1  Einleitung

2  Material und Methoden

• 2.1 Probanden und Patienten

  • 2.1.1 Probanden

  • 2.1.2 Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung

    • 2.1.2.1  Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung

    • 2.1.2.2 Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung

  • 2.1.3  Einschätzung der Krankheitsaktivität entzündlich-rheumatischer Erkrankungen

    • 2.1.3.1 Rheumatoide Arthritis (RA)

    • 2.1.3.2  Systemischer Lupus Erythematodes (SLE)

    • 2.1.3.3  Polymyalgia arteriitica

    • 2.1.3.4 Morbus Behçet

    • 2.1.3.5  Progressive systemische Sklerose

    • 2.1.3.6 Mischkollagenose (MCTD)

    • 2.1.3.7 Sjögren - Syndrom

    • 2.1.3.8  Cogan-Syndrom

    • 2.1.3.9 RS3PE-Syndrom

  • 2.1.4  Patienten mit einer aktiven Infektionskrankheit vor Therapiebeginn

    • 2.1.4.1 Hepatitis A / B Infektion

    • 2.1.4.2 Infektiöse Mononukleose

    • 2.1.4.3 Erysipel

• 2.2  Gewinnung der PBMC und Herstellung der Zellsuspension

• 2.3 Messung des Sauerstoffverbrauchs

  • 2.3.1 Prinzip der Methode und Versuchsdurchführung

    • 2.3.1.1 Prinzip

    • 2.3.1.2  Versuchsdurchführung

  • 2.3.2  Concanavalin A und selektive Hemmstoffe

    • 2.3.2.1 Concanavalin A (Con A)

    • 2.3.2.2 Hemmstoffe

• 2.4  Semiquantitative PCR

  • 2.4.1 Prinzip der Methode

  • 2.4.2 Versuchsablauf

    • 2.4.2.1 Zellpräparation und Inkubation mit Glukokortikoiden

    • 2.4.2.2  Lysierung der PBMC und Isolierung der Gesamt-RNA

    • 2.4.2.3  Umschreibung der RNA in cDNA

    • 2.4.2.4  Einstellung der cDNA-Menge

    • 2.4.2.5 Amplifikation der cDNA

    • 2.4.2.6 Analyse der Amplifikationsprodukte

    • 2.4.2.7  Spaltung der DNA mit Restriktionsendonukleasen

• 2.5  Statistische Auswertungen

3  Ergebnisse

• 3.1 PBMC-Energiestoffwechsel von Probanden im Vergleich zu Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen

  • 3.1.1 Gesamtsauerstoffverbrauch der PBMC im Vergleich zwischen den Gruppen

    • 3.1.1.1 Probanden

    • 3.1.1.2 Patienten

  • 3.1.2 Stimulierbarkeit der PBMC im Vergleich zwischen den Gruppen

  • 3.1.3  Hauptenergieverbrauchende Prozesse in ruhenden PBMC

    • 3.1.3.1 Probanden

    • 3.1.3.2  Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung

    • 3.1.3.3 Patienten mit einer aktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung und aktiven Infektion

    • 3.1.3.4 Zusammenfassung

  • 3.1.4  Hauptenergieverbrauchende Prozesse in mitogen-stimulierten PBMC

    • 3.1.4.1 Probanden

    • 3.1.4.2  Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung

    • 3.1.4.3  Zusammenfassung

    • 3.1.4.4  Patienten mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn

• 3.2  Glukokortikoideffekt auf die Expression der cAMP-spezifische PDE in humanen PBMC

  • 3.2.1 Isolierung und Gelanalyse der Gesamt-RNA

  • 3.2.2  Einfluß von Glukokortikoiden auf die cAMP-spezifische PDE

    • 3.2.2.1 Einfluß von Prednyliden und Dexamethason auf die cAMP-spezifische PDE

  • 3.2.3 Spezifitätsnachweis

4  Diskussion

• 4.1 PBMC-Lymphozyten

• 4.2  Energiestoffwechsel in ruhenden PBMC

  • 4.2.1 Gesamtsauerstoffverbrauch

  • 4.2.2 Hauptenergieverbrauchende Prozesse

  • 4.2.3 Therapeutische Glukokortikoidwirkungen auf den Gesamtsauerstoffverbrauch

  • 4.2.4 Therapeutische Glukokortikoidwirkungen auf hauptenergieverbrauchende Prozesse

• 4.3  Energiestoffwechsel in stimulierten PBMC

  • 4.3.1 Stimulierbarkeit ruhender PBMC

  • 4.3.2  Hauptenergieverbrauchende Prozesse

  • 4.3.3 Therapeutische Glukokortikoidwirkungen auf den Gesamtsauerstoffverbrauch

  • 4.3.4  Therapeutische Glukokortikoidwirkungen auf hauptenergieverbrauchende Prozesse

• 4.4  In vitro - Glukokortikoideffekte auf die PDE - Expression

5  Klinische Relevanz der Ergebnisse

6  Zusammenfassung

Tabelle 1: Diagnosen und Anzahl der untersuchten Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen

Tabelle 2: Diagnosen und Anzahl der untersuchten Patienten mit einer akuten Infektionskrankheit

Tabelle 3: Primer zur Amplifikation der cAMP-spezifischen PDE und der GAPDH

Tabelle 4: PCR-Produkte, verwendete Restriktionsendonukleasen sowie Längen der PCR-Produkte und Restriktionsfragmente in Basenpaaren (bp)

Abbildung 1: Der zelluläre Energiestoffwechsel[Buttgereit et al. 2000]

Abbildung 2: Originalmessung zur Bestimmung des Sauerstoffverbrauches (O2) pro Zeiteinheit (t)

Abbildung 3: Gesamtsauerstoffverbrauch ruhender PBMC von weiblichen und männlichen Probanden. Die MW wurden als Balken eingezeichnet.

Abbildung 4: Gesamtsauerstoffverbrauch von Probanden und Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv, aktiv) bzw. mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn. Angegeben sind die MW und Anzahl der untersuchten Probanden und Patienten. Der SEM wurde eingezeichnet.

Abbildung 5: Sauerstoffverbrauch der PBMC von Probanden und Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv, aktiv) bzw. mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn nach Stimulation mit Con A. Angegeben sind die MW und die Anzahl der untersuchten Probanden und Patienten. Der SEM wurde eingezeichnet.

Abbildung 6: Con A-Stimulierbarkeit in nmol O2/min/107 Zellen von Probanden und Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv, aktiv) bzw. mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn. Angegeben sind die MW und die Anzahl der untersuchten Probanden und Patienten. Der SEM wurde eingezeichnet.

Abbildung 7: Con A-Stimulierbarkeit in % von Probanden und Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv, aktiv) bzw. mit einer akuten Infektion vor Therapiebeginn. Angegeben sind die MW und die Anzahl der untersuchten Probanden und Patienten. Der SEM wurde eingezeichnet.

Abbildung 8: Sauerstoffverbrauch für ATP-verbrauchende Prozesse in ruhenden PBMC von Probanden (n=30). Dargestellt sind die MW. Die Standardabweichung wurde eingezeichnet.

Abbildung 9: Sauerstoffverbrauch für ATP-verbrauchende Prozesse in ruhenden PBMC von Patienten mit einer inaktiven entzündlich-rheumatischen Erkrankung (n=15). Dargestellt sind die MW. Die Standardabweichung wurde eingezeichnet.

Abbildung 10: Aufteilung des absoluten Sauerstoffverbrauchs ruhender und stimulierter PBMC von Probanden (n=30). Angegeben sind die MW.

Abbildung 11: Aufteilung des absoluten Sauerstoffverbrauchs stimulierter PBMC von Probanden (n=30) und Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv n=16, aktiv vor und nach Therapie n=12) und Infektion (n=5). Angegeben sind die MW.

Abbildung 12: Sauerstoffbedarf der Hauptenergieverbraucher vergleichend zum Umfang der ungekoppelten Atmung und anderer sauerstoffverbrauchender Prozesse mitogen-stimulierter PBMC von Probanden (n=30), sowie Patienten mit einer entzündlich-rheumatischen Erkrankung (inaktiv n=16, aktiv vor und nach Therapie n=12) oder Infektion (n=5).

Abbildung 13: Sauerstoffbedarf der Hauptenergieverbraucher, einschließlich des errechneten ungekoppelten Sauerstoffverbrauchs von 10,75%, vergleichend zum Umfang der anderen sauerstoffverbrauchenden Prozesse mitogen-stimulierter PBMC von Probanden und Patienten mit entzündlich-rheumatischen Erkrankungen oder Infektionen.

Abbildung 14: Auftrennung der isolierten Gesamt-RNA einer Probe in einem 1%igen Agarosegel.

Abbildung 15: Gel mit den Banden der GAPDH nach dem 28.Zyklus und der cAMP-spezifischen PDE nach dem 34. Zyklus bei 800 bp. Aufgetragen sind jeweils hintereinander die Proben für 5, 30, 60, 90 und 120 min. In der oberen Reihe sind die Poben mit Prednylideninkubation und in der unteren Reihe ohne Prednylideninkubation zu sehen.

Abbildung 16: Auftrennung der DNA-Fragmente nach der Verdauung mit Restriktionsendonukleasen zum Spezifitätsnachweis der PCR. Auf den Spuren 2-4 sind die Restriktionsfragmente des GAPDH durch Hind III und Hinf I sowie das unverdaute Produkt der GAPDH dargestellt. Auf den Spuren 5-7 sind die Restriktionsfragmente der cAMP-spezifischen PDE durch Pst I und Nco I sowie das unverdaute Produkt der cAMP-spezifischen PDE aufgetragen. In der Spur 1 und 8 befindet sich zur Orientierung der DNA Molecular Weight Marker IV. (La Roche, Mannheim, Deutschland)

Abbildung 17: Sauerstoffverbrauch der Na+K+-ATPase im Vergleich zwischen den Gruppen. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung. *signifikant unterschiedlich zur Gruppe der Probanden (p=0,007)

Abbildung 18: Sauerstoffverbrauch der Ca2+-ATPase im Vergleich zwischen den Gruppen. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung. *signifikant unterschiedlich zur Gruppe der Probanden (p=0,032)

Abbildung 19: Sauerstoffverbrauch der Proteinsynthese im Vergleich zwischen den Gruppen. Angegeben sind der Mittelwert und die Standardabweichung. Es bestehen keine signifikanten Unterschiede.

Abbildung 20: Sauerstoffverbrauch der DNA/RNA-Synthese im Vergleich zwischen den Gruppen. Dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung. *signifikant unterschiedlich zur Gruppe der Probanden (p=0,011)