand dieser Arbeit erstmalig zu zeigen, daß sich die Aktivität des Immunsystems auf zellulärer Ebene in der Atmung von PBMC niederschlägt. Der Gesamtsauerstoffverbrauch verändert sich offenbar in Abhängigkeit von der klinisch und laborchemisch eingeschätzten Aktivität entzündlich-rheumatischer und infektiöser Erkrankungen. Er erhöht sich mit zunehmender Krankheitsaktivität. Daher scheint sich der Gesamtsauerstoffverbrauch frisch aus Vollblut präparierter PBMC als ein guter Parameter zur Beurteilung der Aktivität des Immunsystems und somit auch von Krankheitsaktivität zu eignen.

Wie können diese Befunde erklärt werden?

Die Gruppe der Probanden steht für eine gesunde Population von Individuen mit einem normal aktivierten Immunsystem und repräsentiert mit 3,84 ± 0,1 nmol O2/min/107 Zellen einen Normbereich für den Gesamtsauerstoffverbrauch von PBMC.


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Bei den Patientengruppen mit einer inaktiven bzw. aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung ist grundsätzlich eine Autoimmunerkrankung mit einer ständigen Präsentation von Autoantigenen (körpereigene Proteine) vorhanden. Aus dieser resultiert eine chronische Aktivierung von T-Lymphozyten, die wiederum das Krankheitsgeschehen unterhält [Yocum et al. 1999; Van Noort et al. 1998]. Außerdem kommt es zu einem erhöhten Anteil autoimmun-aktivierter oder stimulierter Lymphozyten innerhalb der PBMC [Erkeller-Yüksel et al. 1993]. Diese Tatsache ist offenbar Ursache für unseren Befund, und daher konnten wir gegenüber Probanden einen nicht-signifikant erhöhten Gesamtsauerstoffverbrauch von 4,18 ± 0,28 nmol O2/min/107 Zellen bei PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung und einen signifikant erhöhten Gesamtsauerstoffverbrauch von 4,82 ± 0,33 nmol O2/min/107 Zellen bei PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung nachweisen. Der Gesamtsauerstoffverbrauch von PBMC unterscheidet sich somit innerhalb der Gruppe entzündlich-rheumatisch erkrankter Patienten und erhöht sich, wie in der Arbeitshypothese angenommen, mit zunehmender Aktivität der Erkrankung.

Die Patienten mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn stehen für eine Gruppe von bisher gesunden Individuen, die seit kurzem an einer aktiv verlaufenden Infektion leiden. Sie repräsentieren damit Patienten mit einem bisher völlig intaktem Immunsystem, welches daher adäquat zur Abwehr der Erreger reagieren sollte. Bedingt durch die Präsentation des infektiösen Agens sind die Lymphozyten aktiviert. Das schlägt sich in der vorliegenden Arbeit bei diesen Patienten im Gesamtsauerstoffverbrauch der PBMC nieder. Er beträgt 5,1 ± 0,29 nmol O2/min/107 Zellen und ist damit deutlich höher als bei Probanden. Interessanterweise ist der Gesamtsauerstoffverbrauch sogar noch höher als bei Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung. Einschränkend ist jedoch festzustellen, daß die untersuchte Gruppe nur orientierend im Sinne einer Pilotstudie untersucht worden ist und somit aus einer recht geringen Anzahl von Patienten besteht. Der Unterschied zwischen Patienten mit einer aktiven Infektion und Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung könnte möglicherweise durch eine unterschiedliche Dauer der Auseinandersetzung des Immunsystems mit dem antigenen Stimulus begründet sein. Bei Patienten mit einer akuten Infektion trat die Aktivierung neu durch die Infektion auf. Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung befinden sich im Schub und damit in einer Phase einer starken Aktivierung des Immunsystems. Im Unterschied zu den Infektionspatienten liegt aber eine latente und chronische Stimulierung des Immunsystems vor. Das wurde in den Ergebnissen im höheren Gesamtsauerstoffverbrauch der Patienten mit einer inaktiven Erkrankung sichtbar. Vielleicht ist das Immunsystem dieser Patienten, bedingt durch eine chronische Auseinandersetzung mit dem antigenen Agens, nicht mehr in gleicher [Seite 68↓]Weise in der Lage zu reagieren. In jedem Fall sollen zur Klärung dieser Frage weitere Untersuchungen an PBMC von Patienten mit akuten Infektionen folgen.

Wie wir also in dieser Arbeit gezeigt haben, ist der durch die Krankheitsaktivität erhöhte Energiebedarf der PBMC als erhöhter Gesamtsauerstoffverbrauch meßbar. Sicherlich bedingen eine Reihe verschiedener Prozesse den erhöhten Energiebedarf. So ist bekannt, daß Lymphozyten Energie zum einem für zelleigenen Funktionen, insbesondere für den Kationentransport und die Makromolekülsynthese, benötigen. Diese Prozesse sind von elementarer Bedeutung für das Überleben und Funktionieren der einzelnen Zelle, da sie durch sie das Zellvolumen regulieren und Zellwachstum steuern können. Desweiteren benötigen Lymphozyten aber auch Energie für ihre immunspezifischen Aufgaben. Dazu zählen unter anderem der Energieverbrauch für Zytokinese, Aktivierungsvorgänge, Antikörpersynthese oder auch Zytotoxizität. Granulozyten und Monozyten benötigen neben ihren Energiebedarf zur Aufrechterhaltung zelleigener Funktionen, Energie für immunspezifische Aufgaben. So verbrauchen sie Energie für Migrationsprozesse, Phagozytose oder für die Antigenverarbeitung und -präsentation [Buttgereit et al. 2000].

4.2.2 Hauptenergieverbrauchende Prozesse

Wie bereits festgestellt wurde, spiegelt der Gesamtsauerstoffverbrauch die Aktivität von zellulären energieverbrauchenen Prozessen wider. Um die gefundenen Unterschiede im Gesamtsauerstoffverbrauch zwischen den untersuchten Gruppen genauer analysieren zu können, war die Untersuchung der einzelnen Energieverbraucher nötig.

Als Hauptenergieverbraucher wurden in der Vergangenheit durch Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe an Lymphozyten als wichtige ATP-verbrauchende Prozesse die Na+K+-ATPase, Ca2+-ATPase, Proteinsynthese und DNA/RNA-Synthese identifiziert. Durch diese Prozesse sind für die Zelle elementare Funktionen wie Ionentransporte und Makromolekülsynthese gewährleistet. Der Energieumsatz durch sie kommt sowohl zelleigenen, als auch immunspezifischen Funktionen zugute [Buttgereit et al. 2000]. Die Untersuchungen wurden an verschiedenen Zellsystemen durchgeführt. So wurden beispielsweise Splenozyten vom Schwein (B-Lymphozyten), Rattenthymozyten (T-Lymphozyten) [Buttgereit et al. 1991, 1992] und PBMC gesunder Spender aus Buffy coats untersucht [Schmid et al. 2000]. Aufbauend auf diesen Arbeiten wurden die genannten Prozesse nun erstmals an frisch aus Vollblut präparierten PBMC von Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen bestimmt. Die Gruppe der Probanden und Patienten mit einer [Seite 69↓]inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung wurde unter ruhenden Bedingungen bilanziert. Das heißt, es wurde der Verbrauch durch die Na+K+-ATPase, Proteinsynthese, Ca2+-ATPase und DNA/RNA-Synthese auf den Gesamtsauerstoffverbrauch aufschlüsselnd ermittelt.

Der Sauerstoffverbrauch durch die Na+K+-ATPase betrug bei PBMC von Probanden 0,25 ± 0,15 nmol O2/min/107 Zellen (6,7%). Bei PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung war der Verbrauch mit 0,33 ± 0,46 nmol O2/min/107 Zellen (7,7%) nicht-signifikant höher. Somit konnte in beiden Gruppen ein in etwa gleich großer Sauerstoffbedarf für die Na+K+-ATPase festgestellt werden.

Die Na+K+-ATPase ist ein Transmembranprotein, welches in Plasmamembranen lokalisiert ist. Sie pumpt Na+ aus der Zelle heraus und K+ in die Zelle hinein, während gleichzeitig intrazelluläres ATP hydrolysiert wird. Sie dient der osmotischen Kontrolle des Zellwassergehaltes.

Es ist seit langem bekannt, daß Ouabain (g-Strophantin) die Na+K+-ATPase-Aktivität hemmt [Voet et al. 1992; Grinstein et al. 1989] und es wurde daher zur selektiven Blockierung dieser eingesetzt. Ouabain ist ein Wirkstoff, der aus den Blättern des Roten Fingerhuts gewonnen wird. Es hemmt die ATPase, indem es eine starke Bindung mit einem auf der Außenseite liegenden Teil des Enzyms eingeht und den transmembranösen Na+-Durchtritt nach extrazellulär verhindert. Vergleichend zu Untersuchungen an humanen PBMC aus Buffy coats konnten der Na+K+-ATPase 8% des Gesamtsauerstoffverbrauchs zugeordnet werden. Dieser Verbrauch scheint somit in humanen PBMC einen sehr stabilen Bedarf für die Na+K+-ATPase zu reflektieren.

Der Sauerstoffverbrauch durch die Proteinsynthese betrug bei PBMC von Probanden 0,33 ± 0,18 nmol O2/min/107 Zellen (8,8%) und bei PBMC der Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung 0,38 ± 0,26 nmol O2/min/107 Zellen (8,9%). Damit war auch hier in beiden Gruppen ein signifikanter Sauerstoffverbrauch feststellbar. Vergleichend zwischen beiden Gruppen ist der Verbrauch jedoch ohne signifikanten Unterschied. Damit ist für diesen Prozeß kein deutlich erhöhter Mehrbedarf bei PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung nachweisbar. Jeder Organismus oder jede Zelle enthält sehr viele Proteine mit unterschiedlichsten Funktionen. Diese Proteine werden beispielsweise als Biokatalysatoren (Enzyme), als Signalstoffe (z.B. Proteohormone), zur Abwehr als γ-Immunglobuline, als Transportproteine (z.B. Albumin) oder Strukturproteine gebildet. Jede Zelle synthetisiert also [Seite 70↓]ständig spezifische Proteine anhand ihrer genetischen Information. Durch die Translation wird die mRNA in die Aminosäuresequenz der Proteine übersetzt. Während der Translation inhibiert der eingesetzte Hemmstoff Cycloheximid die Peptidyl-Transferase, welche auf den Ribosomen die Übertragung der Peptidkette im Prozeß der Kettenverlängerung katalysiert. [Voet et al. 1992] Der Energiebedarf der Proteinsynthese ist hoch und wird ebenfalls durch Hydrolyse energiereicher Phosphatverbindungen bereitgestellt. Wie bereits in vorangegangenen Untersuchungen an humanen PBMC aus Buffy coats konnten hier der Proteinsynthese 8% des Gesamtsauerstoffverbrauchs zugeordnet werden. Damit scheint der Verbrauch für die Proteinsynthese in humanen PBMC einen sehr stabilen Bedarf an Energie zu besitzen.

Im Gegensatz zum Verbrauch durch die Na+K+-ATPase und Proteinsynthese war in beiden Gruppen in ruhenden PBMC für die Ca2+-ATPase sowie DNA/RNA-Synthese kein meßbarer Sauerstoffverbrauch zu bestimmen.

Die Ca2+-ATPase ist ebenfalls ein Transportprotein und ist in Plasmamembranen und im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert. Ca2+ fungiert als universaler second messenger und triggert zahlreiche Reaktionen in den Zellen, einschließlich der Ionentransporte, Bewegungen, Sekretion und Proliferation [Eyster et al. 1998; Grinstein et al. 1989]. Die Konzentration von Ca2+ -Ionen im Cytoplasma ist sehr gering und wird durch die ATP-abhängige Ca2+-ATPase ständig niedrig gehalten. Ein plötzlicher Anstieg des Ca2+ Spiegels durch Öffnung von Ca2+ Kanälen, die sich in der Plasmamembran oder in der Membran von Ca2+-Speichern innerhalb der Zelle befinden, kann durch Signalstoffe ausgelöst werden. Ein Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration führt jedoch zur Aktivierung der Ca2+-ATPase. Deren Aufgabe ist das Herauspumpen der Ca2+-Ionen aus der Zelle, um den Ausgangswert wieder herzustellen bzw. konstant zu halten.

Extrazelluläre Lanthan-Ionen blockieren kompetitiv membranständige Ca2+-Kanäle, ohne selbst die Zellmembran zu penetrieren [Kiss et al. 1994; Segal et al. 1986; Gorman et al. 1980]. Infolge dessen wird die Ca2+-ATPase funktionslos und auf indirekte Weise gehemmt.

In ruhenden PBMC zeigte sich in beiden Gruppen kein Hemmeffekt nach Zugabe von Lanthan. Somit konnte keine signifikante Aktivität der Ca2+-ATPase nachgewiesen werden. Im Gegenteil, es kam zu einer Zunahme des Sauerstoffverbrauchs nach Lanthanzugabe. Weshalb es zur Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs der ruhenden PBMC kommt, konnte bisher nicht restlos geklärt werden. Neben der Hemmung des Ca2+-Transports wurde in der Vergangenheit für Lanthan [Seite 71↓]auch die Fähigkeit zur Erhöhung der gekoppelten Atmung beschrieben. Möglicherweise steht die gemessene Zunahme des Gesamtsauerstoffverbrauchs im Zusammenhang mit dieser Wirkung. [Grivennikova et al. 1994]Das Ergebnis dieser Arbeit steht in Übereinstimmung mit Untersuchungen an humanen PBMC aus Buffy coats und anderen Zellsystemen. [Schmid et al. 2000; Buttgereit et al. 1992]

Für die DNA/RNA-Synthese konnte in ruhenden PBMC beider Gruppen ebenfalls kein signifikanter Sauerstoffverbrauch bestimmt werden. Damit konnten die Beobachtungen, welche an ruhenden PBMC aus Buffy coats und an Rattenthymozyten gewonnen wurden, reproduziert werden. [Schmid et al. 2000; Buttgereit et al. 1992] Offenbar synthetisieren ruhende PBMC zu Reparaturzwecken nur so wenig DNA und RNA [Carson et al. 1986; Seto et al. 1986; Kay et al. 1972], daß der Prozeß mit der angewandten Technik, aufgrund des geringen Umfangs, nicht erfaßt werden konnte. [Schmid et al. 2000] Jede Zelle synthetisiert ständig spezifische Proteine anhand ihrer genetischen Information. Nukleinsäuren sind für die Speicherung (Gene in Form von DNA) und Verarbeitung (u.a. messenger-, transfer-, ribosomale RNA) der genetischen Information von entscheidender Bedeutung. Zur Expression eines Gens, d.h. zur Synthese des entsprechenden Proteins, muß die Sequenzinformation der DNA in eine Proteinsequenz umgesetzt werden. Da die DNA nicht selbst an der Proteinsynthese teilnimmt, wird die Information aus dem Zellkern zum Ort der Proteinsynthese, den Ribosomen übertragen. Dazu wird zunächst durch Transkription der relevante Teil des Gens in eine messenger-RNA (mRNA) umgeschrieben. Das Antibiotikum Actinomycin D hemmt diesen Schritt, indem es die DNA interkaliert, d.h. sich zwischen zwei Basenpaare schiebt und somit das Ablesen der DNA als Matrize unterbricht. [Voet et al. 1992]

Wie die Ergebnisse zeigen, unterscheiden sich die PBMC von Probanden und Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung hinsichtlich der untersuchten Prozesse nicht. Wir konnten ableiten, daß in ruhenden PBMC beider Gruppen die Na+K+-ATPase und Proteinsynthese die hauptsächlich energieverbrauchenden Prozesse sind. Aufgrund des geringen oder nicht bestimmbaren Bedarfs der einzelnen Verbraucher, ist es wahrscheinlich schwierig, anhand dieses Untersuchungsmodells Unterschiede zwischen den Probanden und Patientengruppen nachweisen zu können. Um eventuell vorhandene Reaktionen und Unterschiede besser verdeutlichen zu können, wurden die gleichen Untersuchungen in allen Gruppen nach mitogener Stimula[Seite 72↓]tion vorgenommen. Zunächst stellt sich aber die Frage, welche Prozesse sich den restlichen, nicht in dieser Arbeit identifizierten Sauerstoffverbrauch verursachen?

Es ist anzunehmen, daß sich dieser Verbrauch einerseits durch denungekoppelten Sauerstoffverbrauch und andererseits durch verschiedene andere energieverbrauchende Prozesse zusammensetzt. Neben dem gekoppelten Sauerstoffverbrauch, der fest an die ATP-Synthese gebunden ist, existiert der ungekoppelte Sauerstoffverbrauch. Dieser ist hauptsächlich vom Protonenleak verursacht und entspricht dem Protonenfluß im Mitochondrium, der unter Umgehung der ATP-Synthase erfolgt. Er trägt nicht zur ATP-Bildung bei. Ihm wird eine Bedeutung in der Wärmeproduktion, der Reduktion von schädlichen freien Radikalen und der Produktion von Redoxäquivalenten zugesprochen. [Rolfe et al. 1997] Für diesen ungekoppelte Sauerstoffverbrauch wurde in unserem Labor für ruhende PBMC eine prozentualer Anteil von 16,85% bestimmt [Schmid et al. 2000]. Der ungekoppelte Sauerstoffverbrauch wurde zwar nicht in dieser Arbeit bestimmt, sein Umfang kann jedoch abschätzt werden. In jedem Fall verbirgt er sich mit hinter dem nicht identifizierten Sauerstoffverbauch.

Zu anderen intrazellulären ATP-verbrauchende Reaktionszyklen gehören beispielweise die Phosphorylierung von Enzymen [Yakura et al. 1998; Goldbeter et al. 1987] oder der Umsatz von Membranphospholipiden [Berney et al. 1995]. Ein weiterer Teil des unbekannten Sauerstoffverbrauchs läßt sich im Rahmen der immunspezifischen Funktionen vermuten und suchen. Diese Aussage wird dadurch belegt, daß ruhende PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung bzw. mit einer Infektion einen erhöhten Gesamtsauerstoffverbrauch hatten. So können Lymphozyten als Antwort auf entsprechende Signale in entzündete Gewebe auswandern [Janeway et al. 1997]. Diese Auswanderung wird durch lösliche Mediatoren gesteuert und durch den Grad der Aktivierung beeinflußt. Aktivierte T-Zellen wandern schneller als Ruhende. [Van Noort et al. 1998] Das Auswandern von Immunzellen aus der Blutbahn (Extravasation) zum Ort der Entzündung erfordert Energie [Bianchi et al. 1997]. Eine weitere beträchtliche Menge an ATP benötigen Lymphozyten für den Umbau ihres Zytoskeletts im Rahmen der Fortbewegung [Howard et al. 1997].

Lymphozyten benötigen Energie für Wachstum und Proliferation nach Aktivierung. Ein aktivierter Lymphozyt proliferiert, und durch eine klonale Expression entstehen spezifische Effektorlymphozyten. Die entstandenen Effektorzellen haben eine begrenzte Lebensdauer. Sie werden apoptotisch, wenn das Antigen nicht mehr vorhanden ist bzw. überleben und bilden die Grundlage des immunologischen Gedächtnisses [Janeway et al. 1997]. Zu den Effektorfunktionen zählen [Seite 73↓]die Synthese von Antikörpern, zellvermittelte Zytotoxizität und Regulationsfunktionen. Wahrscheinlich sind hier die Synthese von Antikörpern und Zytotoxizität die wichtigsten Energieverbraucher [Buttgereit et al. 2000]. Es gibt 3 funktionelle Klassen von T-Effektorzellen. Antigene, die von MHC-I-Molekülen präsentiert werden, werden von CD8+ Zellen erkannt, die zu zytotoxischen T-Zellen ausdifferenzieren. Antigene, die von MHC-II-Molekülen präsentiert werden, werden von CD4+ Zellen erkannt. Diese können sich dann in Th1 -Effektorzellen oder Th2 -Effektorzellen weiterentwickeln. Pathogene, die sich in großer Zahl in Vesikeln von Makrophagen ansammeln, induzieren gewöhnlich die Differenzierung von Th1-Zellen. Diese Zellen aktivieren die keimtötenden Eigenschaften von Makrophagen und regen B-Zellen zur Ig G-Antikörpersynthese an. Extrazelluläre Antigene stimulieren die Bildung von Th2-Zellen, die wiederum die Ig M-Antikörpersynthese stimulieren [Janeway et al. 1997].

4.2.3 Therapeutische Glukokortikoidwirkungen auf den Gesamtsauerstoffverbrauch

Der Gesamtsauerstoffverbrauch von Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen wurde vor und nach Glukokortikoidtherapie untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, daß infolge der Glukokortikoidbehandlung der Gesamtsauerstoffverbrauch in PBMC der untersuchten Patienten abgenommen hat. Mit 3,84 nmol O2/min/107 Zellen liegt er wieder in dem Bereich, den wir als physiologischen Verbrauch für die Probanden ermittelt haben. Ziele der Glukokortikoidbehandlung von Patienten mit Autoimmunerkrankungen sind eine Immunsupprimierung und „Eindämmung“ des überschießenden Entzündungsprozesses. Wir haben gefunden, daß der Gesamtsauerstoffverbrauch von PBMC mit zunehmender Aktivität der Erkrankung zunimmt. Nun zeigen unsere Ergebnisse, daß sich offenbar umgekehrt aus der Verlaufsbeobachtung des Gesamtsauerstoffverbrauchs auch eine Aussage über die therapiebedingte „Eindämmung“ der Aktivität und Verbesserung des klinischen Zustandes der Patienten ableiten läßt, indem der Gesamtsauerstoffverbrauch wieder abnimmt. Somit scheint sich der Glukokortikoideffekt in einer Abnahme des Gesamtsauerstoffverbrauchs gegenüber vor der Behandlung zu reflektieren.

Bekanntermaßen haben Glukokortikoide genomische und nicht-genomische Wirkungen, die den Zellmetabolismus beeinflussen [Buttgereit et al. 1998; Wehling et al. 1997]. Während genomische Effekte schon unter einer low-dose-Therapie auftreten, so werden nicht-genomisch spezifische Effekte bei mittleren und nicht-genomisch unspezifische Wirkungen erst bei hochdosierten [Seite 74↓]Therapien beobachtet. Nach einer vier bis fünf tägigen mittelhoch bis hochdosierten Glukokortikoidbehandlung müßten alle genannten Wirkungen zum Tragen gekommen und ebenso schon daraus folgende Effekte aufgetreten sein. Welche Wirkungen könnten an dem wieder verminderten Gesamtsauerstoffverbrauch beteiligt bzw. ihn mit verursacht haben?

Über genomische Wirkungen wird zum einen die Transkription von Genen initiiert, der die Synthese von Proteinen, wie beispielsweise Lipocortin-1 folgt. Lipocortin-1 hemmt die Phospholipase A2 und greift damit in die Arachidonsäurekaskade ein, wodurch die Synthese von Entzündungsmediatoren gehemmt wird [Goulding et al. 1993]. Zum anderen kommt es kernrezeptor-vermittelt zur Hemmung der Synthese verschiedener proinflammatorischer Zytokine wie TNF-α, IL-2 oder IL-6 [Buttgereit et al. 1995]. Diese Prozesse spielen eine Schlüsselrolle bei der „Eindämmung“ des Entzündungsprozesses und sind damit sicherlich von besonderer Bedeutung für das Ergebnis dieser Arbeit.

Da einige Patienten mit einer hoch dosierten Glukokortikoidtherapie behandelt wurden, sind bei diesen Patienten zusätzlich die nicht-genomischen unspezifisch physikochemischen Wirkungen zu diskutieren. Diesbezüglich konnte gezeigt werden, daß hohe Dosen von Methylprednisolon praktisch sofort den Sauerstoffverbrauch hemmen. [Buttgereit et al. 1993] In Untersuchungen an Mitochondrien wurde nachgewiesen, daß hohe Dosen von Methylprednisolon Reaktionen auf Ebene der oxidativen Phosphorylierung inhibieren. Daraus resultiert eine verminderte ATP-Bereitstellung und sekundär eine verminderte Atmung [Buttgereit et al. 1994; Martens et al. 1991].

Hohe Dosen von Glukokortikoiden induzieren Apoptose in peripheren Lymphozyten von Patienten mit schweren Autoimmunerkrankungen [Migita et al. 1997]. Es ist unklar, ob dieser Effekt durch nicht-genomische oder genomische Prozesse ausgelöst wird. So werden genomische Effekte über eine Modulation der Expression verschiedener Gene vermittelt. In diesem Rahmen wird eine verminderte Aktivität des Transkriptionsfaktor AP-1 (FOS/JUN) diskutiert, welcher für das Überleben von Zellen nötig ist. Auf der anderen Seite gibt es Hinweise auf eine verstärkte Expression von Genen, welche an der Auslösung des programmierten Zelltodes beteiligt sind. So wurde in diesem Rahmen eine verstärkte Expression von Sequenzen nachgewiesen, die mit dem P2X1 Rezeptor und einem IP3 Rezeptor korrespondieren [Buttgereit et al. 2000; Distelhorst et al. 1998].

Bei Apoptose, ausgelöst durch Glukokortikoide oder andere Vermittler, ist das mitochondriale Membranpotential erniedrigt [Kroemer et al. 1997], woraus wiederum eine verminderte ATP-[Seite 75↓]Verfügbarkeit resultiert [Petit et al. 1995]. Die angeführten Aspekte zeigen die Komplexität und Interferenz der Wirkungen von Glukokortikoiden auf humane PBMC. Alle die zuvor genannten und durch Glukokortikoide hervorgerufenen Prozesse können entweder zu einer direkten Hemmung der Atmung oder zu einer verminderten ATP-Verfügbarkeit führen. Der verminderte Gesamtsauerstoffverbrauch der PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung nach Glukokortikoidtherapie steht damit im Einklang zu diesen Erkenntnissen. Prinzipiell führen alle diskutierten Mechanismen letztendlich zu einer verminderten Aktivität von Immunzellen, was sich vier bis fünf Tage nach Einleitung der Glukokortikoidtherapie in einer wieder reduzierten und normalisierten Atmung widerspiegelt.

4.2.4 Therapeutische Glukokortikoidwirkungen auf hauptenergieverbrauchende
Prozesse

Die PBMC der Gruppe von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung wurden unter ruhenden Bedingungen nicht bilanziert, da nicht genügend Material zur Verfügung stand. Daher kann keine Aussage zum Umfang bzw. zur Änderung des Umfangs der einzelnen ATP-verbrauchenden Prozesse getroffen werden. Orientierende Untersuchungen haben gezeigt, daß es sich prinzipiell um dieselben Energieverbraucher handelt, die im Kapitel 4.2.2 beschrieben wurden. Die Ergebnisse blieben ohne richtungsweisende Hinweise auf eindeutige Veränderungen.


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4.3  Energiestoffwechsel in stimulierten PBMC

4.3.1 Stimulierbarkeit ruhender PBMC

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß die PBMC von gesunden Probanden und PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung sich in der Stimulierbarkeit nicht unterscheiden. PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung hatten die geringste und im Gegensatz dazu PBMC von Patienten mit einer aktiven Infektion vor Therapiebeginn die höchste Stimulierbarkeit aller Gruppen.

Damit gelang es anhand dieser Arbeit erstmalig darzulegen, daß sich die Stimulierbarkeit der PBMC in Abhängigkeit von der klinisch und laborchemisch eingeschätzten Aktivität entzündlich-rheumatischer Erkrankungen verändert. Zweitens konnten wir interessanterweise feststellen, daß sich aktivierte PBMC von Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung bzw. Infektion hinsichtlich der Stimulierbarkeit unterscheiden.

Con A wurde als definierter Stimulus eingesetzt und führte erwartungsgemäß in allen Gruppen zum Anstieg des Sauerstoffverbrauchs und damit zur Zellaktivierung. Es ist seit langem bekannt, daß die Inkubation von Lymphozyten mit Mitogenen zu einem Anstieg des Sauerstoffverbrauchs führt [Lakin-Thomas et al. 1988; Buttgereit et al. 1992; Guppy et al. 1993]. Das Lektin Con A ist ein Mitogen, das vornehmlich T-Lymphozyten stimuliert [Krauss et al. 1999]. Es bindet an eine Untereinheit des T-Zell-Rezeptors (TCR) [Chilson et al. 1989] und triggert über eine Vernetzung der TCR die intrazelluläre Signalkaskade. Im Ergebnis der Signaltransduktion kommt es zu einem Anstieg der Konzentrationen der sekundären Botenstoffe Ca2+, Inositoltriphosphat und Diacylglycerol. Diese Signale führen zur Synthese zahlreicher, verschiedener Proteine und münden in einer Aktivierung und Proliferation der Zellen. So kommt es beispielsweise zur Produktion von IL-2 und zur Expression des IL-2 Rezeptors [Grinstein et al. 1989]. Die Stimulierung durch Con A erfolgt im Gegensatz zur autoreaktiven Stimulation polyklonal und unspezifisch vom TCR. Damit führt sie nicht zu einem Aktivitätszustand, der dem von PBMC rheumatisch erkrankter Patienten entspricht. Die mitogene Stimulation mit Con A ist für unsere Untersuchungen von Vorteil, da mit ihr eine große Anzahl der Lymphozyten von der Stimulation erfaßt und entsprechende Folgereaktionen deutlicher hervorgehoben werden. Wie Experimente an Rattenthymozyten zeigen, lassen sich in Abhängigkeit von den Versuchsbedingungen bis zu 80% der isolierten Thymozyten innerhalb von Sekunden mit Con A stimulieren. [Krauss et al. 1999; Buttgereit et al. 1993]


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PBMC von gesunden Probanden konnten ihren Sauerstoffverbrauch um 2,03 ± 0,1 nmol O2/min/107 Zellen erhöhen. Diese Stimulation steht damit unter den standardisierten experimentellen Bedingungen für einen Referenzbereich, der Normalbedingungen präsentiert. Mit Con A können nun vergleichend unterschiedliche Reaktionsweisen und damit Zustände des Energiemetabolismus der Gruppen aufgedeckt werden. Als nächstes wurde festgestellt, daß sich der Sauerstoffverbrauch der PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung um 2,15 ± 0,28 nmol O2/min/107 Zellen stimulieren ließ. Damit unterscheidet er sich nicht-signifikant zu dem Wert, der für Normalbedingungen steht. Man kann also sagen, daß die PBMC beider Gruppen ihren Sauerstoffbedarf unter polyklonaler Stimulation mit Con A im gleichem Umfang erhöhen konnten. Daraus läßt sich schlußfolgern, daß PBMC einer inaktiven oder ruhenden entzündlich-rheumatische Erkrankung normal stimulierbar sind. Im Gegensatz dazu sind PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung nur noch um 1,51 ± 0,33 nmol O2/min/107 Zellen stimulierbar. Das ist deutlich weniger als normal. Die Patienten haben offenbar bedingt durch die Erkrankung ein schon voraktiviertes Immunsystem, was aus dem erhöhten Gesamtsauerstoffverbrauch der PBMC geschlossen werden konnte. Nun wurden die PBMC dieser Patienten zusätzlich mit Con A stimuliert. Das heißt, sie wurden noch einem zusätzlichen polyklonalen unspezifischen Stimulus unterworfen, um ihre verbliebene Reagibilität zu testen. Vermutlich konnten die PBMC aufgrund der erkrankungsbedingten starken antigenen Vorstimulation und Erschöpfung nun nicht mehr in gleicher Weise auf einen definierten Stimulus wie PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung und Probanden reagieren.

Die PBMC von Patienten mit einer akuten Infektion zeigten dagegen eine Stimulierbarkeit von 2,9 ± 0,49 nmol O2/min/107 Zellen. Damit nahm hier die Stimulierbarkeit gegenüber Normalbedingungen deutlich zu, während sie bei PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung abnahm. Beide Gruppen verhalten sich damit gegensätzlich bezüglich der Stimulierbarkeit.

Die nur orientierend untersuchte Kontrollgruppe der Patienten mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn bestand nur aus fünf Patienten. Dennoch zeigen die Ergebnisse deutliche Unterschiede zwischen den Gruppen auf. Der Hauptbefund besteht darin, daß die PBMC der Gruppe der Patienten mit einer akuten Infektion schon den höchsten Gesamtsauerstoffverbrauch aller Gruppen hatten und sich nun noch zusätzlich sehr stark mit Con A stimulieren ließen. Dieses Ergebnis wird noch eindrücklicher sichtbar, wenn man sich den Sauerstoffverbrauch nach Con [Seite 78↓]A-Stimulation vergegenwärtigt. Somit hatten PBMC von Probanden nach Con A-Stimulation einen durchschnittlichen Sauerstoffverbrauch von 5,87 nmol O2/min/107 Zellen, PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung einen von 6,33 nmol O2/min/107 Zellen und PBMC von Patienten mit einer Infektion einen von 8 nmol O2/min/107 Zellen. Damit wird gezeigt, daß die PBMC ihren Sauerstoffverbrauch grundsätzlich bis auf 8 nmol O2/min/107 Zellen und mehr steigern können und die Gruppen unterschiedlich aktivierbar sind.

Die Ursache des unterschiedlichen Verhaltens hinsichtlich der Stimulierbarkeit der Gruppen mit einem entzündlich-rheumatisch bzw. durch eine Infektion aktivierten Immunsystem ist unklar. Zur Klärung müssen weitere Untersuchungen vorgenommen werden. Eine mögliche Erklärung für das unterschiedliche Verhalten könnte die folgende sein: Patienten mit der Infektion hatten vor Ansteckung ein intaktes und nicht chronisch aktiviertes Immunsystem. Die PBMC arbeiteten daher vermutlich nicht an der „Grenze ihrer Möglichkeiten“, wie die der Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung. Sie konnten sich deshalb wahrscheinlich besser auf den Con A-Stimulus einstellen und ihren Sauerstoffverbrauch den Einflüssen adäquat anpassen. Somit würde man mit der Stimulierbarkeit eine Aussage zur verbleibenden Fähigkeit der PBMC treffen, auf einen antigenen Stimulus zu reagieren. Chronisch bzw. lange stark aktivierte PBMC könnten durch eine verminderte Stimulierbarkeit und akut sowie noch nicht so lange aktivierte PBMC durch eine normal / erhöhte Stimulierbarkeit gekennzeichnet sein. Es besteht aber genauso die Möglichkeit, daß es sich um unterschiedliche Reaktionsweisen beider genannter Gruppen handelt. In diesen Fall könnte die Stimulierbarkeit möglicherweise für die Diagnostik von Relevanz sein. Oft ist es bei entzündlich-rheumatisch Erkrankten schwierig zu unterscheiden, ob neu aufgetretene Beschwerden durch Krankheitsaktivität, degenerative Veränderungen oder eine Infektion verursacht sind.


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4.3.2  Hauptenergieverbrauchende Prozesse

Im nächsten Schritt wurde versucht zu klären, wie sich die hauptenergieverbrauchenden Prozesse unter mitogen-stimulierten Bedingungen bei PBMC von entzündlich – rheumatisch erkrankten Patienten verhalten. Das heißt, es wurde wieder der Verbrauch durch die Na+K+-ATPase, Proteinsynthese, Ca2+-ATPase und DNA/RNA-Synthese auf den Sauerstoffverbrauch, diesmal jedoch nach Zugabe von Con A aufschlüsselnd ermittelt.

Die Ergebnisse haben gezeigt, daß der Verbrauch durch die Na+K+-ATPase mitogen-stimulierter PBMC innerhalb der Gruppen unterschiedlich groß ist. Den größten Verbrauch hatten PBMC der Gruppe der Probanden. Dieser nahm in der Gruppe der PBMC von Patienten mit einer inaktiven gefolgt von denen mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung vor Therapie ab. Die Daten sind in der Abbildung 17 dargestellt.

Abbildung 17: Sauerstoffverbrauch der Na+K+-ATPase im Vergleich zwischen den Gruppen. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung. *signifikant unterschiedlich zur Gruppe der Probanden (p=0,007)


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Der absolute und prozentuale Bedarf der Na+K+-ATPase nimmt unter mitogener Stimulation zu [Schmid et al. 2000; Buttgereit et al. 1992]. Damit sind die Ergebnisse dieser Arbeit im Einklang mit früheren Untersuchungen. Die Gruppe der Probanden und Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung wurde unter ruhenden und stimulierten Bedingungen vollständig in ihrem ATP-Verbrauch quantifiziert. Die Na+K+-ATPase ruhender PBMC von Probanden und Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung hatte einen Verbrauch von 0,25 nmol O2/min/107 Zellen (6,7%) bzw. 0,33 nmol O2/min/107 Zellen (7,7%). Nach Stimulation lag er bei 0,94 nmol O2/min/107 Zellen (16%) bzw. 0,7 nmol O2/min/107 Zellen (11%). In unserem experimentellen Modell betrachten wir den Wert der für die Na+K+-ATPase unter Stimulation bei Probanden ermittelt wurde, als eine Art Referenzbereich und Normalverbrauch. Nach mitogener Stimulation kommt es zu Verschiebungen der zellulären Konzentrationen von Na+-, K+- und Cl-- sowie anderer Ionen. Außerdem existieren in Lymphozyten ladungsabhängige Natriumkanäle. [Gallin et al. 1991; Seligmann et al. 1990] Nach mitogener Stimulation wird in zahlreichen Studien ein erhöhter Natriumfluß über die Zellmembran entlang des chemischen Gradienten beschrieben, so daß getriggert durch einen Anstieg der intrazellulären Natriumkonzentration die Aktivität der Na+K+-ATPase zunimmt. Es ist eine zwei bis dreifach erhöhte Umsatzrate der Na+K+-ATPase beschrieben worden, die etwa für drei Stunden anhält und von einer erhöhten Anzahl (Expression) der Na+K+-ATPase-Moleküle in der Membran gefolgt wird [Buttgereit et al. 2000; Seligmann et al. 1990].

Neu war jedoch die Entdeckung, daß der Verbrauch an Energie durch die Na+K+-ATPase bei mitogen-stimulierten PBMC mit zunehmender Krankheitsaktivität tendenziell abnahm. So wurde durch sie bei der Gruppe der Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung nur noch 0,7 nmol O2/min/107 Zellen (11%) verstoffwechselt und bei Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung nur noch 0,54 nmol O2/min/107 Zellen (8,5%). Obwohl ihre Funktion zelleigenen wie auch immunspezifischen Funktionen zugute kommt, scheint die Na+K+-ATPase in ihrer Aufgabe restringiert. Die Ursache dafür ist jedoch noch unklar. Möglicherweise benötigen andere Prozesse höherer Priorität die Energie unter diesen Bedingungen, so daß die Na+K+-ATPase sekundär herabgeregelt wird. Denkbar ist aber auch eine direkte Verminderung der Na+K+-ATPase-Aktivität durch die Aktivität der Erkrankung.

Bei PBMC der Patienten mit einer Infektion war der absolute Verbrauch mit 0,97 nmol O2/min/107 Zellen (12,1%) in etwa dem der Probanden. Allerdings fiel eine außerordentlich hohe Streuung zwischen diesen Werten auf. Um hier eine genauere Aussage treffen zu können, müssen noch weitere Untersuchungen folgen.


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Ähnliches kann für den Verbrauch der Ca2+-ATPase berichtet werden. Die Ergebnisse zeigten, daß sich auch der Verbrauch der Ca2+-ATPase in PBMC der Gruppen ändert. Der Verbrauch ist bei der Gruppe der Probanden und Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung in etwa gleich und am größten. Bei PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung nimmt er ab. Die Daten sind in der Abbildung 18 dargestellt.

Abbildung 18: Sauerstoffverbrauch der Ca2+-ATPase im Vergleich zwischen den Gruppen. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung. *signifikant unterschiedlich zur Gruppe der Probanden (p=0,032)

Während in ruhenden Zellen kein signifikanter Verbrauch durch die Ca2+-ATPase nachgewiesen werden konnte, so war er nach mitogener Stimulation grundsätzlich vorhanden und in den einzelnen Gruppen unterschiedlich stark meßbar. Die Ca2+-ATPase hatte in humanen PBMC von gesunden Probanden einen anteiligen Verbrauch von 1,23 nmol O2/min/107 Zellen (21%) am Gesamtsauerstoffverbrauch. Unter mitogener Stimulation kommt es zu einer Zunahme des Energieverbrauchs durch die ATP-abhängige Ca2+-ATPase. Dieser erhöhte Sauerstoffverbrauch der Ca2+-ATPase nach mitogener Stimulation ist in der Vergangenheit mehrfach durch Arbeiten an Lymphozyten belegt und wurde hier erstmals für Patienten bestätigt. [Schmid et al. 2000; Buttgereit et al. 1992] Es ist bekannt, daß Con A in Lymphozyten zu einem anhaltenden Anstieg der [Seite 82↓]intrazellulären Calziumkonzentrationen führt und damit unmittelbar eine erhöhte Pumpaktivität der ATPase nach sich zieht [Lewis et al. 1995]. Ca2+ wirkt als universaler second messenger, und der Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration ist das essentielle Signal zum Anstoß vieler Effektorreaktionen. Aufgrund dieser Funktion dient der hohe Energieverbrauch der Ca2+-ATPase nach mitogener Stimulation der Wiederherstellung des Ionengradientens.

Wir können auch für die Ca2+-ATPase mit zunehmender Krankheitsaktivität einen tendenziell abnehmenden Sauerstoffverbrauch in stimulierten PBMC berichten. So betrug er bei PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung 1,25 nmol O2/min/107 Zellen (19,8%) am Gesamtsauerstoffverbrauch und bei Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung nur noch 0,75 nmol O2/min/107 Zellen (11,8%). Auch hier ist die Ursache noch unklar. Bei PBMC der Patienten mit einer Infektion war der Verbrauch mit 1,32 nmol O2/min/107 Zellen (16,5%) in etwa wie bei Probanden. Da eine recht hohe Streuung zwischen den einzelnen Werten auffällt, ist die Aussagekraft der Daten begrenzt.

In den Untersuchungen zum Verbrauch der Proteinsynthese in mitogen-stimulierten PBMC, wurde festgestellt, daß der Bedarf der Proteinsynthese in allen Gruppen durch Con A-Stimulation absolut und prozentual zunahm. Der Verbrauch ist in PBMC der Gruppe der Probanden und Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung in etwa gleich und nimmt bei PBMC von Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung ab. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 19 dargestellt.


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Abbildung 19: Sauerstoffverbrauch der Proteinsynthese im Vergleich zwischen den Gruppen. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung. Es bestehen keine signifikanten Unterschiede.

Für die DNA/RNA-Synthese war im Gegensatz zu ruhenden Bedingungen nur nach mitogener Stimulation ein signifikanter Sauerstoffverbrauch meßbar. Dieser war bei PBMC von Probanden am größten und nahm in der Gruppe der Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung ab. In PBMC der Gruppe der aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung war der Verbrauch am geringsten. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 20 dargestellt.


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Abbildung 20: Sauerstoffverbrauch der DNA/RNA-Synthese im Vergleich zwischen den Gruppen. Dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung. *signifikant unterschiedlich zur Gruppe der Probanden (p=0,011)

Damit verhalten sich humane PBMC von Patienten prinzipiell ähnlich, wie wir es aus früheren Experimente an stimulierten Rattenthymozyten und humanen PBMC aus Buffy coats kennen. [Schmid et al. 2000; Buttgereit et al. 1992] Aus diesen Experimenten ist bekannt, daß innerhalb von wenigen Minuten in stimulierten Rattenthymozyten und humanen PBMC von Buffy coats der Sauerstoffverbrauch durch die Proteinsynthese und DNA/RNA-Synthese in Abhängigkeit von der Stimulierung zunimmt. So hatten die Proteinsynthese und DNA/RNA-Synthese in humanen PBMC von Buffy coats unter optimaler Stimulation einen prozentualen Anteil von 14% und 8% am Gesamtsauerstoffverbrauch. In dieser Arbeit wurde er bei Probanden für die Proteinsynthese mit 1,29 nmol O2/min/107 Zellen (22%) und für die DNA/RNA-Synthese mit 0,56 nmol O2/min/107 Zellen (9,5%) bestimmt. Prinzipiell handelt es sich um gleichsinnige Veränderungen des Verbrauchs durch die Proteinsynthese und DNA/RNA-Synthese in den Gruppen, wie bei der Na+K+-ATPase und Ca2+-ATPase.

Untersuchungen von Lijnen et al. an PBMC, die auf dem Einbau radioaktiv markierter Isotope beruhen, bekräftigen die Zunahme neu gebildeter DNA, RNA und Proteine nach Inkubation mit Con A. [Lijnen et al. 1997] Die Stimulierung mit Con A führt zu einer Differenzierung und Proliferation der Lymphozyten. Über die Aktivierung verschiedener Transkriptionsfaktoren kommt [Seite 85↓]es zur Synthese und Sekretion zahlreicher Proteine, wie beispielsweise den Faktoren Interleukin-2 und -4 oder den inflammatorisch wirkenden Zytokinen Interleukin-1, -6, -8 und Tumor-Nekrose-Faktor. Infolge des Übertritts der Zellen aus der G0-Phase in die S-Phase des Zellteilungszyklus wird eine Neusynthese und Verdopplung der zellulären DNA induziert. Diese beschriebenen Effekte treten jedoch später auf als in unseren Experimenten. Daher vermuten wir einen sofortigen ATP-Verbrauch für vorangehende Prozesse, die direkt in die oben genannten einmünden. Dazu gehört zum Beispiel der Transport von Aminosäuren über Plasmamembranen. [Buttgereit et al. 2000]

Tendenziell konnte damit bei allen hauptenergieverbrauchenden Prozessen festgestellt werden, daß der absolute und (oder) prozentuale Bedarf durch die einzelnen Prozesse in Abhängigkeit von der Krankheitsaktivität entzündlich–rheumatischer Erkrankungen abnahm.

Wenn man die einzelnen Prozesse für jede Gruppe zusammenfaßt, sieht man, daß die typischen zelleigenen ATP-Verbraucher unter Stimulation bei Probanden etwa 4,02 nmol O2/min/107 Zellen (68,5%) der Energie verbrauchen. Dies entspricht unter unseren experimentellen Bedingungen einem Normwert. Das heißt, daß normalerweise die zelleigenen ATP-Verbraucher fast 70% der Energie verstoffwechseln. 30% des Sauerstoffverbrauchs stehen unter diesen Bedingungen dem ungekoppelten Sauerstoffverbrauch und „anderen Prozessen“ zur Verfügung. Bei Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung werden durch die untersuchten ATP-Verbraucher 3,68 nmol O2/min/107 Zellen (58,1%) und bei einer aktiven Erkrankung vor Therapie nur noch 2,51 nmol O2/min/107 Zellen (39,7%) der Energie verstoffwechselt.

Unter Berücksichtigung des ungekoppelten Sauerstoffverbrauchs, der in unseren Labor für mitogen-stimulierte humane PBMC aus Buffy coats mit 10,75% bestimmt wurde, liegt die entscheidende Beobachtung in der Zunahme des Verbrauchs durch andere Prozesse. Während der Probandengruppe unter mitogener Stimulation ca. 1,22 nmol O2/min/107 Zellen (20,8%) nicht zugeordnet werden konnte, so waren es in der Gruppe der Patienten mit einer inaktiven rheumatischen Erkrankung 1,97 nmol O2/min/107 Zellen (31,1%) und in der Gruppe der aktiv rheumatisch Erkrankten 3,14 nmol O2/min/107 Zellen (49,6%). Es läßt sich anhand des Modells der bioenergetischen Bilanzierung von humanen PBMC schlußfolgern, daß für Krankheitsaktivität der Anstieg des Energieverbrauchs für die anderen ATP-verbrauchenden Prozesse kennzeichnend ist.


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Welche Prozesse verbergen sich hinter diesen „Anderen“? Die Ergebnisse der Patienten mit einem aktivierten Immunsystem spiegeln sicher den Tatbestand wider, daß die durch Autoimmunprozesse aktivierten PBMC neben ihren generellen Funktionen in Abhängigkeit von ihrer Krankheitsaktivität einen zunehmenden Energieverbrauch für ihre überschießenden immunspezifischen Funktionen haben, da der Verbrauch der anderen Prozesse mit zunehmender Krankheitsaktivität zunahm. Im Zusammenhang damit fiel eine in Abhängigkeit von der Krankheitsaktivität verminderte Stimulierbarkeit auf. Wir interpretierten dies als bereits in Anspruch genommene Ausschöpfung von Stoffwechselleistungsreserven. Im Kontext mit diesen Beobachtungen zeigte sich desweiteren, daß die typischen zelleigenen ATP-Verbraucher deutlich weniger verstoffwechseln als gewohnt. Das legt die Vermutung nahe, daß diese Prozesse supprimiert ablaufen oder sogar für einen erhöhten Bedarf anderer eingeschränkt worden sind. Bei diesen anderen Prozessen handelt es sich am ehesten um die, welche wir schon für die ruhenden PBMC diskutiert haben. Desweiteren liegt es bedingt durch die Krankheitsaktivität nahe, daß immunspezifischen Funktionen einen Mehrbedarf in Anspruch nehmen. Zu diesen gehören beispielsweise Migration, Aktivierungsprozesse, aber auch Effektorfunktionen, wie Antikörpersynthese, Zytotoxizität und andere Regulationsfunktionen [Buttgereit et al. 2000; Hatz et al. 1998].

4.3.3 Therapeutische Glukokortikoidwirkungen auf den Gesamtsauerstoffverbrauch

Die Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung wurden mit Glukokortikoiden behandelt. Durch den Vergleich der Ergebnisse vor und nach Therapie konnten zwei wesentliche Effekte der Glukokortikoidtherapie herausgearbeitet werden. Wir haben mit 3,84 nmol O2/min/107 Zellen wieder eine Normalisierung des Gesamtsauerstoffverbrauchs und mit 1,82 nmol O2/min/107 Zellen eine teilweise wieder hergestellte Stimulierbarkeit verglichen mit dem Status Behandlungsbeginn nachgewiesen. Es wurde bereits diskutiert, daß nach einer vier bis fünf tägigen Behandlungsdauer alle genannten Wirkungen der Glukokortikoide zum Tragen gekommen und ebenso schon daraus folgende Effekte eingetreten sein müssen. Durch den damit systemisch „eingedämmten“ Entzündungsprozeß hat sich der Stoffwechsel der PBMC wahrscheinlich wieder normalisiert und dem eines nicht antigen-aktivierten angenähert. Glukokortikoide entfalten ihre Wirkungen schließlich nicht nur in Lymphozyten, sondern auch auf Fibroblasten in den vom Entzündungsprozeß betroffenen Geweben, auf Endothelzellen und andere Gruppen von Leukozyten. [Buttgereit et al. 1995]


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4.3.4  Therapeutische Glukokortikoidwirkungen auf hauptenergieverbrauchende
Prozesse

Der Effekt der Glukokortikoidbehandlung der Patienten auf die einzelnen sauerstoffverbrauchenden Prozesse war verschieden. Die Ergebnisse sind vergleichend zum Verbrauch vor der Behandlung in den Abbildungen 17-20 dargestellt.

Der Verbrauch durch die Na+K+-ATPase hat mit 0,45 nmol O2/min/107 Zellen (8%) weiter abgenommen. Im Gegensatz dazu nahm er bei der Ca2+-ATPase mit 1,03 nmol O2/min/107 Zellen (18,2%) wieder zu. Der Verbrauch durch die Proteinsynthese veränderte sich mit 0,97 nmol O2/min/107 Zellen (17,1%) gegenüber vor Behandlung nicht. Im Gegensatz dazu nahm er bei der DNA/RNA-Synthese mit 0,39 nmol O2/min/107 Zellen (6,9%) ebenfalls wieder zu.

Das verschiedene Verhalten der Prozesse unter Therapie ist unklar. Die beschriebenen Effekte sind jedoch ohne signifikanten Unterschied zu den Werten vor Therapie. Desweiteren fiel eine hohe Streuung zwischen den Werten auf. Diese hohe Streuung ist wahrscheinlich Ausdruck der unterschiedlichen klinischen Symptomatik der Patienten. Als wesentlich ist jedoch herauszustellen, daß alle vier Prozesse zusammen einen Verbrauch 2,84 nmol O2/min/107 Zellen (50,2%) hatten. Damit hat dieser absolut und prozentual wieder zugenommen und sich den Werten der Probanden etwas angenähert. 2,82 nmol O2/min/107 Zellen (49,8%) des Sauerstoffverbrauchs sind nicht den Haupt-ATP-Verbrauchern zuzuschreiben und wurden durch den ungekoppelten Sauerstoffverbrauch und vermutlich durch die schon diskutierten anderen Prozesse verstoffwechselt. Nach rechnerischer Berücksichtigung des ungekoppelten Sauerstoffverbrauchs würde sich für die anderen ATP-verbrauchenden Prozesse ein Bedarf von etwa 2,21 nmol O2/min/107 Zellen (39,0%) ermitteln lassen. Der reduzierte Verbrauch dieser anderen Prozesse reflektiert mit größter Wahrscheinlichkeit die klinische Besserung und Eindämmung des systemischen Entzündungsprozesses.


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4.4  In vitro - Glukokortikoideffekte auf die PDE - Expression

Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß nach einer vier bis fünf tägigen Glukokortikoidbehandlung der Patienten, sich der PBMC-Sauerstoffverbrauch wieder dem der Probanden angeglichen hat. Gleichzeitig nahm die Stimulierbarkeit wieder zu. Wir haben diese Ergebnisse als Eindämmung des Entzündungsprozesses infolge der Therapie betrachtet und erörtert.

Neben den beschriebenen Wirkungen über genomische und physikochemische Mechanismen, werden seit längerem ein Eingreifen der Glukokortikoide in die Signaltransduktion diskutiert. [Yingling et al. 94; Thoresen et al. 1989; Elks et al. 1984 Untersuchungen der Arbeitsgruppe Wertenauer [2000] und Parker [1973], zeigten, daß die Inkubation mit Glukokortikoiden in ruhenden und mitogen stimulierten Zellen innerhalb von Minuten zur Akkumulation von cAMP führen.

Intrazelluläres cAMP ist ein bedeutender Regulator der lymphozytären Aktivität und spielt damit eine Schlüsselrolle im Ablauf von Entzündungsprozessen. [Ekholm et al. 1999] Die Beinflussung des cAMP kann sowohl durch die cAMP bildende Adenylatzyklase als auch durch die cAMP abbauende cAMP-spezifischen PDE erfolgen. In der Vergangenheit konnte für verschiedene cAMP-erhöhende Substanzen und (oder) Medikamente eine inhibitorische Wirkung auf die Lymphozytenproliferation gezeigt werden. [Banner et al. 1999; Marcoz et al. 1993] Dies geschah beispielsweise für Prostaglandine, einem indirekten Aktivator, und für Forskolin, einem direkten Aktivator der Adenylatzyklase [Banner et al. 1999].

Es gibt seit längeren Hinweise darauf, daß Glukokortikoide zu einer verminderten Aktivität der cAMP abbauenden cAMP-spezifischen PDE führen. [Christoffersen et al. 1984; Elks et al.1984, Yingling, Thoresen] Jedoch ist es unklar, ob es sich dabei um ein direktes Eingreifen handelt oder ob es über verschiedene interferrierende Prozesse dazu kommt.

Wertenauer et al. [2000] nehmen an, daß sich die Glukokortikoide in höherer Konzentration in zelluläre Membranen einlagern (interkalieren) bzw. vermittelt durch membranständige Rezeptoren, sofort einsetzende Effekte auslösen, die in die Signaltransduktion eingreifen. Ein erhöhtes cAMP kann seinerseits die TCR-getriggerte Signalkaskade beeinflussen. [Ekholm et al. 1999; Eyster et al. 1998; Tamir et al. 1996; Conti et al. 1995, Skalhegg et al. 1994] Die Akkumulation des cAMP kann sowohl durch eine erhöhte Aktivität der cAMP bildenden Adenylatzyklase [Buc et al. 1993], als auch durch eine verminderte Aktivität der cAMP abbauenden cAMP-spezifischen PDE verursacht sein [El Bawab et al. 1997; Conti et al. 1995]. Wertenauer et al. [Seite 89↓][2000] vermuten aber, daß dieser Effekt durch die hemmende Wirkung der Glukokortikoide auf die cAMP-spezifische Phosphodiesterase verursacht wird. Dieser Glukokortikoideffekt müßte allerdings nicht-genomisch sein, da er innerhalb weniger Minuten auftritt, so daß die Einbeziehung des Genoms nicht möglich ist.

Daher haben wir über einen Inkubationszeitraum von 120 Minuten für PBMC ohne und mit Prednyliden bzw. Dexamethason die Expression der cAMP-spezifischen PDE untersucht. Dabei konnten wir bisher keine Veränderungen zwischen der Expression ohne und mit Glukokortikoidinkubation nachweisen. Desweiteren waren auch keine Veränderungen im Zeitverlauf, das heißt bei Inkubationszeiten von 5, 30, 60, 90 und 120 min für Prednyliden zu finden. Das selbe traf für Dexamethason für 5, 60 und 120 min zu. Dagegen wurde vor kurzem durch Hermsdorf et al. [1999] an Rattenhepatozyten durch Dexamethason eine verminderte PDE-Aktivität nachgewiesen. Diese trat sofort nach Inkubation und bei einer geringeren Dexamethasonkonzentration auf. Damit korreliert der dort beschriebene Effekt mit dem Zeitraum, in welchem Wertenauer et al. [2000] eine erhöhte cAMP-Konzentration, allerdins in humanen PBMC, nach Glukokortikoidapplikation messen konnte.

Somit lassen sich für humane PBMC und für die in dieser Arbeit untersuchten Konzentrationen sowie Inkubationszeiten keine Effekt auf die cAMP-spezifischen PDE nachweisen. Zur weiteren Klärung des Eingreifens der Glukokortikoide in die TCR-vermittelte Signalkette via Erhöhung der cAMP-Konzentration müssen weitere Untersuchungen folgen.


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30.09.2004