Kuner, Ruprecht: Identifizierung differenziell exprimieter Gene bei Brust- und Ovarialkarzinomen in den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23

50

Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Validierung der in-silico Expressionsanalyse

3.1.1 Auswertung des elektronischen Northern

Grundlage dieser Arbeit war die in-silico Expressionsanalyse von Genen durch die Nutzung von EST-Bibliotheken, die aus verschiedenen Normal- und Tumorgeweben generiert wurden. Der daraus resultierende elektronische Northern zu jedem Gen gab Aufschluss über das Expressionsmuster in den Geweben und den korrespondierenden Tumoren, wobei die signifikante differenzielle Expression hinsichtlich Brust- und Ovarialgewebe Auswahlkriterium für die weitere Validierung potenziell tumorassoziierter Gene war. Der elektronische Northern zeigt am Beispiel des Gens YAP65 (’’Yes-Associated Protein’’, 65kDa) die Verteilung der über AUTEX identifizierten ESTs aus den cDNA-Datenbanken von 23 Organen und Zelltypen bzw. ihren korrespondierenden Tumoren (Tab.10).

Tab. 10: Elektronischer Northern von YAP65

Gewebetyp

Normalgewebe

Tumorgewebe

Verhältnis

T/N

P- Wert á

Signifikanzin %

Treffer

Bibliotheks-Größe

Treffer

Bibliotheks-Größe

   

Blase

2

25641

2

42550

0.60

0.635

36.5

Blut-Leukozyten

0

130844

0

941

-

-

-

Brust

26

120725

6

67582

0.41

0.0437

95.6

B-Zell-Lymphom

1

108530

0

7357

-

1

0.0

Dickdarm

3

31042

4

35626

2.38

0.259

74.1

Dünndarm

3

36432

2

9379

2.56

0.272

72.8

Endometrium

3

18977

2

6023

2.08

0.6

40.0

Gehirn

1

110439

4

38567

11.11

0.0178

98.2

Haut

2

27182

0

1180

-

1

0.0

Herz

9

98496

0

7271

-

1

-0.0

Hoden

2

29540

0

16891

-

0.537

46.3

Leber

1

21521

1

15763

1.37

1

-

Lunge

8

96193

4

43114

1.11

1

0.0

Magen-Speiseröhre

0

13799

0

12119

-

-

-

Myometrium

10

35843

0

14713

-

0.0409

95.9

Nebenniere

0

25886

0

20230

-

-

-

Niere

3

44566

1

40078

0.37

0.627

37.3

Ovar

4

33687

7

41736

1.41

0.764

23.6

Pankreas

0

65807

0

21808

-

-

-

Prostata

7

88661

4

76762

0.66

0.56

44.0

Skelettmuskel

1

58315

1

27063

2.17

0.533

46.7

Squamöse Zellen

4

33833

3

25706

0.99

1

0.0

T-Zell-Lymphom

1

60680

0

17313

-

1

-0.0


51

In den Brustgewebe-Bibliotheken ergaben sich für YAP65 im Normalgewebe 26 ESTs (Treffer) gegenüber 6 ESTs im Tumorgewebe. Die Bibliotheksgröße der einzelnen Gewebe und entsprechenden Tumore wurde durch die EST-Gesamtzahl aller gepoolten cDNA-Datenbanken eines Gewebetyps bestimmt. Um relative Expressionswerte der Gene zu analysieren und dadurch die differenzielle Expression zu ermitteln, wurden die EST-Treffer in Abhängigkeit zur Bibliotheksgröße ausgewertet. Das Verhältnis Tumor zu Normalgewebe (T/N) zeigte bei YAP65 eine schwächere Expression im Brusttumor (T/N<1) verglichen mit dem Brustnormalgewebe oder eine stärkere Expression im Hirntumor (T/N>1) verglichen mit normalem glialen Gewebe. Die Signifikanz dieser differenziellen Expression ergab sich nach der Auswertung durch den Fisher Exact Test. Als Signifikanzschwelle wurde ein P-Wert á<0,1 bzw. ein Signifikanzwert von über 90% angesetzt. Bei YAP65 war diese Signifikanzschwelle im Falle der differenziellen Expression in Brustgewebe (á=0,0437; 95,6%) erfüllt, so dass der elektronische Northern auf eine mögliche Involvierung von YAP65 in die Entstehung bzw. Progression des Brustkarzinoms hindeutete.

3.1.2 Bestätigung der in-silico Expressionsdaten

Zur Verifizierung des elektronischen Northern wurde das in-silico generierte Expressionsmuster mit den experimentellen Expressionsdaten aus den Northernblot- und cDNA-Array-Experimenten verglichen. Exemplarisch wurde dieser Vergleich für zwei durch diesen Ansatz identifizierte Kandidatengene, YAP65 und ein putatives Calpain, dargestellt. Der elektronische Northern beinhaltet neben dem Expressionsverhältnis von Normal- und Tumorgewebe Informationen über die Gewebespezifität des untersuchten Gens. Im experimentellen Teil der Arbeit wurde das Expressionsmuster von YAP65 und dem putativen Calpain in 16 verschiedenen Normalgeweben mit Hilfe des Northernblots bestimmt. Zur besseren Darstellung des Vergleichs der Expressionsdaten des in-silico Ansatzes und des Northernblots wurde der elektronische Northern auf 13 äquivalente Normalgewebe reduziert, wobei die Anzahl der ESTs von YAP65 und dem putativen Calpain in den einzelnen Geweben auf eine konstante Bibliotheksgröße (Treffer/ 100.000 ESTs) umgerechnet wurde (Abb.9). Die drei Gewebe Milz, Thymus und Plazenta des Northernblots waren im elektronischen Northern nicht vertreten und konnten für diese Validierung nicht herangezogen werden. Die
13 Gewebe sind hinsichtlich der Expressionsstärke von YAP65 im elektronischen Northern absteigend aufgelistet. Beide Expressionsexperimente zeigen ein nahezu


52

ubiquitäres Vorkommen von YAP65. Die starke Expression von YAP65 in den cDNA-Bibliotheken des Ovars und des Herzes im elektronischen Northern bestätigte sich im Northernblot. Die schwache Expression von YAP65 in Gehirn und die nicht vorhandenen ESTs in den peripheren Blutleukozyten stellten sich auch in den Expressionsdaten des Northernblots dar. Bei den moderat exprimierenden Geweben waren mit wenigen Ausnahmen, wie Dickdarm und Pankreas, ähnliche Tendenzen des Expressionsmusters von YAP65 festzustellen. Mit dem Gen YAP65 wurde die Verifizierung des elektronischen Northern am Beispiel eines ubiquitär exprimierten Gens dargestellt. Eine Korrelation der Expressionsdaten war in diesen Fällen bei größeren quantitativen Unterschieden signifikant.

Abb.9: Vergleich der Expression von YAP65 und dem putativen Calpain in verschiedenen Normalgeweben zwischen elektronischem Northern (Tabelle) und MTN-Northernblot. Im elektronischen Northern beziehen sich die EST-Zahlen der Gene, die die Expressionstärke in den Geweben repräsentieren, auf eine definierte Bibliotheksgröße von 100.000 ESTs (Freq/100.000). Zur Quantifizierung der Gewebe des Northernblots ist die Hybridisierung mit ß-Aktin dargestellt.

Bei dem putativen Calpain zeigte der elektronischen Northern eine sehr gewebespezifische Expression besonders in Dickdarm (16/100.000ESTs) und sehr schwach in Dünndarm, Lunge und Prostata (Abb.9). Der MTN-Northernblot bestätigte die spezifische, sehr starke Expression im Dickdarm und zeigte darüber hinaus wie im elektronischen Northern eine schwache Expression in der Lunge. Die identifizierten ESTs des elektronischen Northern im Dünndarm und Prostata wurden nicht bestätigt. Die Verifizierung des elektronischen Northern war in großem Maße abhängig von der


53

Bibliotheksgröße der beteiligten Gewebe. Je größer die Gesamtzahl der ESTs für ein Gewebe, desto repräsentativer die Anzahl der ESTs eines spezifischen Gens bezogen auf die relative Expression zu anderen Geweben.

Die Gene YAP65 und das putative Calpain wurden aufgrund der in-silico differenziellen Expression in Brust- bzw. Ovarialtumoren identifiziert. Zur Verifizierung der Expressionunterschiede zwischen den Normalgeweben und den korrespondierenden Tumoren erfolgte der Vergleich mit einem radioaktiv markierten cDNA-Array. Auf dem cDNA-Array waren zu verschiedenen Geweben sowohl Normalgewebe als auch Tumorgewebe von Patienten repräsentiert (Brusttumoren: Nr.1, 3, 5, 6, 7, 9: IDCs; Nr.2: ILC; Nr.4: medullär; Nr.8: mucinös; Ovartumore: Nr.1-3: Adenokarzinome; Nr.1: serös; Nr.3: papillär). In der Gegen-überstellung wurde der elektronische Northern und der cDNA-Array auf die Gewebe Brust und Ovar reduziert, für die in dieser Arbeit tumorassoziierte Gene untersucht wurden (Abb.10).

Abb.10: Vergleich der differenziellen Expression von YAP65 und dem putativen Calpain in Brust- und Ovarialtumoren zwischen den Methoden des elektronischen Northern und des radioaktiv markiertem cDNA-Arrays. Die Werte unter den cDNA-Arrays geben die densitometrisch ermittelten Expressionsverhältnisse (T/N) der Probenpaare wieder, die zuvor auf die ß-Aktin-Expression normiert wurden.


54

Die verringerte Expression von YAP65 im Brusttumor (T/N=0,41) des elektronischen Northern bestätigte sich bei vier der neun Probenpaare (Nr.1, 2, 4, 8; T/N<0,5) auf dem cDNA-Array. In den Ovarialtumorproben des cDNA-Arrays zeigte sich ebenfalls in allen drei Fällen (Nr.1, 2, 3; T/N<0,5) eine verringerte Expression im Tumorgewebe, wobei der elektronische Northern auf keine entsprechende differenzielle Expression hindeutete. Im Unterschied zu den gepoolten cDNA-Bibliotheken aus den Geweben (Tumor/Normal) mehrerer Patientinnen als Grundlage des elektronischen Northern, beziehen sich die visualisierten Expressionssignale des cDNA-Arrays auf das Gewebe einer Patientin. Der cDNA-Array gibt daher individuelle Expressionsunterschiede eines Gens zwischen verschiedenen Patientinnen und Geweben unterschiedlicher Histologie wieder, die sich in der Inhomogenität der Expressionsdaten wiederspiegeln. Die Ergebnisse der beiden Expressionsexperimente zeigten das Gen YAP65 in den untersuchten Tumoren herunterreguliert und lassen auf eine mögliche Tumorassoziation schließen.

Im Falle des putativen Calpains zeigte der elektronische Northern eine signifikant verstärkte Expression in Brusttumorgewebe gegenüber dem Normalgewebe (T/N=5,0) und ähnliche Verhältnisse hinsichtlich des Ovargewebes. Es bestätigte sich auf dem cDNA-Array in sieben der neun Gewebepaare für Brust (Nr. 3-9; T/N>2) eine verstärkte Expression des Calpains in den Tumorproben, von denen drei Probenpaare (Nr.3, 5, 6; T/N>4) eine ähnlich hohe differenzielle Expression zeigten wie im elektronischen Northern. Dieses Ergebnis ließ darauf schließen, dass die Expression des putativen Calpains im Brusttumor gegenüber dem Normalgewebe hochreguliert ist. Die in-silico differenzielle Expression im Ovargewebe wurde mittels des cDNA-Arrays nicht bestätigt, wobei sich bei allen drei Gewebepaaren keine Expression des Calpains nachweisen ließ.

Der elektronische Northern stellte sich als schnelle und verifizierbare Methode dar, über die Analyse der differenziellen Expression potenzielle tumorassoziierte Gene zu identifizieren.


55

3.2 Kartierung von 330 in-silico Kandidatengenen für gynäkologische Tumore

Nach der genomweiten in-silico Expressionsanalyse für die gynäkologischen Tumore der Ursprungsgewebe Brust, Ovar, Endometrium und Myometrium ergaben sich insgesamt 457 putative Gene, die nach dem elektronischen Northern in mindestens einem der genannten gynäkologischen Tumore differenziell exprimiert waren. Die
457 in-silico differenziell exprimierten Gene repräsentieren ein nicht-redundantes Set von 330 Kandidatengenen, die mittels der elektronischen PCR und des Radiation Hybrid Mappings chromosomal kartiert wurden (Dahl et al., 1999; Abstract). Die chromosomale Verteilung dieser Kandidatengene wurde anschließend mit bereits beschriebenen aberranten Regionen für die gynäkologischen Tumore verglichen (Abb.11.1/.2). Dabei zeigten sich die potenziell tumorassoziierten Gene nicht zufällig über das menschliche Genom verteilt. Ein große Zahl von Kandidatengenen wurde in chromosomale Regionen kartiert, die in LOH- und Amplifikationsstudien für gynäkologische Tumore häufig als aberrant beschrieben wurden. Beispielsweise in den häufig deletierten Regionen 1p36-p31, 3p21-p14, 6q21-q27, 7q11-q31, 10q23-q26, 11p15, 11q12-q23, 13q21, 17q und 22q sowie in den häufig amplifizierten Regionen 1q32-q41, 8q, 11q, 17q und 20q wurden über 120 in-silico Kandidatengene lokalisiert, die neben bereits bekannten tumorassoziierten Genen neue potenzielle Zielgene für die Tumorentstehung oder Tumorprogression darstellen. In mehreren chromosomalen Regionen wie 1q21-q22, 1q32-q41, 6q21, 7q11, 8p12, 9q34, 10q26, 11p15, 11q12-q23, 19q13, 20q13, 21q22, 22q12-q13 sind signifikante Anhäufungen von Kandidatengenen zu beobachten, die zur weiteren Charakterisierung als besonders interessant erscheinen. Die Kartierung der in-silico Kandidatengene stellt zusammen mit dem Vergleich von beschriebenen chromosomalen Aberrationen die Grundlage für eine Vielzahl möglicher Projekte zur Evaluierung von tumorassoziierten Genen und Proteinen dar. Für diese Arbeit erfolgte eine Auswahl der Kandidatengene aus den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23. Beide Chromosomenabschnitte zeigen signifikante Anhäufungen von in-silico Kandidatengenen und stellen für Brust- und Ovarialkarzinome häufig als aberrant beschriebene Regionen dar, in denen noch unbekannte tumorassoziierte Gene vermutet werden. Die gesamte Kartierungsübersicht soll ausschließlich die Vorgehensweise in dieser Arbeit demonstrieren. Detaillierte Angaben zu den verschlüsselten Genen der anderen chromosomalen Bereiche sind in der Arbeit nicht enthalten.


56

Abb.11.1: Teil 1 der Übersicht über die chromosomale Verteilung von 330 Kandidatengenen für gynäkologische Tumore im Vergleich mit beschriebenen Aberrationen.


57

Abb.11.2: Teil 2 der Übersicht über die chromosomale Verteilung von 330 Kandidatengenen für gynäkologische Tumore im Vergleich mit beschriebenen Aberrationen. Die Literaturhinweise sind im Anhang nach den Chromosomen geordnet (G.3,Tab.27) wiedergegeben. Die Legende gibt Auskunft über Expressionscharakter der Gene für die entsprechenden Gewebe.


58

3.3 Beschreibung der Kandidatengene in 11q12-q23

3.3.1 Validierung aller in-silico Kandidatengene in 11q12-q23

Aus dem genomweiten Ansatz der in-silico Expressionsanalyse für gynäkologische Tumore wurden nach der chromosomalen Kartierung neun Gene in der Region 11q12-q23 identifiziert. Die Annotation der assemblierten Sequenzen nach der AUTEX-Analyse gegen die Nuklein- und Proteindatenbank ergab für alle neun Gene Identitäten zu entsprechenden Datenbankeinträgen (Tab.11).

Tab. 11: Beschreibung der in-silico differenziellen Gene aus der chromosomalen Region 11q12-q23.
*Der Name ELBT wurde für ein während dieser Arbeit noch unbekanntes Gen vergeben (aktueller Datenbankeintrag Stand Oktober 2001: DGAT2).

Gene in 11q12-q23

Gene Abkürzung

Genbank Eintrag

Funktion

Referenz

GS1999full (LOC84649)

ELBT *

gi14211870

unbekannt

 

Frizzled homolog 4

FZD4

gi6912383

Aktivierung des wnt-Signalweges

Kirikoshi et al., 1999; Sagara et al., 2001

CD20-like precursor (LOC64166)

MS4A6A

gi11641258

unbekannt

Liang et al.,2001

Yes-associated protein 1, 65kDa

YAP65

gi5174750

Transkriptions-Co-Aktivator mit WW1-und SH3-Domäne; bindet p53-Bindungsproteine

Sudol et al., 1995;
Yagi et al., 1999;
Espanel et al., 2001

Death associated protein 4

DAP4

gi9886758

Homologie zu P52rIPK;
Regulation der doppelsträngigen
RNA-aktivierten Protein Kinase

Gale et al., 1998

CGI-85 protein

CGI-85

gi7705794

unbekannt

Lai et al., 2000

Chloride channel, nucleotide-sensitive, 1°

CLNS1A

gi4502890

Regulation des Zellvolumens

Nagl et al., 1995;
Buyse et al., 1996

FBR-MuSV associated
ubiquitously expressed gene

FAU

gi31302

Fusionsprotein FAU besteht aus ribosomalen Protein S30 und Ubiquitin-ähnlichem Protein

Kas et al., 1992;
Michiels et al., 1993

SYT interacting protein SIP

SIP

gi3746786

Interaktion mit SYT als transkriptioneller Co-Aktivator

Brett et al., 1997


Für die Gene FZD4, YAP65, DAP4, CLNS1A, FAU und SIP wurden in der Literatur potenzielle Funktionen der Proteine beschrieben. Zu den Genen MS4A6A und CGI-85 waren ausschließlich die Sequenzen annotiert ohne Aussagen über mögliche Funktionen der Proteine. MS4A6A zeigte schwache Homologien zu dem Glykoprotein CD20, während das humane Gen CGI-85 über die komparative Genomanalyse zu C.elegans identifiziert wurde. Das in dieser Arbeit als ELBT (’’Expressed in Liver, Breast and Testis’’) benannte Gen zeigte Sequenzidentitäten zu einem Genbankeintrag (’’GS1999full’’) mit Abweichungen am 5’-Ende des Gens. Die Kartierung der Gene erfolgte über Radiation Hybrid Mapping und der elektronischen PCR (Tab.12). Die


59

daraus resultierenden STS-Marker wurden zu Beginn der Arbeit mit Hilfe der genomischen Datenbank (Genome Database GDB, NCBI) in die Region 11q12-q23 genetisch kartiert. Zum Ende dieser Arbeit wurde die chromosomale Lokalisation der STS-Marker und Gene nach der physikalischen Karte der annotierten genomischen Sequenzdatenbank (UCSC) aktualisiert.

Tab. 12: Allgemeine Angaben zu den Genen in 11q12-q23 und Ergebnisse der chromosomalen Kartierung über Radiation Hybrid Mapping (RHdb) mit Angabe der Wahrscheinlichkeit (LOD_Score), des statistisch ermittelten Abstandes (cRs) und der zytogenetischen Bande nach der genomischen Datenbank (GDB) bzw. der aktuellen genomischen Sequenzdatenbank (UCSC).

Gene in 11q12-q23

Assembly
in bp

Transkript
in bp

Protein
in aa

Chromosomale Kartierung

 

RHdb / ePCR

LOD_Score

Abstand in cRs

GDB (08/1998)

UCSC (06/2001)

ELBT *

2408

2,4

388

SHGC-32865

1000

0

11q14.1

11q13.5

FZD4

1388

7,4

537

SHGC-20692

11.3

14

11q14.2-q14.3

11q14.2

MS4A6A

1679

1,5 (SV)

225

SHGC-35409

17.5

5.6

11q12.1-q13.1

11q12.3

YAP65

5132

5,2

454

D11S1339

1000

0

11q21.1-q22.3

11q22.1

DAP4

3275

4,2

761

SHGC-31396

10.4

6

11q13.5-q14.1

11q13.5

CGI-85

1574

2,8 (SV)

384

SHGC-14407

8.6

21

11q13.2-q13.5

11q13.4

CLNS1A

1427

1,5

237

SHGC-20692

11.3

14

11q14.2

11q14.1

FAU

598

0,5

133

RH76564

-

-

11q13.2

11q13.2

SIP

2913

2,8

669

SHGC-11846

-

-

11q13.3

11q13.3


Abb.12: Cytogenetische Lokalisation der Kandidatengene in 11q12-q23. Die in-silico differenziell exprimierten Genen (rechte Spalte) wurden entsprechend der annotierten Genomdatenbank (UCSC) chromosomal kartiert. Dazu sind schon beschriebene tumorassoziierte Gene wie MEN1, CCND1, FGF4, FGF3, EMS1 (11q13 Amplikon) und ATM angegeben.


60

Die meisten der untersuchten Gene wurden in den chromosomalen Abschnitt 11q13-q14 kartiert, einer Region, die genomisch in verschiedenen Tumoren häufig als aberrant beschrieben wurde. Die Gene FAU, SIP und CGI-85 waren in der Nähe des 11q13-Amplikons lokalisiert, das in gynäkologischen Tumoren häufig amplifiziert ist. Das Gen YAP65 wurde in dieser Arbeit in die chromosomale Region 11q22.1 kartiert, wobei in der Literatur 11q13 als Genlocus für YAP65 beschrieben wurde. Die untersuchten neun Gene waren nach der Expressionsanalyse des elektronischen Northern hinsichtlich Brust- oder Ovartumoren signifikant differenziell exprimiert (Tab.13).

Tab. 13: Ergebnisse des elektronischen Northern der Gene in 11q12-q23 bezüglich der differenziellen Expression in Brust- und Ovargewebe.

Gene in 11q12-q23

Gewebetyp

Normalgewebe

Tumorgewebe

Verhältnis T/N

P-Wert
á

Signifikanz in %

Treffer

Bibliotheks-Größe

Treffer

Bibliotheks-Größe

   

ELBT

Brust

24

120725

3

67582

0.22

0.00772

99.2

Ovar

0

33687

0

41736

-

-

-

FZD4

Brust

14

120725

1

67582

0.13

0.0155

98.5

Ovar

0

33687

1

41736

-

1

-0.0

MS4A6A

Brust

14

120725

1

67582

0.13

0.0155

98.5

Ovar

0

33687

6

41736

-

0.0366

96.3

YAP65

Brust

26

120725

6

67582

0.41

0.0437

95.6

Ovar

4

33687

7

41736

1.41

0.764

23.6

DAP4

Brust

10

120725

0

67582

-

0.017

98.3

Ovar

0

33687

21

41736

-

0.00055

99.9

CGI-85

Brust

2

120725

1

67582

0.89

1

0.0

Ovar

0

33687

6

41736

-

0.0366

96.3

CLNS1A

Brust

18

120725

22

67582

2.17

0.0197

98.0

Ovar

2

33687

15

41736

5.88

0.00612

99.4

Fau

Brust

4

120725

11

67582

5.00

0.0048

99.5

Ovar

2

33687

11

41736

4.35

0.0476

95.2

SIP

Brust

3

120725

6

67582

3.57

0.0786

92.1

Ovar

1

33687

8

41736

6.67

0.0488

95.1


Die Gene ELBT, FZD4, MS4A6A, YAP65, DAP4 waren in Brusttumoren signifikant geringer exprimiert gegenüber den Bibliotheken des Brust-Normalgewebes. Die Gene CLNS1A, FAU und SIP zeigten sich sowohl in Brusttumoren als auch in Ovarialtumoren signifikant überexprimiert gegenüber den Normalgeweben. Für das Gen CGI-85 ergab sich im elektronischen Northern in Ovarialtumor-Bibliotheken eine Überexpression. Damit wurden in der Region 11q12-q23 Kandidatengene für die Entstehung und Progression dieser Tumore identifiziert. Zur weiteren Charakterisierung und der Verifizerung der differenziellen Expression wurden die Gene über Northernblot- und cDNA-Array-Analysen untersucht. Für acht von neun Genen wurde die generierten cDNA-Sonde im MTN-Northernblot auf ihre Spezifität getestet. Für das Gen CLNS1A


61

lag die Sonde bereits validiert vor und konnte direkt mit dem cDNA-Array hybridisiert werden (Abb.13).

Abb.13: Übersicht über das Expressionsmuster der Gene aus 11q12-q23 im MTN-Northernblot (linke Bilderspalte) mit 16 verschiedenen Gewebetypen und im cDNA-Array (beide rechte Bildspalten) mit korrspondierenden Normal (N)- und Tumorproben (T) von Brust- und Ovargewebe. Unter den cDNA-Arrays sind die densitometrisch ermittelten Expressionsverhältnisse (T/N) in Bezug zur ß-Aktin-Expression angegeben (n.d.-nicht definiert). Für das Gen CLNS1A ist nur die Hybridisierung des cDNA-Arrays dargestellt, da die cDNA-Sonde bereits validiert vorlag.


62

Bis auf die Gene ELBT und CGI-85 waren alle untersuchten Gene ubiquitär exprimiert. Die Gene MS4A6A und CGI-85 zeigten neben dem angegeben Haupttranskript weitere Spleissvarianten. Im Vergleich mit der Konsensussequenz aus den über AUTEX assemblierten ESTs ergaben sich aus der Northernblot-Analyse bei den Genen FZD4, DAP4 und CGI-85 größere Transkripte (Tab.12). Bei den anderen Genen entsprachen die Transkriptgrößen den assemblierten Sequenzen. Mit den im Northernblot getesteten Sonden wurde die Expression der Gene auf dem cDNA-Array untersucht. Die Expressionsunterschiede wurden nach densitometrischen Auswertung für jedes Probenpaar als Verhältnis Normal- zu Tumorgewebe (N/T) dargestellt. Die in-silico differenzielle Expression der Gene ELBT und FZD4 hinsichtlich Brusttumoren konnten im cDNA-Array eindeutig bestätigt werden. Die Expression von ELBT war in acht der neun Probenpaare (Abb.13; Nr.1-8) im Tumor signifikant (T/N<0,25) verringert, das Gen FZD4 zeigte sich in sieben der neun Probenpaare (Nr.1-5, 7, 8) im Tumor geringer exprimiert (T/N<0,5). Die Ergebnisse des cDNA-Arrays für die Gene YAP65 und DAP4 waren heterogener. Es bestätigte sich die in-silico differenzielle Expression in vier (Nr.1, 2, 4, 8) bzw. drei Probenpaaren (1, 2, 7) mit einer beobachteten Herunterregulation in den Brusttumoren. Die Gene YAP65 und FZD4 zeigten sich auch für alle drei Ovartumor-Probenpaare differenziell exprimiert (T/N<0,25), wobei der elektronischen Northern keine entsprechende Aussage ergab. Bei den weiteren untersuchten Genen konnte die differenzielle Expression hinsichtlich Brust- oder Ovarialtumoren im cDNA-Array nicht bestätigt werden. Die Expression in den Normal- und Tumorproben war entweder kaum messbar (CGI-85 und SIP im Ovar) oder es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede (MS4A6A, FAU und CLNS1A in Brust und Ovar). Das Gen ELBT zeigte die signifikantesten Expressionsunterschiede in den Proben des cDNA-Arrays und wurde als potenzielles Tumorsuppressorgen weiter untersucht.


63

3.3.2 Charakterisierung des potenziellen Tumorsuppressorgens ELBT

Von den neun untersuchten Genen aus der Region 11q12-q23 wurde ELBT aufgrund der bestätigten in-silico Expressionsdaten für die weitere Validierung eines potenziellen Tumorsuppressorgens ausgewählt. Es erfolgten Expressionsexperimente wie cDNA-Array-Hybridisierung und Taqmananalysen, die die verringerte Expression von ELBT in Brusttumoren belegen sollten. Mittels der Mutationsanalyse sollten mögliche Mutationen des Gens in Brusttumoren detektiert werden, die ein Ausfall des Proteins als Tumorsuppressor begründen könnten. Neben den quantitativen Expressionsstudien wurden RNA in-situ Hybridisierungen an Gewebeschnitten durchgeführt, um weitere Aussagen über die Lokalisation des Transkriptes im Brustgewebe und anderen Gewebetypen zu erhalten.

3.3.2.1 ELBT zeigte sich in Brusttumoren signifikant geringer exprimiert

ELBT wurde durch die in-silico analysierte differenzielle Expression in Brusttumoren identifiziert (Tab.14). Der elektronische Northern von ELBT zeigte ein weitgehend spezifisches Vorkommen von ESTs vor allem im Normalgewebe der Brust, Haut und Herz, sowie in geringerer Zahl in Blut-Leukozyten, Hoden und Niere.

Tab. 14: Elektronischer Northern von ELBT

Gewebetyp

Normalgewebe

Tumorgewebe

Verhältnis T/N

P-Wert á

Signifikanz in %

Treffer

Bibliotheks-Größe

Treffer

Bibliotheks-Größe

   

Blase

0

25641

1

42550

-

1

-0.0

Blut-Leukozyten

5

130844

0

941

-

1

0.0

Brust

24

120725

3

67582

0.22

0.00772

99.2

B-Zell-Lymphom

0

108530

0

7357

-

-

-

Dickdarm

0

31042

0

35626

-

-

-

Dünndarm

0

36432

0

9379

-

-

-

Endometrium

0

18977

0

6023

-

-

-

Gehirn

1

110439

0

38567

-

1

0.0

Haut

4

27182

0

1180

-

1

0.0

Herz

9

98496

0

7271

-

1

-0.0

Hoden

2

29540

0

16891

-

0.537

46.3

Leber

0

21521

0

15763

-

-

-

Lunge

1

96193

0

43114

-

1

-0.0

Magen-Speiseröhre

0

13799

2

12119

-

0.219

78.1

Myometrium

0

35843

0

14713

-

-

-

Nebenniere

0

25886

0

20230

-

-

-

Niere

2

44566

0

40078

-

0.501

49.9

Ovar

0

33687

0

41736

-

-

-

Pankreas

0

65807

0

21808

-

-

-

Prostata

0

88661

1

76762

-

0.464

53.6

Skelettmuskel

1

58315

1

27063

2.17

0.533

46.7

Squamöse Zellen

2

33833

0

25706

-

0.509

49.1

T-Zell-Lymphom

0

60680

0

17313

-

-

-


64

Eine signifikante differenzielle Expression ergab sich nach dem Fisher Exact Test (0,0077; 99,2%) bezüglich der Brust mit 24 ESTs im Normalgewebe gegenüber drei ESTs im Tumorgewebe. Auch die ESTs in den übrigen Geweben waren zumeist auf die Normalgewebe beschränkt. Das in-silico generierte Expressionsmuster war der erste Hinweis, dass es sich bei ELBT um ein Tumorsuppressorgen hinsichtlich der Entstehung von Brusttumoren handeln könnte.

Nach diesem ersten Hinweis der differenziellen Expression in Brusttumoren wurde zur statistisch signifikanteren Verifizierung der in-silico Ergebnisse als weiterer cDNA-basierter Blot der ’’Cancer Profiling Array’’ (CPA) mit der ELBT-Sonde hybridisiert. Der CPA repräsentiert, neben einer Vielzahl anderer Gewebe, cDNA-Proben von den Tumoren und den korrespondierenden Normalgeweben von insgesamt 50 Brusttumorpatientinnen (Abb.14). Zusammen mit drei Patientinnen, von denen neben dem Normal- und Tumorgewebe auch metastatisches Gewebe vorhanden war, wurden 53 Probenpaare zur Auswertung gebildet. Von 52 Probenpaaren konnten die Expressionsintensitäten nach Visualisierung mittels PhosphoImager über ImageQuant quantitativ ausgewertet werden. Die Berechnung der relativen Expressionverhältnisse von ELBT zwischen Normalgewebe und Tumorgewebe der Probanden erfolgte unter Berücksichtigung der Normierung der Proben nach der ß-Aktin-Hybridisierung (Abb.15). Die Expressionsverhältnisse zeigten eine signifikant geringere Expression von ELBT in den Tumorproben gegenüber den Normalgeweben der Brust (Tab.15). Neben einigen selteneren Karzinom-Typen waren 33 invasiv duktale Karzinome (IDC) und neun invasiv lobuläre Karzinome (ILC) unterschiedlicher Progression (Grading) vertreten. Eine mindestens vierfach geringere Expression von ELBT gegenüber dem Normalgewebe ergab sich bei 48% der IDCs und 56% der ILCs (T/N<0,25). Mindestens zehnfach geringer exprimiert waren noch 24% der IDCs und 33% der ILCs (T/N<0,1). Im Gegensatz dazu wurde bei nur 8% aller Tumore eine mindestens zweifach verstärkte Expression gegenüber dem Normalgewebe festgestellt. Bei 27% aller Tumore ergaben sich keine signifikanten Expressionsunterschiede (0,5<T/N<2). Unter den duktalen Karzinomen konnten Gruppen unterschiedlichen Gradings unterschieden werden. Eine signifikante Korrelation der differenziellen Expression von ELBT zur Tumorprogression konnte bei den IDCs nicht nachgewiesen werden (Abb.16).


65

Abb.14: Expression von ELBT auf dem ’’Cancer Profiling Array’’

Abb.15: Expression von ß-Aktin auf dem ’’Cancer Profiling Array’’


66

Tab. 15: Quantitative Auswertung der Expression von ELBT in den 53 Brustgewebe-Probenpaaren des Cancer Profiling Array (CPA) über ImageQuant. Die Koordinaten X,Y geben die Lage des untersuchten Probenpaars auf dem CPA (Abb.14) wieder. Der relative Expressionslevel (T/N) bezieht sich auf die differenzielle Expression (k.A.-keine Angaben; n.a.-nicht auswertbar).

Nr.

Y

X

Histologie

Grad

Lymph-
knoten

T/N

 

Nr.

Y

X

Histologie

Grad

Lymph-
knoten

T/N

1

Q

1/2

IDC

1

k.A.

0,22

28

L

½

IDC

k.A.

negativ

3,29

2

R

1/2

IDC

1

k.A.

0,22

29

O

½

IDC

k.A.

negativ

0,46

3

S

1/2

IDC

1

k.A.

2,05

30

V

½

IDC

k.A.

k.A.

0,36

4

T

1/2

IDC

1

k.A.

0,08

31

Z

½

IDC

k.A.

k.A.

0,07

5

U

1/2

IDC

1

k.A.

3,20

32

AA

½

IDC

k.A.

k.A.

0,05

6

D

3/4

IDC

1

k.A.

0,40

33

O

¾

IDC

k.A.

positiv

0,04

7

F

3/4

IDC

1

k.A.

1,11

34

A

½

DCIS

k.A.

negativ

0,88

8

N

3/4

IDC

2B

k.A.

0,74

35

Y

½

ILC

k.A.

k.A.

0,57

9

K/L

3/4

IDC

2B

positiv

0,12

36

DD

½

ILC

k.A.

k.A.

0,02

10

A

3/4

IDC

3A

k.A.

0,63

37

EE

½

ILC

k.A.

k.A.

0,19

11

B

3/4

IDC

3A

k.A.

0,53

38

FF

½

ILC

k.A.

k.A.

0,30

12

M

3/4

IDC

3A

k.A.

0,23

39

B

½

LC

k.A.

positiv

0,65

13

G/H

3/4

IDC

3A

positiv

0,14

40

M

½

LC

k.A.

positiv

0,05

14

I/J

3/4

IDC

3A

positiv

0,01

41

F

½

LC

k.A.

negativ

0,29

15

C

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,54

42

K

½

LC

k.A.

negativ

0,04

16

D

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,61

43

E

¾

LC

2A

k.A.

0,15

17

E

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,03

44

BB

½

lob-duct. Ca

k.A.

k.A.

0,07

18

H

1/2

IDC

k.A.

positiv

1,80

45

Q

¾

medulläres Ca

k.A.

negativ

1,51

19

I

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,21

46

T

¾

muzinöses AdCa

k.A.

k.A.

0,13

20

J

1/2

IDC

k.A.

positiv

5,34

47

C

¾

tubuläres AdCa

1

k.A.

0,14

21

N

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,01

48

W

½

tubuläres Ca

2

k.A.

1,68

22

P

1/2

IDC

k.A.

positiv

0,18

49

X

½

Fibrosarkoma

k.A.

k.A.

0,21

23

P

3/4

IDC

k.A.

positiv

0,23

50

K

¾

Metastasen

-

-

0,41

24

R

3/4

IDC

k.A.

positiv

0,39

51

G

¾

Metastasen

-

-

0,11

25

S

3/4

IDC

k.A.

positiv

0,01

52

I

¾

Metastasen

-

-

0,05

26

U

3/4

IDC

k.A.

positiv

1,30

 

27

G

1/2

IDC

k.A.

negativ

1,12

53

CC

½

ILC

k.A.

k.A.

n.a.


Abb.16: Darstellung der relativen Expression (T/N) von ELBT im Säulendiagramm für 52 Probenpaare mit Unterteilung der Brusttumore in histologische Typen. Die Tabelle gibt die statistische Auswertung der signifikant geringeren Expression in IDCs und ILCs wieder.


67

3.3.2.2 Bestätigung der ELBT-Expression in mikrodissezierten Brustgeweben

Die differenzielle Expression von ELBT bezieht sich im elektronischen Northern und in den cDNA-Arrays auf nicht-mikrodisseziertes Gewebe. Um die differenzielle Expression hinsichtlich des Mammaepithels und daraus entstehenden Tumoren zu verifizieren, wurden quantitative Expressionsstudien an mikrodissezierten Brusttumoren und histologisch unauffälligen Mammaepithelien durchgeführt. Nach der Mikrodissektion erfolgte eine ELBT-spezifische Taqman-Analyse mit anschließender Bestimmung der Expressionsstärke (Tab.16). Für die Analyse wurden cDNA-Proben von 18 Brusttumoren eingesetzt, wovon 13 invasiv duktale und fünf invasiv lobuläre Karzinome waren. Von den mikrodissezierten Normalgeweben konnten drei unterschiedliche cDNA-Proben ausgewertet werden. Alle Proben wurden zuvor über die GAPDH-Expression normiert. Nach der Auswertung der ELBT-Expression, repräsentiert durch die ermittelten CT-Werte, ergaben sich durch den Vergleich mit der Referenzprobe (Nr. B19) relative Expressionsverhältnisse (Level) zwischen den verschiedenen mikrodissezierten Geweben. Die drei Normalepithel-Proben zeigten bis zu zweifache Expressionsunterschiede. Die mikrodissezierten Tumore waren in überwiegender Zahl signifikant geringer exprimiert als die Normalepithelien (Abb.17). Von den duktalen Karzinomen zeigten 77% eine mindestens vierfach (T/N<0,25), 46% eine mindestens zehnfach (T/N<0,1) geringere Expression gegenüber der Referenzprobe. Von den lobulären Karzinomen waren alle fünf Proben (100%) mindestens vierfach, zwei Proben (40%) mindestens zehnfach herunterreguliert. Die Expressionsanalyse der mikrodissezierten Brusttumoren und Normalepithelien bestätigte die differenzielle Expression von ELBT in einem größeren Anteil der untersuchten Probanden als in den bisherigen Expressionsexperimenten. Ein Grund dafür könnte das methodische Vorgehen der Isolierung distinkter Zellpopulationen durch die Mikrodissektion sein, wodurch ein sensitiverer Vergleich zwischen Normal- und Tumorgewebe gewährleistet ist. Die höhergradigen duktalen Karzinome (Nr. B9-B12: IDC, G3) waren gegenüber den geringergradigen Tumoren größtenteils schwächer differenziell exprimiert, wobei diese Korrelation zur Tumorprogression bei den zahlreicheren Probenpaaren des cDNA-Arrays nicht ersichtlich war.


68

Tab. 16: Quantifizierung der Expression von ELBT in den mikrodissezierten Brustgeweben nach der Taqman-PCR. Alle Proben wurden über die GAPDH-Expression normiert und der Expressionslevel aller mikrodissezierten Proben in Bezug zur Referenzproben B19 (Mammaepithel-Probe) gesetzt.

Nr.

Histologie

Gen

CT (Mw)

Stabw

Gen

CT (Mw)

Stabw

?CT

Stabw?CT

??CT

Level

- Fehler

+ Fehler

B1

IDC, Grad 2

GAPDH

24,7

0,10

ELBT

37,1

0,19

12,4

0,22

6,9

0,008

0,00

0,0

B2

IDC, Grad 2

GAPDH

25,8

0,44

ELBT

34,2

0,29

8,4

0,53

2,9

0,136

0,04

0,1

B3

IDC, Grad 2

GAPDH

28,2

0,18

ELBT

39,9

0,2

11,7

0,27

6,2

0,014

0,00

0,0

B4

IDC, Grad 2

GAPDH

27,2

0,13

ELBT

36,1

0,14

8,9

0,19

3,4

0,096

0,01

0,0

B5

IDC, Grad 2

GAPDH

25,9

0,22

ELBT

33,5

0,00

7,6

0,22

2,1

0,238

0,03

0,0

B6

IDC, Grad 2

GAPDH

24,9

0,03

ELBT

35,8

0,31

10,9

0,31

5,4

0,024

0,00

0,0

B7

IDC, Grad 2

GAPDH

26,9

0,12

ELBT

36,8

0,33

9,9

0,35

4,3

0,049

0,01

0,0

B8

IDC, Grad 3

GAPDH

26,9

0,28

ELBT

37,5

0,13

10,6

0,31

5,1

0,029

0,01

0,0

B9

IDC, Grad 3

GAPDH

26,5

0,14

ELBT

32,8

0,48

6,3

0,50

0,8

0,594

0,17

0,2

B10

IDC, Grad 3

GAPDH

27,7

0,18

ELBT

35,5

0,28

7,9

0,34

2,3

0,200

0,04

0,1

B11

IDC, Grad 3

GAPDH

28,8

0,19

ELBT

36,4

0,45

7,5

0,49

2,0

0,251

0,07

0,1

B12

IDC, Grad 3

GAPDH

31,3

0,06

ELBT

37,7

0,66

6,5

0,66

0,9

0,524

0,19

0,3

B13

IDC, Grad 3

GAPDH

25,1

0,20

ELBT

36,3

0,34

11,2

0,39

5,7

0,020

0,00

0,0

B14

ILC, Grad 2

GAPDH

28,4

0,32

ELBT

38,7

0,03

10,3

0,32

4,8

0,036

0,01

0,0

B15

ILC, Grad 2

GAPDH

27,3

0,45

ELBT

37,1

0,08

9,8

0,46

4,3

0,052

0,01

0,0

B16

ILC, Grad 2

GAPDH

31,7

0,10

ELBT

39,3

0,87

7,6

0,88

2,1

0,231

0,10

0,2

B17

ILC, Grad 3

GAPDH

24,1

0,29

ELBT

32,9

0,31

8,8

0,43

3,3

0,103

0,03

0,0

B18

ILC, Grad 3

GAPDH

28,5

0,10

ELBT

37,1

0,04

8,6

0,11

3,1

0,116

0,01

0,0

 

B19

Mammaepithel

GAPDH

28,8

0,55

ELBT

34,3

1,03

5,5

1,17

0,0

1,000

0,55

1,2

B20

Mammaepithel

GAPDH

31,4

0,30

ELBT

37,9

0,32

6,5

0,44

1,0

0,505

0,13

0,2

B21

Mammaepithel

GAPDH

31,5

0,05

ELBT

36,9

0,54

5,4

0,55

-0,2

1,124

0,35

0,5


Abb.17: Darstellung der relativen Expression von 21 mikrodissezierten Brusttumoren und Normalepithelien im Säulendiagramm mit Unterteilung der histologischen Typen. Die statistische Auswertung der signifikant geringeren Expression in Tumoren bezieht sich auf die Referenzprobe B19.


69

3.3.2.3 Die Mutationsanalyse des Gens ELBT ergab keine genomischen Veränderungen in Brusttumoren

Die Ergebnisse aus den Expressionsexperimenten, in denen das Gen ELBT als herunterreguliert in Brusttumoren identifiziert wurde, wiesen darauf hin, dass es sich um ein potenzielles Tumorsuppressorgen handeln könnte. Eine Möglichkeit der Validierung von Tumorsuppressorgenen ist die Suche nach Mutationen in der transkribierten Sequenz. Mutationen würden zwar nicht die verringerte Expression in den Tumoren erklären, jedoch einen Hinweis auf den Verlust der Proteinfunktion von ELBT in den Tumorzellen geben und damit die These der möglichen Tumorsuppressorfunktion unterstützen. In dieser Arbeit wurden 71 Brusttumore auf Mutationen untersucht. Der erste Schritt war die Optimierung der acht Primerpaare, mit denen die acht Exons von ELBT in den Tumorproben amplifiziert wurden (Abb.18).

Abb.18: Optimierung der PCR für 8 Primerpaare zur Amplifikation der Exons von ELBT in den Tumor-DNA-Proben. In den oberen Bildern sind die PCR-Amplifikate für Exon 1, 2 und 3-8 bei unterschiedlichen PCR-Bedingungen gezeigt. Im unteren Bild sind exemplarisch für Exon 4 die Amplifikate der 71 Tumorproben und der Plazentakontrolle (Nr.48) gezeigt. Als Längenstandard diente ein 100bp Marker.


70

Die PCR-Bedingungen wurden für jedes Primerpaar mit einer Plazenta-Kontroll-DNA eingestellt. Es wurde der Einsatz der AmpliTaq Gold gegenüber der herkömmlichen TaqPolymerase für alle Primerpaare vorgezogen. Die Optimierung hinsichtlich der Annealingtemperatur und der MgCl2-Konzentration ergab für sieben von acht Primerpaaren gleiche Bedingungen (Exon 1, 3 - 8: 61°C, 1,5mM; Exon 2: 66°C, 4mM). Nach der Optimierung der PCR-Bedingungen wurden die acht Exons von ELBT in 71 Brusttumorproben und der Plazenta-DNA-Kontrolle amplifiziert. Bei wenigen Tumorproben ließen sich einzelne Exons nicht amplifizieren, was an der unzureichenden Qualität der Tumor-DNA gelegen haben könnte. Mögliche Deletionen in der Tumor-DNA wurden in diesen Fällen nicht untersucht. Von den 576 möglichen Amplifikaten aus den acht amplifizierten Exons der 72 Proben ließen sich 533 Amplifikate nach Markierung und Auftrennung im SSCP-Gel auswerten (Tab.17).

Tab. 17: Übersicht über die Bearbeitung und Ergebnisse der 72 in der Mutationsanalyse untersuchten Proben (71 Tumorproben, 1 Plazenta-Kontrolle VP). Histologische Daten zu den Tumoren lagen in einem Teil der Tumorproben vor (IDC, ILC, DCIS) oder waren nicht weiter klassifiziert (BrCa). Es konnten einige Exons in den Tumorproben nicht amplifiziert werden (negativ), die meisten Amplifikate waren im SSCP-Gel unauffällig (-) oder wurden aufgrund auffälliger SSCP-Analysen anschließend sequenziert (Seq).

Nr.

Tumor

Ex 1

Ex 2

Ex 3

Ex 4

Ex 5

Ex 6

Ex 7

Ex 8

Nr.

Tumor

Ex 1

Ex 2

Ex 3

Ex 4

Ex 5

Ex 6

Ex 7

Ex 8

1

BrCa

negativ

-

-

-

-

-

-

-

37

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

2

BrCa

Seq

-

-

-

-

-

Seq

-

38

BrCa

-

-

-

Seq

-

-

-

-

3

BrCa

-

-

-

Seq

-

-

-

-

39

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

4

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

Seq

40

BrCa

-

Seq

-

-

negativ

-

-

-

5

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

41

BrCa

-

Seq

-

-

Seq

-

-

-

6

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

42

BrCa

-

Seq

-

-

Seq

-

-

-

7

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

Seq

43

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

8

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

Seq

44

BrCa

-

-

Seq

-

-

Seq

-

-

9

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

45

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

10

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

46

BrCa

-

-

-

-

-

Seq

-

-

11

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

47

BrCa

negativ

-

-

-

-

-

negativ

-

12

BrCa

-

-

-

-

-

-

Seq

-

48

Plazenta

VP

VP

VP

VP

VP

VP

VP

VP

13

BrCa

-

-

Seq

-

-

-

-

-

49

ILC

-

-

-

-

-

-

-

-

14

BrCa

-

-

-

-

Seq

-

-

-

50

ILC

negativ

-

-

-

negativ

-

-

-

15

BrCa

-

-

-

-

Seq

-

-

Seq

51

IDC

negativ

-

-

-

negativ

-

negativ

-

16

BrCa

-

-

Seq

-

-

-

-

Seq

52

IDC

-

-

-

-

negativ

-

-

-

17

BrCa

-

-

-

-

-

-

Seq

-

53

IDC

negativ

-

-

-

negativ

-

negativ

-

18

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

54

IDC

negativ

-

-

-

negativ

-

-

-

19

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

Seq

55

IDC

negativ

-

Seq

-

negativ

-

-

-

20

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

56

IDC

-

-

-

-

negativ

-

-

-

21

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

57

IDC

-

Seq

-

-

-

-

-

-

22

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

Seq

58

IDC

-

-

-

-

Seq

-

-

-

23

BrCa

-

-

-

-

Seq

-

-

Seq

59

IDC

-

Seq

-

-

Seq

-

-

-

24

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

60

IDC

negativ

-

-

-

-

negativ

-

-

25

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

61

ILC

negativ

-

-

-

-

negativ

-

-

26

BrCa

-

-

-

Seq

-

Seq

-

Seq

62

BrCa

negativ

-

Seq

-

negativ

negativ

-

-

27

BrCa

negativ

negativ

negativ

-

negativ

-

negativ

-

63

BrCa

negativ

-

-

-

-

-

-

Seq

28

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

64

BrCa

-

-

-

-

negativ

negativ

-

Seq

29

BrCa

negativ

negativ

-

-

negativ

-

-

-

65

BrCa

negativ

-

-

-

-

-

-

-

30

BrCa

negativ

negativ

-

Seq

Seq

-

Seq

-

66

IDC

-

-

-

-

-

-

-

Seq

31

BrCa

-

-

-

-

-

Seq

-

Seq

67

DCIS

-

-

-

-

-

-

-

Seq

32

BrCa

-

-

-

Seq

Seq

Seq

-

-

68

BrCa

-

Seq

-

Seq

-

-

-

-

33

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

69

BrCa

negativ

-

-

-

-

-

-

-

34

BrCa

-

-

-

-

-

-

-

-

70

IDC

negativ

Seq

-

Seq

-

Seq

-

Seq

35

BrCa

-

-

-

Seq

-

-

-

-

71

DCIS

-

Seq

-

Seq

-

Seq

-

Seq

36

BrCa

-

-

-

-

-

Seq

-

-

72

IDC

-

-

-

-

negativ

-

-

-


71

Die 43 negativen Proben konnten auch nach wiederholter PCR nicht amplifiziert werden oder waren nach der SSCP-Analyse nicht auswertbar. Insgesamt waren die amplifizierten Exons von 473 Tumorproben im SSCP-Gel unauffällig und wurden nicht weiter untersucht. 60 PCR-Fragmente zeigten in der SSCP-Analyse im Vergleich zur Kontroll-DNA auffällige Bandenshifts, die auf eine Mutation hindeuten könnten. Die anschließende Sequenzierung dieser 60 Amplifikate erbrachte in keinem einzigen Fall einen Hinweis auf mögliche Mutationen oder Polymorphismen im ELBT-Transkript.

3.3.2.4 Expression von ELBT in Leber, Brust, Hoden und Blutleukozyten

Der elektronische Northern gab die größte EST-Frequenz des Gens ELBT in den Bibliotheken für Brust-Normalgewebe wieder. Darüber hinaus zeigten die in-silico Daten die Expression von ELBT in den Geweben Haut, Herz, Hoden und Blutleukozyten an (C.3.2.1,Tab.14). Dieses Expressionsmuster wurde durch die Northernblot- und Taqman-Analyse verifiziert und erweitert. Der MTN-Northernblot mit 16 verschiedenen Geweben ergab nach Hybridisierung mit der radioaktiv markierten ELBT-Sonde (Klon H25327) eine spezifische Bande mit der erwarteten Fragmentgröße von etwa 2,4kb (C.3.1, Abb.13). Die stärkste Expression von ELBT zeigte sich in Leber, eine moderate Expression in Blutleukozyten und Hoden sowie eine sehr schwache Expression in Herz und anderen Geweben. Die Expression von Herz im elektronischen Northern konnte im Northernblot nicht bestätigt werden, während die starke Expression von Leber im Northernblot nicht im elektronischen Northern auftrat. Die moderate Expression von ELBT im Hoden und in den Blutleukozyten korrelierten in beiden Expressionsexperimenten.

Um die Expression von ELBT in einem größeren Gewebespektrum zu untersuchen, wurden Taqman-Analysen mit cDNA-Proben von 22 verschiedenen Geweben, sechs Brusttumor-Zelllinien und drei Ovartumor-Zelllinien durchgeführt (Tab.18). Die quantitative Auswertung der Taqman-PCR erfolgte nach Normierung der cDNA-Proben über die GAPDH-Expression. Die Expressionslevel von ELBT in den Geweben und Zelllinien bezogen sich auf das Brustgewebe als Referenzwert. Das Ergebnis korrelierte sehr gut mit den Expressionsdaten des Northernblots. Die stärkste Expression von ELBT wurde in Leber nachgewiesen, gefolgt von den Geweben Brust und Hoden (Abb.19). Die übrigen Gewebe zeigten in Bezug auf Brustgewebe eine sehr schwache Expression, in den Tumorzelllinien war ELBT nicht mehr nachweisbar. Eine Normierung


72

der cDNA-Proben auf ß-Aktin analog zum Northernblot ergab vergleichbare Expressionslevel.

Tab. 18: Auswertung der Taqman-PCR von 22 Geweben und 9 Tumorzelllinien. Die CT-Werte ergaben sich aus dem Mittelwert (Mw) des dreifachen PCR-Ansatzes mit Angaben der Standardabweichung (Stabw). Alle Proben wurden über die GAPDH-Expression normiert (DeltaCT). Die relativen Expressionsverhältnisse (Level) der Proben beziehen sich auf Brust als Referenzprobe (Level=1).

Name

Gen

CT (Mw)

Stabw

Gen

CT (Mw)

Stabw

?CT

Stabw ?CT

??CT

Level

- Fehler

+ Fehler

Gehirn

GAPDH

21,1

0,23

ELBT

27,8

0,18

6,7

0,29

6,4

0,01

0,00

0,00

Speicheldrüse

GAPDH

21,8

0,14

ELBT

27,8

0,16

6,1

0,21

5,8

0,02

0,00

0,00

Schilddrüse

GAPDH

21,6

0,01

ELBT

27,1

0,08

5,6

0,09

5,3

0,03

0,00

0,00

Magen

GAPDH

23,8

0,3

ELBT

28,8

0,24

5,0

0,38

4,7

0,04

0,01

0,01

Thymus

GAPDH

21,2

0,02

ELBT

27,1

0,19

5,9

0,19

5,6

0,02

0,00

0,00

Uterus

GAPDH

22,0

0,24

ELBT

31,2

0,13

9,2

0,27

8,9

0,00

0,00

0,00

Prostata

GAPDH

22,3

0,19

ELBT

29,0

0,3

6,7

0,36

6,4

0,01

0,00

0,00

Skelettmuskel

GAPDH

19,3

0,25

ELBT

30,4

0,09

11,1

0,27

10,8

0,00

0,00

0,00

Dünndarm

GAPDH

22,6

0,21

ELBT

28,9

0,15

6,3

0,26

6,1

0,01

0,00

0,00

Herz

GAPDH

21,5

0,49

ELBT

27,4

0,21

5,9

0,53

5,6

0,02

0,01

0,01

Plazenta

GAPDH

23,2

0,04

ELBT

30,7

0,21

7,4

0,21

7,1

0,01

0,00

0,00

Hoden

GAPDH

23,2

0,17

ELBT

24,9

0,05

1,6

0,18

1,3

0,40

0,05

0,05

Milz

GAPDH

23,4

0,1

ELBT

28,5

0,24

5,2

0,26

4,9

0,03

0,01

0,01

Hypophyse

GAPDH

22,9

0,24

ELBT

30,9

0,28

8,1

0,37

7,8

0,00

0,00

0,00

Pankreas

GAPDH

25,8

0,19

ELBT

31,0

0,27

5,2

0,33

5,0

0,03

0,01

0,01

Leber

GAPDH

23,7

0,24

ELBT

22,4

0,28

-1,2

0,37

-1,5

2,89

0,65

0,84

Brust

GAPDH

22,5

0,14

ELBT

22,8

0,15

0,3

0,21

0,0

1,00

0,13

0,15

Lunge

GAPDH

23,2

0,15

ELBT

28,2

0,1

5,0

0,18

4,8

0,04

0,00

0,00

Lymphknoten

GAPDH

24,2

0,3

ELBT

28,9

0,33

4,8

0,45

4,5

0,04

0,01

0,02

Dickdarm

GAPDH

23,3

0,11

ELBT

29,4

0,15

6,1

0,19

5,9

0,02

0,00

0,00

Niere

GAPDH

23,2

0,05

ELBT

29,9

0,26

6,7

0,26

6,4

0,01

0,00

0,00

Cervix

GAPDH

26,5

0,15

ELBT

32,1

0,25

5,6

0,30

5,3

0,03

0,00

0,01

MCF7

GAPDH

21,2

0,02

ELBT

28,7

0,19

7,6

0,19

7,3

0,01

0,00

0,00

T47D

GAPDH

23,1

0,07

ELBT

30,9

0,19

7,8

0,20

7,5

0,01

0,00

0,00

MDA231

GAPDH

21,2

0,11

ELBT

29,6

0,14

8,4

0,18

8,1

0,00

0,00

0,00

BT474

GAPDH

21,4

0,1

ELBT

31,4

0,28

10,0

0,30

9,7

0,00

0,00

0,00

MDA453

GAPDH

20,7

0,12

ELBT

29,2

0,43

8,5

0,45

8,2

0,00

0,00

0,00

SKBR3

GAPDH

20,6

0,26

ELBT

30,2

0,12

9,6

0,29

9,3

0,00

0,00

0,00

EB-2

GAPDH

19,7

0,16

ELBT

29,0

0,32

9,2

0,36

9,0

0,00

0,00

0,00

PA-1

GAPDH

21,3

0,07

ELBT

33,2

0,18

11,9

0,19

11,6

0,00

0,00

0,00

BG-1

GAPDH

21,0

0,16

ELBT

30,0

0,08

9,0

0,18

8,7

0,00

0,00

0,00


Abb.19: Darstellung der Expression von ELBT in verschiedenen Geweben im Säulendiagramm. Der relative Expressionslevel bezieht sich auf den DeltaCT-Wert der Brust-Probe. Es zeigt sich eine spezifische Expression in Leber, Brust und Hoden.


73

3.3.2.5 Die RNA in-situ Hybridisierung zeigte die Expression von ELBT in Brustepithelzellen und in der Haut

Die quantitativen Expressionsexperimente ergaben Aufschluss über die differenzielle Expression von ELBT zwischen dem normalem Epithel und den daraus entstehenden Tumoren des Brustgewebes. Mittels der RNA in-situ Hybridisierung wurde die Expession von ELBT in Gewebeschnitten visualisiert. Durch diese qualitative Expressionsstudie sollte die Transkriptionsaktivität des ELBT-Gens distinkten Zellpopulationen zugeordnet werden und die Expressionsverhältnisse der bisherigen Experimente bestätigen. Der Nachweis der ELBT-Expression erfolgte auf Paraffinschnitten von Normalgeweben und Tumoren der Brust, desweiteren auf Gewebe-Arrays mit Paraffinschnitten von unterschiedlichen Organen und Tumoren. Die ELBT-spezifischen Sonden wurden durch Linearisierung des Klons H25327 und in-vitro Transkription von 1µg linearisierter DNA präpariert (Abb.20).

Abb.20: Fragmente der Antisense (A)- und Sense (S)-Sondenpräparation von ELBT (Klon H25327) nach der Linearisierung und der in-vitro Transkription (IVT).

Die DIG-markierten Antisense- und Sense-RNA-Sonden waren etwa 1kb lang und wurden für die Hybridisierung der Gewebeschnitte in einer Konzentration von 2,5ng/µl eingesetzt. Die Visualisierung der an die zelluläre RNA gebundenen Sonde erfolgte nach der Inkubation mit dem Farbstoff BM-Purple durch ein blau-violettes Präzipitat. Präparate, die mit der Antisense-RNA-Sonde von ELBT hybridisiert wurden, zeigten im Falle der Expression des Gens nach drei bis vier Tagen Färbung bei 4°C einen Farbniederschlag. Die Gewebeschnitte, die zur Kontrolle mit der Sense-RNA-Sonde von ELBT hybridisiert wurden, waren negativ. Die rosa Gegenfärbung des gesamten


74

Gewebes war Resultat der nachfolgenden Kernechtrot-Inkubation der Schnitte. Aufgrund der besseren histologischen Beurteilung der Gewebe wurden neben den Versuchspräparaten die entsprechenden Hämalaun-Eosin-gefärbten Schnitte dargestellt. Die Hybridisierung von Brustgewebe mit normalen Epithelien und Tumoren verschiedener Probanden zeigte ausschließlich eine schwache Expression von ELBT in normalen Epithelzellen der Drüsengänge (Abb.21). Die detektierten Signale waren in den Drüsenstrukturen nicht gleichmäßig verteilt, sondern erschienen stärker in den lobulären Endverzweigungen der Drüsengänge (Lobuli). Das Bindegewebe und die Fettzellen im umliegenden Brustgewebe waren negativ. In keinem Fall der untersuchten Brusttumore (10 IDCs und 6 ILCs) konnte eine Expression von ELBT festgestellt werden (Abb.22). Im Gegensatz dazu wurde eine schwache ELBT-Aktivität bei der Untersuchung weiterer Tumore in Leberkarzinomzellen nachgewiesen. Tumore des Verdauungstraktes, der Reproduktionsorgane und des Urogenitaltraktes waren alle negativ. Auffallend spezifisch und stark war die Expression von ELBT in distinkten Hautschichten, erstmals detektiert in Hautanteilen der Brustgewebe. Diese Expression an der Grenzschicht von Stratum granulosum und Stratum lucidum zum Stratum corneum konnte in weiteren Hautpräparaten bestätigt werden (Abb.23). Bei der 400fachen Vergrößerung lassen sich ein bis zwei positive Zellreihen unterhalb der verhornten Hautschicht erkennen, die schon weiter ausdifferenziert erscheinen. Eine weitere starke Expression von ELBT konnte in den Schweißdrüsen der Haut detektiert werden (Abb.24). Dabei schien die Expressionsintensität von ELBT innerhalb der Schweißdrüse von den äußeren sekretorischen Zellen zu den dem Lumen zugewandten Zellen abzunehmen (Abb.24, rechte Spalte). Die starke Expression in der Haut deutete sich in den bisherigen Experimenten nur durch die EST-Zahlen des elektronischen Northern an. Im Vergleich zu den quantitativen Expressionsexperimenten spiegelten die Ergebnisse der RNA in-situ Hybridisierung von ELBT in den Gewebeschnitten die differenzielle Expression in Brusttumoren und die schwache Expression in weiteren Geweben wieder.

75

Abb.21: Expression von ELBT im Drüsenepithel der Brust. Die beiden Ausschnitte in der oberen Reihe zeigen die Expressionssignale nach der Antisense-Sonden-Hybridisierung visualisiert durch den blauen Niederschlag von BM Purple. Die mittleren äquivalenten Auschnitte aus dem Präparat, hybridisiert mit der Sense-Sonde, stellen die Negativkontrolle des Experimentes dar. In der unteren Reihe sind die Gewebeareale zur histologischen Beurteilung nach Hämalaun-Eosin-Färbung dargestellt. In der linken Spalte ist ein Lobulus in der 200fachen mikroskopischen Vergrößerung gezeigt, in der rechten Spalte ein Ausschnitt der Epithelzellen (Pfeile) in 400facher Vergrößerung.


76

Abb.22: Expression von ELBT in verschiedenen Tumoren. Im Brusttumor (IDC) konnte keine Expression von IDC nachgewiesen werden (linke Bildreihe). Eine schwache Expression konnte in Zellen des Leberkarzinoms detektiert werden (rechte Bildreihe).


77

Abb.23: Expression von ELBT in Hautanteilen des Brustgewebe-Präparates. Es zeigt sich in der oberen Reihe ein sehr spezifisches Signal in den Hautschichten Stratum granulosum und Stratum lucidum an der Grenze zur Stratum corneum (Pfeile).


78

Abb.24: Expression von ELBT in den sekretorischen Zellen von Schweißdrüsen (Pfeile) in der Haut. In der linken Bilderspalte ist die Schweißdrüse tiefer im Gewebe angeschnitten, in der rechten Bilderspalte ist die positive Schweißdrüse direkt unter der Epidermis lokalisiert.


79

3.3.2.6 Transkriptanalyse und genomische Struktur von ELBT

Das durch den in-silico Ansatz identifizierte Gen ELBT ergab nach der Assemblierung der ESTs durch AUTEX eine cDNA-Länge von 2408 Basenpaaren. Die Transkriptlänge konnte in den Northernblot-Experimenten bestätigt werden, Spleissvarianten wurden nicht identifiziert. Der größte offene Leserahmen betrug 1164bp und ergab ein mögliches translatiertes Protein von 388 Aminosäuren. Zur Verifizierung der Sequenz wurden verschiedene Klone aus dem Assembly sequenziert, die zudem als Sonde für die Expressionsexperimente dienten. Das 5’-Ende des Gens zeigte innerhalb der assemblierten ESTs Sequenzvariationen, die nicht von öffentlichen Klonen abgedeckt waren. Daher wurde eine RACE-PCR mit einem ELBT-spezifischen 3’-Primer durchgeführt, das amplifizierte PCR-Fragment von ca. 550bp kloniert und sequenziert (Abb.25). Mit der gesicherten Sequenzinformation wurde nahezu das gesamte Transkript (P1: 1,4kb; P2: 2,3kb) einschließlich des kodierenden Bereiches amplifiziert, kloniert und sequenziert.

Abb.25: Ergebnis der RACE-PCR zur Verifizierung des 5’-Endes (R1) und der Amplifikation von ELBT-Fragmenten (P1, P2) zur Klonierung der kodierenden Sequenz.

Um die genomische Struktur des Gens zu ermitteln, wurde die cDNA-Sequenz gegen die humane genomische Sequenzdatenbank abgeglichen. Dabei wurden zwei sich überlappende BAC-Sequenzen (AP000649; AC021221) identifiziert, die zusammen assembliert die gesamte genomische Sequenz von ELBT abdeckten (Abb.26). Die BACs kartierten gemäß der annotierten Sequenzdatenbank in die chromosomale


80

Region 11q13.5 und bestätigten die Lokalisation von ELBT. Nach einem Vergleich der cDNA- und genomischen Sequenz ergaben sich für ELBT insgesamt 8 Exons über eine Gesamtlänge des Gens von etwa 30kb. Die Exon-Intron-Übergänge konnten anhand der charakteristischen Signalsequenzen (GT...AG) identifiziert werden. Auf der Sequenz der beiden assemblierten BACs waren mit der cDNA FLJ22644 und dem bekannten Gen UVRAG zwei weitere Transkripte lokalisiert, die ELBT flankieren. UVRAG wurde in Komplementationsexperimenten für UV-Sensitivität als Kandidatengen für Xeroderma pigmentosum beschieben (Perelman et al., 1997).

Abb.26: Chromosomale Lokalisation und genomische Struktur von ELBT. Oben ist die physikalische Lokalisation des Gens in 11q13.5 angegeben (A.). Das Gen ELBT wird von den BACs AP000649 und AC021221 der genomischen Sequenzdatenbank UCSC abgedeckt (B.). Innerhalb der Region liegt ELBT zwischen den Genen FLJ22644 und UVRAG (C.). Das Gen besteht aus 8 Exons (Kästen) mit einer Transkriptlänge von insgesamt 2408bp und umspannt etwa 30kb (D.).

Der aktuellste Datenbankabgleich (Oktober 2001) ergab Sequenzübereinstimmungen zum Unigene-Cluster Hs.334305 mit den Einträgen ’’GS1999full’’ (gi14211870) und ’’Diacylglycerol acyltransferase 2’’ (DGAT2, gi15099952). DGAT2 codiert ein Protein von 387aa und ist mit einer geringen Abweichung von 4bp des offenen Leserahmens identisch zu ELBT (translatierte Sequenz siehe Anhang G.4).


81

3.3.2.7 Das Protein ELBT ist eine putative Acyltransferase

Die Zusammenstellung einer potenziellen ELBT-Proteinfamilie beruhte auf den Protein-Datenbank-Vergleich (nr, NCBI) des humanen ELBT mit 388 Aminosäuren (Stand 1.Juli 2001). Es konnten insgesamt 18 putative Proteine der ELBT-Familie mit einem vorgegebenen Erwartungswert (E>4e-5) zugeordnet werden (Abb.27.1/.2). Die Ähnlichkeit zwischen der humanen und der Maus-Sequenz (gi12832432) betrug auf der Proteinebene 95%. Die weiteren putativen Proteine unbekannter Funktion wurden bei unterschiedlichen Organismen gefunden, wie beispielweise Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae oder Mycobacterium tuberculosis, was auf eine hohe Konservierung dieser Proteinfamilie hindeutete. Innerhalb der Proteinsequenz bilden die Aminosäuren 73-95 eine Transmembran-Domäne (TMHMM, Version 2.0).

Der erste Hinweis auf eine Acyltransferase-Funktion von ELBT erbrachte nach der Datenbanksuche (E=4e-4) die Identifizierung eines hypothetischen Proteins Mycobakterium tuberculosis (gi7476966). Dieses Protein wurde als Acyltransferase im Pfam64 Modell identifiziert (E=2,1e-27). Um dieses Ergebnis zu bestätigen wurde mit der ELBT-Proteinsequenz eine iterative PSIBLAST-Suche gegen die Proteindatenbank (nr) durchgeführt und alle Proteine über dem vorgegebenen Erwartungswert (E>1e-5) eingesammelt. Nach vier PSIBLAST-Runden wurden neben den Mitgliedern der potenziellen ELBT-Proteinfamilie eine gut annotierte 1-Acyl-SN-Glycerol-3-Phosphat Acyltransferase (1-AGPAT) von Borrelia Burgdorferi (gi3914378) mit signifikantem Erwartungswert (E=1e-4) identifiziert. Die reziproke PSIBLAST-Suche mit 1-AGPAT führte neben der Identifizierung von 230 putativen 1-AGPAT-ähnlichen Acyltransferasen wiederum zum oben genannten Protein (gi7476966) von M. tuberculosis, das als mögliche Verbindung zur ELBT-Familie gesehen wurde. Um dies zu bestätigen, wurde ein erneuter PSIBLAST (E>4e-5) mit diesem Protein als Matrize durchgeführt. Neben einigen Mitgliedern der ELBT-Familie (beispielsweise gi7304166 von Drosophila melanogaster und gi6324819 von Saccharomyces cerevisiae) wurden auch Mitglieder der 1-AGPAT-Proteinfamilie (beispielsweise gi7477100 von Mycobacterium tuberculosis, gi7479681 von Streptomyces coelicolor) identifiziert und damit eine Verbindung zwischen den beiden Proteinfamilien gezeigt.


82

Abb.27.1: 1. Abschnitt des Sequenzvergleichs der ELBT-Proteinfamilie.


83

Abb.27.2: 2. Abschnitt des Sequenzvergleichs der ELBT-Proteinfamilie.


84

zu Abb.27.1/.2: a) Vergleich aller identifizierter Mitglieder der ELBT-Proteinfamilie. b) Vergleich der humanen und murinen ELBT-Proteinsequenz. Die jeweils letzen Zeilen jedes Alignments repräsentieren die Konsensussequenz. Die Farbgebung der Aminosäuren wurde mit der CHROMA Software erstellt und gibt ein vorgegebenes Farbschema entsprechend der Aminosäureeigenschaften wieder. 80% der Aminosäuren einer Reihe mussten identisch sein oder zu einer der folgenden Gruppen gehören. Konsensus-Symbol / Farbe / Aminosäuren der Gruppe sind in Klammern wiedergegeben:
negativ (-/rot/DE), hydroxyl (*/hellblau/ST), aliphatisch (|/grau auf gelb/ILV), positiv (+/blau/HKR),
sehr klein (t/grün/AGS), aromatisch (a/blau auf gelb/FHWY), geladen (c/Pink/DEHKR), klein (s/dunkelgrün/ACDGNPSTV), polar (p/hellblau/CDEHKNQRST), groß (b/Lila auf hellgelb/ EFHIKLMQRWY), hydrophob (h/schwarz auf gelb/ACFGHILMTVWI). Der Einlettercode für die Aminosäuren ist im Anhang (G.5) wiedergegeben. Nach Vorhersage von TMHMM Version 2.0 bilden die Aminosäuren 73-95 von ELBT_Mensch eine Transmembran-Helix und sind im entsprechenden Konsensus rot markiert.

Neuste Literaturhinweise über ELBT (Stand Oktober 2001):

ELBT wurde als Gen DGAT2 einer Acyl CoA:Diacylglycerol Acyltransferase (DGAT) beschrieben und einer neuen DGAT-Genfamilie zugeordnet (Cases et al., 2001). Identifiziert wurde DGAT2 über die Homologie zu DGAT aus dem Pilz Mortierella rammaniana (Lardizabal et al., 2001). DGAT2, das keine Homologien zu DGAT1 zeigt, wurde in Insektenzellen exprimiert und zeigte eine Stimulation der Triglycerin-Synthese. Dadurch wurde die vorangegangene Hypothese von ELBT als Acyltransferase und die zusammengefasste neue Proteinfamilie bestätigt. Die in der Publikation beschriebenen weiteren humanen und murinen Mitglieder wurden in dieser Arbeit nicht identifiziert. Die in der TMHMM-Analyse vorhergesagte Transmembrandomäne wurde auch in der oben genannten Referenz beschrieben.


85

3.4 Identifizierung von neuen Kandidatengenen in 11q12-q23 mittels der positionalen Strategie

Im genomweiten Ansatz der in-silico Expressionsanalyse mit den schon beschriebenen Genen aus der chromosomalen Region 11q wurden nach dem elektronischen Northern differenziell exprimierte Gene chromosomal kartiert. Im Gegensatz dazu sollten bei der positionalen Strategie möglichst viele Gene aus der Region 11q über AUTEX identifiziert und assembliert werden, um sie anschließend im elektronischen Northern zu analysieren. Für diese systematische in-silico Expressionsanalyse von Transkripten aus der chromosomalen Region 11q12-q23 wurden 968 STS-Markern zwischen dem proximalen Marker RH13699 in 11q12 und dem distalen Marker RH27416 in 11q23 über AUTEX verlängert und im elektronischen Northern ausgewertet. Die Sequenzen von 921 STS-Marker aus der ’’GenMap99’’-Datenbank konnten durch AUTEX mit Hilfe der EST-Datenbanken verlängert werden. Nach der Eliminierung von identischen Sequenzen resultierte ein nicht-redundantes Set von 563 assemblierten Sequenzen, die jeweils putative Gene aus dieser chromosomalen Region repräsentieren. Die in-silico Expressionsanalyse durch den elektronischen Northern ergab 30 differenziell exprimierte Gene in den Brustgewebe-Bibliotheken (Tumor- gegen Normalgewebe) unter Berücksichtigung der definierten Signifikanzschwelle (P-Wert<0,05). Von den 30 im Brustgewebe differenziell exprimierten Genen waren verglichen mit dem Brust-Normalgewebe 19 im Tumor überexprimiert und 11 im Tumor unterexprimiert (Tab.19). Die meisten der identifizierten Gene stellten bekannte Gene dar. Einige der im genomweiten Ansatz identifizierten Gene wie ELBT, Frizzled 4, CLNS1A oder YAP65 aus 11q12-q23 wurden auch in diesem positionalen Ansatz gefunden. Den in-silico differenziellen Genen gegenübergestellt wurden 21 LOH-Marker und 9 Amplifikations-Marker (Gene), die innerhalb dieser chromosomalen Region 11q12-q23 lokalisiert waren und für die in primären Brusttumoren entsprechende Aberrationen beschrieben worden sind (Tab.19). Zusammen mit den 30 in-silico differenziellen Gene wurden die LOH- und Amplifikations-Marker physikalisch neu kartiert, wobei die annotierte genomische Sequenzdatenbank der UCSC (Stand Juni 2001) verwendet wurde. Die angegebenen physikalischen Bereiche (Position in Mb) bezogen sich auf die Ausdehnung der BAC-Sequenzen, auf denen die Gene und STS-Marker lokalisiert wurden. Dadurch konnten neben der Abfolge auch die ungefähren Abstände der potenziell tumorassoziierten Gene und aberranten Loci wiedergegeben werden.


86

Tab. 19: Auflistung der in-silico Kandidatengene und beschriebenen aberranten STS-Marker für Brusttumore von proximal 11q12 nach distal 11q23 mit Angaben der zytogenetischen Bande und der physikalischen Position auf dem Chromosomenabschnitt in Megabasen (MB). Die Spalte Expression/ Aberration zeigt die charakteristischen Eigenschaften der differenziell exprimierten Gene und beschriebenen STS-Marker in den Brusttumoren (rotes Feld, auf: überexprimiert; grünes Feld, ab: unterexprimiert; rote Schrift, Amp: amplifiziert; grüne Schrift, LOH: Verlust der Hetreozygotie) mit Angaben der Ergebnisse des elektronischen Northern (P-Wert<0,05) und der Aberrationsstudien (verschlüsselte Referenz, siehe Anhang G.2).

Nr.

Gen / STS-Marker

Expression /Aberration

Kartierung

eNORTHERN in Brust

Aberrationen in primären Brusttumoren

Bande

Position in Mb

Hits N

Hits T

Ratio T/N

Ratio

Fälle

Referenzen

1

Lipophilin B

auf

11q12.1

54,40 - 54,70

14

24

2,86

-

-

-

2

Mammaglobin 1

auf

11q12.1

54,40 - 54,70

51

98

3,13

-

-

-

3

Desmoyokin

ab

11q12.1

54,90 - 55,20

60

15

0,45

-

-

-

4

Transcobalamin 1

auf

11q12.3

60,70 - 60,90

1

6

11,11

-

-

-

5

CD 20 like precursor

ab

11q12.3

61,00 - 61,30

14

1

0,12

-

-

-

6

Lipophilin A

auf

11q13.1

63,00 - 63,30

0

4

n.d.

-

-

-

7

Nuclear RNA export factor 1

ab

11q13.1

64,10 - 64,50

18

3

0,30

-

-

-

8

Solute carrier family 3, member 2

auf

11q13.1

64,10 - 64,50

4

14

6,25

-

-

-

9

Retinoic acid receptor responder 3

auf

11q13.1

65,20 - 65,60

10

21

3,70

-

-

-

10

Cytochrome c oxidase subunit VIII

auf

11q13.1

65,70 - 66,00

2

7

6,25

-

-

-

11

FLJ22711

auf

11q13.1

66,30 - 66,80

1

6

11,11

-

-

-

12

Fau

auf

11q13.2

67,30 - 67,60

4

11

5,00

-

-

-

13

Heat shock protein 90

ab

11q13.3

67,70 - 68,00

232

102

0,72

-

-

-

14

Alpha gene sequence

ab

11q13.3

67,70 - 68,00

105

35

0,60

-

-

-

15

Protein kinase MLK-3

auf

11q13.3

67,90 - 68,10

1

6

11,11

-

-

-

16

Non-muscle type cofilin 1

auf

11q13.3

68,30 - 68,50

9

19

3,70

-

-

-

17

FLJ21749

auf

11q13.3

71,40 - 71,70

0

5

n.d.

-

-

-

18

FLJ20853

auf

11q13.3

71,40 - 71,70

1

5

9,09

-

-

-

19

Glutathione S-transferase pi 1

Amp

11q13.4

71,60 - 71,90

-

-

-

5%

13 / 239

1

20

Deleted in oral cancer-related 1

auf

11q13.4

71,60 - 71,90

3

9

5,26

-

-

-

21

Aldehyde dehydrogenase 8

auf

11q13.4

71,60 - 71,90

5

14

5,00

-

-

-

22

D11S97

Amp

11q13.4

73,40 - 73,60

-

-

-

17%

86 / 514

1, 2

23

Cyclin D1 (PRAD1)

Amp

11q13.4

73,90 - 74,20

-

-

-

15%

373 / 2451

1 - 8

24

CCND1 / FGF3

Amp

11q13.4

73,90 - 74,20

-

-

-

16%

317 / 1993

9 - 12

25

Fibroblast growth factor 4

Amp

11q13.4

73,90 - 74,20

-

-

-

14%

231 / 1632

1, 4, 8, 13 - 16

26

FGF4 / FGF3

Amp

11q13.4

73,90 - 75,60

-

-

-

17%

49 / 292

17

27

Fibroblast growth factor 3

Amp

11q13.4

75,40 - 75,60

-

-

-

14%

447 / 3311

1, 4 - 8, 13, 15, 16, 18 - 25

28

Fibroblast growth factor 3

LOH

11q13.4

75,40 - 75,60

-

-

-

22%

32 / 143

23, 26, 27

29

Amplaxin

Amp

11q13.4

74,80 - 75,10

-

-

-

11%

146 / 1350

1, 12

30

Protein phosphatase methylesterase-1

auf

11q13.4

78,90 - 79,20

1

5

9,09

-

-

-

31

ELBT

ab

11q13.5

80,50 - 80,80

24

3

0,22

-

-

-

32

Death associated protein 4

ab

11q13.5

81,10 - 81,40

10

0

n.d.

-

-

-

33

GARP

Amp

11q13.5

81,30 - 81,60

-

-

-

12%

66 / 544

1, 7

34

Chloride channel regulatory protein 1A

auf

11q14.1

82,50 - 82,80

18

22

2,17

-

-

-

35

D11S901

LOH

11q14.1

87,10 - 87,40

-

-

-

30%

16 / 54

28, 29

36

Unbekannt

auf

11q14.1

88,60 - 88,80

0

3

n.d.

-

-

-

37

Clathrin assembly protein

ab

11q14.2

91,70 - 92,00

25

4

0,29

-

-

-

38

Frizzled 4

ab

11q14.2

92,60 - 92,80

14

1

0,12

-

-

-

39

D11S4175

LOH

11q14.3

96,40 - 96,60

-

-

-

34%

24 / 70

30

40

D11S1342

LOH

11q14.3

96,60 - 96,80

-

-

-

40%

4 / 10

31

41

D11S873

LOH

11q14.3

98,60 - 98,90

-

-

-

46%

5 / 11

29

42

D11S29

LOH

11q14.3

98,70 - 100,00

-

-

-

38%

60 / 160

31, 32

43

Hypothetical protein HSPC148

auf

11q21

101,60 - 102,00

0

3

n.d.

-

-

-

44

D11S35

LOH

11q22.1

108,60 - 108,90

-

-

-

39%

64 / 165

26, 27, 28, 31

45

D11S940

LOH

11q22.1

109,30 - 109,50

-

-

-

31%

11 / 36

31

46

Yes-associated protein

ab

11q22.1

109,90 - 110,20

26

6

0,41

-

-

-

47

Matrix metalloproteinase 7

ab

11q22.2

110,30 - 110,60

18

3

0,30

-

-

-

48

D11S2000

LOH

11q22.3

113,80 - 114,00

-

-

-

43%

3 / 7

31

49

D11S1325

LOH

11q22.3

113,90 - 114,10

-

-

-

33%

30 / 91

33

50

D11S1778

LOH

11q22.3

116,40 - 116,70

-

-

-

37%

294 / 791

33, 34

51

D11S1294

LOH

11q22.3

116,50 - 116,70

-

-

-

43%

258 / 607

33, 34

52

D11S927

LOH

11q22.3

118,60 - 118,90

-

-

-

39%

185 / 472

27, 33, 34

53

D11S1391

LOH

11q23.1

119,10 - 119,30

-

-

-

37%

38 / 97

36, 37

54

D11S1347

LOH

11q23.1

120,80 - 121,20

-

-

-

37%

46 / 123

33

55

D11S897

LOH

11q23.1

121,60 - 121,80

-

-

-

36%

9 / 25

29, 31

56

D11S528

LOH

11q23.2

123,30 - 123,60

-

-

-

38%

16 / 42

26, 31

57

Apolipoprotein C-III

LOH

11q23.3

126,20 - 126,30

-

-

-

44%

231 / 529

28, 33, 38, 39

58

D11S976

LOH

11q23.3

127,50 - 127,70

-

-

-

24%

43 / 182

32

59

CD3D antigen

LOH

11q23.3

127,80 - 128,10

-

-

-

27%

15 / 56

29, 31

60

D11S925

LOH

11q23.3

131,10 - 131,30

-

-

-

31%

27 / 87

27


87

Ein Vergleich der in-silico Kandidatengene mit den abberranten Regionen ermöglichte die Zuordnung von in Tumoren geringer exprimierten Genen als potenzielle Kandidatengene für spezifische LOH-Regionen sowie die Zuordnung von in Tumoren überexprimierten Genen als potenzielle Kandidatengene für beschriebene amplifizierte Chromosomenabschnitte. Desweiteren ließen sich Gencluster identifizieren, in deren chromosomalen Bereichen bisher keine Aberrationen beschrieben worden sind (Abb.28).

Abb.28: Vergleich der Lokalisation beschriebener aberranter Loci (grüne quergestreifte Balken = LOH-Region; rote quergestreifte Balken = amplifizierte Region) und der über den positionalen Ansatz identifizierten in-silico Kandidatengene (grüne Balken= im Tumor herunterreguliert; rote Balken= in Tumor hochreguliert). Die Kandidatengene bzw. Nummern entsprechen den Angaben der Tab.19. Die Gene MEN1, CCND1, FGF3, FGF4, EMS1 und ATM stellen schon beschriebene tumorassoziierte Gene dar.

Im proximalen Abschnitt 11q12.1-q13.3 wurden mehrheitlich Gene identifiziert, die sich im elektronischen Northern als überexprimiert in Brusttumoren zeigten. Mit Lipophilin A, Lipophilin B und Mammaglobin 1 (MGB1) gehören drei dieser Gene der Uteroglobin-Familie an, wobei für MGB1 eine Überexpression in Brusttumoren bereits beschrieben


88

worden ist (Watson et al., 1996). Ein distinkte signifikante Anhäufung von überexprimierten Genen (Tab.19: Nr.8-12) wurde in 11q13.1 lokalisiert, wobei keines dieser Gene im Zusammenhang mit der Entstehung von Brusttumoren in Verbindung gebracht worden ist. Auf der DNA-Ebene wurden in diesem proximalen Abschnitt von 11q keine Beschreibungen über Amplifikationen in Brusttumoren gefunden, die auf ein tumorförderndes Gen schließen lassen. Distal an diesem Gencluster ist MEN1 als Tumorsuppressorgen für familläre Neoplasien lokalisiert. Die häufigste in Brusttumoren amplifizierte Region (ca. 15%) wurde in 11q13.4 lokalisiert, für die mit Cyclin D1, FGF3 und FGF4 bereits involvierte Gene bekannt sind. Proximal zu dieser Region wurden in 11q13.3-q13.4 weitere Gene (Nr.15-18, 20, 21) identifiziert, die in-silico in Brusttumoren überexprimiert waren und weitere Kandidatengene für dieses Amplikon darstellen. Die Gene ELBT und DAP4 (Nr.31, 32), die schon im genomweiten Ansatz identifiziert wurden, lagen distal des beschriebenen Amplikons in einer Region für die sowohl LOH als auch Amplifikationen beschrieben worden ist. Der Chloridkanal CLNS1A (Nr.34), welcher in Brusttumoren als überexprimiert identifiziert wurde, kartierte in geringer Distanz (ca. 1Mb) zum Gen GARP, das in 12% der Brusttumoren als amplifiziert beschrieben worden ist. Im distalen Bereich der untersuchten Region 11q12-q23 wurden in der Literatur gehäuft Deletionen beschrieben. Dabei konnten für zwei distinkte LOH-Regionen Kandidatengene aus dem in-silico Ansatz identifiziert werden. Die beiden Gene CLTH und Frizzled 4 (Nr.37, 38) in 11q14.2 waren im elektronischen Northern signifikant in Brusttumoren herunterreguliert und kartierten proximal (ca. 4Mb) zu der beschriebenen LOH-Region in 11q14.3 (Nr.39-42; LOH in ca. 38% der Brusttumore). Als mögliche Tumorsuppressorgen-Kandidaten für die LOH-Region in 11q22.1 (D11S940, D11S35) konnten in geringem physikalischen Abstand (ca. 1Mb) die distal lokalisierten Gene YAP65 und MMP7 (Nr.46, 47) identifiziert werden. Beide Gene zeigten sich im elektronischen Northern als signifikant im Brusttumor herunterreguliert. In der chromosomalen Region 11q22.3-q23.3 ergaben sich nach Auswertung der LOH-Studien über eine große Distanz von fast 20Mb (D11S2000-D11S925) Deletionen in 35-40% der Brusttumore. In diesem Bereich konnten keine neuen Kandidatengene über die in-silico Expressionsanalyse identifiziert werden.


89

3.5 Beschreibung der Kandidatengene in 1q32-q41

Aus dem genomweiten Ansatz wurden, neben der Region 11q12-q23, die differenziell exprimierten Gene aus der Region 1q32-q41 weiter untersucht. Aufgrund der schlechteren genomischen Charakterisierung der Region 1q und der geringen Vergleichsdaten aus LOH- und Amplifikationsstudien über die Tumore erfolgte die für die Region 11q durchgeführte positionale Strategie nicht für die Region 1q.

3.5.1 Validierung aller in-silico Kandidatengene in 1q32-q41

In der chromosomalen Region 1q32-q41 konnten fünf Gene identifiziert werden, die nach der in-silico Expressionsanalyse in Brust- oder Ovarialtumoren differenziell exprimiert waren. Vier Gene zeigten nach der Annotation durch die Nukleinsäure- und Protein-Datenbanken Identitäten zu bereits beschriebenen Genen (Tab.20).

Tab. 20: Beschreibung der in-silico differenziellen Gene aus der chromosomalen Region 1q32.q41. Die Angabe der Signifikanz (E-Wert) bezieht sich auf das Ergebnis des Vergleichs der assemblierten Sequenz mit der Nukleinsäure-Datenbank (BLASTN).

Gene in 1q32-q41

Gene Abkürzung

Genbank-eintrag

Funktion

Referenz

Protein phosphatase 2, regulatory subunit B (B56), alpha isoform

PPP2R5A

gi5453949

Interaktion mit APC; inhibitiert
ß-catenin über wnt-Signalweg

McCright et al., 1996; Seeling et al., 1999

ETS-related transcription factor ERT / ELF3

ERT / ELF3

gi2338755

Transkriptionsfaktor der ETS-Familie; epithelspezifisch

Brembeck et al., 2000; Chang et al., 2000

Homologie zu:
RAT mRNA for calpain

putatives Calpain

gi441199

Calpaine: Ca2+ -aktivierte Protease reguliert Ca2+-abhängige Signalwege des Zellzyklus

Sato et al., 2001

Decay accelerating factor DAF

DAF / CD55

gi181464

Hemmung des Komplement-systems; Interaktion mit CD97

Aust et al., 1997; Hamann et al., 1998

Hypothetical protein HSPC186

HSPC186

gi7106761

unbekannt

 


Eines der identifizierten Gene zeigte signifikante Ähnlichkeiten zu einem Calpain der Ratte (gi441199) und wurde in dieser Arbeit als putatives Calpain bezeichnet. Die allgemeinen Angaben über die Funktion bezieht sich dabei auf die Proteinfamilie der Calpaine, zu der das putative Calpain ein potenziell neues Mitglied darstellt. Für die Gene PPP2R5A, ELF3 und DAF lagen Literaturhinweise vor, die aufgrund ihrer Funktion für einen möglichen Einfluss in die Karzinogenese sprechen. Zum Gen HSPC186 gab es ausser dem Sequenzeintrag in der Datenbank keine weiteren Informationen zur möglichen Funktion des Proteins.


90

Tab. 21: Ergebnisse der chromosomalen Kartierung der Gene in 1q32-q41 über Radiation Hybrid Mapping (RHdb) oder ePCR mit Angabe der Wahrscheinlichkeit (LOD_Score), des statistisch ermittelten Abstandes (in cRs) und der Angabe der zytogenetischen Bande nach der genomischen Datenbank (GDB) bzw. der aktuellen genomischen Sequenzdatenbank (UCSC). Die Größe des Transkriptes ergab sich aus dem Northernblot (Abb.30).

Gene in 1q32-q41

Assembly in bp

Transkript in bp

Protein in aa

Chromosomale Kartierung

 

RHdb / ePCR

LOD_Score

Abstand in cRs

GDB (08/1998)

UCSC (06/2001)

PPP2R5A

3121

3,1

486

WI-7329

11.5

5.4

1q32.2-q32.3

1q32.3

ERT / ELF3

2657

2,5

371

RH75923

-

-

1q32.2

1q32.1

putatives Calpain

1499

7,5

n.b.

SHGC-3992

11.5

5.4

1q41

n.b.

DAF / CD55

2367

2,2 (SV)

381

SHGC-11228

1000

0

1q32.2

1q32.2

HSPC186

1571

1,5

183

SHGC-76170

9.4

0

1q32.1

1q32.1


Abb.29: Cytogenetische Lokalisation der Kandidatengene in 1q32-q41. Die in-silico differenziell exprimierten Genen (rechte Spalte) wurden entsprechend der annotierten Genomdatenbank (UCSC) chromosomal kartiert. Die getrennt dargestellten Gene ELF3 und MDM4 wurden in verschiedenen Tumoren als häufig amplifiziert beschrieben (Tymms et al., 1997; Riemenschneider et al., 1999).


91

Alle fünf Gene wurden bei der chromosomalen Lokalisation aufgrund der identifizierten STS-Marker in die Region 1q32-q41 kartiert, die in Brust- und Ovarialkarzinomen häufig als amplifiziert gefunden wurden (Tab.21). Das Gen PPP2R5A wurde über Radiation Hybrid Mapping und nach den Einträgen der annotierten humanen Genomsequenz in 1q32.3 kartiert, wohingegen dieses Gen in der Literatur in 1q41 lokalisiert wurde. Mit dem Gen ELF3 wurde ein Gen in 1q32 identifiziert, das zusammen mit MDM4 als mögliche Kandidatengene für dieses Amplikon beschrieben worden sind (Abb.29). Im elektronischen Northern zeigten alle Gene hinsichtlich Brust oder Ovar eine signifikante Überexpression im Tumor gegenüber dem Normalgewebe (Tab.22). Die Gene ELF3, DAF und das putative Calpain waren sowohl in Brust- als auch in Ovarialtumoren überexprimiert, die Gene PPP2R5A und HSPC186 zeigten in-silico in Brusttumoren eine signifikante Überexpression. Das beobachtete Expressionsverhalten dieser Gene korreliert mit den beschriebenen genomischen Veränderungen, dass es sich bei der chromosomalen Region 1q32-q41 um eine amplifizierte DNA-Region in verschiedenen Tumoren handelt und dort tumorassoziierte Gene vermutet werden.

Tab. 22: Ergebnisse des elektronischen Northern der Gene in 1q32-q41 bezüglich der differenziellen Expression in Brust- und Ovargewebe.

Gene in 1q32-q41

Gewebetyp

Normalgewebe

Tumorgewebe

Verhältnis T/N

P-Wert
á

Signifikanz in %

Treffer

Bibliotheks-Größe

Treffer

Bibliotheks-Größe

   

PPP2R5A

Brust

7

120725

10

67582

2.56

0.0732

92.7

Ovar

4

33687

0

41736

-

0.0394

96.1

ERT / ELF3

Brust

10

120725

23

67582

3.85

0.00023

100.0

Ovar

3

33687

11

41736

2.94

0.107

89.3

Putatives Calpain

Brust

2

120725

6

67582

5.00

0.0598

94.0

Ovar

0

33687

6

41736

-

0.0369

96.3

DAF / CD55

Brust

6

120725

9

67582

2.50

0.107

89.3

Ovar

0

33687

5

41736

-

0.0697

93.0

HSPC186

Brust

10

120725

15

67582

2.50

0.0366

96.3

Ovar

0

33687

2

41736

-

1

0.0


Zur Verifizierung der in-silico Ergebnisse wurde die Expression der Gene auf dem cDNA-Array mit paarweise aufgebrachten Normal- und Tumorproben von Brust- und Ovarialgeweben untersucht (Abb.30). Von den Genen PPP2R5A, dem putativen Calpain und HSCP186 wurde zuvor das Expressionsmuster auf dem Northernblot bestimmt. Die Gene PPP2R5A und HSCP186 zeigten eine ubiquitäre Expression in vielen Geweben, wobei bezüglich des HSCP186 neben dem Haupttranskript (1,5kb) weitere Spleissvarianten identifiziert werden konnten. Das putative Calpain zeigte eine sehr spezifische Expression im Dickdarm und korrelierte mit gewebespezifischen Calpainen wie nCL-2 und nCL-4 des Verdauungstraktes. Das Transkript des putativen


92

Calpains ergab in der Northernblot-Analyse eine Größe von ca. 7,5kb, wovon in der assemblierten Sequenz nur 1499bp repräsentiert waren (Tab.21). Der fehlende Teil der Sequenz des putativen Calpains konnte in dieser Arbeit nicht entschlüsselt werden. Die Sonden für die Gene ELF3 und DAF lagen für diese Arbeit bereits optimiert vor, so dass aufgrund der bereits beschriebenen Gewebeexpression nur die Ergebnisse der cDNA-Arrays dargestellt sind. Von den fünf untersuchten Genen ließ sich im cDNA-Array die Überexpression in den Brusttumoren signifikant (T/N>2) für das Gen des putativen Calpains in sieben der neun Probenpaare (Abb.30; Nr.3-9) bestätigen. Die Gene HSCP186 und ELF3 zeigten eine signifikante Hochregulation der Transkription in nur zwei der neun Probenpaare (Nr. 1, 5 bzw. Nr.5, 6). Die Expressionanalyse der Gene PPP2R5A und DAF in den Brusttumoren des cDNA-Arrays ergaben ein heterogenes Ergebnis.

Abb.30: Übersicht über das Expressionsmuster der Gene aus 1q32-q41 im MTN-Northernblot (linke Bilderspalte) mit 16 verschiedenen Gewebetypen und im cDNA-Array (beide rechte Bildspalten) mit korrespondierenden Normal (N)- und Tumorproben (T) von Brust- und Ovargewebe. Für die Gene ELF3 und DAF lagen die Sonden schon validiert vor und es sind nur die Hybridisierung des cDNA-Arrays dargestellt. Unter den cDNA-Arrays sind die Expressionsverhältnisse (T/N) angegeben.


93

Für das Gen PPP2R5A bestätigte sich die Überexpression im Tumor (T/N>2) in vier der neun Brust-Probenpaare (Nr.3, 5, 6, 8), während zwei Probenpaare (Nr.1, 7) eine signifikant geringere Expression in den Tumoren (T/N<0,5) zeigten. Im Falle des Gens DAF waren fünf der neun Probenpaare im Tumor signifikant niedriger exprimiert, während sich nur bei drei Probenpaaren eine verstärkte Expression in den Tumoren zeigte. Die in-silico identifizierte Hochregulation von DAF im Ovarialkarzinom bestätigte sich in zwei der drei Probenpaare (Nr.1, 2) auf dem cDNA-Array.

Das putative Calpain ließ sich nach diesen Expressionsexperimenten als potenziell tumorassoziiertes Gen bestätigen. Es konnte zu der kurzen Sequenz des Assemblies keine weitere Sequenz des großen Transkriptes, das sich aus dem Northernblot ergab, entschlüsselt werden. Dadurch konnte keine Aussage über eine translatierte Proteinsequenz getroffen werden. Für die Gene ELF3 und HSPC186 ließ sich die Hochregulation in Brusttumoren in der Mehrzahl der untersuchten Probenpaare nicht bestätigen. Die Expressionsverhältnisse der Gene DAF und PPP2R5A waren bezüglich der Probenpaare des cDNA-Arrays sehr heterogen, wobei sich im Falle des Gens PPP2R5A die Hochregulation in Brusttumoren aus dem elektronischen Northern tendenziell bestätigte.

3.5.2 Charakterisierung des potenziellen Onkogens PPP2R5A

Mit dem Gen PPP2R5A wurde ein potenzielles Onkogen im Amplikon 1q32 identifiziert, das aufgrund der Expressionsstudien in einer Fraktion von Brusttumoren überexprimiert war. Mit PPP2R5A wurde ein Gen identifiziert, das im ’’Wingless-Signalweg’’ involviert ist, der mit der Entstehung verschiedener Tumore in Verbindung gebracht worden ist. Die Ergebnisse des cDNA-Arrays zur Validierung der differenziellen Expression ergaben für PPP2R5A eine heterogenes Expressionsmuster. Um die differenzielle Expression zu überprüfen, wurden für PPP2R5A quantitative Taqman-Analysen an mikrodissezierten Brusttumoren und Normalepithelien der Brust durchgeführt. Desweiteren wurde die Lokalisation der Genexpression durch die RNA in-situ Hybridisierung in Brustgewebe-Paraffinschnitten ermittelt.


94

3.5.2.1 Geringe Expressionsunterschiede von PPP2R5A in Brusttumoren

Die Ergebnisse der Expression des Gens PPP2R5A in den mikrodissezierten Brusttumoren gaben die heterogenen Verhältnisse der Expression in den Probenpaaren des cDNA-Arrays wieder. Es konnten nach der Taqman-Analyse 17 Tumorproben und eine Normalepithelprobe ausgewertet werden (Tab.23).

Tab. 23: Auswertung der Taqman-Analyse zur Expression von PPP2R5A in den mikrodissezierten Brustgeweben.

Nr.

Histologie

Gen

CT (Mw)

Stabw

Gen

T (Mw)

Stabw

?C?

Stabw?C?

??C?

Level

- Fehler

+ Fehler

B1

IDC, grade 2

GAPDH

24,7

0,1

PPP2R5A

35,0

0,26

10,3

0,28

0,4

0,734

0,13

0,2

B2

IDC, grade 2

GAPDH

25,8

0,44

PPP2R5A

36,4

0,36

10,6

0,57

0,7

0,595

0,19

0,3

B3

IDC, grade 2

GAPDH

28,2

0,18

PPP2R5A

36,9

0,36

8,7

0,40

-1,1

2,158

0,53

0,7

B5

IDC, grade 2

GAPDH

25,9

0,22

PPP2R5A

35,2

0,01

9,3

0,22

-0,5

1,384

0,20

0,2

B6

IDC, grade 2

GAPDH

24,9

0,03

PPP2R5A

36,3

0,05

11,4

0,06

1,6

0,332

0,01

0,0

B7

IDC, grade 2

GAPDH

26,9

0,12

PPP2R5A

35,7

0,24

8,8

0,27

-1,1

2,083

0,35

0,4

B8

IDC, grade 3

GAPDH

26,6

0,08

PPP2R5A

36,1

0,47

9,5

0,48

-0,3

1,210

0,34

0,5

B9

IDC, grade 3

GAPDH

26,5

0,14

PPP2R5A

36,4

0,13

9,8

0,19

0,0

0,992

0,12

0,1

B10

IDC, grade 3

GAPDH

27,7

0,18

PPP2R5A

35,8

0,45

8,2

0,48

-1,7

3,171

0,90

1,3

B11

IDC, grade 3

GAPDH

28,8

0,19

PPP2R5A

39,9

0,21

11,0

0,28

1,2

0,425

0,08

0,1

B12

IDC, grade 3

GAPDH

31,3

0,06

PPP2R5A

39,3

0,59

8,0

0,59

-1,8

3,418

1,15

1,7

B14

ILC, grade 2

GAPDH

28,4

0,32

PPP2R5A

35,9

0,15

7,5

0,35

-2,3

4,902

1,07

1,4

B15

ILC, grade 2

GAPDH

27,3

0,45

PPP2R5A

36,4

0,30

9,1

0,54

-0,7

1,653

0,52

0,7

B16

ILC, grade 2

GAPDH

26,8

0,22

PPP2R5A

36,2

0,06

9,4

0,23

-0,4

1,326

0,19

0,2

B22

ILC, grade 2

GAPDH

25,3

0,41

PPP2R5A

37,7

0,13

12,4

0,43

2,6

0,165

0,04

0,1

B17

ILC, grade 3

GAPDH

24,1

0,29

PPP2R5A

35,8

0,34

11,7

0,45

1,9

0,266

0,07

0,1

B18

ILC, grade 3

GAPDH

28,5

0,1

PPP2R5A

38,4

0,55

9,9

0,56

0,1

0,924

0,30

0,4

 

B19

Normalepithel

GAPDH

28,8

0,55

PPP2R5A

38,6

0,27

9,8

0,61

0,0

1,000

0,35

0,5


Abb.31: Übersicht der Expressionslevel von PPP2R5A in 17 mikrodissezierten Tumoren bezogen auf eine Normalepithelprobe (B19). Die Tabelle gibt die Fraktionen der Tumore nach IDC und ILC getrennt wieder, die differenziell exprimiert (Unterexpression: T/N < 0,5; Überexpression: T/N > 2) waren.


95

Im Vergleich der relativen Expression der Tumorproben zur Normalepithelprobe (B19) ergaben sich in 36% der IDCs eine mindestens zweifache Überexpression, in 18% der IDCs eine mindestens zweifache Unterexpression (Abb.31). Bei den ILCs bestätigte nur eine (17%) von sechs Proben die im elektronischen Northern vorhergesagte Überexpression, zwei Proben (33%) waren mindestens zweifach geringer exprimiert. Die getroffenen statistischen Aussagen müssen bei diesem Experiment aufgrund der einzelnen Normalepithelprobe relativiert und im Zusammenhang mit den vorangegangenen Studien betrachtet werden. Die Resultate der Expression von PPP2R5A in den mikrodissezierten Proben bestätigen das Expressionsmuster des cDNA-Arrays. Aus den Expressionsstudien resultierend ergab sich in etwa 30-40% der Tumore eine moderate Überexpression von PPP2R5A (2<T/N<5), während in ca. 20% der Tumore das Gen geringer exprimiert war (0,2<T/N<0,5).

3.5.2.2 Ubiquitäre Expression von PPP2R5A in verschiedenen Geweben

Parallel zu den Taqman-Analysen der mikrodissezierten Brusttumoren wurde die Expression von PPP2R5A in 22 verschiedenen humanen Organen und neun Tumorzelllinien untersucht (Tab.24).

Tab. 24: Auswertung der Taqman-Analyse zur Expression von PPP2R5A in 22 verschiedenen Normalgeweben und neun Zelllinien.

Name

Gen

CT (Mw)

Stabw

Gen

(Mw)

Stabw

?CT

Stabw?C?

??CT

Level

- Fehler

+ Fehler

Gehirn

GAPDH

21,1

0,23

PPP2R5A

25,8

0,28

4,7

0,36

2,2

0,23

0,05

0,06

Speicheldrüse

GAPDH

21,8

0,14

PPP2R5A

25,3

0,17

3,5

0,22

1,0

0,51

0,07

0,08

Schilddrüse

GAPDH

21,6

0,01

PPP2R5A

25,1

0,38

3,6

0,38

1,0

0,50

0,12

0,15

Magen

GAPDH

23,8

0,3

PPP2R5A

25,4

0,25

1,6

0,39

-1,0

1,98

0,47

0,61

Thymus

GAPDH

21,2

0,02

PPP2R5A

25,1

0,15

3,8

0,15

1,3

0,41

0,04

0,05

Uterus

GAPDH

22,0

0,24

PPP2R5A

24,8

0,13

2,8

0,27

0,2

0,85

0,15

0,18

Prostata

GAPDH

22,3

0,19

PPP2R5A

25,2

0,24

2,9

0,31

0,3

0,79

0,15

0,19

Skelettmuskel

GAPDH

19,3

0,25

PPP2R5A

25,1

0,17

5,9

0,30

3,3

0,10

0,02

0,02

Dünndarm

GAPDH

22,6

0,21

PPP2R5A

25,6

0,07

3,0

0,22

0,5

0,73

0,10

0,12

Herz

GAPDH

21,5

0,49

PPP2R5A

25,2

0,1

3,7

0,50

1,1

0,45

0,13

0,19

Placenta

GAPDH

23,2

0,04

PPP2R5A

26,1

0,34

2,9

0,34

0,3

0,81

0,17

0,22

Hoden

GAPDH

23,2

0,17

PPP2R5A

26,9

0,06

3,7

0,18

1,1

0,46

0,05

0,06

Milz

GAPDH

23,4

0,1

PPP2R5A

25,0

0,24

1,6

0,26

-1,0

1,98

0,33

0,39

Hypophyse

GAPDH

22,9

0,24

PPP2R5A

26,3

0,18

3,5

0,30

0,9

0,53

0,10

0,12

Pankreas

GAPDH

25,8

0,19

PPP2R5A

27,1

0,3

1,3

0,36

-1,3

2,40

0,52

0,67

Leber

GAPDH

23,7

0,24

PPP2R5A

25,4

0,24

1,7

0,34

-0,8

1,76

0,37

0,47

Brust

GAPDH

22,5

0,14

PPP2R5A

25,0

0,06

2,6

0,15

0,0

1,00

0,10

0,11

Lunge

GAPDH

23,2

0,15

PPP2R5A

24,6

0,13

1,5

0,20

-1,1

2,14

0,27

0,31

Lymphknoten

GAPDH

24,2

0,3

PPP2R5A

26,8

0,14

2,7

0,33

0,1

0,94

0,19

0,24

Dickdarm

GAPDH

23,3

0,11

PPP2R5A

25,9

0,35

2,6

0,37

0,1

0,95

0,21

0,27

Niere

GAPDH

23,2

0,05

PPP2R5A

26,5

0,09

3,2

0,10

0,7

0,63

0,04

0,05

Cervix

GAPDH

26,5

0,15

PPP2R5A

28,6

0,21

2,0

0,26

-0,5

1,44

0,24

0,28

MCF7

GAPDH

21,2

0,02

PPP2R5A

27,1

0,29

6,0

0,29

3,4

0,09

0,02

0,02

T47D

GAPDH

23,1

0,07

PPP2R5A

26,2

0,08

3,2

0,11

0,6

0,65

0,05

0,05

MDA231

GAPDH

21,2

0,11

PPP2R5A

27,0

0,11

5,8

0,16

3,3

0,10

0,01

0,01

BT474

GAPDH

21,4

0,1

PPP2R5A

26,4

0,12

4,9

0,16

2,4

0,19

0,02

0,02

MDA453

GAPDH

20,7

0,12

PPP2R5A

24,6

0,29

3,9

0,31

1,4

0,39

0,08

0,09

SKBR3

GAPDH

20,6

0,26

PPP2R5A

25,2

0,12

4,7

0,29

2,1

0,23

0,04

0,05

EB-2

GAPDH

19,7

0,16

PPP2R5A

26,4

0,12

6,7

0,20

4,1

0,06

0,01

0,01

PA-1

GAPDH

21,3

0,07

PPP2R5A

27,4

0,21

6,2

0,22

3,6

0,08

0,01

0,01

BG-1

GAPDH

21,0

0,16

PPP2R5A

28,2

0,01

7,2

0,16

4,6

0,04

0,00

0,00


96

Abb.32: Darstellung der Expression von PPP2R5A in 22 unterschiedlichen Normalgeweben und neun Tumorzelllinien im Säulendiagramm.

Die Taqman-Analyse ergab die stärkste Expression in den Organen Pankreas, Lunge, Milz, Leber, Magen und Cervix. Die weiteren untersuchten Normalgewebe zeigten eine ähnlich starke bis zweifach geringere Expression von PPP2R5A gegenüber dem Brustgewebe als Referenzprobe. Die geringsten Expressionslevel wurden in Gehirn und Skelettmuskel festgestellt. Damit bestätigte sich das Ergebnis des elektronischen Northern und des Northernblots einer weitgehend ubiquitären Expression von PPP2R5A in den humanen Geweben (Abb.32). Die Brust-Tumorzelllinien zeigten bis auf die Zelllinie T47D gegenüber den meisten Normalgeweben eine deutlich schwächere Expression von PPP2R5A (Level<0,5). Die Expressionslevel der Ovarial-Tumorzelllinien (EB-2, PA-1, BG-1) waren nochmals deutlich geringer (Level<0,1) gegenüber den Brust-Tumorzelllinien.

3.5.2.3 RNA in-situ Hybridisierung zeigte die Expression von PPP2R5A sowohl im Tumor als auch im Normalepithel der Brust

Zur Durchführung der RNA in-situ Hybridisierung des Gens PPP2R5A auf Paraffinschnitten verschiedener Brustgewebe wurden aus dem genspezifischen Klon (AA486712) entsprechende RNA-Sonden mit einer Größe von 2,3kb präpariert (Abb.33). Die Hybridisierung der Antisense- und Sense-Sonden von PPP2R5A erfolgte


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auf Paraffinschnitten einschließlich Normalepithelien der Brust, zehn invasiv duktalen und sechs invasiv lobulären Karzinomen. Die Sense-Sonde als Negativ-Kontrolle ergab kein Expressionssignal auf den Gewebeschnitten, wodurch die Spezifität der Antisense-Sonde gewährleistet wurde. Die Hybridisierung mit der PPP2R5A-spezifischen Antisense-Sonde zeigte die Expression des Gens sowohl in den Normalepithelien der Brust, als auch in den verschiedenen Tumoren. In den Normalepithelien der Brust waren etwa 20-40% der Zellen positiv gefärbt (Abb.34). Es konnten in den verschiedenen Drüsenanteilen der Brust keine Expressionsunterschiede festgestellt werden. Die Expression des Gens war neben dem abgebildeten unauffälligen Epithel auch in hyperplastischen Epithelien nachweisbar. Eine ebenso moderate, bis starke Expression ergab die Hybridisierung der invasiv duktalen Tumoren (Abb.34). In dem abgebildeten Beispiel des IDCs sind weniger als 20% der Tumorzellen positiv. Dies entsprach der Expressionsstärke in ca. 50% der untersuchten invasiv duktalen Karzinome. Weitere 50% der IDCs zeigten in ca. 20-40% der Tumorzellen eine Expression des Gens PPP2R5A. Ähnliche Expressionsverhältnisse ergaben sich bei der Untersuchung von den invasiv lobulären Karzinomen (Abb.35). Die Hybridisierung von vier der sechs ILCs ergaben ca. 20-40% positive Tumorzellen, wie im abgebildeten Beispiel. Dabei zeigte sich eine Expression von PPP2R5A nicht nur in den kompakten Tumorarealen, sondern auch in den kleineren Tumorzellhaufen, die durch Invasion einzelner Tumorzellen in Lymphgefäße, Fett- oder Bindegewebe entstanden sind. Quantitative Expressionsunterschiede hinsichtlich der Tumorprogression konnten in den untersuchten Präparaten nicht festgestellt werden.

Abb.33: Sondenpräparation für die RNA in-situ Hybridisierung des Gens PPP2R5A. Für die Linearisierung und in-vitro Transkription wurde der Klon AA486712 eingesetzt.


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Abb.34: RNA in-situ Hybridisierung der PPP2R5A-Sonde auf Brustgewebe-Paraffinschnitte. Das Gen PPP2R5A ist sowohl in normalem Brustepithel (linke Bilderspalte, Pfeile), als auch in invasiv duktalen Karzinomen (IDC, rechte Bilderspalte, Pfeile) exprimiert. Die Negativ-Kontrollpräparate zeigen keine Färbung (PPP2R5A Sense). In den HE-Schnitten sind die blaugefärbten Zellkerne erkennbar. Der HE-Schnitt des Normalepithels zeigt aufgrund der Entfernung zu den beiden hybridisierten Schnitten nicht mehr die gleiche Drüsenstruktur.


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Abb.35: Die RNA in-situ Hybridisierung der PPP2R5A-Sonde ergab die Expression im invasiv lobulären Typ (ILC) des Brustkarzinoms. In der linken Bilderspalte sind die stark positiven kompakten Tumormassen des ILC dargestellt (Pfeile). Eine Expression von PPP2R5A zeigte sich auch in kleineren Tumorzellhaufen in Lymphgefäßen und im Bindegewebe (rechte Bilderspalte, Pfeile; Doppelpfeil markiert venöses Gefäß).


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Thu Jan 30 14:01:20 2003