Kuner, Ruprecht: Identifizierung differenziell exprimieter Gene bei Brust- und Ovarialkarzinomen in den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23

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Kapitel 4. Diskussion

4.1 Bewertung der in-silico Expressionsanalyse als Methode zur Identifizierung tumorassoziierter Gene

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von neuen tumorassoziierten Genen aufgrund ihrer differenziellen Expression in Brust- und Ovarialkarzinomen. Die Karzinogenese stellt einen sehr komplexen, weitgehend noch unbekannten Prozess der Fehlregulation zellulärer Stoffwechselwege dar, in dessen Verlauf eine Vielzahl von Genen involviert sind. Es wurden bereits Gene beschrieben, die durch ihren proliferationshemmenden Charakter die Entartung der Zellen verhindern oder durch ihren onkogenen Charakter die Tumorentstehung fördern. Bei den klassisch definierten Tumorsuppressorgenen (TSG) wie RB, TP53, APC und WT1 sowie Onkogenen wie RAS, MYC und BCL1 wurden Mutationen in der genomischen Sequenz für verschiedene Tumore festgestellt (Bishop, 1991; Sager et al., 1994; Cooper, 1995; Weinberg, 1996). Veränderungen auf DNA-Ebene können die Aktivität des Proteins beeinflussen, aber auch zu einer Deregulation der Genexpression in den Tumoren führen. Dem gegenüber steht eine zahlreicher werdende Gruppe von Genen, die durch Veränderung ihrer Expressionsstärken signifikante Assoziationen zur Tumorentstehung zeigen, ohne dass Veränderungen auf der DNA-Ebene vorhanden sind. Beispiele für solche Gene sind Maspin, CDKN2A oder EGFR (Sager et al., 1997; Zhang et al., 1998). Als möglicher Grund für die veränderte Genexpression wird der Einfluss von TSG und Onkogenen angenommen, die die Transkription dieser Gene über Signalübertragungswege regulieren. Die quantitative Analyse der Genexpression in Tumoren sollte es ermöglichen, neben den Genen mit genomischen Veränderungen auch die Gene zu identifizieren, die sekundär über Veränderungen ihrer Transkriptionsregulation in die Tumorentstehung und -progression involviert sind.

Aufgrund der vermuteten großen Zahl von Genen, deren Proteine in den für
die Tumorentstehung wichtigen Signalwegen wie Zellteilung, DNA-Reparatur, Angiogenese, Seneszenz und Apoptose mitwirken, wurden Methoden entwickelt, um in einem Vorscreening die Expression möglichst vieler Gene zu untersuchen. Zahlreiche Studien basieren auf bereits etablierte Methoden wie Differential Display, subtraktive Hybridisierung oder SAGE. Eine aktuelle Methode stellt die Hybridisierung chipbasierter Mikroarrays dar, mit deren Hilfe in den Tumoren ein Expressionsprofil über mehrere tausend Gene generiert werden kann (Gruvberger et al., 2001; West et al., 2001).


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Ein Nachteil dieser Methoden ist der Bedarf an großen Mengen RNA aus den zu untersuchenden Geweben bzw. die Notwendigkeit von Amplifikationssystemen zur Vermehrung der RNA-Moleküle.

Als Grundlage der vorliegenden Arbeit wurde ein bioinformatischer Ansatz als Methode der vergleichenden Expressionsanalyse zwischen dem Tumor und dem korrespondierenden Normalgewebe gewählt. Im Gegensatz zu den oben genannten, labortechnischen Methoden erfolgte die Suche nach neuen tumorassoziierten Genen durch die systematische Auswertung von cDNA-Bibliotheken. Die Gesamtheit der in diesen cDNA-Bibliotheken enthaltenen ESTs repräsentiert das Expressionsmuster des jeweiligen Gewebes, aus denen sie generiert wurden. Mittels der bioinformatischen Programme AUTEX und dem elektronischen Northern wurden die ESTs als exprimierte Teilsequenzen der Gene aus den cDNA-Bibliotheken assembliert und nach der in-silico Expressionsanalyse aufgrund ihrer differenziellen Expression in den Tumoren selektiert (Schmitt et al., 1999). Der Nutzen von EST-Datenbanken zur Identifizierung tumorassoziierter Gene wurde in einer vergleichbaren Studie beschrieben. Dabei wurde ein Expressionsprofil durch den zum elektronischen Northern äquivalenten digitalen Differential Display für verschiedene solide Tumore erstellt (Scheurle et al., 2000).

Wichtige Grundlage für den elektronischen Northern war die korrekte Assemblierung der ESTs zu den entsprechenden Genen. Die erfolgreiche Generierung der Volllängentranskripte aus den ESTs über das Programm AUTEX konnte für zehn der
14 bearbeiteten Genen aus 1q und 11q durch den anschließenden Datenbankvergleich bzw. durch Nachsequenzierung und Northernblot-Analysen mittels genspezifischer cDNA-Klonen bestätigt werden. Im Falle sehr großer Transkripte wie bei den Genen FZD4 oder dem putativen Calpain wurde nur ein Teilabschnitt am 3‘-Ende der gesamten transkribierten Sequenz durch spezifische ESTs abgedeckt. Das Fehlen der 5‘-Enden von langen Transkripten erklärt sich aus dem Prinzip der Generierung der cDNA-Bibliotheken, das heißt der durchgeführten cDNA-Synthese mittels Oligo(d)T-Primer und anschließender Klonierung und Sequenzierung der cDNA-Fragmente (Krizman et al., 1996). Im Vergleich zur Transkriptgröße des Northernblots ergaben sich nach der Assemblierung der ESTs auch für die Gene DAP4 und CGI-85 kürzere cDNA-Sequenzen, die sich durch den entsprechenden Datenbankeintrag verifizieren ließen. Die Transkriptgröße des Gens DAP4 im Northernblot bestätigte sich in der Beschreibung des zu DAP4 synonymen Gens P52rIPK (Gale et al., 1998), während für das Gen CGI-85 keine vergleichbaren Studien vorlagen. Weitere Arbeiten zeigen durch


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ähnliche bioinformatische Ansätze den Erfolg der in-silico Klonierung von Volllängentranskripten durch ESTs (Prigent et al., 1999; Huminiecki et al., 2000; Wittenberger et al., 2001).

Für die Expressionsanalyse der Gene in 23 unterschiedlichen Normalgeweben und korrespondierenden Tumoren durch den elektronischen Northern standen 4 Mio. ESTs aus den öffentlichen und privaten cDNA-Bibliotheken zur Verfügung. Ein Vergleich der Genexpression in den Normalgeweben zwischen den cDNA-Bibliotheken des in-silico Ansatzes und der Northernblot-Analyse ergab signifikante Korrelationen bei den untersuchten Genen. Am Beispiel des Gens YAP65 bestätigt sich die ubiquitäre Expression sowohl im elektronischen Northern als auch im Northernblot im Vergleich zur Literatur (Sudol et al., 1995). Dabei können Differenzen zwischen den beiden Methoden auf die geringe Anzahl der ESTs in den cDNA-Bibliotheken betreffender Gewebe zurückzuführen sein. Während der Northernblot die Expression eines Gens in einer relativ großen, konstanten Menge von RNA-Molekülen der untersuchten Gewebe wiedergibt, ist die Auflösung der Expressionsunterschiede im elektronischen Northern von der EST-Anzahl eines Gens in Bezug zur Bibliotheksgröße der Gewebe abhängig. Dies erklärt die deutlichere Übereinstimmung der Expressionsmuster bei spezifischen, stark exprimierten Genen wie dem putativen Calpain gegenüber den ubiquitär oder sehr schwach exprimierten Genen wie PPP2R5A.

Die Auswahl der differenziell exprimierten Gene beruhte in dieser Arbeit auf dem Vergleich zwischen den cDNA-Bibliotheken der Brust- bzw. Ovargewebe und den daraus entstehenden Tumoren. Um maximale Bibliotheksgrößen zwischen 30.000 und 120.000 ESTs zu erhalten, wurden die ESTs aus den einzelnen cDNA-Bibliotheken der jeweiligen Gewebe gepoolt. Bei der Interpretation der Ergebnisse muss daher berücksichtigt werden, dass der elektronische Northern eines Gens nicht nur von dem unterschiedlichen Expressionsprofil zwischen verschiedenen Tumorpatienten beeinflusst wird sondern auch von möglichen Expressionsunterschieden in den verschiedenen Tumorsubtypen wie beispielweise dem lobulären und duktalen Karzinom der Brust (Ahr et al., 2001). Diese Aspekte der in-silico Expressionsanalyse von Kandidatengenen spiegeln sich bei der Validierung durch den cDNA-Array wieder. Im Unterschied zu den gepoolten cDNA-Bibliotheken von Geweben mehrerer Probanden als Grundlage des elektronischen Northern beziehen sich die visualisierten Expressionssignale des cDNA-Arrays auf das Gewebe von jeweils einem Probanden. Von den insgesamt 14 untersuchten Genen aus 1q und 11q wurde die differenzielle


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Expression in Brusttumoren bei den Genen ELBT, FZD4 und dem putativen Calpain in mehr als 75% der untersuchten Tumorprobenpaare des cDNA-Arrays bestätigt. Für die Gene YAP65, DAP4 und PPP2R5A bestätigte sich die veränderte Expression in 30-50% der Tumorproben. Die Deregulation der Genexpression in vergleichbaren Anteilen der Brusttumore wurde schon für beschriebene tumorassoziierte Gene wie ERBB2 gezeigt (Perou et al., 2000). Sechs der 14 Gene ließen sich über den cDNA-Array nicht bestätigen, für die zwei Gene SIP und CGI-85 war aufgrund fehlender Expressionssignale keine Auswertung möglich. Die Repräsentativität der neun Brusttumor-Probenpaare zeigt sich durch nachfolgende Expressionsexperimente mit größerem Probenumfang am Beispiel der Gene ELBT und PPP2R5A. Die drei Ovartumor-Probenpaaren des cDNA-Arrays können nur begrenzt als Bestätigung des elektronischen Northern genutzt werden und machen umfassendere Expressionsstudien bei dieser Tumorentität notwendig.

Resümierend konnte bei der Hälfte der auswertbaren Gene die im elektronischen Northern vorhergesagte differenzielle Expression für eine signifikante Fraktion der untersuchten Tumore im cDNA-Array bestätigt werden. Dieser bioinformatische Ansatz zur Identifizierung differenziell exprimierter Gene hat sich damit als nützliches Vorscreening erwiesen, der durch die größer werdende Zahl von cDNA-Bibliotheken weiter an Effektivität gewinnen könnte. Ein weiteres Ziel sollte es sein, die EST-Datenbanken in die verschiedenen Subtypen der Tumore zu unterteilen, um Fragestellungen der Tumorentität und der Tumorprogression mit den differenziell exprimierten Genen zu korrelieren. Die Ergebnisse unterstreichen aber auch die Wichtigkeit der Validierung dieser in-silico Expressionsanalyse, um die Kandidatengene zu selektieren, deren veränderte Genexpression verifizierbar sind und weitere aufwendigere Methoden rechtfertigen.

4.2 Bewertung der Kandidatengene in 11q12-q23 unter Einbeziehung der positionalen in-silico Expressionsanalyse

Die zahlreich beschriebenen Aberrationen im langen Arm von Chromosom 11 für Brust- und Ovarialtumore weisen auf die Lokalisation von tumorassoziierten Genen hin. Korrelationen zwischen Veränderungen der Gene auf DNA-Ebene und der Genexpression haben sich bereits für die chromosomale Region 11q bestätigt. In der amplifizierten Region 11q13 wurden mit Cyclin D1 und EMS1 Gene beschrieben, die in einer Fraktion von Brusttumoren überexprimiert sind und ein tumorförderndes Potenzial


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besitzen (Karleder et al., 1994; Schuuring, 1995). In weiteren aberranten Genloci wie den LOH-Regionen in 11q14.1-q23.3 werden noch unbekannte tumorassoziierte Gene vermutet (Negrini et al., 1995; Laake et al., 1997). Nach der genomweiten in-silico Expressionsanalyse wurden neun Kandidatengene in die Region 11q12-q23 kartiert. Diese Gene waren nach dem elektronischen Northern in Brusttumoren geringer exprimiert (ELBT, FZD4, MS4A6A, YAP65 und DAP4) oder in Brust- und Ovarialtumoren überexprimiert (CGI-85, CLNS1A, FAU und SIP). Sie stellen damit potenzielle Kandidatengene für die aberranten Regionen in 11q dar und könnten in die Tumorentstehung und -progression involviert sein. Nach der Validierung des elektronischen Northern bestätigte sich für die Gene ELBT, FZD4, YAP65 und DAP4 die Herunterregulation der Expression in einer Fraktion der untersuchten Brusttumore, während die übrigen Gene keine signifikante Expressionsunterschiede in den Tumoren zeigten.

Die große Zahl beschriebener LOH-Marker und amplifizierter Gene in 11q bei Brusttumoren sowie die fortschreitende Annotation der humanen genomischen Sequenz ermöglichten es, eine weitere positionsspezifische in-silico Expressionsanalyse für möglichst viele Transkripte in diesem chromosomalen Abschnitt durchzuführen. Eine Studie mit einer ähnlich systematischen Suche nach differenziell exprimierten Genen beschreibt neue Kandidatengene in der aberranten Region 17q23 (Monni et al., 2001). Neben den oben genannten, bereits validierten Genen aus 11q12-q23 konnten über den Ansatz weitere 23 Kandidatengene für Brusttumore in dieser chromosomalen Region identifiziert werden.

In den folgenden Abschnitten werden die experimentellen Expressionsdaten der neun Kandidatengene im Vergleich zu beschriebenen Funktionen diskutiert. Die Gegenüberstellung dieser Gene mit den aberranten Loci in 11q12-q23 des positionsspezifischen Ansatzes gab Aufschluss über die Korrelation der veränderten Genexpression mit genomischen Veränderungen.

Das Gen FZD4 (‘‘Frizzled-4‘‘) kodiert für einen 7-Transmembran-Rezeptor und gehört der FZD-Genfamilie an (Kirikoshi et al., 1999). Diese Rezeptoren binden die Glykoproteine WNT innerhalb des ‘‘Wingless-Signaltransduktionsweges‘‘, der die Aktivität von ß-Catenin und dadurch die Transkription von wachstumsfördernden Genen reguliert. Eine positive Regulation dieses Signaltransduktionsweges wurde neben anderen Mitgliedern dieser Rezeptoren für eine Spleißvariante von FZD4 beschrieben (Sagara et al., 2001). Im Falle einer ähnlichen Funktion von FZD4 würde nach


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bisherigen Erkenntnissen ein vermehrt auftretender Rezeptor eine Proliferationsstimulation verursachen und für eine tumorfördernde Wirkung sprechen. Im Gegensatz dazu zeigt sich in der Erstbeschreibung des Gens die mögliche Funktion von FZD4 als Tumorsuppressorgen. Es konnten für eine mutierte Form von FZD4, jedoch nicht für das Wildtypgen FZD4, stabile Transformanten etabliert werden, die das Gen in Tumorzellen überexprimieren (Kirikoshi et al., 1999). Eine mögliche Erklärung wäre die Hemmung des Wachstums der Tumorzellen durch die Überexpession von Wildtyp-FZD4 und würde für die in der vorliegenden Arbeit beobachteten verringerten Expression von FZD4 in Tumoren sprechen. Eine weitere Assoziation von FZD4 als mögliches Tumorsuppressorgen in Brusttumoren ergab sich nach der physikalischen Kartierung. In der Nähe des Genlocus von FZD4 ist eine LOH-Region lokalisiert, deren Marker D11S4175, D11S1342, D11S873 und D11S29 in etwa 38% der untersuchten Brusttumore deletiert sind (Negrini et al., 1995; Schmutzler et al., 1996; Koreth et al., 1997; Shen et al.,2000). Die Ergebnisse der genomischen und transkriptionellen Analysen sprechen für eine tumorsupprimierende Eigenschaft des Gens FZD4, die durch eine funktionelle Charakterisierung des translatierten Rezeptors im Brustepithel bewiesen werden muss.

Das Gen YAP65 (’‘Yes-associated protein‘‘) kodiert für ein 65kDa Protein mit einer prolinreichen Bindungsdomäne und einer konservierten WW-Domäne (Sudol et al., 1994; Chen et al., 1995). Bislang beschriebene Experimente weisen darauf hin, dass YAP65 als Transkriptions-Coaktivator wirkt, der über die prolinreiche Region an die SH3-Domäne von Tyrosin-Kinasen wie den Protoonkogen-Produkten c-Yes, c-Src oder Crk bindet und deren Signal vom Cytoplasma in den Zellkern auf Transkriptionsfaktoren überträgt (Sudol et al., 1995; Yagi et al., 1999). Die WW-Domäne der Proteinsequenz von YAP65 ist für die Bindung an Transkriptionsfaktoren wie PEBP2alphaA verantwortlich. Zielgene, deren Transkription durch YAP65 beeinflusst sein könnten, sind noch unbekannt. Eine Assoziation zur Tumorenstehung ergibt sich aufgrund der beobachteten Überexpression von Tyrosin-Kinasen in Brusttumoren und des möglichen Therapieansatzes durch Inhibitoren (Moasser et al., 1999). Dabei ist unklar, ob Expressionsveränderungen des Gens YAP65 die Vermittlung des tumorfördernden Signals beeinflussen. Als weitere interessante Beobachtung ist die Interaktion von YAP65 mit dem p53-Bindungsprotein 2 (53BP2) beschrieben worden (Linn et al., 1997; Espanel et al., 2001). Das Protein 53BP2 verstärkt die Aktivität des bekannten Tumorsuppressors p53, hemmt den Zellzyklus und aktiviert die Apoptose (Naumovski et


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al., 1996; Lopez et al., 2000). Die in der vorliegenden Arbeit beobachtete Herunterregulation der Genexpression von YAP65 in Brusttumoren weist auf die mögliche Funktion eines Tumorsuppressorgens hin. Dieser Einfluss von YAP65 könnte sich im Falle eines negativen Einfluss auf die Signalübertragung der Src-Protoonkogen-Produkte oder im Zusammenhang mit der Interaktion zu 53BP2 durch eine positive Regulation auf die wachstumshemmende Funktion des Proteins ausprägen. Ein weiterer Hinweis auf YAP65 als Tumorsuppressorgen-Kandidat zeigt sich in dieser Arbeit durch den Vergleich mit LOH-Studien in Brusttumoren. Für die im Abstand von ca. 1Mb zum Gen YAP65 gelegenen Marker D11S35 und D11S940 sind in etwa 39% der untersuchten Brusttumore Deletionen beschrieben worden (Gudmundsson et al., 1995; Negrini et al., 1995). YAP65 stellt aufgrund der verringerten Expression und der beschriebenen funktionellen Aspekte ein mögliches Kandidatengen für diese LOH-Region in 11q22.1 dar.

Als weiteres in dieser Arbeit identifiziertes Gen zeigte DAP4 (‘‘Death associated protein‘‘) eine verringerte Expression in Brusttumoren. Das Gen wurde unter der synonymen Bezeichnung P52rIPK beschrieben und kodiert für ein Inhibitorprotein des PKR-Repressors P58IPK (Gale et al., 1998). Die interferon-induzierte Serin/Threonin-Proteinkinase (PKR) wird durch virale Invasion, Cytokine, Wachstumsfaktoren sowie weitere Stressfaktoren aktiviert und hemmt durch die Phosphorylierung des Initiationsfaktors eIF2 die Proteintranslation in der Zelle (Williams, 1999). Aufgrund der Hemmung der Proliferation und Aktivierung der Apoptose wurde PKR als mögliches Tumorsuppressorgen beschrieben. (Jagus et al.,1999; Savinova et al.,1999). Dem Repressor P58IPK wird aufgrund der Hemmung der Proteinkinase PKR ein tumorförderndes Potential zugeschrieben (Lee et al., 1994; Barber et al., 1994). Das Protein P52rIPK wirkt durch die Hemmung des P58-Repressors als positiver Regulator von PKR in dieser Signalkaskade und könnte daher wie PKR als potenzielles Tumorsuppressorgen fungieren (Gale et al., 1998). Diese Hypothese würde die in dieser Arbeit beobachtete verringerte Expression von P52rIPK (DAP4) in Brusttumoren erklären.

Die Gene CLNS1A, FAU und SIP stellen nach dem elektronischen Northern aufgrund der Überexpression tumorassoziierte Gene für Brust- und Ovarialtumore dar, wobei sich die differenzielle Expression in den Validierungsexperimenten nicht bestätigt hat. Das Gen CLNS1A und eine intronlose Kopie CLNS1B kodieren für den Chloridkanal ICln, der durch den Chloridtransport das Zellvolumen reguliert (Nagl et al., 1996; Schwartz et


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al., 1997). Das Gen CLNS1A wurde aufgrund der nahen chromosomalen Lokalisation zu GARP als ein mögliches Kandidatengen in der amplifizierten Region 11q13-q14 für Brusttumore beschrieben (Karlseder et al., 1994; Bekri et al., 1997). Die bislang bekannte Funktion des Chloridkanals ICln ergab keine Assoziation zur Tumorentstehung. Das Gen FAU stellt ein zelluläres Homolog zur viralen Sequenz FOX dar, das für ein Fusionsprotein bestehend aus dem ribosomalen Protein S30 und einem Ubiquitin-ähnlichen Protein kodiert (Kas et al., 1992; 1993). Das Gen FAU zeigt wie das Gen SIP (’’SYT interacting protein’’) bis auf die chromosomale Lokalisation in der amplifizierten Region 11q13 keinen Hinweis auf ein tumorförderendes Potenzial. Auch für die beiden in-silico Kandidatengene MS4A6A und CGI-85 ergaben sich aus den bisherigen Beschreibungen keine Assoziationen zur Tumorentstehung (Liang et al., 2001; Lai et al., 2000). Damit konnten die zuletzt aufgeführten in-silico Kandidatengene weder experimentell noch durch Literaturdaten bestätigt werden.

Neben den neun kartierten Genen aus der genomweiten Expressionsanalyse konnten durch die systematische Suche nach differenziell exprimierten Genen in 11q12-q23 weitere Kandidatengene für die Entstehung von Brusttumoren identifiziert werden. Der Vergleich mit den LOH- und Amplifikationsstudien ergibt eine Reihe von in-silico differenziell exprimierten Genen, die benachbart zu beschriebenen aberranten Regionen in 11q kartieren. Die Abfolge der Gene und Marker zeigen vermehrt überexprimierte Gene im proximalen Teil 11q12-q13. Ein Gencluster in 11q13.3-q13.4 grenzt an die häufig beschriebene amplifizierte Region mit Cyclin D1 und könnte potenzielle Onkogene für dieses Amplikon beinhalten. Für die dort lokalisierte Proteinkinase MLK3 wurde bereits im Falle der Überexpression in Fibroblasten eine transformierende Aktivität beschrieben (Hartkamp et al., 1999). Die weiter zentromer gelegene, signifikante Anhäufung überexprimierter Genen in 11q13.1 könnte auf eine größere Ausdehnung der schon beschriebenen amplifizierten Region 11q13 in Brusttumoren hinweisen. Unabhängige Amplifikationen von tumorassoziierten Genen innerhalb einer distinkten Region wurden bereits für EMS1 im 11q13 Amplikon beschrieben (Hui et al., 1997). Für die meisten der zentromer identifizierten Kandidatengene wurde die in-silico differenzielle Expression bislang nicht validiert bzw. ergaben sich keine entsprechenden Hinweise in der Literatur. Die Überexpression des im genomischen Ansatz untersuchten Gens FAU ließ sich durch den cDNA-Array nicht verifizieren. Im Gegensatz dazu bestätigte sich die beobachtete Überexpression von


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MGB1 (Mammaglobin 1) in der Literatur (Watson et al., 1996). Die beiden Beispiele zeigen die Notwendigkeit der Validierung dieser neuen tumorassoziierten Gene.

Im Gegensatz zu den Amplikons in 11q13 wurden innerhalb der Region 11q14-q23 vermehrt Deletionen in Brusttumoren beschrieben (Gudmundsson et al., 1995;
Negrini et al., 1995; Laake et al., 1997). Die bereits beschriebenen Gene FZD4 und YAP65 kartieren in zwei distinkte LOH-Regionen in 11q14 bzw. 11q22. Sie stellen zusammen mit den beiden noch nicht verifizierten Genen CLTH (‘‘Clathrin assembly protein‘‘; CALM) und MMP7 (‘‘Matrix Metalloproteinase 7‘‘) potenzielle Kandidatengene für diese LOH-Regionen dar. Für das Protein MMP7 wurde mit der Hemmung der Vaskularisierung in Tumoren bereits eine Funktion beschrieben, die das Tumorwachstum beeinflusst (Pozzi et al., 2000).

Die über diesen positionalen Ansatz identifizierten Kandidatengene in 11q12-q23 bilden eine gute Grundlage, potenzielle Tumorsuppressorgene und Onkogene durch weitere Expressionsexperimente und funktionelle Analysen zu verifizieren. Darüber hinaus läßt sich der beschriebene Vergleich von differenziell exprimierten Genen mit aberranten DNA-Regionen auf weitere interessante chromosomale Regionen anwenden. Mit Hilfe des elektronischen Northern kann diese Vorselektion tumorassoziierter Gene neben Brust- und Ovarialtumoren auch auf andere Tumorentitäten fokussiert werden. Die Methode der in-silico Expressionsanalyse stellt nur eine Möglichkeit dar, Kandidatengene für die LOH- und Amplifikationsregionen zu selektieren. Für einige aberrante Loci, wie beispielsweise in der distalen LOH-Region 11q22-q23 ergaben sich in dieser Arbeit über den bioinformatischen Ansatz keine Kandidatengene. Ein Vergleich der chromosomalen Lokalisation von aberranten Loci mit putativen Genen aus der annotierten genomischen Datenbank könnte zusätzlich als Grundlage zur Identifizierung tumorassoziierter Gene dienen.

4.3 ELBT als potenzielles Tumorsuppressorgen im Brustepithel

Das Gen ELBT zeigte nach dem elektronischen Northern eine signifikant geringere Expression in Brusttumoren gegenüber den Normalgeweben. Diese Herunterregulation auf RNA-Ebene bestätigte sich sowohl in den cDNA-Array-Experimenten als auch in der quantitativen Expressionsanalyse mikrodissezierter Gewebe in über 50% der Tumorproben. Bis zum Abschluss des praktischen Teils dieser Arbeit ergab der Datenbankvergleich keine Homologien zu schon funktionell beschriebenen humanen Genen. Die durchgeführte Annotation der Proteinsequenz von ELBT weist darauf hin,


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dass es sich um eine putative Acyltransferase handelt. Durch den Vergleich mit Proteinen aus anderen Spezies konnte eine konservierte Proteinfamilie mit
18 Mitgliedern zusammengestellt werden. Die Proteinfamilie zeichnet sich durch eine Transmembrandomäne aus und zeigt Ähnlichkeiten zu Mitgliedern der 1-Acyl-SN-Glycerol-3-Phosphat Acyltransferase (1-AGPAT). Diese Enzyme katalysieren die Umwandlung von Lysophosphatidsäure (LPA) in Phosphatidsäure (PA). Es handelt sich dabei um zwei Phospholipide, die in die Lipidsynthese und in Signaltransduktionsprozesse involviert sind (Kume et al., 1997; Leung et al., 2001). Für die Isoform AGPAT2 wird aufgrund von Expressionsstudien ein Einfluss in die Karzinogenese des weiblichen Genitaltraktes vermutet. Eine Korrelation zur Tumorentstehung wurde auch für weitere Mitglieder der membranständigen O-Acyltransferasen beschrieben. Für die beiden Enzyme Acyl CoA:Glycerol Acyltransferase (ACAT) und Acyl CoA:Diacylglycerol Acyltransferase (DGAT) zeigen sich aufgrund von Sequenzhomologien zu charakterisierten Proteinen aus anderen Spezies mögliche Assoziationen zum schon genannten WNT-Signaltransduktionsweg (Hofmann, 2000). Das homologe Protein Porc ist essentiell für die Prozessierung und Sekretion des Gykloproteins WNT, das beim Menschen die Transkription von tumorfördernden Zielgenen wie Cyclin D1, c-Myc oder c-Jun über eine Signalkaskade aktiviert (Kadowaki et al., 1996; Dierick et al., 1999).

Nach den Expressionsanalysen in dieser Arbeit ergibt sich für ELBT die mögliche Funktion eines Tumorsuppressors in den Epithelien der Brust. In diesem Zusammenhang könnte die Funktion von zwei weiteren Enzymen dieser Gruppe, der Lecithin-Retinol-Aycltransferase (LRAT) und der Acyl CoA:Retinol Acyltransferase (ARAT) Aufschluss über eine Involvierung in die Karzinogenese geben. Diese Enzyme katalysieren die Umwandlung von Retinol in Retinylester, die bereits als chemopräventive und chemotherapeutische Agenzien bei Brusttumorpatienten eingesetzt werden (Guo et al., 2000: Yang et al., 1999). Retinol-Metabolite regulieren Wachstums- und Differenzierungsvorgänge in normalen und malignen Epithelzellen (Gudas et al., 1994). Für das Gen LRAT wurde eine reduzierte Expression in transformierten epithelialen Zellen der Brust beschrieben. Ein Hinweis für eine funktionelle Homologie mit den genannten Enzymen LRAT und ARAT beziehungsweise der Umsetzung von Retinol ergibt sich aus dem Expressionsmuster des Gens ELBT in der Haut. ELBT zeigt eine sehr spezifische Expression in den oberen Hautschichten Statum granulosum und Stratum lucidum an der Grenze zur Stratum corneum. Diese Hautschichten zeichnen sich neben einer geringer werdenden Proliferationsaktivität und


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steigender Differenzierung der Keratinozyten auch durch die größte Konzentration an Retinylester wie Vitamin A aus (Torma, 1990). Vergleichbar zum Enzym ARAT könnte eine erhöhte Aktivität von ELBT in den oberen Hautschichten die steigenden Konzentrationen von Retinylestern mit verursachen. Aufgrund der spezifischen Expression von ELBT wäre ein Einfluss dieser Acyltransferase zusammen mit den bereits beschriebenen Enzymen LRAT und ARAT in den Retinol-Metabolismus möglich. Im malignen Brustepithel könnte die analysierte, verringerte Expression von ELBT zu einer mangelnden Umsetzung von Retinol beitragen und dadurch die Transformation der Epithelzellen begünstigen.

Zwei aktuelle Referenzen beschreiben eine neue Acyl CoA:Diacylglycerol Acyltransferase (DGAT2), die identisch mit dem in dieser Arbeit benannten ELBT-Protein ist (Lardizabal et al., 2001; Cases et al., 2001). Das aufgeführte Expressionsmuster von DGAT2 in Leber, Brust, Hoden und den peripheren Blutleukozyten bestätigt die Identität mit dem Gen ELBT, wobei die beschriebene kleinere Spleißvariante mit 1,4kb in der vorliegenden Arbeit nicht identifiziert wurde. Dies ist auf eine unterschiedliche Sondenauswahl für den Northernblot zurückzuführen. Das Protein DGAT2 zeigt keine signifikante Homologie zum bereits beschriebenen humanen DGAT. Es wurden jedoch Ähnlichkeiten zu weiteren Proteinen anderer Spezies festgestellt, die auch in dieser Arbeit identifiziert wurden. Die Klassifizierung als DGAT2 begründet sich in der Literatur auf die Homologie zu DGAT aus dem Pilz Mortierella Ramanniana (Lardizabal et al., 2001). Die Verwandtschaft zu DGAT ist funktionell durch die Expression von DGAT2 in Insektenzellen bestätigt worden, die eine Stimulierung der Triglycerin-Synthese in Abhängigkeit vom Vorhandensein der Fettsäure Acyl CoA und Diacylglycerin ergaben (Cases et al., 2001). Aufgrund der beschriebenen Funktion in der Lipidsynthese wird DGAT2 neben DGAT als ein neues Kandidatengen für Adiposis diskutiert. Diese neuen Literaturdaten deuten darauf hin, dass die großen Expressionsunterschiede des Gens DGAT2 in Brusttumoren gegenüber dem Normalgewebe im cDNA-Array auf unterschiedliche Bestandteile an Fettgewebe zurückzuführen sein könnten. Dagegen spricht die Bestätigung der differenziellen Expression in den cDNA-Arrays durch die quantitative PCR-Analyse der mikrodissezierten Gewebeproben, in denen überwiegend epitheliales Gewebe selektiert wurde. Die Expression von DGAT2 in benignen Brustepithelzellen bestätigt sich zudem in den Experimenten der RNA in-situ Hybridisierung.


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Die bisherigen funktionellen Beschreibungen von DGAT2 schließen die dikutierten Assoziationen zu anderen Acyltransferasen nicht aus. Hinweise, dass es sich bei diesen Proteinen um multifunktionelle Enzyme handeln könnte, zeigten sich bereits für zahlreiche membranständige Acyltransferasen und wurde auch bei DGAT vermutet (Hofmann, 2000). Die Mutationsanalyse der acht Exons dieses Gens erbrachte keinen Hinweis auf Mutationen in der genomischen Sequenz der untersuchten Brusttumore, die auf eine Veränderung oder den Ausfall des Proteins hindeuten könnten. Weitere, zu überprüfende Möglichkeiten der Inaktivierung der Transkription wären Mutationen im Promotorbereich oder Hypermethylierung der DNA-Sequenz, die mittlerweile als häufigere Mechanismen des Verlustes von Tumorsuppressorgen-Funktionen angenommen werden (Ponder et al., 2001). Der Nachweis der Proteinexpression von DGAT2 im Epithelgewebe der Brust und eine weitere funktionelle Analyse des Enzyms sind nötig, um Aufschluss über eine mögliche Involvierung in die Karzinogenese zu erhalten.

4.4 Bewertung der Kandidatengene in 1q32-q41

Die chromosomale Region 1q32-q41 wurde in zahlreichen CGH-Studien mit Brust- und Ovarialkarzinomen als amplifiziert beschrieben (Tirkkonen et al., 1998, Sonoda et al., 1997). Diese DNA-Veränderungen lassen auf eine Überexpression möglicher tumorfördernder Gene in 1q schließen, die einen Einfluss auf die Tumorentstehung haben könnten. Mit MDM4 und ELF3 sind bereits zwei Kandidatengene aus 1q32 bekannt, die als überexprimiert in verschiedenen Tumoren beschrieben wurden (Tymms et al., 1997; Riemenschneider et al., 1999). Nach dem Ergebnis der in-silico Expressionsanalyse in der vorliegenden Arbeit zeigen die in 1q kartierten Gene ELF3, PPP2R5A, HSPC186 und das putative Calpain eine Überexpression in Brust- oder Ovarialtumoren. Damit korreliert das Expressionsverhalten der identifizierten Gene mit den beschriebenen Aberrationen auf DNA-Ebene, die auf die Lokalisation von potenziellen Onkogenen in dieser Region hindeuten. Nach der Validierung des elektronischen Northern bestätigte sich die differenzielle Expression in Brusttumoren für das putative Calpain und in einer kleineren Fraktion der Tumore bei dem Gen PPP2R5A. Die Diskussion der fünf Kandidatengene mit den in der Literatur beschriebenen Funktionen gibt im folgenden weiteren Aufschluss über eine mögliche Tumorassoziation.


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Das Gen für den ‘‘Decay-accelerating Factor‘‘ DAF (CD55) zeigte sich in der Mehrzahl der Ovarialtumorproben des cDNA-Arrays überexprimiert, wobei eine statistische Aussage die Untersuchung weiterer Tumore erfordert. Eine Überexpression von DAF wurde bereits in Tumorgewebe der Brust und des Dickdarms nachgewiesen (Thorsteinsson et al., 1998). Die beschriebene Funktion von DAF stützt die These eines tumorassoziierten Gens. Das membrangebundene Glykoprotein DAF inhibiert das Komplementsystem und könnte im Falle einer Überexpression die Tumorzellen vor einem Angriff durch das Immunsystem schützen. Für das Gen HSPC186 liegen keine Literaturdaten vor, beziehungsweise konnte keine Funktion des Proteins abgeleitet werden. Die Expressionsstudien zum Gen HSPC in Brusttumoren sprechen gegen eine Involvierung in die Karzinogenese.

Das Gen ELF3 kodiert für einen Transkriptionsfaktor der ETS-Familie und reguliert die Expression von Genen wie Keratin 4, der als Differenzierungsmarker bekannt ist (Oettgen et al., 1999; Brembeck et al., 2000). Als Kandidatengen für das Amplikon 1q32 ist ELF3 bereits in Lungen- und Adenokarzinomen als überexprimiert beschrieben worden (Tymms et al., 1997). Die in-silico Expressionsanalyse ergab eine Überexpression in Brusttumoren, die jedoch in weiteren Experimenten nicht bestätigt werden konnte. Eine Involvierung des epithelial exprimierten Gens ELF3 in die Entstehung von epithelialen Tumoren ist aufgrund der beschriebenen Funktionen möglich, wobei die Expressionsstudie in dieser Arbeit keinen Hinweis auf den Einfluss in die Karzinogenese der Brust gibt.

Die assemblierte Sequenz des putativen Calpains zeigt Ähnlichkeiten zu einem gewebespezifischen Calpain der Ratte. Calpaine sind Ca2+- abhängige Cysteinproteasen, die Moleküle wie Proteinkinasen, Transkriptionsfaktoren und Cytoskelettproteine modifizieren (Sorimachi et al., 1997). Neben ubiquitär exprimierten Mitgliedern der µ- und m-Calpainen werden die gewebespezifischen Calpaine nCL-1, nCL-2 und nCL-4, die im Muskel, Magen beziehungsweise im Verdauungstrakt vorkommen, zu einer Familie zusammengefaßt. Die spezifische Genexpression des in dieser Arbeit identifizierten putativen Calpains im Dickdarm spricht dafür, dass es sich um ein weiteres Mitglied der gewebespezifschen Calpaine handelt. Die benachbarte Lokalisation des Calpains nCL-4 in 1q42 könnte auf ein Gencluster von Calpainen in dieser chromosomalen Region hindeuten (Lee et al., 1998). Im Vergleich zu den anderen gewebespezifischen Calpainen zeichnet sich das putative Calpain durch ein sehr großes Transkript von über 7kb aus. Um weitere Aussagen über


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Sequenzhomologien treffen zu können, muß zunächst die identifizierte Teilsequenz des Gens vervollständigt werden. Unter der Annahme, dass die Expression des Gens normalerweise auf den Verdauungstrakt beschränkt ist, könnte die Überexpression in Brusttumoren auf eine Aktivierung der Transkription während der Tumorentstehung zurückzuführen sein. Für das Calpain nCL-4 wurde bereits eine Involvierung in die Entstehung des Magenkarzinoms vermutet (Yoshikawa et al., 2000). Eine mögliche tumorfördernde Wirkung von Calpainen zeigt die proteolytische Aktivität hinsichtlich Caspasen. Durch die Inaktivierung der Caspasen könnten Calpaine als negative Regulatoren der Apoptose agieren und damit die Tumorproliferation begünstigen (Chua et al., 2000). Das putative Calpain ist aufgrund der Expressionsexperimente und den beschriebenen Funktionen möglicherweise in die Entstehung und Progression von Brusttumoren involviert, wobei die Entschlüsselung des Gens und des kodierenden Proteins als Grundlage für weitere Untersuchungen notwendig ist.

Das Gen PPP2R5A, kodierend für die regulatorische Untereinheit B56 alpha der Protein-Phosphatase 2A (PP2A) wurde aufgrund der Überexpression in Brusttumoren identifiziert. Diese Serin/Threonin-Phosphatase besteht aus einer katalytischen, einer strukturellen und einer variablen regulatorischen Untereinheit von denen das Mitglied B56 alpha in 1q41 kodiert ist (McCright et al., 1996). Die katalytische Aktivität dieser Enzyme umfaßt posttranslationelle Modifikationen wie Phosphorylierung und Methylierung, die in wichtigen regulatorischen Prozessen wie Zellteilung, Zellmorphologie, Differenzierung, Apoptose und Transformation eine Rolle spielen (Janssens et al, 2001). Es wurde gezeigt, dass PP2A über die regulatorische Untereinheit B56 den WNT-Signaltransduktionsweg inhibiert und dadurch einen potenziellen Tumorsuppressor darstellt (Li et al., 2001; Seeling et al., 1999). In Bezug auf die Karzinogenese der Brust hemmt PP2A aufgrund der Inhibition der Telomeraseaktivität ein unkontrolliertes Zellwachstum (Li et al., 1997). In Brustkarzinomen wie auch anderen Tumoren wurden sowohl in der katalytischen als auch in regulatorischen Untereinheiten Mutationen beschrieben, die wiederum für die Funktion eines Tumorsuppressorgens sprechen (Ruediger et al., 2001; Calin et al., 2000; Wang et al., 1998). Die beschriebenen Funktionen zur Protein-Phosphatase PP2A und zu den regulatorischen Untereinheiten sprechen gegen die Ausgangshypothese einer möglichen tumorfördernden Wirkung des Gens PPP2R5A. Für die translatierte regulatorische Untereinheit B56 alpha wurde jedoch bislang keine direkte Tumorassoziation gezeigt. Die heterogene Genexpression von PPP2R5A des cDNA-


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Arrays und nach der quantitativen PCR von mikrodissezierten Brusttumoren erschwert eine Aussage über die Involvierung von PPP2R5A in Brusttumoren. Sowohl die Überexpression als auch die geringere Expression von PPP2R5A in Brusttumoren deuten auf eine Deregulation der Transkription bei der Tumorgenese hin. Inwieweit die veränderte Genexpression von PPP2R5A einen Einfluss auf die Karzinogenese in der Brust ausübt, müssen funktionelle Analysen in diesen Geweben zeigen.

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Thu Jan 30 14:01:20 2003