Kuner, Ruprecht: Identifizierung differenziell exprimieter Gene bei Brust- und Ovarialkarzinomen in den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Allgemeine Charakteristika von gynäkologischen Tumoren

Die gynäkologischen Tumore der Brust, des Ovars und des Genitaltraktes gehören zu den häufigsten Krebserkrankungen bei der Frau. Weltweit werden jährlich etwa
1 Mio. neue Fälle des Mammakarzinoms diagnostiziert, wobei allein in Deutschland 40.000 Frauen betroffen sind. Während sich die Heilungsaussichten beim Mammakarzinom aufgrund verbesserter Diagnostik erhöht haben, liegt die Sterberate beim Ovarialkarzinom vor allem wegen der späten Symptomatik im ersten Jahr bei über 50% (Statistisches Bundesamt 2001, Deutschland).

Die Epithelien als häufigstes Ursprungsgewebe der gynäkologischen Tumore unterliegen ständigen Veränderungen ihrer Proliferations- und Differenzierungsaktivität. Eine Deregulation dieser Vorgänge führt zur Transformation der gesunden Zelle in eine Tumorzelle. Diese Tumorzellen zeigen neue Eigenschaften wie ungehemmte Zellteilung, schwache Differenzierung, Unabhängigkeit vom Gewebeverband und Unsterblichkeit. Essentielle Signalwege für diese Eigenschaften sind der Zellzyklus und der programmierte Zelltod (Evan und Vousden, 2001). In den Tumorzellen lassen sich die genetischen Veränderungen schon an ihren Chromosomen erkennen. Es wurden sowohl Verluste als auch Vervielfältigungen der genomischen DNA in chromosomalen Regionen identifiziert, die wichtige regulatorische Gene, sogenannte Tumorsuppressorgene bzw. Onkogene beherbergen können. Aus diesen chromosomalen Aberrationen resultieren Veränderungen der Expression involvierter Gene, die für die Entstehung von Tumoren mitverantwortlich sein können.

Ein immer größer werdendes Netzwerk von Datenbanken, die exprimierte Sequenzabschnitte aus spezifischen Geweben enthalten, machen es möglich, das Expressionsmuster zwischen dem gesunden und dem Tumorgewebe zu vergleichen (Scheurle et al., 2000). Das Transkriptom zusammen mit den genomischen Sequenzdaten aus dem weltweiten humanen Genomprojekt stellen eine nützliche Grundlage dar, um neue tumorassoziierte Gene zu identifizieren. Ein Problem hinsichtlich der genetischen Charakterisierung von Tumoren ist die Heterogenität des Gewebes. Mit Hilfe verbesserter Technologien wie der lasergestützten Mikrodissektion lassen sich distinkte Areale im Tumor isolieren, die mit dem gesunden Gewebe auf molekularer Ebene verglichen werden können (Sirivatanauksorn et al. 1999). Da das Verhalten einer Zelle durch sehr komplexe Stoffwechselwege gesteuert wird, sind


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wahrscheinlich auch die Ursachen für eine Entartung sehr vielfältig. Die Involvierung einzelner Gene stellen dabei nur ein Puzzlestück im gesamten Prozess der Tumorentstehung dar. Ziel muss es sein, möglichst viele assoziierte Gene und beeinflusste Signalwege in den Tumorzellen zu identifizieren, um neue effektive Angriffsmöglichkeiten für eine verbesserte Diagnose und Therapie von Krebs zu finden.

1.1.1 Die Histopathologie des Mammakarzinoms

Das Mammakarzinom ist der häufigste diagnostizierte Tumor bei Frauen der westlichen Länder. In den USA wurde die Anzahl der Neuerkrankungen im Jahr 2000 auf 182.800 geschätzt. Die Anzahl der Verstorbenen lag bei 40.800, womit das Mammakarzinom die häufigste Todesursache aufgrund einer Tumorerkrankung bei Frauen darstellt (Cancer Facts & Figures 2000, American Cancer Society). Die Überlebensrate ist durch die verbesserte Diagnose des Tumors im frühen Stadium in den letzten Jahrzehnten deutlich gestiegen. Dazu haben intensivere Vorsorgeprogramme wie die routinemäßig durchgeführte Mammographie beigetragen. Das Mammakarzinom tritt gehäuft ab dem 50. Lebensjahr auf. Statistisch signifikant ist ein verringertes Risiko im Falle einer frühen Schwangerschaft der Frau, während die Einnahme oraler Kontrazeptiva als Risikofaktor kontrovers diskutiert wird (Pathak et al., 2000).

Das Ursprungsgewebe des Mammakarzinoms ist in den meisten Fällen das Epithel, das die Milchgänge der weiblichen Brust auskleidet. Sie unterliegen ständigem hormonellen Einfluss während des monatlichen Zyklus der Frau, in der Schwangerschaft und in der Menopause. Man unterscheidet in diesem Milchgangsystem die duktalen Anteile, die die kleineren und größeren milchabführenden Gänge (Duktuli) bilden und in die Mamille münden, von den lobulären Anteilen, die die feinen milchproduzierenden Endstrukturen (Lobuli) des Milchgangsystems darstellen (Abb.1). Die invasiven Brustkarzinome sind bezüglich ihrer klinischen und histologischen Erscheinung sehr heterogen. Bezogen auf den Ursprungsort werden beim Mammakarzinom das häufiger vorkommende invasiv duktale Karzinom (IDC; 70-80%) und das seltenere invasiv lobuläre Karzinom (ILC; 10-20%) mit subtypisierten Varianten diagnostiziert (De Vita: Cancer, Lippincott-Raven Publishers, 5th ed, 1997). Etablierte prognostische Faktoren sind Erkrankungsalter, menopausaler Status der Patientin, histologischer Typ und TNM-Status des Tumors sowie der Östrogenrezeptor (ER)- und Progesteronrezeptor (PR) -Status. Der TNM-Status beschreibt die Charakteristika des Primärtumor (T) und die Beteiligung regionaler Lymphknoten (N) sowie entfernter Metastasen (M) bei der Erkrankung


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(UICC Klassifikation; Hermanek et al., 1997). Alle genannten Faktoren erlauben die Abschätzung der längerfristigen Prognose und bestimmen das therapeutische Vorgehen wie die Operation, nachfolgende Chemo- oder Bestrahlungstherapien sowie Hormontherapie. Eine wichtiger Therapieansatz beruht auf dem Einfluss von Östrogen und Progesteron auf die Proliferation des Brustepithels. Durch Anti-Östrogene wie Tamoxifen wird die Signalübertragung auf den Östrogenrezeptor blockiert und die Entstehung von Rezidiven unterdrückt. Der Verlust der Anti-Östrogenwirkung ist für die Entstehung von Resistenzen mitverantwortlich und daher ein wichtiger prognostischer Faktor (Dahiya et al., 1998).

Abb. 1: Lobulus als milchproduzierende Endstruktur des Brustepithels

Die Entstehung und Progression des Mammakarzinoms wird durch eine Anhäufung genetischer Veränderungen erklärt. Frühe, meist nicht diagnostizierte Veränderungen sind benigne Läsionen im Epithel, sogenannte Hyperplasien, die aufgrund einer erhöhten Proliferationsrate auffällig werden. Die malignen in-situ Karzinome werden als unmittelbare Vorstufe des gefährlichen invasiven Mammakarzinoms gesehen. Das duktale in-situ Karzinom (DCIS) konnte als Prekanzerose bei 30% der Patientinnen mit malignem Mammakarzinom diagnostiziert werden (Fonseca et al. 1997). Bei dem selteneren invasiven lobulären Karzinom ist noch unklar, ob es aus dem lobulären in-situ Karzinom (LCIS) oder de-novo entsteht (Buerger et al., 2000). Eine weitere Eigenschaft der fortschreitenden Progression und wichtiger prognostischer Faktor ist die Metastasierung. Tumorzellen gelangen aus dem Ursprungsorgan über das Lymphsystem in andere Organe und bilden dort Metastasen. Das Auftreten von lokalen


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Metastasen in den axillären Lymphknoten wird bei der Entfernung des Primärtumors routinemäßig mituntersucht. Die Identifizierung von Fernmetastasen in weiteren Organen geht mit einer schlechteren Prognose einher.

1.1.2 Die Histopathologie des Ovarialkarzinoms

Das Ovarialkarzinom ist der zweithäufigste gynäkologische Tumor in den USA und in Europa. Die Zahl der Neuerkrankungen lag im Jahr 2000 in den USA bei 23.100 Fällen. Mit 14.000 Todesfällen im Jahr 2000 rangiert das Ovarialkarzinom an der fünften Stelle der Todesfälle aufgrund einer Tumorerkrankung. Das Risiko für ein Ovarialkarzinom steigt ab dem 40. Lebensjahr signifikant an (Cancer Facts & Figures 2000, American Cancer Society). Für die hohe Mortalitätsrate ist ein ungünstiger Verlauf dieser Karzinogenese verantwortlich. Gründe sind die Abwesenheit von Symptomen im Frühstadium, das Fehlen von diagnostizierbaren Läsionen des Ovarepithels und der Mangel an spezifischen und sensitiven Screeningverfahren. Im Falle eines detektierten Ovarialkarzinoms werden Primärtumor und mögliche vorhandene weitere Tumorherde im Intraabdominalraum entfernt und anschließend eine Strahlungs- oder Chemotherapie durchgeführt.

Das Ovarialkarzinom weist ein sehr umfangreiches histologisches Spektrum auf. Es entsteht aus dem Epithel, dem Stroma oder den Eizellen des Ovars. Die häufigen epithelialen Tumore (80-90%) werden nach der UICC Klassifikation in serös, muzinös, endometroid, Klarzell- und Brenner-Typ unterklassifiziert. Die Progression der Karzinogenese verläuft vom benignen Cystadenom über eine mögliche Zwischenstufe (Borderline-Tumor) zum malignen invasiven Karzinom. Prognostische Faktoren sind wie beim Mammakarzinom der histologische Typ des Tumors, der TNM-Status und das Alter der Frau. Als diagnostische Methoden werden die rektovaginale Untersuchung, der transvaginale Ultraschall und ein Radioimmunoassay mit dem Tumormarker CA125 durchgeführt. CA125 ist hinsichlich einer frühen Diagnose von geringer Bedeutung, korreliert jedoch nach der Therapie bei deutlich verringertem Serumspiegel mit
einer besseren Prognose für die Patientin (Mogensen et al., 1992). Die relative
5-Jahresüberlebensrate des invasiven Karzinoms von nur 50% im Vergleich zu 95% bei der Diagnose eines Borderline-Tumors unterstreicht die Notwendigkeit verbesserter diagnostischer Möglichkeiten.


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1.2 Genetik der gynäkologischen Tumore

Tumorerkrankungen treten entweder in erblicher oder sporadischer Form auf. Charakteristisch für die erbliche Form ist das frühe und in einer Familie gehäufte Auftreten des Tumors. Klassisch beschrieben am Beispiel des Retinoblastom (RB), einem Tumor der Netzhaut, liegt die Mutation eines Allels des RB-Gens in der Keimbahn vor. Tritt im Laufe des Lebens im zweiten Allel eine Deletion auf, die zum Verlust der Funktion des Tumorsuppressorgens in der betroffenen Zelle führt, kommt es zur Ausprägung des Retinoblastoms (Knudsen et al., 1971). Bei den Mammakarzinomen sind etwa 5% der Tumore familiären Ursprungs (Newman et al., 1988). Im Gegensatz zu anderen erblichen Tumorerkrankungen, die auf den Ausfall eines Gens zurückzuführen sind, wurden beim familiären Mammakarzinom Keimbahnveränderungen in unterschiedlichen Genen identifiziert. Bei einem großen Teil der Patientinnen wurden gehäuft Mutationen in den beiden Tumorsuppressorgenen BRCA1 und BRCA2 gefunden (Miki et al., 1994; Wooster et al., 1994; Blackwood et al., 1998). Mutationen des BRCA1 Gens und seltener des BRCA2 Gens sind neben dem Mammakazinom auch mit dem Auftreten des Ovarialkarzinoms assoziiert (Frank et al., 1998). Die familiären Fälle gynäkologischer Tumore und die Involvierung identischer Gene deuten auf gemeinsame Entstehungsmechanismen hin.

Die Mehrheit der gynäkologischen Tumore (90-95%) der Brust und des Ovars treten sporadisch auf und sind durch eine Vielzahl genetischer Veränderungen in den somatischen Zellen entstanden. Dabei wird hinsichtlich der Progression der Tumore von einer schrittweisen Ansammlung spezifischer genetischer Veränderungen ausgegangen, die das jeweilige Tumorstadium charakterisieren. Wie bei vielen anderen Tumoren wurden auch bei über 50% der Mamma- und Ovarialkarzinome Mutationen im Tumorsuppressorgen TP53 gefunden (Levine et al. 1997; Kupryjanczyk et al., 1993; Runnebaum et al., 1991). Weitere Gene, die im Zellzyklus wirken und die Proliferation der Zellen kontrollieren, zeigen in diesen Tumoren eine gesteigerte Expression. Das Onkogen MYC (Watson et al., 1993; Aunoble et al., 2000) und Cyclin D1 (Lammie et al. 1991; Barbieri et al., 1997) wirken während der G1-Phase und fördern die Zellteilung. ERBB2 reguliert als Rezeptor-Tyrosinkinase über eine Signalkaskade die Expression mitogen wirkender Gene und ist in gynäkologischen Tumoren überexprimiert (Slamon et al., 1989; Aunoble et al., 2000). Veränderungen auf DNA-Ebene können zum Verlust von Tumorsuppressorgenen führen oder die Amplifikation von Genen verursachen, die


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die Tumorentstehung fördern. Die Analyse aberranter chromosomaler Regionen durch Methoden wie LOH (’’Loss Of Heterozygosity’’), CGH (’’Comparative Genome Hybridization’’), Southern Blot Analyse und Karyotypisierung stellen zusammen mit der positionalen Klonierung eine Strategie zur Identifizierung von tumorassoziierten Genen dar.

1.2.1 Genetische Ursachen des sporadischen Mammakarzinoms

Um die primären genetischen Veränderungen im Verlauf der Tumorprogression zu identifizieren, werden die chromosomalen Aberrationen in den Tumoren untersucht. LOH- und CGH-Studien ergaben eine Vielzahl struktureller Aberrationen beim Mammakarzinom. In dem dargestellten Progressionsmodell wurden die chromosomalen Aberrationen hinsichtlich der Entwicklung des Tumors aus dem Mammaepithel über benigne Vorstufen zum malignen Karzinom in frühe und späte Ereignisse eingeordnet (Abb.2).

Abb. 2: Progressionsmodell des Mammakarzinoms am Beispiel des häufigsten duktalen Typs auf der Grundlage ausgewerteter Aberrationsstudien (Anhang: G3, Tab.27). Oben sind die histologisch differenzierbaren Stadien dargestellt, unten werden die Ereignisse chromosomaler Aberrationen wie Deletionen (-) und Amplifikationen (+) bestimmten Phasen der Tumorprogression zugeordnet.

Diesem Progressionsmodell liegen die Daten aus den LOH- und CGH-Studien zugrunde, die in den folgenden Erläuterungen zitiert werden einschließlich der im Anhang wiedergegebenen Referenzen (G3, Tab.27). Schon Zellen aus histologisch normalem Mammaepithel, die mit Hilfe der Mikrodissektion aus benachbarten Regionen


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von Tumoren isoliert wurden wiesen Deletionen in den Regionen 3p22-p25, 17p13 und 11p15 auf (Deng et al., 1996). Untersuchungen im Stroma von Tumoren ergaben in mikrodissezierten mesenchymalen Zellen Deletionen in 3p14, 11q21-q23, 16q23-q24 und 17q24 (Monifar et al., 2000). Die duktalen in-situ Karzinome (DCIS) zeigen zusätzlich ein sehr umfangreiches Spektrum weiterer Deletionen in 8p, 16q, 17q, 18p, 18q und 22q (Radford et al., 1995; O‘Connell et al., 1998; Kittiniyom et al., 2001). Die weniger häufigen lobulären in-situ Karzinome (LCIS) weisen ähnliche Aberrationen mit Deletionen in 16p, 16q, 17p, 22q und Amplifikationen in 6q auf (Lu et al., 1998). Bei den invasiven Karzinomen wurden in groß angelegten Studien die chromosomalen Aberrationen mit der Histologie des Tumors, Eigenschaften wie dem Grading, der Metastasierung, der Rezidiventstehung und der Prognose verglichen, um so Korrelationen zwischen genetischen Veränderungen und der Progression des Tumors aufzudecken (Hirano et al., 2001; Driouch et al., 1998; Schmutzler et al., 1997). Danach zeigen sich in den Regionen 3p14, 6q24-q27, 11q22-qter und 17q21-q24 gehäuft Verluste bei den invasiven Karzinomen höheren Grades. In den Vorgang der Metastasierung scheinen Gene in den häufig deletierten Regionen 1p22-p31, 9q, 15q und 16q22-q23 involviert zu sein. Das Auftreten von Rezidiven wird mit dem Vorhandensein von Deletionen in 3p14, 3p25, 8p12-p22, 13q12-q14, 17p13.1-p13.3 und 22q12 in Verbindung gebracht.

In den jeweiligen deletierten Regionen wurden Kandidatengene identifiziert, die in Brusttumoren eine verringerte Expression auf RNA- oder Proteinebene zeigten. Bei den Tumorsuppressorgenen TP53, CDH1 und FHIT wurden in Brusttumoren, neben dem Verlust des einen Allels, Mutationen im zweiten Allel gefunden, die für einen Funktionsausfall und eine Beteiligung an der Karzinogenese sprechen (Valgardsdottir et al., 1997; Berx et al., 1998; Kannan et al., 2000). In über 60% der Brusttumore wurden Amplifikationen von DNA-Abschnitten beschrieben (Hermsen et al., 1998; Lu et al., 1998; Courjal et al., 1997). In den amplifizierten Regionen stellen MYC, ERBB2,
Cyclin D1, FGFR1 und MDM2 bereits bekannte tumorassoziierte Gene dar. Die weitere Aufklärung der Abfolge von Ereignissen genetischer Veränderung während der Tumorprogression ist wichtig für das Verständnis der Tumorgenese auf molekularer Ebene und kann zur Identifizierung neuer prognostischer Marker dienen.


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1.2.2 Genetische Ursachen des sporadischen Ovarialkarzinoms

Das Epithel des Ovars ist häufigster Ursprung eines Ovarialkarzinoms. Bei der Progression des Tumors unterscheidet man benigne Vorstufen wie frühe Läsionen im Epithel (Adenome) und Borderline-Tumore, die sich zum malignen Karzinom entwickeln können. Häufig wird der Tumor erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert. In den verschiedenen Tumorstadien wurden eine Vielzahl chromosomaler Veränderungen identifiziert, die nach Auswertung von LOH- und CGH-Studien zu einem möglichen Progressionsmodell zusammengefasst wurden (Abb. 3).

Abb. 3: Progressionsmodell des epithelialen Ovarialkarzinoms mit den histologisch differenzierbaren Stadien auf der Grundlage ausgewerteter Aberrationsstudien (Anhang G3, Tab.28). Unten angegeben die Deletionen ( - ) bzw. Amplifikationen (+) in entsprechenden Phasen der Tumorprogression.

In benignen Tumoren des Ovars wurden Deletionen in 6q, 7p und 9p sowie Amplifikationen von K-RAS und ERBB2 (Roy et al., 1997; Link et al., 1996) nachgewiesen. Borderline-Tumore zeigten weitere Deletionen in 7q und 11q (Watson et al., 1998). Die malignen Ovarialkarzinome werden histologisch in mäßiggradige und höhergradige Tumore unterschieden, denen als Ursache bestimmte genetische Aberrationen zugeschrieben werden. Als frühe Ereignisse wurden Deletionen in 3p, 6p und 17p neben Amplifikationen in 12p und 17q identifiziert. Spätere Ereignisse, die in den höhergradigen Ovarialkarzinomen aufgedeckt wurden, sind Deletionen in 11p, 13q, 15q, 17q ,18q und 22q neben den häufigsten Amplifikationen in 1q, 3q, 8q und 20q (Saretzki et al., 1997; Sonoda et al., 1997). Dabei wurden in einigen Regionen Kandidatengene identifiziert, die bei der Entstehung des Ovarialkarzinoms eine Rolle spielen könnten. Tumore frühen Stadiums zeigten gehäuft Mutationen in TP53 und
K-RAS (Link et al., 1996). Trotz der gehäuften Deletionen in 17q scheint BRCA1 wie


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beim sporadischen Mammakarzinom keine wichtige Rolle bei der Entstehung des sporadischen Ovarialkarzinoms zu spielen (Futreal et al., 1994). Eine erhöhte Expression des ERBB2-Protoonkogens (17q) wurde in Vorstufen des malignen Ovarialkarzinoms gefunden, die für eine Involvierung in die frühe Karzinogenese spricht (Slamon et al., 1989). Das Kandidatengen AKT2 in der Region 19q war nach Southern Blot Analysen in 12% der untersuchten Ovarialkarzinome amplifiziert (Bellacosa et al., 1995). Im Gegensatz zum Brustkarzinom breitet sich das Ovarialkarzinom nicht nur über die Lymphgefäße aus, sondern invadiert häufig durch Ausdehnung in umliegende Organe des Peritonealraums ohne dass spezifische genetische Veränderungen hierfür bekannt sind. Innerhalb des Progressionsmodells wurden hinsichtlich einer früheren Diagnose und verbesserter Mortalitätsraten noch keine adäquaten Tumormarker evaluiert.

1.2.3 Charakterisierung der chromosomalen Region 1q32-q41

Die in dieser Arbeit näher untersuchte chromosomale Region 1q wird in CGH-Studien von Brust- und Ovarialkarzinomen häufig als amplifiziert beschrieben. Dabei zeigten sich in 40-75% der Brusttumore und 40% der Ovarialtumore Amplifikationen in 1q32-q41 (Tirkkonen et al., 1998; Benitez et al., 1997; Tapper et al., 1997; Sonoda et al., 1997). Mögliche Kandidatengene werden im Zusammenhang mit dem 1q32-Amplikon in verschiedenen Tumoren diskutiert. In einer CGH-Studie über squamöse Zellkarzinome des Ösophagus wurde die 1q-Amplifikation mittels FISH auf einen minimalen Bereich kartiert und der Transkriptionsfaktor ATF3 und das Zentromerprotein CENPF als amplifiziert identifiziert (Pimkhaokham et al., 2000). Das Gen für einen weiteren Transkriptionsfaktor ELF3 wurde in die Region 1q32 kartiert und zeigte sich im Lungenkarzinom, im Adenokarzinom und in verschiedenen Tumorzelllinien epithelialen Ursprungs überexprimiert (Tymms et al., 1997). Das epithelspezifisch exprimierte Gen ELF3 wurde mit der Regulation von Genen assoziiert, die bei späten Differenzierungsvorgängen eine Rolle spielen (Oettgen et al., 1999; Brembeck et al., 2000). Eine induzierte Überexpression von ELF3 in der Brusttumor-Zelllinie Hs578t zeigt eine Aktivierung des TGF-beta-Signalweges (Chang et al., 2000). Weitere tumorassoziierte Gene liegen in einem Gencluster in 1q32, dessen Mitglieder das Komplementsystem regulieren. Die Glykoproteine CD46/MCP und CD55/DAF inhibieren dabei das Komplementsystem über die C3-Konvertase. Die Tumorzellen könnten sich im Falle einer Überexpression der komplement-gekoppelten


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Immunantwort entziehen, wie am Beispiel des zervikalen Karzinoms gezeigt wurde (Simpson et al., 1997). Das Protein DAF besitzt zudem eine Bindungsstelle für CD97, einem Marker für Differenzierungsvorgänge und Lymphknoten-Involvierung beim Schilddrüsentumor (Hamann et al., 1998). Für Brust- und Ovarialkarzinome wurden validierte Onkogene innerhalb der Region 1q32-q41 bislang nicht beschrieben.

1.2.4 Charakterisierung der chromosomalen Region 11q12-q23

Die chromosomale Region 11q12-q23 wurde aufgrund der vielen Hinweise auf die Lokalisation tumorassoziierter Gene hinsichtlich der Entstehung von Brust- und Ovarialtumoren ausgewählt. Zahlreiche LOH- und CGH-Studien über Brusttumore beschreiben innerhalb 11q12-q23 Hot-Spot-Regionen, die gehäuft Amplifikationen und Deletionen zeigen (Tab.1). Dabei wurden in der Vergangenheit für einige der aberranten Regionen Gene identifiziert, die in der Entstehung dieser Tumore involviert sind. Proximal ist die Region 11q13 in vielen soliden Tumoren, als auch in Zelllinien häufig amplifiziert (Forozan et al., 1999). Das gut charakterisierte Gen Cyclin D1 (CCND1) und die weiter distal gelegenen Gene FGF4/HSTF1, FGF3/INT-2 und EMS1/Cortactin werden zum 11q13 Amplikon zusammengefasst, das in etwa 15% der soliden Brusttumore amplifiziert ist (Dickson et al., 1995; Schuuring, 1995). Dabei zeigten sich in einem großen Anteil der Tumore Koamplifikationen von CCND1, FGF3 und FGF4 (Borg et al., 1991; Karlseder et al., 1994), wobei auch unabhängige Amplifikationen von EMS1 in 7% der Tumore beschrieben wurden (Hui et al., 1997). In Ovarialkarzinomen korrelierte der Grad der Transformation mit einer übermäßigen Expression von FGF4, FGF3 und CCND1 (Schmitt et al., 1996; Barbieri et al., 1997). Eine weitere amplifizierte Region wurde weiter distal in 11q13.5-q14 einschließlich dem Kandidatengen GARP beschrieben, das in 12% der untersuchten Brusttumore amplifiziert war (Karlseder et al., 1994; Szepetowski et al. 1992b).

Neben den beschriebenen Amplifikationen konnte in der Region 11q13 auch LOH in
23-67% der untersuchten Brusttumore nachwiesen werden (Gudmundsson et al., 1995; Zhuang et al., 1995). In dieser Region wurde das potenzielle Tumorsuppressorgen BRMS1 identifiziert, das nach Transfektion in der Brusttumor-Zelllinie MDA-MB-231 die Metastasierung hemmt (Seraj et al., 2000). Als schon bekanntes tumorassoziiertes Gen in 11q13 ist MEN1 mit einem familiären Syndrom multipler endokriner Neoplasien Typ 1 assoziiert, wobei keine Korrelation zu gynäkologischen Tumoren nachgewiesen wurde. In zahlreichen Studien wurden mittels unterschiedlicher STS-Marker innerhalb der


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Region 11q14.1-q23.3 gehäuft LOH in Brusttumoren beschrieben. Dabei ergaben sich eine Reihe von auffälligen Loci, in denen Tumorsuppressorgene vermutet jedoch noch nicht identifiziert wurden. Proximal in 11q22.1 konnte in etwa 40% der untersuchten Brusttumore LOH nachgewiesen werden (Koreth et al., 1997 ; Negrini et al., 1995).

Tab. 1: Die LOH- und Amplifikationsstudien bei Brusttumoren in der chromosomalen Region 11q12-q23 sind durch die deletierten (LOH) oder amplifizierten (Amp) Loci, die Häufigkeit der Aberration und der Fallzahlen aufgelistet. Die verschlüsselten Literaturstellen sind im Anhang (G.2, Tab.25) wiedergegeben.

Gen / STS-Marker

Lokalisation

Aberration

Studien mit primären Brustkarzinomen

Ratio

Fallzahlen

Referenzen

GSTP1

11q13.4

Amp

5%

13 / 239

1

D11S97

11q13.4

Amp

17%

86 / 514

1, 2

Cyclin D1

11q13.4

Amp

15%

373 / 2451

1 - 8

CCND1 / FGF3

 

Amp

16%

317 / 1993

9 - 12

FGF4

11q13.4

Amp

14%

231 / 1632

1, 4, 8, 13 - 16

FGF4 / FGF3

 

Amp

17%

49 / 292

17

FGF3

11q13.4

Amp

14%

447 / 3311

1, 4 - 8, 13, 15, 16, 18 - 25

FGF3

 

LOH

22%

32 / 143

23, 26, 27

Amplaxin

11q13.4

Amp

11%

146 / 1350

1, 12

SEA

11q13.4

Amp

3%

7 / 239

1

GARP

11q13.5

Amp

12%

66 / 544

1, 7

D11S527

11q13.5

LOH

25%

26 / 103

27

D11S901

11q14.1

LOH

30%

16 / 54

28, 29

D11S4175

11q14.3

LOH

34%

24 / 70

30

D11S1342

11q14.3

LOH

40%

4 / 10

31

D11S873

11q14.3

LOH

46%

5 / 11

29

D11S29

11q13.4

LOH

38%

60 / 160

31, 32

D11S35

11q22.1

LOH

39%

64 / 165

26, 27, 28, 31

D11S940

11q22.1

LOH

31%

11 / 36

31

D11S2000

11q22.3

LOH

43%

3 / 7

31

D11S1325

11q22.3

LOH

33%

30 / 91

33

D11S1778

11q22.3

LOH

37%

294 / 791

33, 34

D11S1294

11q22.3

LOH

43%

258 / 607

33, 34

D11S2179 / D11S1294

11q22.3

LOH

25%

8 / 32

35

D11S2179

11q22.3

LOH

37%

47 / 127

33

D11S927

11q22.3

LOH

39%

185 / 472

27, 33, 34

D11S1391

11q23.1

LOH

37%

38 / 97

36, 37

D11S1347

11q23.1

LOH

37%

46 / 123

33

D11S897

11q23.1

LOH

36%

9 / 25

29, 31

D11S528

11q23.2

LOH

38%

16 / 42

26, 31

D11S1340

11q23.3

LOH

60%

5 / 8

31

APOC3

11q23.3

LOH

44%

231 / 529

28, 33, 38, 39

D11S976

11q23.3

LOH

24%

43 / 182

32

CD3D antigen

11q23.3

LOH

27%

15 / 56

29, 31

D11S924

11q23.3

LOH

60%

3 / 5

31

D11S925

11q23.3

LOH

31%

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Die Feinkartierung der LOH-Region 11q23 ergab zwei unterschiedliche Loci in 11q23.1 und 11q23.3, die in 30-40% der Brusttumore deletiert waren (Monaco et al., 1997;
Di Iasio et al., 1999; Laake et al., 1999). In der Region 11q23.1 sind die tumorassoziierten Gene ATM und PPP2R1B lokalisiert, für die sowohl Deletionen als auch Mutationen in verschiedenen Neoplasien beschrieben wurden (Gatti et al., 1999;


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Wang et al.,1998). Für das Gen ATM ergab sich ein Hinweis auf die Involvierung in die Entstehung familiärer Brusttumore (Easton, 1994). Weitere Gene in 11q23 wie LOH11CR2A und ZNF202 wurden als mögliche Kandidatengene in den LOH-Regionen diskutiert, konnten über eine Mutationsanalyse aber nicht bestätigt werden (Monaco et al., 1997, 1998). Im Gen HSC70 (Heat Shock Cognate 70) wurden in zwei von 15 sporadischen Brusttumoren Mutationen gefunden, die auf einen Einfluss des Gens in die Karzinogenese einer kleinen Fraktion von Tumoren schließen lassen (Bakkenist et al., 1999). Die weniger zahlreichen LOH-Studien von Ovarialkarzinomen ergaben ähnliche Hot-Spot-Regionen in 11q22.1 und 11q23 mit Deletionen in 30-50% der untersuchten Tumore, ohne dass Kandidatengenen beschrieben wurden (Gabra et al., 1995; Davis et al., 1996; Launonen et al., 1998).

1.3 Methoden zur Identifizierung von tumorassoziierten Genen

Die chromosomalen Aberrationen bei den gynäkologischen Tumoren der Brust und des Ovars sind Grundlage für die Strategie der positionalen Klonierung von tumorassoziierten Genen. Dabei wird klassischerweise mittels physikalischer und genetischer Karten die genaue Position des Genlocus bestimmt. Mittlerweile können über den wesentlich schnelleren Ansatz des positionellen Kandidatengenverfahrens genomische Sequenzdatenbanken des humanen Genomprojekts (HUGO) genutzt werden, um spezifische chromosomale Regionen auf mögliche Kandidatengenen zu untersuchen (Sanseau, 2001). Unter der Annahme, dass Verhalten und Funktion einer Zelle von ihrem Transkriptom bestimmt werden und die Zusammensetzung an Proteinen mit dem Vorhandensein der RNA-Moleküle korreliert, können Expressionsanalysen zur Identifizierung von Kandidatengenen sehr nützlich sein. Es sind verschiedene Methoden entwickelt worden differenziell exprimierte Gene zu identifizieren. Beim ‘‘Differential Display‘‘ werden die 3‘-Enden der mRNAs aus Tumorgewebe und entsprechenden Normalgewebe revers transkribiert, mit Hilfe der PCR amplifiziert und nebeneinander auf einem denaturierenden Sequenzgel aufgetrennt. Dabei lassen sich differenzielle Banden identifizieren, die cDNA eluieren und klonieren (Liang und Pardee, 1992). Eine ähnliche Methode der Identifizierung differenziell exprimierter Gene stellt die subtraktive Hybridisierung dar (Diatchenko et al., 1996). Grundlage für beide Methoden ist die Isolierung qualitativ hochwertiger mRNA aus den zu untersuchenden Geweben. Der notwendige Schritt der PCR-Amplifikation zur Gewinnung ausreichender cDNA-Mengen ist mit dem Risiko falsch positiver Fragmente verbunden. Die beiden


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genannten Methoden sind sehr aufwendig in ihrer Durchführung und benötigen große Mengen an RNA, deren Beschaffung im Falle von menschlichem Normalgewebe für den Vergleich mit Tumorgewebe sehr schwierig ist.

Die Identifizierung tumorassoziierter Gene aufgrund ihrer differenziellen Expression ist auch ohne aufwendige labortechnische Methoden durchführbar. Neben den genomischen Sequenzdatenbanken stehen sogenannte EST- (’’Expressed Sequence Tag’’) Bibliotheken zur Verfügung, die in Verbindung mit bioinformatischen Programmen eine nützliche Quelle zur Identifizierung von tumorassoziierten Kandidatengenen darstellen (Zhang et al., 1997). EST-Bibliotheken repräsentieren gewebespezifische Sequenzabschnitte exprimierter Gene, die über RNA-Isolierung, cDNA-Synthese, Klonierung und Sequenzierung erzeugt wurden. Es wird geschätzt, dass je nach Zelltyp zwischen 10.000 und 30.000 verschiedene Gene mit einer durchschnittlichen Gesamtzahl von 300.000 mRNA-Molekülen pro Zelle exprimiert werden. Eine erzeugte EST-Bibliothek enthält zwischen 1.000 und 10.000 ESTs und repräsentiert daher nur ein Bruchteil der mRNAs von exprimierten Genen (Vingron et al., 1999). In einer Arbeit wurden 1.5 Millionen ESTs verfügbar in CGAP- (’’Cancer Gene Anatomy Project’’) Bibliotheken genutzt, um mittels ’’digitalem Differential Display’’ über 600 differenziell exprimierte Gensequenzen in soliden Tumoren zu identifizieren (Scheurle et al., 2000).

Die Grundlage der vorliegenden Arbeit war ein ähnlicher bioinformatischer Ansatz zur Identifizierung potenzieller tumorassoziierter Gene (Schmitt et al., 1999). Dabei wurden öffentliche (CGAP) und private (Incyte Pharmaceutical, Palo Alto, CA, USA) EST-Datenbanken mit insgesamt über 4 Mio ESTs aus unterschiedlichen Geweben und korrespondierenden Tumoren genutzt, um über eine in-silico Expressionsanalyse differenzielle Gene zu identifizieren. Im Gegensatz zur Studie von Scheurle et al. erfolgte die Assemblierung der ESTs aus den cDNA-Bibliotheken zu putativen Genen. Die differenzielle Expression der Gene wurde anschließend über die Herkunft der zugehörigen ESTs aus den Normalgewebe- oder korrespondierenden Tumorgewebe-Bibliotheken bestimmt. Der bioinformatische Ansatz der Kandidatengensuche über EST-Datenbanken stellt eine Methode zur schnellen Identifizierung von differenziell exprimierten Genen dar, die als Grundlage für weiterführende experimentelle Studien dienen.


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1.4 Zielsetzung dieser Arbeit

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Validierung von Genen, die in die Entstehung bzw. Progression von Brust- und Ovarialkarzinomen involviert sind und in den häufig aberranten Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23 lokalisiert sind. Die Arbeit gliedert sich in zwei Abschnitte. Im ersten Teil wurden EST-Datenbanken verschiedener Gewebe und korrespondierender Tumore bioinformatisch ausgewertet, um differenziell exprimierte Gene zu selektieren. In diesem genomweiten Ansatz wurden 330, in gynäkologischen Tumoren differenziell exprimierten Kandidatengenen (Dahl et al., 1999; Abstract) chromosomal kartiert, wobei der Fokus dieser Arbeit auf Kandidatengene für sporadische Brust- und Ovarialkarzinome gelegt wurde. Auf dieser Grundlage wurden die kartierten Kandidatengene mit den beschriebenen chromosomalen Aberrationen in gynäkologischen Tumoren verglichen. Aufgrund der in Brust- und Ovarialkarzinomen häufig nachgewiesenen Deletionen und Amplifikationen für die chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23 wurden die dort lokalisierten in-silico Kandidatengene für diese Arbeit ausgewählt und weiter untersucht. Die in-silico differenzielle Expression dieser Gene sollte durch weitere Expressionsexperimente bestätigt werden, um tumorassoziierte Gene in diesen Regionen zu identifizieren. Zum anderen wurden die humanen annotierten Genomsequenzen genutzt, um die Kandidatengene genomisch zu charakterisieren.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein positionaler Ansatz der in-silico Kandidatengensuche für die Region 11q12-q23 durchgeführt. Aufgrund der Vielzahl von Studien, die chromosomale Aberrationen in dieser Region für Brusttumore beschreiben und der geringen Zahl von bereits identifizierten Kandidatengenen war es ein Ziel, diese Region systematisch auf weitere tumorassoziierte Gene zu untersuchen. Mit Hilfe der aktuellen genomischen Sequenzdatenbank konnte die chromosomale Region für deletierte und amplifizierte Loci physikalisch neu kartiert und mit den differenziell exprimierten Kandidatengenen verglichen werden.

Die Vorgehensweise für die Kandidatengensuche in dieser Arbeit kombiniert die in-silico Expressionsanalyse mit der Validierung differenziell exprimierter Gene unter Berücksichtigung beschriebener tumorassoziierter Genloci in 1q32-q41 und 11q12-q23.


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Thu Jan 30 14:01:20 2003