Kuner, Ruprecht: Identifizierung differenziell exprimieter Gene bei Brust- und Ovarialkarzinomen in den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Übersicht über die Vorgehensweise in dieser Arbeit

Grundlage für die Arbeit war die in-silico Expressionsanalyse von putativen Genen mit Hilfe der in der Firma metaGen Pharmaceuticals GmbH etablierten bioinformatischen Programme AUTEX und eNORTHERN (Schmitt et al., 1999). Die identifizierten, in-silico differenziell exprimierten Gene wurden anschließend über elektronische PCR oder mittels des ’’Radiation Hybrid Panel’’ chromosomal kartiert. Die Kartierung von 330 in-silico differenziell exprimierten Kandidatengene für gynäkologische Tumore war die Basis für die weitere Arbeit (Dahl et al., 1999; Abstract). Über den Vergleich von beschriebenen chromosomalen Aberrationen in Brust- und Ovarialkarzinomen wurden die in-silico Kandidatengene aus den Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23 zur weiteren Charakterisierung für die vorliegende Arbeit ausgewählt. Ein erstes Ziel war es, die in-silico Expressionsdaten der Gene experimentell zu bestätigen und den Nutzen des bioinformatischen Ansatzes zur Kandidatengensuche zu überprüfen. Dabei wurden Northernblot- und cDNA-Array-Analysen von Normal- und Tumorgeweben durchgeführt, um die differenzielle Expression in den gynäkologischen Tumoren zu bestätigen. Zur weiteren Charakterisierung der Gene wurden Annotationen auf cDNA- und genomischer Ebene durchgeführt. Bei unbekannten Genen wurde durch Sequenzierung von cDNA-Klonen versucht, das cDNA-Assembly zu bestätigen und, falls erforderlich, fehlende
5‘-Enden über RACE-PCR zu identifizieren. Nach der Interpretation der bioinformatischen Daten zusammen mit den ersten Expressionsdaten wurden die Gene weiterbearbeitet, deren Tumorassoziation bestätigt werden konnte. Es erfolgte eine weitere Charakterisierung dieser Gene durch Expressionsexperimente wie RNA in-situ Hybridisierung an Tumorschnitten und Taqman-Analysen von mikrodissezierten Brusttumoren. Bei dem potenziellen Tumorsuppressorgen ELBT wurde eine Mutationsanalyse in Brusttumoren durchgeführt.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein weiterer bioinformatischer Ansatz gewählt, um speziell die Region 11q12-q23 systematisch auf weitere Kandidatengene für Brustkarzinome zu untersuchen. Alle identifizierten, in-silico differenziell exprimierten Gene wurden zusammen mit den beschriebenen LOH- und Amplifikations-Loci physikalischen neu kartiert, wobei die aktuelle annotierte genomische Sequenzdatenbank verwendet wurde. Der Vergleich der in-silico Kandidatengene mit den aberranten Loci sollte zum einen Aufschluss über neue tumorassoziierte Gene in der


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Region 11q12-q23 geben, zum anderen die im ersten Teil der Arbeit untersuchten Gene als potenzielle Onkogene und Tumorsuppressorgene für schon beschriebene Loci eingrenzen (Abb.4).

Abb.4: Fließdiagramm über die Vorgehensweise in dieser Arbeit.


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2.2 Bioinformatische Analysen als Grundlage dieser Arbeit

2.2.1 EST-Datenbanken

Für die in-silico Kandidatengensuche standen neben der Nutzung der öffentlichen cDNA-Datenbanken (CGAP, National Cancer Institute) auch ein Zugang zu den privaten cDNA-Bibliotheken der Firma Incyte Pharmaceuticals (Palo Alto, CA, USA) zur Verfügung. Insgesamt gingen vier Millionen ESTs aus 23 verschiedenen Geweben und korrespondierenden Tumoren in die Analyse ein. Um für die in-silico Expressionsanalyse eine repräsentative EST-Anzahl für ein spezifisches Normalgewebe, beziehungsweise Tumorgewebe zu gewährleisten, wurden die ESTs der cDNA-Bibliotheken eines Gewebetyps gepoolt. Dabei wurden ausschließlich nicht-normalisierte cDNA-Bibliotheken verwendet, um die absoluten EST-Zahlen der Gewebe für die in-silico Expressionsanalyse aufrechtzuerhalten.

2.2.2 AUTEX und eNORTHERN

Der bioinformatische Ansatz ( Schmitt et al., 1999) läßt sich in zwei Schritte unterteilen (Abb. 5). Im ersten Schritt wurde ein nicht-redundantes Set an Start-ESTs generiert und mittels aller verfügbaren ESTs aus den Bibliotheken über das Programm AUTEX (’’Automatic Extension of partial DNA Sequences’’) zu maximal langen Sequenzabschnitten (Contigs) verlängert. In diesem automatischen, iterativen Suchverfahren wurden alle ESTs eingesammelt, die aufgrund Sequenzidentitäten mit dem Start-EST überlappen. Für die Assemblierung der einzelnen ESTs wurde das Programm GAP (’’Genome Assembly Program’’, Bonfield et al., 1995) genutzt. In der ersten Runde von AUTEX wurde eine Fehlerrate von nur 2% zugelassen, um eine möglichst gesicherte Anfangssequenz zu erhalten, mit der in den folgenden AUTEX-Runden weitere ESTs mit 5% Fehlerrate gesucht wurden. Die zugelassene Fehlerrate begründet sich durch Sequenzierfehler überwiegend am 3‘ Ende der ESTs. Die Annotation der Sequenzen von den in-silico differenziell exprimierten Genen und daraus resultierenden Proteinen erfolgte über das geläufige BLAST-Programm gegen nicht-redundante Nukleotid- und Proteinsequenzen (Altschul et al., 1990). Im zweiten Schritt wurde auf der Basis der generierten Assemblies eine in-silico Expressionsanalyse durchgeführt. Das Programm eNORTHERN (elektronischer Northern) basiert auf ein Suchprogramm, das alle eingesammelten ESTs eines putativen Gens entsprechend ihrer Herkunft aus den gewebespezifischen Bibliotheken anordnet. Die differenzielle Expression zwischen dem Normalgewebe und dem korrespondierendem Tumor ergibt sich über die Anzahl der


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ESTs zu einem Gen in den jeweiligen Geweben unter Berücksichtigung der Bibliotheksgrößen. Dabei wurde die Signifikanz der differenziellen Expression mittels dem Fisher Exact Test (Fisher et al., 1973) statistisch ausgewertet und eine Signifikanzschwelle (P-Wert alpha<0,1) definiert. Das Verhältnis Tumor zu Normalgewebe (T/N) gibt Aufschluss darüber, ob das Gen im Tumor stärker (T/N > 1) oder schwächer (T/N < 1) exprimiert wird und zeigt die Intensität der differenziellen Expression an (Schmitt et al., 1999).

Abb.5: Darstellung der in-silico Expressionsanalyse mittels der bioinformatischen Programme AUTEX und eNORTHERN (Schmitt et al., 1999).

2.2.3 In-silico Expressionsanalyse als positionaler Ansatz für die chromosomale Region 11q12-q23

Neben dem genomweiten Ansatz der Identifizierung von tumorassoziierten Genen wurde für die Region 11q12-q23 eine positionale Strategie gewählt, um weitere Kandidatengene in dieser Region zu identifizieren. Es wurden für die in-silico Expressionanalyse von Transkripten in der Region 11q12-q23 alle zur Verfügung stehenden 968 STS-Markern zwischen dem proximalen Marker RH13699 in 11q12 und dem distalen Marker RH27416 in 11q23 aus GeneMap ‘99 (NCBI, Stand Juni 2000) ausgewählt und über AUTEX verlängert. Durch ein ‘‘jeder-gegen-jeden-BLASTN’’ wurde ein nicht-redundantes Set von putativen Genen aus 11q12-q23 generiert und über den elektronischen Northern analysiert. Anschließend wurden die Gene selektiert, die in Brustkarzinomen gegenüber den Normalgeweben in-silico differenziell exprimiert waren.


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2.2.4 Elektronische PCR und physikalische Kartierung

Die chromosomale Kartierung der Kandidatengene wurde primär über eine Datenbankabfrage, die ePCR (elektronische PCR) durchgeführt. Bei der ePCR erfolgt ein Vergleich der zu analysierende Sequenz gegen die STS (’’Sequence Tagged Site’’)-Datenbank (Schuler et al., 1998). Im Falle eines positiven Ergebnisses werden die STS-Marker wiedergegeben, die mit hoher Wahrscheinlichkeit in der Suchsequenz lokalisiert sind. Die chromosomale Position des Kandidatengens kann über die angegebenen STS-Marker bestimmt werden, die in genetischen und physikalischen Karten (Genome Database, GDB; Human Genome Draft, NCBI) angeordnet sind und abgefragt werden können. Je nach Genauigkeit der Kartierung des STS-Markers kann die unbekannte Sequenz einem chromosomalen Abschnitt unterschiedlicher Ausdehnung zugeordnet werden.

Die in-silico differenziell exprimierten Gene des positionalen Ansatzes aus 11q12-q23 wurden zusammen mit den beschriebenen LOH- und Amplifikations-Loci physikalisch kartiert, wobei die annotierte genomische Sequenzdatenbank der Universität von Kalifornien in Santa Cruz (http://genome.ucsc.edu/; Stand Juni 2001) verwendet wurde. Zuerst erfolgte ein Vergleich der zu analysierenden Sequenzen gegen die genomische Datenbank (HTGS), um zu ermitteln, auf welchen BAC-Klonen die Gen oder die STS-Marker lokalisiert sind. Die physikalische Position der Gene und STS-Marker richtete sich nach der Ausdehnung der getroffenen, annotierten BAC-Sequenzen im humanen Genom.

2.2.5 Sonstige Software und Datenbanken

  • BLAST, PSIBLAST

  • Altschul et al., 1990

  • CHROMA (alignment software)

  • Goodstadt et al., 2001

  • ClustalX (multiple sequence alignment)

  • Jeanmougin et al., 1998

  • gap4 (global alignment program)

  • MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge

  • gde (genetic data environment), reap, scope

  • Institut für Molekulare Biotechnologie, Jena

  • GeneScan™ 672

  • PE Applied Biosystems, Weiterstadt

  • HTGS (High Throughput Genomic Sequences)

  • National Center of Biotechnology Information (NCBI)

  • ImageQuaNT

  • Molecular Dynamics, Krefeld

  • Primer3

  • Whitehead Institute for Biomedical Research, Boston

  • RepeatMasker

  • University of Washington

  • TMHMM 2.0

  • Krogh et al., 2001


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2.3 Verwendete Materialien

Die Materialien wurden von den Firmen Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) oder Sigma (Deisenhofen) bezogen, sofern in den Beschreibungen der Methoden nicht anders angegeben. Häufig verwendete Reagenzien und Lösungen sind im Anhang (G.1) aufgeführt.

2.4 Radiation Hybrid Mapping

Die Kandidatengene, bei denen die Datenbankabfrage der elektronischen PCR zu keinem Ergebnis führte, wurden über die Methode des ‘‘Radiation Hybrid Mapping‘‘ chromosomal kartiert (Cox et al., 1990). Das in dieser Arbeit verwendete Stanford G3 Radiation Hybrid Panel (RH01; Research Genetics, Inc, AL, USA) besteht aus
83 Hamster-Mensch-Hybrid DNA-Proben. Die somatischen Hybridklone entstanden durch Bestrahlung einer humanen lymphoblastoiden Donor-Zelllinie (RM), die anschließend mit Thymidin-defizienten Hamsterzellen fusioniert wurden. Die humanen Chromosomenbruchstücke integrierten in die Hamsterchromosomen und wurden zu den 83 stabilen Hybridklonen selektiert. Die 83 Hybrid-DNA Proben wurden über STS-Marker charakterisiert, so dass nach einer genspezifische PCR eine beliebige Sequenz chromosomal kartiert werden konnte. Nach der Gelelektrophorese ergab sich entsprechend dem Ergebnis der positiven (1) oder negativen (0) PCR ein binärer 0-1 Code der Proben 1-83. Mit Hilfe dieses Codes wurde am Stanford Human Genome Center (http://www-shgc.stanford.edu) der nächstliegende STS-Marker mit Angabe der Wahrscheinlichkeit und dem kalkulierten Abstand (in centiRay) zur amplifizierten Sequenz bestimmt (Abb.6).

Tab.2: Verwendete Primer zur Kartierung der Gene in 1q und 11q über das G3 Radiation Hybrid Panel

Gen

5'-Primer Sequenz

3'-Primer Sequenz

ELBT

5'-TGGTCTTGTGCTTGTCGAAG-3'

5'-GTCATGGAGCTGACCTGGTT-3'

FZD4

5'-TGCTGTCTCTTGCCATGCACTTG-3'

5'-AAATTGCCTGGGGAAATTCTGGG-3'

MS4A6A

5'-CTGGCCGGCTTCACTTAACCTTG-3'

5'-TCCCAGAGTCTCATTCCCTTCGC-3'

YAP65

5'-GGCACCAGCTAGCACCTCTGTGTT-3'

5'-TTCCAACTTTTGCCCTCCTCCAA-3'

DAP4

5'-TCAGAACCCCAGCGAAGAAGA-3'

5'-TCAGCCTCATGTCCATCCAGA-3'

CGI-85

5'-GGGCTACAGCGCTGCTTTTATGC-3'

5'-CTTGGCGATTCCGAAAGTATGCC-3'

CLNS1A

5'-ATCAGCGTTGGAGGCAATGTTCA-3'

5'-TGTGGCTTGGCCTTCTGCTGTTA-3'

PPP2R5A

5'-TGGGTAGAGGCAGCTCAGGTG-3'

5'-CACTGTGGGACTCAAAGCCTC-3'

putatives Calpain

5'-TGAGTCCTGGGCACATTGGTCAT-3'

5'-CCCTCCACCACACTGCTTTCTCA-3'

DAF

5'-TGGGATCACGAGGAAAAGAGAAGGA-3'

5`-ACCCCTGGTTCACCAGCATGTTT-3'

HSPC186

5'-CACTGGAAGCTGGTGTTCGCTGT-3'

5'-GCTGTGGTGTTCAGATCCACGCT-3'


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Durchführung:

Die genspezifischen Primer (Tab.2; MWG Biotech, Ebersberg) wurden zuerst auf der mitgelieferten humanen DNA und Hamster-DNA getestet. Standardmäßig wurde für ein 25µl PCR-Ansatz mit 1xPCR-Puffer, 2mM MgCl2, 200nM dNTP, 1 Unit Taq Polymerase (alle Life Technologies, Eggenstein), 50ng DNA und je 0,4µM 3‘-Primer und 5’- Primer eingesetzt. Die Reaktion erfolgte im PCR-Cycler PTC-200 (MJ Research Inc., Watertown, MA, USA) für 35 Cyclen (94°C, 30sec; 60°C, 30sec; 72°C, 1min). 10µl PCR-Produkt wurden mit 2µl DNA-Gelladepuffer vermischt und im 1%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Überprüfung der positiven PCR bei der humanen DNA und der negativen PCR bei der Hamster-DNA wurde die genspezifische PCR unter den gleichen Bedingungen auf allen 83 Hybrid-DNA Proben einschließlich der Positiv- und Negativkontrolle ausgeführt und nach elektrophoretischer Auftrennung der binäre 0-1 Code bestimmt.

Abb.6: Das Prinzip des Radiation Hybrid Mapping beruht auf 83 DNA-Hybriden, bestehend aus den grün dargestellten Hamsterchromosomen, in die die rot dargestellten humanen Chromosomenbruchstücke integriert wurden. Nach der PCR und der Elektrophorese ergibt sich ein binärer 0-1 Code, je nach positivem (1) oder negativem Erbgebnis (0) für alle 83 Proben (P-Positivkontrolle, N-Negativkontrolle).


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2.5 Zellkultur

2.5.1 Herkunft der Zelllinien

Die sechs Brusttumor-Zelllinien (MCF7, MDA231, MDA453, SKBR3, BT474, T47D) und
drei Ovarialtumor-Zelllinien (BG-1, EB2, PA-1) wurden von der Firma Berlex, USA in kryokonservierter Form zugesandt.

2.5.2 Kultivierung der Zelllinien

Die Brusttumor-Zelllinien (MCF7, MDA231, MDA453, SKBR3, BT474, T47D) wurden alle im folgenden Medium bei 37°C und 5% CO2 angezüchtet und entsprechend der Zelldichte passagiert. Das Medium bestand aus Alpha MEM, 10% FKS, 0,1mM MEM Non Essential Amino Acids, 1mM MEM Sodium Pyruvate, 10mM HEPES, 2mM
L-Glutamine, 50µg/ml Gentamycin (alle Life Technologies, Eggenstein) und 1µg/ml Insulin. Die Anzucht der Ovarialtumor-Zelllinien BG-1 und PA-1 erfolgte unter den gleichen Bedingungen im Kulturmedium Alpha MEM und 10% FKS. Die Ovarialtumor-Zelllinie EB-2 wurde in RPMI mit 10% FKS angezüchtet und wuchs als einzige der bearbeiteten Zelllinien in Suspension. Um ein Anheften dieser Zellen zu verhindern, wurde die Kulturflasche vertikal gestellt und regelmäßig geschwenkt.

2.6 Mikrodissektion

Die Mikrodissektion dient der Selektion distinkter Zellen und Gewebeareale. Sie wird eingesetzt, wenn sich die zu untersuchenden Zellen innerhalb eines sehr heterogenen Gewebes befinden und die weiteren Experimente ein möglichst homogenes Ausgangsmaterial erfordern (Sirivatanauksorn et al., 1999). Bei der lasergestützten Mikrodissektion wird das Zielgewebe durch ein computergesteuertes Mikroskop visualisiert, mittels entsprechender Software markiert und anschließend durch den Laser vom übrigen Gewebe getrennt. In dieser Arbeit wurde das UV-Laser Mikrodissektions-System SL Mikrotest (SL Mikrotest, Jena) verwendet. Ziel war es, gezielt Tumorareale und normales Epithelgewebe der Brust zu isolieren und daraus RNA zu isolieren. Es wurde kryokonserviertes Gewebe eingesetzt, um eine gute Ausgangs-Qualität der RNA zu gewährleisten. Das sterile Vorgehen während der Mikrodissektion sollte sicherstellen, dass die Bearbeitung des Gewebes die Qualität der RNA nicht beeinflusst (Schutze et al.; 1998). Zur histologischen Bewertung der Gewebe wurden die fixierten Kryoschnitte mit Hämalaun-Eosin gefärbt.


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2.6.1 Herkunft des Gewebes

Die kryokonservierten Proben von Brusttumoren und Normalgeweben wurden uns im Rahmen einer Kooperation mit der Pathologie des Universitätsklinikums Charité in Berlin überlassen. Es waren 13 invasiv duktale Karzinome und sechs invasiv lobuläre Karzinome unterschiedlicher Malignität (Grading). Die drei Normalepithel-Proben der Brust stammten zum Teil aus separaten Gewebeblöcken oder konnten aus Randbereichen der Tumorschnitte gewonnen werden.

2.6.2 Vorbereitung der Kryoschnitte

Auf gebackene Superfrost-Objektträger wurden ca. 2-3cm² große Folienabschnitte (Foliendicke: 2µm; SL Microtest, Jena) aufgezogen und an zwei Seiten mit Fixogum befestigt. Da die Folien nicht autoklavierbar waren, wurden die Objektträger mit Folie zur Sterilisation eine Stunde unter UV-Licht exponiert. Bei schlechter Haftung der Schnitte erfolgte die Beschichtung der Folie mit einer wässrigen 0,01%igen Poly-L-Lysin-Lösung.

Die kryokonservierten Gewebe wurden nach Entnahme aus dem flüssigen Stickstoff umgehend ins Kryotom (Microm HM560, Microm Laborgeräte, Walldorf) überführt. Von jedem Präparat wurden jeweils 5-15 Gewebeschnitte zwischen 6µm und 8µm Dicke hergestellt und auf die vorbereiteten Objektträger mit Folie aufgezogen. Alle für die Fixierung und Färbung verwendeten Lösungen wurden mit 0,1% DEPC-behandeltem Millipore-H2O angesetzt. Nach kurzem Lufttrocknen erfolgte die Fixierung der Schnitte 30sec in 70%igem Ethanol. Die Schnitte wurden kurz in H2ODEPC gespült, 1min 30sec in Hämalaun nach Mayer gefärbt, kurz in H2ODEPC gespült, jeweils 1min in 70% und 95% Ethanol entwässert, 30sec in Eosin Y (0,1% alkoholisch) gefärbt und zuletzt zweimal 2min in 95% Ethanol und 1min in absolutem Ethanol entwässert. Anschließend wurden die Schnitte mit der Folie abgelöst und mit der Schnittseite nach unten auf einen frisch gebackenen, mit Xylol versehenen Objektträger überführt. Nach dem Verdunsten des Xylols wurde die Folie glattgestrichen und mit Klarlack an den Objektträger fixiert. Nach einstündiger Trocknung waren die Schnitte bereit für die Mikrodissektion.


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2.6.3 Durchführung der lasergestützten Mikrodissektion

Die lasergestützte Mikrodissektion erfolgte mit dem UV-Laser Mikrodissektions-System SL Mikrotest (Manual SL Mikrotest, Jena). Der Objektträger mit dem Kryoschnitt wurde auf dem Objekttisch des Mikroskops fixiert und das Gewebe histologisch begutachtet. Anschließend wurde auf die ausgewählten Gewebeareale ein steriles Kunstoff-Cap (CapSure, Arcturus Engeneering, CA, USA) aufgesetzt und leicht angedrückt. Das Cap diente zur Ablösung und Überführung des mikrodissezierten Areals. Die zu mikrodissezierenden Tumor- und Normalgewebe-Areale wurden, visualisiert durch das zugehörige Softwareprogramm, am Bildschirm vorgezeichnet, um als Vorlage für den Laser zu dienen. Der computergesteuerte, motorisierte Mikroskoptisch ermöglichte das Abfahren des eingezeichneten Areals durch den UV-Laser (Abb.7). Die Einstellungen (Leistung, Geschwindigkeit) am Laser erfolgten in Abhängigkeit zum Schneideerfolg. Anschließend wurden die ausgeschnittenen Gewebeareale mittels des Caps abgehoben und in ein 0,5ml-Eppendorfgefäß überführt. Für die RNA-Isolierung wurden die Schnitte in Lysispuffer (Guanodinium-Isothiocyanat-Lösung) mit 1% beta-Mercaptoethanol aufgenommen. Dabei wurden sämtliche ausgeschnittenen Areale eines Gewebetyps der Patientin (ca. 20mm² Fläche) vereinigt und bis zur Aufarbeitung bei
-80°C gelagert.

Abb.7: Vorgehensweise der lasergestützten Mikrodissektion. Die linken Bilder zeigen die mit dem Laser umfahrenen Tumorareale der Brust (oben: IDC; unten: DCIS). In den rechten Bildern ist der Gewebeschnitt nach Abnahme des Caps mit den ausgeschnittenen Arealen dargestellt.


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2.7 RNA-Isolierung und cDNA-Synthese

2.7.1 Kommerzielle mRNA-Proben

Für die Taqman-Analysen wurden neben der isolierten RNA aus den mikrodissezierten Gewebeproben auch kommerzielle mRNA-Proben aus 22 unterschiedlichen humanen, normalen Geweben von den Firmen Clontech, Palo Alto, CA, USA und Invitrogen, Groningen bezogen.

2.7.2 Isolierung der poly(A+)mRNA aus Zelllinien

Aus den Zellen einer 175cm² Kulturflasche der jeweiligen Tumorzelllinien wurde die poly(A+)mRNA durch das PolyATtract System 1000 (Promega, Madison, WI, USA) isoliert. Diese Methode beruht auf den lysierenden und Ribonuklease-inhibierenden Eigenschaften von Guanidinium-Isothiocyanat (GTC) mit ß-Mercaptoethanol. Die poly(A+)mRNA wird mittels biotinylierter Oligo(dT)-Primer und Streptavidin-gekoppelter paramagnetischer Partikel (SA-PMP) aus dem Lysat isoliert und aufgereinigt.

Durchführung:

Der Überstand der Zellkulturen wurde verworfen und die Zellen mit 4ml GTC-Extraktionslösung (4M GTC; 25mM Natriumcitrat, pH7,1) und 2% ß-Mercaptoethanol lysiert. Mit einem sterilen Zellschaber wurden die Zellen anschließend aus der Kulturflasche transferiert und das Lysat zum Aufschluss der Zellen mehrmals durch eine Kanüle (0,9mm) gezogen. Im nächsten Schritt wurde das Lysat mit 8ml auf 70°C vorgewärmtem Verdünnungspuffer (6xSSC, 10mM Tris-HCl pH7,4, 1mM EDTA, 0,25% SDS) gemischt, 500pmol Oligo(dT)-Primer zugegeben und 5min bei 70°C inkubiert. Nach 5min Abkühlung wurde das Lysat bei Raumtemperatur (Rt) zentrifugiert (12.000g, 10min), der Überstand abgenommen und in ein neues Gefäß überführt. Anschließend erfolgte die Zugabe von 6ml SA-PMP, die zuvor dreimal mit 0,5xSSC gewaschen wurden. Nach Mischung und 5min Inkubation bei Rt wurde das Röhrchen in den Magnetständer gestellt, um die poly(A+)mRNA-gebundenen Partikel abzutrennen. Das klare Lysat wurde verworfen und die Partikel dreimal in 0,5xSSC gewaschen. Im letzten Schritt wurde die poly(A+)mRNA in 1ml H2ODEPC aufgenommen, die SA-PMP im Magnetständer abgetrennt und die gelöste mRNA bei -80°C konserviert.


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2.7.3 Isolierung der Gesamt-RNA aus mikrodissezierten Geweben

Aus den mikrodissezierten Geweben wurde die Gesamt-RNA nach dem geläufigen Protokoll mittels Guanidinium-Isothiocyanat (GTC) und saurem Phenol isoliert (Chomczynski et al., 1987). Durch diese Aufarbeitungsmethode sollten die RNA-Verluste bei den geringen mikrodissezierten Gewebemengen minimal gehalten werden. Dabei werden durch das GTC als chaotrope Substanz Proteine denaturiert. Natriumcitrat wirkt als Puffersubstanz, das Natriumlauroylsarkosin als Detergenz. Die Zugabe von beta-Mercaptoethanol dient der Inhibition von RNasen durch Denaturierung. Das saure Phenol bindet DNA und Proteine, während die RNA in der wässrigen Phase bleibt und durch mehrfache Fällung gereinigt wird.

Durchführung:

Die Gewebeproben wurden nach der Mikrodissektion in 50µl GCS-Lösung (4M GTC, 25mM Natriumcitrat pH7,0, 0,5% Na-Lauroylsarkonisin) mit 1% beta-Mercaptoethanol aufgenommen. Zu dieser Lösung wurden 5µl 2M Natriumacetat (pH4,0), sowie 50µl einer Mischung aus saurem Phenol und Chloroform im Verhältnis 5:1 gegeben. Nach Zentrifugation (12.000xg, 20min, 4°C) wurde die wässrige Phase abgenommen und zur Fällung 20µl Isopropanol zugegeben. Nach einstündiger Fällung bei -20°C und Zentrifugation (12.000xg, 20min, 4°C) wurde der Überstand abgenommen und verworfen. Das RNA-Pellet wurde nochmals in 20µl GCS-Lösung aufgenommen und mit 1 Vol Isopropanol wie oben gefällt. Anschließend wurde das RNA-Pellet in 20µl H2ODEPC gelöst, mit 2µl 3M NaAc (pH5,2) und 40µl absolutem Ethanol erneut 1h bei
-20°C gefällt und abzentrifugiert (12.000xg, 30min, 4°C). Der Überstand wurde abgenommen, das Pellet zweimal mit 20µl 80%igem Ethanol gewaschen, abzentrifugiert (12.000xg, 5min, 4°C) und schließlich in 20µl H2ODEPC aufgenommen. Die Konzentration der Gesamt-RNA wurde mittels RiboGreenTM bestimmt.

2.7.4 Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA

Die Bestimmung von Konzentrationen von DNA und RNA erfolgte mit RiboGreenTM bzw. PicoGreenTM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Gegenüber der spektrometrischen Messung von RNA können bei dieser sensitiven Methode durch die spezifische Bindung der fluoreszierenden Ribogreen-Partikel sehr geringe RNA-Konzentrationen bis zu 1ng/µl gemessen werden. Die RiboGreen-Stammlösung
wurde zur Messung von RNA-Endkonzentrationen im Bereich von 1-50ng/ml


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(bzw. 20-1000ng/ml) 1:2000 (bzw. 1:200) mit TE-Puffer verdünnt. Die PicoGreen-Stammlösung wurde immer 1:200 verdünnt. Von der Standard-Nukleinsäure-Lösung bekannter Konzentration wurde eine Eichreihe mit fünf verschiedenen Konzentrationen im angegebenen Messbereich erstellt. Für die Messung wurden sowohl die Standard-Lösung, als auch die Versuchsproben in 100µl TE-Puffer verdünnt und in einer optischen Platte mit 100µl der verdünnten Ribogreen- oder Picogreen-Lösung gemischt. Die Extinktion der Proben wurde im Fluoreszenzscanner bestimmt. Nach linearer Regression der Eichgeraden konnten die Konzentrationen der Versuchsproben bestimmt werden.

2.7.5 Reverse Transkription

Bei der Reversen Transkription wird die RNA mittels Oligo-(dT)- oder Hexamer Primer und dem Enzym Reverse Transkriptase (RT) in einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Die cDNA ist stabiler und kann als Matrize für PCR-basierte Experimente genutzt werden. Dabei wurde für größere RNA-Konzentrationen (>50ng; Zelllinien, kommerzielle RNA-Proben) der OmniscriptTM-RT-Kit (Qiagen, Hilden), für geringe RNA-Konzentrationen (<50ng; mikrodissezierte Proben) der SensiscriptTM-
RT-Kit (Qiagen) verwendet. Sämtliche Bestandteile bis auf den Oligo-(dT)-Primer (Clontech, Palo Alto, CA, USA) wurden den Qiagen-Kits entnommen.

Für die cDNA-Synthese wurde die RNA mit 1x Reverse Transkriptase-Puffer, dNTP-Mix (0,5mM je dNTP), 1µM Oligo-(dT)-Primer, 10 Units RNase Inhibitor und 1µl Reverse Transkriptase angesetzt (für 20µl Ansatz). Dabei wurde die Gesamt-RNA der mikrodissezierten Proben vollständig eingesetzt oder bei der ausreichenden poly(A+)-mRNA der Zelllinien und kommerziellen Gewebeproben eine konstante Menge von 500ng in cDNA umgeschrieben. Der Reaktionsansatz inkubierte 1h bei 37°C und wurde anschließend zur Inaktivierung der Reversen Transkriptase 5min auf 95°C erhitzt. Die Aufbewahrung der cDNA-Proben erfolgte bei -80°C.


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2.8 Aufarbeitungen und Bestätigung von cDNA-Klonen

Zur Durchführung von Expressionsanalysen für die zu untersuchenden Gene wurden spezifische E.coli-Klone bestellt und aufgearbeitet. Um sicherzustellen, dass zu allen Genen bestätigte cDNA-Sequenzen vorliegen, wurden mehrere Klone bearbeitet. Die Klone wurden ausgestrichen, Einzelkolonien gepickt, in Flüssigkultur vermehrt und die Plasmid-DNA präpariert. Dabei enthalten diese cDNA-Klone Teilsequenzen der Gene, die nach der Plasmid-DNA-Präparation mittels Sequenzierung bestätigt werden sollten. Aus den bestätigten cDNA-Proben erfolgte die Generierung der Sonden für quantitative Expressionsanalysen und die RNA in-situ Hybridisierung. Zuvor wurde sichergestellt (’’RepeatMasker’’), dass sich in der cDNA-Sequenz keine repetitiven Basenabfolgen befinden, die unspezifische Signale in der Northernblot-Analyse verursachen könnten.

2.8.1 Herkunft der cDNA-Klone für die bearbeiteten Gene

Für die Auswahl der cDNA-Klone standen zum einen die über AUTEX generierten Assemblies der entsprechenden Gene zur Verfügung, zum anderen konnte bei den bekannten Genen die cDNA-Klone über den UniGene-Datenbankeintrag (NCBI) in Erkenntnis gebracht werden (Tab.3a, 3b). Dabei wurden öffentliche Bakterien-Klone ausgewählt und bei Incyte Genomics (St. Louis, MO, USA) bestellt. Die Klone wurden als Agarsteps geliefert und konnten sofort ausgestrichen werden.

Tab. 3a: Bearbeitete cDNA-Klone der Gene auf Chromosom 1. Die entsprechenden Angaben zu den Klonen sind den jeweiligen Kloninformationen (Entrez, NCBI) entnommen (k.A.: keine Angaben).

Gene auf

Chromosom 1

IMAGE

Klon-ID

GenBank

Acc. Nr.

Vektor

 

Ursprungsgewebe

Insert-Size

in bp

PPP2R5A

841208 3'

AA486712

pBluescript SK-

Lunge

2346

41356 5'

R59164

Lafmid BA

Gehirn

1908

668858 5'

AA234321

pT7T3D-Pac

k.A.

k.A.

ERT/ ELF3

770910 5'

AA433851

pT7T3D

Ovartumor

k.A.

308288 5'

W24679

pT7T3D

fetale Lunge

1704

591374 3'

AA159295

pBluescript SK-

Pankreas

457

putatives Calpain

365665 5'

AA025386

pT7T3D

fetales Herz

410

1086969 3'

AA583505

pBluesript SK-

k.A.

660

365665 3'

AA026030

pT3T7D

fetales Herz

410

2142037 3'

AI446497

pCMV-Sport6

Adenokarzinom

1820

2189119 3'

AI537761

pCMV-Sport6

k.A.

1557

2506373 3'

AW007803

pT7T3D-Pac

Dickdarm

1004

DAF/ CD55

668796 3'

AA262303

pT7T3D-Pac

k.A.

682

239335 5'

H71561

pBluescript SK-

Riechepithel

k.A.

131473 5'

R23380

pT7T3D

Plazenta

1230

HSPC186

740243 5'

AA477024

pT7T3D

Ovartumor

1691

152739 5'

R47823

pT7T3D

Brust

913

186580 5'

H43255

pT7T3D

Brust

4093


29

Tab. 3b: Bearbeitete cDNA-Klone der Gene auf Chromosom 11. Die entsprechenden Angaben zu den Klonen sind den jeweiligen Kloninformationen (Entrez, NCBI) entnommen (k.A.: keine Angaben).

Gene auf

Chromosom 11

IMAGE

Klon-ID

GenBank

Acc. Nr.

Vektor

 

Ursprungsgewebe

Insert-Size

in bp

ELBT

161288 5'

H25327

pT7T3D

Brust

982

161484 3'

H25560

pT7T3D

Brust

676

358629 5'

W96417

pT7T3D

fetales Herz

946

1276329 3'

AA693505

pT7T3D-Pac

Hoden

1612

FZD4

146058 5'

R79705

pT7T3D

Plazenta

1039

429599 5'

AA011621

pT7T3D

fetale Leber, Milz

1270

233782 5'

H64595

pT7T3D

fetale Leber, Milz

2159

MS4A6A

207240 3'

H59599

pT7T3D

fetale Leber, Milz

1267

148348 5'

H13072

pT7T3D

Plazenta

775

243038 5'

H95741

pT7T3D

fetale Leber, Milz

1592

YAP65

308163 5'

W24622

pT7T3D

fetale Lunge

1440

268971 5'

N36721

pT7T3D

Melanocyten

k.A.

1131225 3'

AA610311

pT7T3D-Pac

Brust

982

Cyclin D1

199371 5'

R97329

pT7T3D

fetale Leber, Milz

3230

309834 5'

W24017

pT7T3D

Fibroblasten

519

DAP4

838220 5'

AA457452

pBluescript SK-

fetale Retina

k.A.

595208 5'

AA173504

Bluescript SK-

Ovartumor

691

594345 5'

AA169668

Bluescript SK-

Ovartumor

k.A.

CGI-85

826099 3'

AA521414

pT7T3D-Pac

B-Zellen

k.A.

545163 3'

AA076053

Bluescript SK-

Ovartumor

472

294739 5'

W03217

pT7T3D

fetale Leber, Milz

k.A.

CLNS1A

845595 3'

AA644338

pBluescript SK-

Lungentumor

1023

72050 5'

T52435

pBluescript SK-

fetale Milz

970

501458 5'

AA135531

pT7T3-Pac

Uterus

920

Fau 1

724122 5'

AA411247

pT7T3D

Ovartumor

1068

5'

AA321581

pBluescript SK-

Lymphoid

k.A.

491497 5'

AA148815

pT7T3-Pac

Uterus

1438

SIP

739270 5'

AA421233

pT7T3D

Ovartumor

1198

770968 5'

AA428091

pT7T3D

Ovartumor

k.A.

47920 5'

H11992

Lafmid BA

Gehirn

1098

2.8.2 Präparation der Plasmid-DNA

Aus den gelieferten Agarsteps wurden die Klone auf Agarplatten ausgestrichen, um Einzelkolonien zu erhalten. Nach Vermehrung der Klone in Flüssigkultur erfolgte die Minipräparation der Plasmid-DNA. Durch den Restriktionsverdau der Plasmid-DNA-Proben sollten die cDNA-Fragmente isoliert und über die anschließende Sequenzierung bestätigt werden. Die positiven Klone wurden erneut in einem großen Volumen kultiviert, um nach der Maxipräparation ausreichende cDNA-Mengen für die weiteren Expressionsexperimente zu gewinnen. Die durchgeführte Methode der Präparation von Plasmid-DNA beruhte auf dem Prinzip der alkalischen Lyse (modifiziert nach Birnboim und Doly, 1979). Dabei wird chromosomale Bakterien-DNA durch alkalische Denaturierung und Fällung von der Plasmid-DNA getrennt.


30

Kultivierung:

Die Klone wurden in LB-Agar mit 100µg/ml Antibiotika Ampicillin oder Kanamycin (Fluka Biochemika, Neu-Ulm), abhängig von der Resistenz ausgestrichen und etwa 12h bei 37°C kultiviert. Von jedem Klon wurden drei Einzelkolonien gepickt und in einer
2ml LB-Medium-Flüssigkultur 10h bei 37°C kultiviert. Von dieser Flüssigkultur wurden 0,5ml für ein 1ml Glyzerinstock (15% Glyzerin) angelegt, aus den restlichen 1,5ml erfolgte die Präparation der Plasmid-DNA. Für die Maxipräparation der Plasmid-DNA wurden von dem Glyzerinstock der Klone 500ml LB-Medium angeimpft und etwa 14h bei 37°C kultiviert.

Minipräparation der Plasmid-DNA:

Die Minipräparation der Plasmid-DNA erfolgte mittels des GFXTM Micro Plasmid Prep Kit (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Die 1,5ml Bakterienkultur wurde abzentrifugiert (12000xg, 30sec, Rt) und der Überstand verworfen. Das Bakterienpellet wurde in 150µl Resuspensionspuffer (100mM Tris-HCl, pH7,5, 10mM EDTA, 400µg/ml RNaseI) durch Vortexen aufgenommen, anschließend unter Durchmischung 150µl Lysispuffer (200mM NaOH, 1% SDS) und 300µl Neutralisationspuffer (3M KAc, pH5,5) dazugegeben. Die denaturierte E.coli-DNA und die Proteine wurden abzentrifugiert (12.000xg, 5min, Rt) und der Überstand auf die vorbereiteten GFXTM-Säulen gegeben. Nach einminütiger Inkubationszeit erfolgte die Zentrifugation der Proben (12000xg, 30sec, Rt), um die Plasmid-DNA an die Säule zu binden. Nach einem Waschschritt mit 400µl Waschpuffer (80% Ethanol in Tris-EDTA Puffer) wurde die DNA mit 50µl TE-Puffer eluiert und bei -20°C gelagert.

Maxipräparation der Plasmid-DNA:

Die Maxipräparation der Plasmid-DNA erfolgte mit Hilfe des Nucleobond AX500-Kit (Macherey-Nagel, Düren). Im ersten Schritt wurde der 500ml Kulturansatz zentrifugiert (5000xg, 15min, 4°C), das Pellet mit 12ml Lösung S1 (50mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 100µg/ml RNaseI, pH8,0) resuspendiert und nach Zugabe von 12ml Lösung S2 (200mM NaOH, 1% SDS) 5min bei Rt inkubiert. Die Suspension wurde nach Zugabe von 12ml Lösung S3 (2,8M KAc, pH5,1) 5min auf Eis inkubiert und abzentrifugiert (15.000xg, 1h, 4°C). Der Überstand wurde durch einen Faltenfilter filtriert und anschließend auf die mit 5ml Puffer N2 (15% Ethanol, 100mM Tris, 900mM KCl, pH6,3) equilibrierten Säulen gegeben. Nach dem zweimaligem Waschen der Säule mit je
12ml Puffer N3 (15% Ethanol, 100mM Tris, 1,15M KCl, pH6,3) wurde die Plasmid-DNA


31

mit 12ml Puffer N5 (15% Ethanol, 100mM Tris, 1M KCl, pH8,5) eluiert. Zur Reinigung und Aufkonzentrierung wurde die gelöste DNA mit 0,7 Vol Isopropanol 60min bei Rt gefällt und abzentrifugiert (18.000g, 30min, 4°C). Der Überstand wurde verworfen, das DNA-Pellet mit 70%igem Ethanol (4°C) gewaschen und in 500µl TE-Puffer aufgenommen. Die Konzentration der isolierten Plasmid-DNA wurde über Gelelektrophorese neben einem DNA-Standard bestimmt.

2.8.3 Restriktionsverdau der Plasmid-DNA

Der Restriktionsverdau diente der Abtrennung des genspezifischen cDNA-Inserts von der Vektor-DNA. Dabei werden Restriktionsenzyme eingesetzt, deren Erkennungssequenzen sich an den die cDNA-flankierenden Klonierungsstellen befinden. Die Auswahl der Restriktionsendonukleasen richtete sich nach den Klonierungsvektoren (Tab.4). Nach der Elektrophorese wurde die cDNA für die Sondenherstellung aus dem Gel extrahiert werden.

Tab. 4: Enzymkombinationen für den Restriktionsverdau der jeweiligen Vektoren

Vektor

Enzym 1

Enzym 2

Reaktionspuffer

PT7T3D (-PAC)

EcoRI (AvaI)

HindIII (NotI)

Puffer B (H)

(p)Bluescript SK-

EcoRI (XbaI)

XhoI (PstI)

Puffer H

Lafmid BA

EcoRI

HindIII

Puffer B

pCMV-Sport6

EcoRI

HindIII

Puffer B

Durchführung:

Für den Restriktionskontrollansatz wurden 500ng Plasmid-DNA mit 5 Units der für den Vektor entsprechenden Enzyme (Kombination aus Enzym1 und Enzym2) und
1x Restriktionspuffer (alle Roche Diagnostics, Mannheim) in einem 20µl Ansatz für 2-3h bei 37°C verdaut. Zur Sondenpräparation wurden 10µg Plasmid-DNA mit jeweils
20 Units der Enzyme in einem 50µl Ansatz 3h verdaut. Der Ansatz wurde anschließend mit 1/6 Vol Gel-Ladepuffer versetzt, zusammen mit einem DNA-Größenstandard in einem 1%iges Agarosegel aufgetrennt und durch Ethidiumbromid-Färbung (0,5µg/ml in H2Odest ; 15min) detektiert.


32

2.8.4 Sequenzierung der cDNA-Inserts

Die Sequenzierung wurde nach dem Prinzip der Kettenabbruch-Reaktion durchgeführt (Sanger et al., 1977). Dabei werden die DNA-Moleküle in einem zyklischen Prozess denaturiert, ein Primer gebunden und der dabei gebildete DNA-Primer-Doppelstrang durch DNA-Polymerasen verlängert. Im Sequenzieransatz-Ansatz sind neben den üblichen Nukleotiden auch fluoreszenzmarkierte Didesoxy-Nukleotide enthalten, die zum Kettenabbruch führen. Jeder der vier Basen dieser markierten Nukleotide enthält ein Fluorophor mit spezifischer Emissionswellenlänge. Die unterschiedlich langen DNA-Fragmente werden nach der PCR-Amplifikation elektrophoretisch in einem denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die unterschiedlichen Fluorophore, die eine spezifische Base repräsentieren, werden am Ende der Auftrennung durch einen Laser angeregt und die emittierte Strahlung detektiert. Durch Übertragung der Sequenzinformationen auf ein entsprechendes Software-Programm (gap4) kann die ermittelte Sequenz mit der bestehenden Sequenz des Gens verglichen und bestätigt werden.

Für die Sequenzieransätze wurden mit dem BigDye-Mix (BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, PE Applied Biosystem, Weiterstadt) und dem DyeET-Mix (DYEnamicTM ET Terminator Cycle Sequencing Premix, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) zwei kommerzielle Sequenzierreaktions-Kits eingesetzt. Die Auswahl der Sequenzierprimer richtete sich nach dem Klonierungsvektor der genspezifischen Plasmid-DNA-Proben (Tab.5). Die Elektrophorese und Übertragung der Sequenzierdaten erfolgte im Sequenzierautomat ABI PrismTM 377 (PE Applied Biosystem, Weiterstadt).

Tab. 5: Auswahl der Sequenzierprimer für die entsprechenden Vektoren

Vektor

5'-Primer Sequenz

3'-Primer Sequenz

pT7T3D (-PAC)

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT -3'

5'-TAATACGACTCACTATAGGG -3'

(p)Bluescript SK-

5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG -3'

5'-GTAAAACGACGCCAGT -3'

Lafmid BA

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'

5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'

pCMV-Sport6

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT -3'

5'-GGAAACAGCTATGACCATG -3'

Vorbereitung der Sequenzierproben:

Für einen 15µl Sequenzieransatz mit dem BigDye-Kit wurden 3µl BigDye-Mix,
1µl Sequenzierprimer (5pmol/µl) und etwa 500ng Plasmid-DNA vermischt und über
30 Zyklen (95°C, 30sec; 50°C, 10sec; 60°C, 4min) amplifiziert. Für die Sequenzierung mit dem DyeET-Kit wurden in einem 15µl Ansatz 6µl DyeET-Mix, 1µl Sequenzierprimer


33

(5pmol/µl) und etwa 500ng Plasmid-DNA eingesetzt und über 25 Zyklen amplifiziert (95°C, 20 sec; 50°C, 15sec; 60°C, 1min). Im Anschluss an die Sequenzierungsreaktion wurde der Ansatz über Sephadex G-50 Säulen (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) gereinigt. Als Vorbereitung wurde in eine 96-well-Multi-Screen-HV-Platte (Amersham) ca. 0,3mg Sephadex G-50 eingefüllt, mit je 300µl Millipore-Wasser versetzt und 3h quellen gelassen. Die hergestellten Säulen wurden vor dem Gebrauch abzentrifugiert (910xg, 5min, Rt), die Sequenzierreaktion aufgetragen und im folgenden Zentrifugationsschritt (wie oben) von freien Terminatormolekülen gereinigt. Die Proben wurden vor dem Auftragen auf das Sequenziergel bei 80°C im Brutschrank getrocknet und in 3µl Sequenzier-Auftragspuffer aufgenommen. Vor der Elektrophorese wurden die Proben in der 96-well-Platte 30min bei Rt geschüttelt, 5 min bei 80°C denaturiert und bis zum Auftragen auf Eis gestellt.

Elektrophorese im Sequenziergel und Auswertung der Daten:

Für die elektrophoretische Auftrennung der Sequenzierreaktion wurde ein 5,25%iges Polyacrylamidgel (48cm lang, 200µm dick; PAGE plus, Amresco, Solon, USA) mit
6M Harnstoff in 1xTBE gegossen und mit 0,5% TEMED und 0,05% Ammoniumpersulfat auspolymerisiert. Für die Elektrophorese wurden 1,5µl Sequenzierprobe aufgetragen und nach entsprechenden Einstellungen am Sequenzierautomat ABI Prism 377 aufgetrennt (Elektrophoreseleistung 200W, Gel-Temperatur 51°C, Laser-Leistung 40mW, Laufzeit 12h, CCD-Einstellung 250, CCD-Empfindlichkeit 2, CCD X Pixel Position 196). Die Auswertung der Rohdaten erfolgte mit Hilfe der zu den Sequenzierautomaten ABI Prism 377 gehörenden Macintosh-Software. Die qualitative Auswertung und Formatierung der Sequenzdaten wurde mit den Programmen ‘‘reap‘‘ und ‘‘scope‘‘ (Institut für Molekulare Biotechnologie, Jena) durchgeführt. Anschließend wurden die Sequenzabschnitte unter den im Programm ‘‘gap4‘‘ bestehenden Assemblies der Gene editiert und im Falle von Sequenzidentität integriert.


34

2.9 Expressionsanalyse über Northernblot und cDNA-Arrays

Nach der Sequenzierung konnten die bestätigten cDNA-Klone zur Generierung von genspezifischen Sonden verwendet werden. Von den in Tab.3a und 3b (Kap.B.8.1) aufgelisteten Genen wurde jeweils die aufgearbeitete cDNA des erstgenannten Klons eingesetzt. Durch die Northernblot-Hybridisierung sollte zum einen die Spezifität der Sonde getestet und zum anderen das Expressionverhalten der Gene in verschiedenen Geweben untersucht werden. Die nachfolgende Hybridisierung des cDNA-Arrays mit parallel aufgespotteten Tumor- und Normalgewebeproben diente zur Verifizierung der in-silico analysierten differenziellen Expression der Gene in Tumoren. Die Sondenpräparation war für beide Expressionsexperimente identisch. Die spezifischen cDNA-Fragmente wurden nach dem Restriktionsverdau aus dem Gel präpariert, aufgereinigt, ihre Konzentration bestimmt und radioaktiv markiert. Die Detektion der Expressionssignale erfolgte durch Radiographie oder mittels Phosphor-Imager (Fujifilm BAS-1800II) und der Quantifizierungs-Software ImageQuant.

2.9.1 Präparation der cDNA-Sonden

Der Restriktionsansatz mit 10µg Plasmid-DNA wurde wie in B.8.3 beschrieben verdaut und in einem 1%igen Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Nach Ethidiumbromid-Färbung erfolgte die Präparation der genspezifischen Fragmente aus dem Gel bzw. die Extraktion der cDNA mit Hilfe des QIAEX Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden). Die ausgeschnittenen Gelstücke mit den cDNA-Fragmenten wurden abgewogen und jeweils 100µg Agarosegel 300µl Lysispuffer (QX1-Puffer) zugegeben. Von der resuspendierten QIAEXII-Lösung mit den Silikagelpartikel wurden 20µl (extrahierte DNA-Mengen von
2-10µg) zugegeben und 10min bei 50°C in einen Schüttelinkubator gestellt. Anschließend wurden die Silikagelpartikel mit der adsorbierten DNA durch Zentrifugation (12.000g, 30sec, Rt) pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und das nach drei Waschschritten (1x 500µl QX1-Puffer, 2x 500µl Puffer PE) luftgetrocknete Pellet in 20µl Tris-Puffer (10mM Tris-Cl, pH8,5) eluiert. Zur Konzentrationsabschätzung wurde die eluierte cDNA erneut elektrophoretisch neben einem DNA-Standard (Marker III, Roche Diagnostics, Mannheim) aufgetrennt und durch den Vergleich der Bandenintensitäten mit dem Standard nach Protokoll des Herstellers quantifiziert. Die cDNA-Proben wurden schließlich zu 25ng aliquotiert und bei -20°C gelagert.


35

2.9.2 Kontroll-Dot Blot

Als Positivkontrolle für die Northernblot- und cDNA-Array-Hybridisierung wurde spezifisch für jedes Gen ein Kontroll-Dot-Blot hergestellt. Bei diesem Kontroll-Dot-Blot wurde die eingesetzte cDNA-Sonde in absteigenden Konzentrationen (1ng; 100pg, 10pg, 1pg) auf eine ungeladene Nylonmembran (Hybond-N, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) transferiert und über UV-Strahlung immobilisiert (“UV-cross-linking“ bei 120mJ/cm²).

2.9.3 Northernblot- und cDNA-Array-Hybridisierung

Die Northernblot- und cDNA-Array-Analysen erfolgten durch Hybridisierung mit radioaktiv markierten cDNA-Sonden. Für die Gewebeexpression wurden die kommerziell erhältlichen MTN-Blots (’’Multiple Tissue Northern’’-Blot 1+2, Clontech, Palo Alto, USA) eingesetzt. Die beiden Nylon-Membranen mit mRNA von 16 unterschiedlichen humanen Geweben (MTN1: Herz, Hirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, Pankreas; MTN2: Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Ovar, Dünndarm, Dickdarm, periphere Blut-Leukocyten) waren gebrauchsfertig zur Hybridisierung. Die verwendeten cDNA-Arrays (Matched Tumor/Normal Expression Array; Cancer Profiling Array, beide Clontech) basieren auf der SMARTTM cDNA Synthese (Clontech) von mRNA aus verschiedenen Tumoren und Normalgeweben. Dabei werden die amplifizierten cDNA-Proben auf die Nylonmembran gespottet. Informationen zu den Tumoren wurden aus den Protokollen des Herstellers entnommen. Für beide Expressionssysteme wurden Kontroll-cDNA-Proben der ubiquitär exprimierten Gene ß-Aktin und Ubiquitin mitgeliefert.

Radioaktive Markierung der Sonden:

Die Herstellung radioaktiv markierter Sonden erfolgte nach der Methode von Feinberg und Vogelstein (1983) mit Hilfe des MegaprimeTM DNA Markierungs-System (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) und wurde nach angegebenen Protokoll durchgeführt. Zunächst wurden 25ng der cDNA-Sonde mit 1µg Nonamer-Primer in einem 28µl Ansatz vermischt, und 5min bei 95°C-100°C denaturiert. Nach langsamen Abkühlen der Reaktion, das die Bindung der Primer ermöglicht, wurden 10µl Markierungspuffer (dATP, dGTP, dTTP in Tris/HCl, pH7,5; MgCl2, ß-Mercaptoethanol), 50µCi[alpha-32P]dCTP (10mCi/ml, Amersham) und 2 Units Klenov-Enzym zu einem 50µl Markierungsansatz zugegeben. Der Ansatz inkubierte zur Zweitstrangsynthese 30min


36

bei 37°C. Anschließend erfolgte eine Aufreinigung des Ansatzes über Sephadex-Säulen (Sephadex G-50, Amersham), um ungebundene Nukleotide abzutrennen. Nach Vorbereitung der Säule (720xg, 1min, Rt) wurde der Ansatz über die Säule zentrifugiert (720xg, 2min, Rt). Zur Hybridisierung des MTN-Blots wurde dieser Ansatz 5min bei
95-100°C denaturiert und auf Eis gestellt.

Für die cDNA-Arrays wurde der markierte 50µl Ansatz nach Aufreinigung über die Sephadex-Säule mit 50µl 20xSSC, 30µg COT1-DNA (Roche, Mannheim) und 150µg Heringssperma-DNA in 200µl Gesamtvolumen versetzt, danach 5min bei 95-100°C denaturiert und 30min bei 68°C inkubiert.

Hybridisierung des Northernblots und des cDNA-Arrays:

Der MTN-Blot wurde in 10ml vorgewärmter ExpressHyb-Lösung (Clontech) für 30min bei 68°C prähybridisiert und in 5ml ExpressHyb mit der denaturierten, radioaktiv markierten Sonde 1h bei 68°C hybridisiert. Anschließend wurde der Blot zweimal für 15min in 2xSSC/0,05%SDS bei Rt und ein- bis dreimal für 15min in 0,1xSSC/0,1%SDS bei 50°C gewaschen (bis zu einer Aktivität von 70-180Beq/cm²). Zur Detektion wurde der Blot in einer Kassette mit Hyperscreen-Verstärkerfolien (Amersham) fixiert und ein Film (Biomax MS-1, Kodak) ca. 24h zur Exposition aufgelegt.

Der cDNA-Array wurden in 10ml vorgewärmter ExpressHyb-Lösung (Clontech) mit 1,5mg Heringssperma-DNA für 30min bei 65°C prähybridisiert und anschließend in 5ml ExpressHyb mit der denaturierten, radioaktiv markierten Sonde über Nacht bei 65°C hybridisiert. Der hybridisierte cDNA-Array wurde anschließend zweimal für 15min in 2xSSC/ 0.5%SDS bei 65°C und mehrmals in 0,1xSSC/ 0,5%SDS bei 65°C gewaschen (bis zu einer Aktivität von 70-180Beq/cm²). Zur Detektion wurde der Array in einer Phosphor-Screen Kassette (Molecular Dynamics, Amersham) über 6-12h exponiert und im Phosphor-Imager ausgewertet. Die Datenanalyse erfolgte mit Hilfe des Programms ImageQuant (Molecular Dynamics, Amersham).


37

2.10 PCR-basierte Methoden und Klonierung

2.10.1 SMART-RACE-PCR

Mit Hilfe der RACE-Methode (’’Rapid amplification of cDNA ends’’) lassen sich noch unbekannte 3‘- oder 5‘- Enden eines Gens amplifizieren und die gesamte cDNA eines unbekannten Gens klonieren (Chenchik et al., 1996; Bertioli et al., 1997). Für die
5‘-RACE wurde der SMART-RACE-cDNA-Synthese-Kit (Clontech) verwendet. Bei der SMART-Erststrangsynthese der poly(A+)mRNA werden modifizierte Oligo(dT)-Primer (SMART-Oligonukleotide) und eine MMLV-Reverse Transkriptase eingesetzt, die über Terminale-Transferase-Aktivität verfügt. Erreicht die Reverse Transkriptase das 5‘-Ende der RNA, so werden einige Desoxy-Cytidin hinzugefügt. Im Ansatz befinden sich zudem die SMART-Oligonukleotide, die am 3‘-Ende Oligo(dG) tragen. Diese binden an den Oligo(dC)-Schwanz des neusynthetisierten Erststrangs, wobei der Überhang des SMART-Oligos als verlängertes Template für die Reverse Transkription dient. In der nachfolgenden PCR kann das SMART-Oligo als 5’-Primer zusammen mit einem genspezifischen 3‘-Primer genutzt werden, um das 5‘-Ende des Gens zu amplifizieren. In dieser Arbeit wurde versucht, für ein unbekanntes Gen (ELBT) das 5‘-Ende des Gens zu amplifizieren und über die nachfolgende Sequenzierung zu identifizieren.

Duchführung:

Aufgrund des Expressionsmusters im Gewebe wurde für das Gen ELBT poly(A+)mRNA aus Brustgewebe in cDNA umgeschrieben. In einem 5µl Ansatz wurden 1µg poly(A+)-mRNA, 1µl modifizierter Oligo(dT)-Primer (5‘CDS; 10µM) und 1µl SMART-Oligo (10µM) 2min bei 70°C inkubiert und auf Eis gestellt. Für die Erststrang-Synthese wurden
2µl Erststrang-Puffer, 1µl DTT (20mM), 1µl dNTP (10mM) und 1µl MMLV Reverse Transkriptase zugegeben und 2h bei 42°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz mit Tricine-EDTA Puffer auf 250µl verdünnt, 7min bei 73°C erhitzt und bei -20°C gelagert. Zur Amplifikation des 5’-RACE Produktes wurde ein 50 µl PCR-Ansatz mit 2,5µl 5‘-RACE cDNA, 1x Advantage 2 PCR Puffer, 1x Advantage 2 Polymerase Mix (Proofreading Polymerase und TaqStart Antikörper, Clontech), 0,2mM dNTP, 5µl UPM Primer Mix (5‘-Primer für Smart-Oligo) und 0,2µM genspezifischer 3‘-Primer von ELBT (5’-GGAAAGTAGTCTCGAAAGTAGC-3’) angesetzt und über 25 Zyklen (94°C, 30sec; 65°C, 30sec; 72°C, 1min) amplifiziert. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte im 1,5%igen Agarosegel.


38

2.10.2 PCR von großen Transkripten

Für die Klonierung eines neuen Gens (ELBT) wurde versucht, über eine PCR den Bereich des ORFs zu amplifizieren. Die erwarteten PCR-Produkten (bis zu 2kb) ließen sich in einer Standard-PCR (Taq Polymerase) nicht amplifizieren. Daher wurde das ELONGASE Enzym System (Life Technologies, Eggenstein) verwendet. In einem 50µl Ansatz wurden 50ng Brust-cDNA, 0,2mM dNTPs, je 0,2µM 3‘-und 5‘-Primer von ELBT (Tab.6), 10µl Puffer System A+B und 1µl Elongase Enzym Mix über 35 Zyklen (94°C, 30sec; 60°C, 30sec; 68°C, 3min) amplifiziert und im 0,8% Agarasogel aufgetrennt.

Tab. 6: ELBT-Primer zur Amplifikation und Klonierung des ORFs

ELBT-Produkt

5'-Primer Sequenz

3'-Primer Sequenz

Produktgröße in bp

P1

5'-TCTGCTGGGGTCTAGGCTGTTT -3'

5'-TAACCCACAGACACCCATGA -3'

1430

P2

5'-TCTGCTGGGGTCTAGGCTGTTT -3'

5'-AGAACACACAGGAGAGGGTT -3'

2280

2.10.3 Klonierung von PCR-Fragmenten

Die Klonierung der PCR-Produkte mit dem AdvanTAge PCR Cloning Kit (Clontech) basiert auf der terminalen Transferase-Aktivität der hitzestabilen Taq Polymerasen, die am Ende der PCR an das 3’-Ende des Amplifikates ein einzelnes Deoxyadenosin anfügen (Clark et al., 1988). Diese PCR-Fragmente können mit hoher Effizienz in linearisierte Vektoren mit Tymidinüberhängen kloniert werden. Der pT-Adv Vektor zeichnet sich durch 3’-T-Überhänge aus, mit Hilfe derer im Ligationsansatz das PCR-Fragment einkloniert wird. Anschließend wird der Vektor in TOP10F’ E.coli kompetente Zellen transformiert und durch LB-Medium mit X-GAL/IPTG die weißen Kolonien selektiert.

Durchführung:

Für einen 10µl Ligationsansatz wurden 50ng PCR-Produkt (< 1Tag alt), 50ng pT-Adv-Vektor, 4 Units T4 DNA Ligase in 1x Ligations-Puffer angesetzt und über Nacht
bei 14°C inkubiert. Die Transformation der kompetenten Zellen erfolgte mit
2µl Ligationsansatz und voraliquotierten 50µl TOP10F‘ E.coli-Zellen. Der Ansatz wurde 30min auf Eis inkubiert, anschließend 30sec im 42°C Wasserbad durch Hitzeschock behandelt und 2min auf Eis gestellt. Die transformierten Zellen wurden in 250µl vorgewärmtes SOC-Medium aufgenommen und 1h bei 37°C im Schüttelinkubator kultiviert. Daraufhin wurden jeweils 50µl bzw. 200µl eines Transformationsansatzes auf LB-Agarplatten mit X-GAL (1,6mg), IPTG (0,95mg) und Ampicillin (50µg/ml) ausplattiert


39

und 18h bei 37°C kultiviert. Die weißen Kolonien wurden anschließend gepickt, die Plasmid-DNA präpariert und sequenziert (B.8.2-B.8.4).

2.10.4 Real-time Reverse Transkriptase-PCR (Taqman-PCR)

Die Taqman PCR ist ein automatisierter PCR-Assay, bei dem die Amplifikation und der Nachweis des PCR-Produktes simultan ermöglicht werden. Bei dieser sogenannten ‘‘Real-Time‘‘- PCR wird bei den zu quantifizierenden Proben das entstehende Amplifikat nach jedem Zyklus über ein Fluoreszenzsignal-übermittelndes System detektiert (Higuchi et al., 1992 und 1993). Die Ausgangsproben können anschließend über den logarithmisch dargestellten Verlauf der PCR innerhalb der exponentiellen Phase miteinander verglichen und der Expressionslevel des untersuchten Gens bestimmt werden.

Abb.8: Prinzip der Taqman-PCR basierend auf 5‘-3‘-Exonuklease-Aktivität der Taq Polymerase.
Bei der Extension wird der Reporter-Farbstoff (R) vom Quencher-Farbstoff (Q) abgespalten und erzeugt ein Fluoreszenzsignal.


40

Bei der Detektion durch die fluoreszenzmarkierte, genspezifische Sonde wird die
5‘-3‘-Exonuklease-Aktivität der Taq DNA Polymerase genutzt (Holland et al., 1991). Im ersten Schritt der PCR hybridisieren die spezifischen Primer und die fluoreszenz-markierte Sonde an den Matrizen-Strang (Abb.8). Die Sonde ist am 5‘-Ende mit einem Reporter-Farbstoff (Fluoreszein-Derivat) markiert, deren Fluoreszenz von einem Quencher-Farbstoff (Rhodamin-Derivat) am 3‘-Ende aufgrund der räumlichen Nähe unterdrückt wird. Bei der Extension verdrängt die Taq Polymerase die Sonde, die durch die 5‘-3‘- Exonuklease-Aktivität hydrolisiert wird. Dabei wird der Reporter-Farbstoff abgetrennt und kann nun ein Fluoreszenzsignal erzeugen. Die Taqman-PCR mit fluoreszenzmarkierter Sonde erfolgte im GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Perkin Elmer, Weiterstadt). Das Fluoreszenzsignal wurde während der PCR-Zyklen von einer CCD-Kamera empfangen und über ein entsprechendes Software-Programm (GeneAmp 5700 SDS Software, Perkin Elmer) prozessiert. Die benötigten PCR- Reagenzien (2xTaqman Universal PCR Master Mix mit AmpliTaq Gold, dNTP mit dUTP, AmpErase UNG, 25mM MgCl2) wurden vom gleichen Hersteller bezogen. Uracil-N-Glycosylase (UNG) bewirkt durch das eingebaute dUTP den Abbau der Amplikons und wird als Schutz vor Kontamination mit Produkten früherer PCR-Experimente eingesetzt. Die Amplifikation erfolgte durch eine 2-Schritt PCR mit 40 Zyklen (95°C, 15sec; 60°C, 1min) wobei zwei initiale Temperaturschritte (50°C, 2min; 95°C, 10min) vorausgingen. Aufgrund der Sensitivität dieser quantitativen PCR wurden von jeder cDNA-Probe drei identische PCR-Ansätze (Dreifachbestimmung) durchgeführt und als Ergebnis der Mittelwert mit der Standardabweichung berechnet.

2.10.4.1 Relative Quantifizierung

Im Falle einer 100% Effizienz der PCR müsste sich mit jedem Zyklus die Amplifikatmenge und analog dazu das Fluoreszenzsignal einer Probe verdoppeln. Die Effizienz der PCR eines bestimmten Amplifikates läßt sich durch die Erstellung einer Standardkurve aus unterschiedlichen Verdünnungsstufen einer Kontrollprobe bestimmen. Nach der Taqman-PCR wird das Fluoreszenzniveau bzw. die entstehende Amplifikatmenge in einer logarithmischen Funktion gegen die Zyklenzahl dargestellt. Als Maß zur Quantifizierung der Ausgangsmenge des genspezifischen Templates wird der CT-Wert definiert. Dieser Wert gibt für jede cDNA-Probe an, bei welcher Zykluszahl in der exponentiellen Phase ein vorher definiertes Fluoreszenzniveau (Basislinie) erreicht wird. Zum Vergleich der Expression eines Gens in unterschiedlichen cDNA-Proben


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wurde eine relative Quantifizierungsstrategie gewählt (PE-Applied Biosystems, User Bulletin No.2). Dabei werden nicht die absoluten Kopienzahlen oder Konzentrationen bestimmt, sondern die Expression des zu untersuchenden Gens wird auf ein zweites, ubiquitär homogen exprimiertes Gen bezogen (Bieche et al., 2001). Diese sogenannten ’’Housekeeping’’-Gene wie GAPDH und ß-Aktin dienen zur Normalisierung verschiedener Proben analog zur Northernblot-Analyse. Die relative Expression des zu untersuchenden Gens in den experimentellen Proben wird auf ein Standard-Probenmaterial (Kalibrator) bezogen. Die mathematische Kalkulation der Expression erfolgte durch die DeltaDeltaCT-Methode. Dabei wird im ersten Schritt für jede experimentelle Probe der CT-Wert des Referenzgens (z.B. GAPDH) vom CT-Wert des zu untersuchenden Gens subtrahiert (DeltaCT). Nach dieser Normierung wurden von den DeltaCT-Werten der experimentellen Proben der DeltaCT einer Standard-Probe abgezogen (DeltaDeltaCT). Der relative Expressionslevel einer Probe normalisiert zum Referenzgen und bezogen auf eine Standardprobe ergibt sich aus der arithmetischen Formel 2-ÄÄCT (GeneAmp 5700, User Manual, PE-Applied Biosystems).

2.10.4.2 Optimierung der Primer und Sonden

Die Auswahl der Sonden und Primer für die untersuchten Gene wurde mit einer speziellen Software des Herstellers (Primer Express, PE) abgeleitet (Tab.7).

Tab. 7: Sequenzen der verwendeten Primer und markierten Sonden für die Taqman-PCR.

Gen

5'-Primer Sequenz

3'-Primer Sequenz

ELBT

5'-CGGAACCGCAAGGGCT-3'

5'-TGTGAAACTGGCCCTGCGTCATG-3'

MS4A6A

5'-ACCAACGGGCACAGTTGG-3'

5'-TGATGACATTTGATGGGAGCA-3'

CGI-85

5'-ACCAGTTTGGTTCTTGATCCCTAT-3'

5'-CCTCGAGCTCCTCGAAGGA-3'

PPP2R5A

5'-GCCTTTCCAGTCCTCACAACC-3'

5'-TGGGACTCAAAGCCTCCATC-3'

putatives Calpain

5'-TCAGGAAGGCAGGTTTCACC-3'

5'-CGCATACCGCAGGGCA-3'

ERT/ ELF3

5'-CGGGCCATGAGGTACTACTACAA-3'

5'-ACGAGTCGCCGGCCA-3'

GAPDH

5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'

5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'

ß-Aktin

5'-TGCATTGTTACAGGAAGTCCCTT-3'

5'-GGGAGAGGACTGGGCCAT-3'

 

Gen

markierte Sonde 5'-FAM / 3'-TAMRA

Produktgröße in bp

ELBT

5'-GTAGATGGGAACCAGGTCAGCT-3'

84

MS4A6A

5'-ACACCATCATGACATCACAACCTGTTCCC-3'

85

CGI-85

5'-TTTTCAAACACACCAAATGAATACTAGCGCCT-3'

80

PPP2R5A

5'-TCCTTCACCTAGTCCCTCCTGACCCAG-3'

71

putatives Calpain

5'-TCAACAGCCAGGTGCAGCAGACCA-3'

62

ERT/ ELF3

5'-CGGGAGATCCTGGAACGGGTGG-3'

62

GAPDH

5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3'

206

ß-Aktin

5'-CCATCCTAAAAGCCACCCCACTTCTCTCTA-3'

79


42

Die Auswahlkriterien für die Primersequenzen (MWG Biotech, Ebersberg) richteten sich nach Standardprotokollen. Für die untersuchten Gene in dieser Arbeit (außer GAPDH und ß-Aktin) wurden intron-überspannende Primerpaare ausgewählt, um Auswirkungen möglicher genomischer Kontaminationen der eingesetzten cDNA-Proben in der Taqman-PCR zu vermeiden. Die Amplikon-Länge wurde für eine optimale PCR-Effizienz zwischen 75-150bp gewählt. Die zwischen den Primern lokalisierte Sonde wurde 5‘-FAM (Reporter) und 3‘-TAMRA (Quencher) fluoreszenzmarkiert eingesetzt (metabion, Martinsried). Um die optimalen PCR-Bedingungen für das zu untersuchende Gen zu erhalten, wurden spezifische Primer und Sonden vorher in unterschiedlichen Konzentrationen getestet.

Durchführung:

Bei der Primermatrix wurden die Primerpaare (Tab.7) in unterschiedlichen Konzentrationen getestet (50nM/50nM; 50nM/300nM; 50nM/900nM; 300nM/50nM; 300nM/300nM; 300nM/ 900nM; 900nM/50nM; 900nM/300nM; 900nM/900nM). Der 25µl PCR-Ansatz bestand aus 1x PCR Master Mix, 100nM genspezifische Sonde, 2ng cDNA Standardprobe und den variierten Primerkonzentrationen und wurde in einer 2-Schritt PCR (95°C, 15sec; 60°C, 1min) amplifiziert. Die Primerkonzentration, die den geringsten CT-Wert ergab, wurde für die weiteren Experimente eingesetzt. Bei der Sondenmatrix wurde ein PCR-Ansatz mit optimierten Primerkonzentrationen unter den gleichen Bedingungen wie oben angesetzt, wobei die Konzentrationen der Sonde (50nM, 100nM, 150nM, 200nM) variiert wurden. Die weiteren Experimente erfolgten mit der Sondenkonzentration des geringesten CT-Werts.

Mit den oben eingestellten Primer- und Sondenkonzentrationen wurden die Effizienz der PCR über eine Standard-Poben-Verdünnungsreihe überprüft. Dabei wurde ein PCR-Ansatz unter den gleichen Bedingungen wie oben gewählt, wobei Verdünnungsstufen der Standard-Probe von 4ng, 2ng, 0,5ng, 0,125ng gewählt wurden. In der Standardkurve (CT-Wert im Verhältnis zum log der Verdünnungsstufe) ließ sich die Effizienz über die Steigung berechnen (PCR-Effizienz 100% entspricht der Steigung 2).

2.10.4.3 Taqman-PCR mit experimentellen Proben

Die Taqman-PCR wurde mit cDNA-Proben der kommerziellen Normalgewebe, der Zelllinien und der mikrodissezierten Tumor- und Normalgewebe durchgeführt. Der 25µl PCR-Ansatz setzte sich aus 1x PCR Master Mix und den optimierten Konzentrationen der Sonde (50nM-200nM) und Primer (50-900nM) zusammen. Für die Taqman-PCR


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der Normalgewebe, Zelllinien und mikrodissezierten Gewebe wurden 2ng cDNA-Template eingesetzt. Die Normierung aller experimentellen Proben erfolgte über die Referenzgene GAPDH und ß-Aktin. Die Basislinie zur Bestimmung der CT-Werte wurde für alle Taqman-PCR Versuche auf 0,025 konstant gesetzt, um die Experimente untereinander vergleichen zu können.

2.10.5 Mutationsanalyse

Die Mutationsanalyse ist eine Methode zur Validierung von Tumorsuppressorgenen. Dabei sollen minimale Veränderungen wie Basensubstitutionen, kleine Deletionen und Insertionen nachgewiesen werden, die zum Verlust der Genfunktion führen können (Knudsen et al., 1971). Als Vorscreening stellt die SSCP (’’Single-Strand Conformational Polymorphism’’) -Analyse eine schnelle und sensitive Methode dar, Veränderungen in PCR-amplifizierten DNA-Abschnitten nachzuweisen (Orita et al., 1989). Die PCR-Fragmente können fluoreszenzmarkiert und nach der Denaturierung der DNA durch die Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) analysiert werden (Makino et al., 1992). Dabei bilden die DNA-Einzelstränge Sekundärstrukturen aus, die spezifisch für ihre Primärsequenz sind. Mutationen können aufgrund der Konformationsänderungen durch unterschiedliches Laufverhalten im Gel im Vergleich zur Wildtyp-DNA detektiert werden. Die Bildung der Sekundärstruktur und Auftrennung im Gel ist stark abhängig von variablen Bedingungen wie Temperatur und Ionenkonzentration während der Elektrophorese. Die Verifizierung der Veränderungen erfolgt durch Sequenzierung der auffälligen PCR-Fragmente des Kandidatengens.

In dieser Arbeit wurde ein potenzielles Tumorsuppressorgen (ELBT) in Brusttumoren untersucht. Erster Schritt war die Amplifikation der Exons des Kandidatengens (ELBT) durch flankierende Primer in Brusttumor-DNA-Proben. Die Markierung der PCR-Fragmente erfolgte anschließend in einem Post-PCR-Labeling-Verfahren durch den Einbau eines fluoreszenzgekoppelten Nukleotids mittels des Klenov-Enzyms
(Inazuka et al., 1996). Die elektrophoretische Auftrennung der Fragmente wurde bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Nach der SSCP-Analyse wurden alle Tumor-DNA-Fragmente, die nach der Elektrophorese im Vergleich zur Wildtyp-DNA ein auffälliges Bandenmuster zeigten, nachsequenziert.


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2.10.5.1 Herkunft der Brusttumor-DNA

Vom Universitätsklinikum Charité in Berlin wurden 71 Brusttumore zur Verfügung gestellt. 47 Tumore lagen als DNA-Proben vor, 24 Brusttumore wurden zuvor mikrodisseziert und die DNA anschließend isoliert. Der Großteil der Brusttumore (ca. 90%) waren invasiv duktale Karzinome.

2.10.5.2 PCR-Amplifikation von Tumor-DNA

Das in der Mutationsanalyse untersuchte Gen (ELBT) bestand aus acht Exons. Die Exons 2-8 konnten jeweils durch ein flankierendes Primerpaar in der intronischen Sequenz amplifiziert werden (Tab.8). Für das erste Exon war der 5‘-Primer innerhalb des Exons lokalisiert, da zu diesem Zeitpunkt keine intronische Sequenz zur Verfügung stand. Es wurde die gesamte kodierende Region auf Mutationen untersucht. Die Optimierung der PCR erfolgte in einer Gradienten-PCR (Mastercycler Gradient, Eppendorf, Hamburg) mit zwei unterschiedlichen MgCl2-Konzentrationen.

Tab. 8: Primer zur Amplifikation der 8 Exons von ELBT. Am 5‘-Ende der Primer wurde an die genspezifische Sequenz zusätzlich die Basen ‘‘ATT‘‘ angefügt, die zur Fluoreszenz-Markierung dienten.

ELBT

5'-Primer Sequenz

3'-Primer Sequenz

Produktgröße in bp

Exon 1

5'-ATTTCAGCCATGAAGACCCTCATAG-3'

5'-ATTCTTCTCGCAGGTCCATAACC-3'

163

Exon 2

5'-ATTGAGAGAAGGGTGACAGTGGA-3'

5'-ATTGACACTGCCTGCCCACCT-3'

215

Exon 3

5'-ATTAAGCCCAGTAGGACCTGACC-3'

5'-ATTCTAGAATGAGAGGTGGGGCA-3'

187

Exon 4

5'-ATTCACCCCCACCAACTCTGTAT-3'

5'-ATTATTCCCACCCTCCCAAAAC-3'

160

Exon 5

5'-ATTCTCTCCCAGCCAGTTTCCTC-3'

5'-ATTCCTTGACAACAGTGCCCAG-3'

292

Exon 6

5'-ATTCAACCCTGACTGTTGCGTC-3'

5'-ATTTGGAGGGGTGTGTGTGTGT-3'

244

Exon 7

5'-ATTGCCAGTAAGTAGGGTATGACAGA-3'

5'-ATTGTTCAGGACAGCCCTTGGT-3'

284

Exon 8

5'-ATTGGTGTTGACTAACCAGAAGCCT-3'

5'-ATTATTTGCAGCTGGTTCCTCC-3'

244

Durchführung:

In einem 25µl Ansatz wurden 1xPCR-Puffer, 0,2mM dNTP, 0,2µM 3‘-Primer, 0,2µM
5‘-Primer, 2 Units Taq Polymerase, 15mM bzw. 40mM MgCl2 (alle Life Technologies, Eggenstein) und 30ng Plazenta-DNA 35 Zyklen in einer Gradienten-PCR (94°C, 30sec; 50-70°C, 30sec; 72°C, 1min) amplifiziert. Im Falle unspezifischer Produkte wurde eine ‘‘Hot-Start‘‘-PCR mit 2 Units AmpliTaq GoldTM DNA Polymerase (Perkin Elmer, Langen) durchgeführt. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte im 2% Agarosegel. Von den Tumor-DNA-Proben wurden 50ng unter den optimierten PCR-Bedingungen amplifiziert. Als Wildtyp-Kontrolle wurde eine Plazenta-DNA eingesetzt.


45

2.10.5.3 Fluoreszenz-Markierung der PCR-Fragmente

Zur Detektion der PCR-Fragmente in der SSCP-Analyse wurden die PCR-Fragmente mit dem fluoreszenzgekoppelten Nukleotid R6G-dUTP durch die Klenov-Enzym-basierte 3‘-Austauschreaktion markiert. Die Markierung erfolgte durch die 5‘-3‘-Exonukleaseaktivität des Klenow-Fragmentes, wobei das letzte Nukleotid am 5‘-Ende des Gegenstranges des PCR-Fragments durch R6G-DUTP ersetzt wurde. Um die Austauschreaktion zu erleichtern, wurden nach dem Adenin am 5‘-Ende zwei Thymine als Abstandhalter in die Primer-Sequenz eingebaut. Das entsprechende Thymin auf dem Gegenstrang wurde gegen R6G-DUTP ausgetauscht. Bei der Markierungsreaktion wurden beide Stränge markiert.

Für die 10µl Post-PCR-Labeling-Reaktion wurden 5mM Tris-HCl (pH8,7), 10mM MgCl2, 0,4µM R6G-dUTP (PE Applied Biosystems, Weiterstadt), 5 Units Klenow-Fragment (New England BioLabs, Frankfurt) und 5µl PCR-Fragment 30min bei 37°C inkubiert. In einem Multiplexansatz wurden bis zu drei PCR-Fragmente unterschiedlicher Exons in einem Markierungsansatz gepoolt. Durch Zugabe von 5mM EDTA und 3 Vol deionisiertem Formamid wurde die Reaktion abgestoppt. Die Analyse im SSCP-Gel erfolgte am selben Tag der Markierung.

2.10.5.4 SSCP-Analyse

Die fluoreszenz-markierten PCR-Fragmente wurden in einem 8%igen Poyacrylamidgel (AccuGelTM 40%, 29:1 Acrylamid:Bisacrylamid-Lösung, National Diagnostic, Atlanta, USA) mit 10% deionisiertem Formamid aufgetrennt. Dafür wurde 1µl Post-PCR-Labeling-Ansatz mit 0,4µl Rhodamin-markiertem DNA-Größenstandard GS500 und 0,6µl Dextran-Blue Stammlösung (Perkin Elmer, Langen) gemischt, bei 94°C denaturiert und anschließend bis zum Auftragen auf Eis gelagert. Die Elektrophorese erfolgte im Sequenzierautomat ABI PRISM 377 DNA (PE Applied Biosystem, Weiterstadt) unter gerätespezifischen Einstellungen (Elektrophoreseleistung 200W, Geltemperatur siehe unten, Laser-Leistung 40mW, Laufzeit 12h, CCD-Einstellung 250, CCD-Empfindlichkeit 2, CCD X Pixel Position 196). Die Geltemperatur wurde über ein externes Kühlgerät eingestellt und konstant gehalten, wobei alle PCR-Fragmente bei drei Geltemperaturen (15°C, 25°C und 30°C) aufgetrennt wurden. Die Analyse der Rohdaten des Sequenzierautomats erfolgte über die Software GeneScanTM 672 (PE) auf Basis der Laufstrecke der Fragmente. Der interne Standard GS500 wurde zur Größenbestimmung und Identifizierung der Fragmente im Multiplexansatz benutzt. Die


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ausgegebenen Elektropherogramme stellten für jedes PCR-Fragment die Fluoreszenzintensität als Funktion der Laufzeit dar. Über den Vergleich der Elektropherogramme des Wildtyp-Fragmentes mit den PCR-Produkten der Tumor-DNA konnten die Fragmente identifiziert werden, die ein auffälliges Laufverhalten im Gel zeigten.

2.10.5.5 Sequenzierung auffälliger Fragmente

Die in der SSCP- Analyse auffällig gewordenen Exonfragmente wurden in einem 50µl PCR-Ansatz (B.10.6.2) amplifiziert, über eine kommerzielle Säule (QIAquick PCR Purification Kit) gereinigt und in 30µl TE-Puffer aufgenommen. Die Sequenzierung erfolgte mit 5µl gereinigtem PCR-Produkt wie in B.8.4 beschrieben. Anschließend wurden die sequenzierten Fragmente im gap4-Projekt mit der Wildtyp-Sequenz verglichen und nach möglichen Veränderungen in der Tumor-DNA untersucht.

2.11 RNA in-situ Hybridisierung

Die RNA in-situ Hybridisierung (ISH) erstmals beschrieben von Gall und Pardue (1969) sowie John et al (1969) wird zur qualitativen und semi-quantitativen Expressionanalyse eingesetzt. Bei dieser Methode werden genspezifische Nukleinsäure-Sequenzen in ihrer zellulären Umgebung visualisiert. Als Sonde können DNA und RNA Proben genutzt werden, die radioaktiv oder nicht-radioaktiv mit Digoxygenin (DIG), Biotin oder Fluorochromen markiert sind. In dieser Arbeit wurden RNA-Sonden eingesetzt, die über die in-vitro Transkription von genspezifischer cDNA generiert und DIG-markiert wurden (Holtke et al., 1990; Komminoth et al., 1992a,b). Bei der in-vitro Transkription konnten die T3-, T7- und SP6-Promotorsequenzen der Klonierungsvektoren genutzt werden (Dunn and Studier, 1983; Kassavetis et al., 1982). Im ersten Schritt wurde die Plasmid-DNA der cDNA-Klone linearisiert und durch die entsprechende RNA-Polymerase unter Einbau von Digoxygenin-markiertem dUTP in-vitro transkribiert. Dabei wurde neben der spezifischen Antisense-Sonde auch eine Sense-Sonde als Negativ-Kontrolle hergestellt. Die Hybridisierung erfolgte auf paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten, die zuvor mittels der Vorhybridisierung entparaffiniert, rehydriert und fixiert wurden. Die Detektion der Hybridisierung wurde durch die Bindung des alkalische Phosphatase-gekoppelten Anti-DIG-Antikörpers ermöglicht, der nach Zugabe des Substrates BM Purple eine blaue Präzipitation verursacht. Eine Überprüfung der Spezifität des Hybridisierungssignals wurde durch die zelluläre Lokalisation des Präzipitates und der Sense-Negativkontrolle ermöglicht.


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2.11.1 Herkunft des Paraffingewebes

Die verwendeten paraffin-eingebetteten Tumor- und Normalgewebe wurden zusammen mit Informationen über die Histopathologie im Rahmen einer Kooperation von dem Universitätsklinikum Charité in Berlin zugesendet. Weitere Gewebearrays (’’Multiple Tissue Arrays’’) wurden von der Firma Biocat GmbH, Heidelberg bezogen.

2.11.2 Präparation der RNA-Sonden

Für die Linearisierung der Antisense- und Senseprobe wurden 20µg Plasmid-DNA mit 20 Units Restriktionsenzym in Abhängigkeit vom Vektor 3h verdaut (Tab.9).

Tab. 9: Angaben der Restriktionsenzyme für die Linearisierung und der RNA-Polymerasen für die in-vitro Transkription in Abhängigkeit von den Vektoren.

Vektor

Linearisierung

RNA-Polymerase

 

Antisense

Sense

Antisense

Sense

pT7T3D (-PAC)

EcoRI (AvaI)

HindIII (NotI)

T3

T7

(p)Bluescript SK-

EcoRI (XbaI)

XhoI (PstI)

T7

T3


Die Aufreinigung des Linearisierungsansatzes erfolgte durch Zugabe von 1 Vol Phenol (Tris-gesättigt, pH8,0). Nach dem Mischen und Abzentrifugieren (12.000g, 5min, Rt) wurde der wässrige Überstand abgenommen, mit 1 Vol Chloroform vermischt und erneut wie oben abzentrifugiert. Der wässrige Überstand, welcher die gereinigte DNA enthält, wurde in 2,5 Vol absolutem Ethanol und 1/10 Vol 3M NaAc (pH7,0) 10min bei
-80°C gefällt und abzentrifugiert (12.000g, 10min, 4°C). Das Pellet wurde mit
70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 40µl H2ODEPC aufgenommen. Zur Konzentrationsabschätzung der linearisierten DNA wurden 1µl der Probe und 250ng DNA-Standard (MarkerIII, Roche Diagnostics, Mannheim) auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen, und die Konzentration über den Vergleich mit dem Standard abgeschätzt.

Für die in-vitro Transkription wurde 1µg linearisierte DNA in einem 20µl-Ansatz mit
2µl DIG RNA Labeling Mix (je 10mM ATP,CTP,GTP, 6,5mM UTP, 3,5mM DIG-UTP in Tris-HCl, pH7,5), 2µl 10xTranscription Puffer (400mM Tris-HCl, pH8,0, 60mM MgCl2, 100mM DTE, 20mM Spermidine, 100mM NaCl, 1 Unit/ml RNase Inhibitor), 16 Units RNase Inhibitor und 16 Units RNA-Polymerase für 3h bei 37°C inkubiert (alle Reagenzien von Roche, Mannheim). Die RNA wurde anschließend durch Zugabe von 2,5µl 4M LiCl und 75µl absolutem Ethanol 10min bei -80°C gefällt und abzentrifugiert (12.000g, 30min, 4°C). Die gefällte RNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen, 5min luftgetrocknet und in 50µl H2ODEPC aufgenommen. Die Kontrolle der in-vitro


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transkribierten RNA erfolgte im 0,7% Agarose-RNA-Gel (in 1xMOPS-Puffer mit
1% Formaldehyd). Dabei wurde 1µl RNA mit 40% Formamid, 6% Formaldehyd, 400ng in 1xMOPS-Puffer vermischt, 10min bei 65°C inkubiert und auf Eis gestellt. Die Proben wurden neben einem RNA-Größenstandard mit 1/6 Vol RNA-Ladepuffer (50% Glycerin, 1mM EDTA, 0,4% Bromphenolblau, 0,4% Xylencyanol) versetzt und elektrophoretisch aufgetrennt. Die gesamte RNA wurde in 1/20 Vol Hybridisierungslösung (siehe Anhang G1) aufgenommen und bei -20°C gelagert.

2.11.3 Hybridisierung der Paraffinschnitte

Bei der Vorhybridisierung der paraffinierten Gewebe wurden die Schnitte durch Xylol entparaffiniert und mittels einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert. Zwei Inkubationsschritte mit Paraformaldehyd (PFA) dienten der Fixierung der Gewebestrukturen, während durch die Proteinase-K-Behandlung das Gewebe angedaut und für die anschließende Hybridisierung mit der RNA-Sonde zugänglich gemacht werden sollte. Die Inkubations-schritte der Vorhybridisierung wurden in gebackenen Küvetten durchgeführt. Alle anzusetzenden Lösungen (mit Ausnahme von Tris-Puffern) wurden mit 0,1% DEPC versetzt und sterilfiltriert.

Vorhybridisierung:

Die Präparate wurden dreimal 10min in Xylol entparaffiniert. Die Rehydrierung erfolgte zweimal 5min in absolutem Ethanol und anschließenden einminütigen Inkubationsschritten in absteigenden Ethanol-Konzentrationen (95%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30%). Die Präparate wurden zweimal 5min in 1xPBS gewaschen, 30min in 4% PFA fixiert und wiederholt zweimal 5min in 1xPBS gewaschen. Anschließend wurden die Präparate in Proteinase K-Puffer (10µg/ml Proteinase K) 10min inkubiert und erneut zweimal in 1xPBS gewaschen. Es erfolgte ein erneuter Fixationsschritt 30min in 4% PFA mit weiteren Inkubationen 5min in 1xPBS und zweimal 2min in 2xSSC. Bis zur Hybridisierung mit der Sonde inkubierten die Schnitte mindestens 30min in Tris-Glycin-Puffer.

Hybridisierung der RNA-Sonde:

Vor der Sonden-Hybridisierung wurde die überschüssige Flüssigkeit von den Gewebeschnitten entfernt und die Objektträger mit der Schnittfläche nach oben in eine 4-Well-Schale gelegt. Die Schnitte wurden mit 100µl Hybridisierungslösung (2,5ng/µl RNA-Sonde) versetzt, wobei die Flüssigkeit durch ein Parafilm-Streifen auf dem Präparat verteilt und abgedeckt wurde. Die Hybridisierung erfolgte 12h bei 65°C in einer


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feuchten Kammer. Anschließend wurden die Präparate in Küvetten überführt. Nach dreimaligem Waschen für je 20min in 5xSSC bei Rt wurden die Präparate 40min bei 60°C in Formamid-Waschlösung (20% Formamid, 0,5xSSC) inkubiert. Die Formamid-Waschlösung wurde einmal gewechselt und sehr langsam (über ca. 1,5h) auf 37°C abkühlt. Es folgte ein Waschschritt für 15min bei 37°C in NTE-Puffer (0,5M NaCl, 10mM Tris-HCl, pH7,0, 0,5mM EDTA). Die nicht-gebundene RNA wurde im nächsten Waschschritt 30min bei 37°C in NTE-Puffer mit RNase A (10µg/ml) abgebaut und die Präparate anschließend erneut in NTE-Puffer für 15min bei 37°C gewaschen. Es folgte ein wiederholter Waschschritt in Formamid-Waschlösung 40min bei 60°C und eine zweimalige Inkubation in 2xSSC für 15min bei Rt.

Antikörper-Inkubation:

Vor der Antikörper-Inkubation wurden die Schnitte 1h in 1% Blocking-Lösung
(1% Blocking Reagent, Roche, Mannheim, in 0,1M Maleinsäure-Puffer) inkubiert. Die Hybridisierung der Präparate erfolgte mit dem Anti-DIG-Antikörper (Roche; 1:2000 verdünnt in 1% Blocking-Reagent) 12h bei 4°C in einer feuchten Kammer. Die Präparate wurden anschließend dreimal 10min und zweimal 1h in 1xTBST-Puffer (1xTBS mit 0,1% Tween-20), und dreimal 10min in NTMT-Puffer (100mM NaCl, 100mM Tris-HCl, pH9,5, 50mM MgCl2, 0,1% Tween-20) gewaschen.

Detektion und Gegenfärbung:

Für die Detektion des Hybridisierungssignals wurden die Schnitte in 1ml BM-Purple (Roche) mit 2mM Levamisol und 0,1% Tween-20 bei Rt (schnelle Reaktion) oder 4°C (langsame Reaktion) inkubiert und je nach Färbereaktion zweimal täglich gewechselt. Die Färbedauer betrug in der Regel bis zu vier Tage, wobei die Reaktion unter dem Binokular kontrolliert wurde. Bei gut sichtbarem Signal wurden die Präparate dreimal 10min in NTMT-Puffer gewaschen und mit 0,1% Kernechtrot-Lösung 10min gegengefärbt. Abschließend wurden die Schnitte mit Kaisers Glyceringelatine eingedeckelt.


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Thu Jan 30 14:01:20 2003