Kuner, Ruprecht: Identifizierung differenziell exprimieter Gene bei Brust- und Ovarialkarzinomen in den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23

metaGen Pharmaceuticals GmbH


Identifizierung differenziell exprimieter Gene bei Brust- und Ovarialkarzinomen in den chromosomalen Regionen
1q32-q41 und 11q12-q23
Dissertation

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

vonRuprecht Kuner,
geb. am 07.01.69 in Stuttgart

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Thomas Börner
2. Prof. Dr. André Rosenthal
3. Prof. Dr. Matthias Dürst

eingereicht: 23.01.2002
Datum der Promotion: 02.07.2002

Abstrakt:

Brust- und Ovarialkarzinome gehören zu den häufigsten sporadischen Tumorerkrankungen bei der Frau. Die Progression von benignen Neoplasien zu malignen Karzinomen werden von spezifischen Veränderungen der Genexpression begleitet. Durch die bioinformatische Auswertung von vier Millionen ESTs aus cDNA-Bibliotheken von Normalgeweben und der korrespondierenden Tumore wurden Hunderte von differenziell exprimierten Genen selektiert. Nach der chromosomalen Kartierung der Kandidatengene erfolgten weitere Untersuchungen für Gene aus den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23, die häufig in Brust- und Ovarialkarzinomen als aberrant beschrieben wurden. Die Validierung der in-silico Expressionsdaten erfolgte über Northernblot- und cDNA-Array-Analysen von unselektierten und mikrodissezierten Tumorproben. Es konnte für einige der Gene die differenzielle Expression in Brusttumoren bestätigt und dadurch neue Kandidatengene für die untersuchten Genloci identifiziert werden. Das Expressionsmuster einer Acyltransferase in 11q13 als potenzielles Tumorsuppressorgen erbrachte den Hinweis auf eine mögliche Involvierung in den Retinol-Metabolismus und könnte auf einen Mechanismus der Inhibierung der Karzinogenese im Brustepithel hindeuten.

Schlagwörter:
Tumor, Brustkarzinom, Genexpression, EST, Tumorsuppressorgen, Chromosom 11

Abstract:

Breast and ovarian cancers have become major tumor diseases among woman. The progression of benign neoplasia to malignant carcinoma is characterized by specific changes of gene expression. By using an in-silico strategy to analyze four million ESTs available in cDNA libraries of normal and the corresponding tumor tissues, we selected hundreds of differentially expressed genes. After chromosomal assignment of the candidate genes, further experiments were focussed on these genes located in the specific regions 1q32-q41 and 11q13-q23 often described to be aberrant in breast and ovarian cancer specimen. The in-silico expression analysis was verifyed by Northern blot and cDNA-Array techniques of unselected and microdissected tumor samples. We could confirm the in-silico expression pattern of some genes and identified novel tumor associated candidate genes for the investigated loci. According to the expression pattern, an acyltransferases located in 11q13 may represent a tumor suppressor gene, which could possibly inhibit breast carcinogenesis by involving in retinol metabolism.

Keywords:
cancer, breast carcinoma, gene expression, EST, tumor suppressor gene, chromosome 11


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [120] [121] [122] [123] [124] [125] [126] [127] [128] [129] [130] [131] [132] [133] [134] [135] [136] [137] [138] [139] [140] [141] [142] [143] [144] [145] [146] [147] [148] [149] [150]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteIdentifizierung differenziell exprimieter Gene bei Brust- und Ovarialkarzinomen in den chromosomalen Regionen 1q32-q41 und 11q12-q23
1 Einleitung
1.1Allgemeine Charakteristika von gynäkologischen Tumoren
1.1.1Die Histopathologie des Mammakarzinoms
1.1.2Die Histopathologie des Ovarialkarzinoms
1.2Genetik der gynäkologischen Tumore
1.2.1Genetische Ursachen des sporadischen Mammakarzinoms
1.2.2Genetische Ursachen des sporadischen Ovarialkarzinoms
1.2.3Charakterisierung der chromosomalen Region 1q32-q41
1.2.4Charakterisierung der chromosomalen Region 11q12-q23
1.3Methoden zur Identifizierung von tumorassoziierten Genen
1.4Zielsetzung dieser Arbeit
2 Material und Methoden
2.1Übersicht über die Vorgehensweise in dieser Arbeit
2.2Bioinformatische Analysen als Grundlage dieser Arbeit
2.2.1EST-Datenbanken
2.2.2AUTEX und eNORTHERN
2.2.3In-silico Expressionsanalyse als positionaler Ansatz für die chromosomale Region 11q12-q23
2.2.4Elektronische PCR und physikalische Kartierung
2.2.5Sonstige Software und Datenbanken
2.3Verwendete Materialien
2.4Radiation Hybrid Mapping
2.5Zellkultur
2.5.1Herkunft der Zelllinien
2.5.2Kultivierung der Zelllinien
2.6Mikrodissektion
2.6.1Herkunft des Gewebes
2.6.2Vorbereitung der Kryoschnitte
2.6.3Durchführung der lasergestützten Mikrodissektion
2.7RNA-Isolierung und cDNA-Synthese
2.7.1Kommerzielle mRNA-Proben
2.7.2Isolierung der poly(A+)mRNA aus Zelllinien
2.7.3Isolierung der Gesamt-RNA aus mikrodissezierten Geweben
2.7.4Konzentrationsbestimmung von DNA und RNA
2.7.5Reverse Transkription
2.8Aufarbeitungen und Bestätigung von cDNA-Klonen
2.8.1Herkunft der cDNA-Klone für die bearbeiteten Gene
2.8.2Präparation der Plasmid-DNA
2.8.3Restriktionsverdau der Plasmid-DNA
2.8.4Sequenzierung der cDNA-Inserts
2.9Expressionsanalyse über Northernblot und cDNA-Arrays
2.9.1Präparation der cDNA-Sonden
2.9.2Kontroll-Dot Blot
2.9.3Northernblot- und cDNA-Array-Hybridisierung
2.10PCR-basierte Methoden und Klonierung
2.10.1SMART-RACE-PCR
2.10.2PCR von großen Transkripten
2.10.3Klonierung von PCR-Fragmenten
2.10.4Real-time Reverse Transkriptase-PCR (Taqman-PCR)
2.10.4.1Relative Quantifizierung
2.10.4.2Optimierung der Primer und Sonden
2.10.4.3Taqman-PCR mit experimentellen Proben
2.10.5Mutationsanalyse
2.10.5.1Herkunft der Brusttumor-DNA
2.10.5.2PCR-Amplifikation von Tumor-DNA
2.10.5.3Fluoreszenz-Markierung der PCR-Fragmente
2.10.5.4SSCP-Analyse
2.10.5.5Sequenzierung auffälliger Fragmente
2.11RNA in-situ Hybridisierung
2.11.1Herkunft des Paraffingewebes
2.11.2Präparation der RNA-Sonden
2.11.3Hybridisierung der Paraffinschnitte
3 Ergebnisse
3.1Validierung der in-silico Expressionsanalyse
3.1.1Auswertung des elektronischen Northern
3.1.2Bestätigung der in-silico Expressionsdaten
3.2Kartierung von 330 in-silico Kandidatengenen für gynäkologische Tumore
3.3Beschreibung der Kandidatengene in 11q12-q23
3.3.1Validierung aller in-silico Kandidatengene in 11q12-q23
3.3.2Charakterisierung des potenziellen Tumorsuppressorgens ELBT
3.3.2.1ELBT zeigte sich in Brusttumoren signifikant geringer exprimiert
3.3.2.2Bestätigung der ELBT-Expression in mikrodissezierten Brustgeweben
3.3.2.3Die Mutationsanalyse des Gens ELBT ergab keine genomischen Veränderungen in Brusttumoren
3.3.2.4Expression von ELBT in Leber, Brust, Hoden und Blutleukozyten
3.3.2.5Die RNA in-situ Hybridisierung zeigte die Expression von ELBT in Brustepithelzellen und in der Haut
3.3.2.6Transkriptanalyse und genomische Struktur von ELBT
3.3.2.7Das Protein ELBT ist eine putative Acyltransferase
3.4Identifizierung von neuen Kandidatengenen in 11q12-q23 mittels der positionalen Strategie
3.5Beschreibung der Kandidatengene in 1q32-q41
3.5.1Validierung aller in-silico Kandidatengene in 1q32-q41
3.5.2Charakterisierung des potenziellen Onkogens PPP2R5A
3.5.2.1Geringe Expressionsunterschiede von PPP2R5A in Brusttumoren
3.5.2.2Ubiquitäre Expression von PPP2R5A in verschiedenen Geweben
3.5.2.3RNA in-situ Hybridisierung zeigte die Expression von PPP2R5A sowohl im Tumor als auch im Normalepithel der Brust
4 Diskussion
4.1Bewertung der in-silico Expressionsanalyse als Methode zur Identifizierung tumorassoziierter Gene
4.2Bewertung der Kandidatengene in 11q12-q23 unter Einbeziehung der positionalen in-silico Expressionsanalyse
4.3ELBT als potenzielles Tumorsuppressorgen im Brustepithel
4.4Bewertung der Kandidatengene in 1q32-q41
5 Zusammenfassung
Bibliographie Referenzen
Anhang A Anhang
A.1Häufig verwendete Lösungen und Reagenzien
A.2Weitere Informationen zu den Referenzen und zu den Kandidatengenen in 11q12-q23
A.3Referenzen zu Aberrationsstudien bei gynäkologischen Tumoren in Bezug auf das gesamte Genom
A.4Nukleinsäure-und Proteinsequenz von ELBT
A.5Aminosäuren
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Danksagung
Selbständigkeitserklärung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Die LOH- und Amplifikationsstudien bei Brusttumoren in der chromosomalen Region 11q12-q23 sind durch die deletierten (LOH) oder amplifizierten (Amp) Loci, die Häufigkeit der Aberration und der Fallzahlen aufgelistet. Die verschlüsselten Literaturstellen sind im Anhang (G.2, Tab.25) wiedergegeben.
Tab.2: Verwendete Primer zur Kartierung der Gene in 1q und 11q über das G3 Radiation Hybrid Panel
Tab. 3a: Bearbeitete cDNA-Klone der Gene auf Chromosom 1. Die entsprechenden Angaben zu den Klonen sind den jeweiligen Kloninformationen (Entrez, NCBI) entnommen (k.A.: keine Angaben).
Tab. 3b: Bearbeitete cDNA-Klone der Gene auf Chromosom 11. Die entsprechenden Angaben zu den Klonen sind den jeweiligen Kloninformationen (Entrez, NCBI) entnommen (k.A.: keine Angaben).
Tab. 4: Enzymkombinationen für den Restriktionsverdau der jeweiligen Vektoren
Tab. 5: Auswahl der Sequenzierprimer für die entsprechenden Vektoren
Tab. 6: ELBT-Primer zur Amplifikation und Klonierung des ORFs
Tab. 7: Sequenzen der verwendeten Primer und markierten Sonden für die Taqman-PCR.
Tab. 8: Primer zur Amplifikation der 8 Exons von ELBT. Am 5‘-Ende der Primer wurde an die genspezifische Sequenz zusätzlich die Basen ‘‘ATT‘‘ angefügt, die zur Fluoreszenz-Markierung dienten.
Tab. 9: Angaben der Restriktionsenzyme für die Linearisierung und der RNA-Polymerasen für die in-vitro Transkription in Abhängigkeit von den Vektoren.
Tab. 10: Elektronischer Northern von YAP65
Tab. 11: Beschreibung der in-silico differenziellen Gene aus der chromosomalen Region 11q12-q23.
*Der Name ELBT wurde für ein während dieser Arbeit noch unbekanntes Gen vergeben (aktueller Datenbankeintrag Stand Oktober 2001: DGAT2).
Tab. 12: Allgemeine Angaben zu den Genen in 11q12-q23 und Ergebnisse der chromosomalen Kartierung über Radiation Hybrid Mapping (RHdb) mit Angabe der Wahrscheinlichkeit (LOD_Score), des statistisch ermittelten Abstandes (cRs) und der zytogenetischen Bande nach der genomischen Datenbank (GDB) bzw. der aktuellen genomischen Sequenzdatenbank (UCSC).
Tab. 13: Ergebnisse des elektronischen Northern der Gene in 11q12-q23 bezüglich der differenziellen Expression in Brust- und Ovargewebe.
Tab. 14: Elektronischer Northern von ELBT
Tab. 15: Quantitative Auswertung der Expression von ELBT in den 53 Brustgewebe-Probenpaaren des Cancer Profiling Array (CPA) über ImageQuant. Die Koordinaten X,Y geben die Lage des untersuchten Probenpaars auf dem CPA (Abb.14) wieder. Der relative Expressionslevel (T/N) bezieht sich auf die differenzielle Expression (k.A.-keine Angaben; n.a.-nicht auswertbar).
Tab. 16: Quantifizierung der Expression von ELBT in den mikrodissezierten Brustgeweben nach der Taqman-PCR. Alle Proben wurden über die GAPDH-Expression normiert und der Expressionslevel aller mikrodissezierten Proben in Bezug zur Referenzproben B19 (Mammaepithel-Probe) gesetzt.
Tab. 17: Übersicht über die Bearbeitung und Ergebnisse der 72 in der Mutationsanalyse untersuchten Proben (71 Tumorproben, 1 Plazenta-Kontrolle VP). Histologische Daten zu den Tumoren lagen in einem Teil der Tumorproben vor (IDC, ILC, DCIS) oder waren nicht weiter klassifiziert (BrCa). Es konnten einige Exons in den Tumorproben nicht amplifiziert werden (negativ), die meisten Amplifikate waren im SSCP-Gel unauffällig (-) oder wurden aufgrund auffälliger SSCP-Analysen anschließend sequenziert (Seq).
Tab. 18: Auswertung der Taqman-PCR von 22 Geweben und 9 Tumorzelllinien. Die CT-Werte ergaben sich aus dem Mittelwert (Mw) des dreifachen PCR-Ansatzes mit Angaben der Standardabweichung (Stabw). Alle Proben wurden über die GAPDH-Expression normiert (DeltaCT). Die relativen Expressionsverhältnisse (Level) der Proben beziehen sich auf Brust als Referenzprobe (Level=1).
Tab. 19: Auflistung der in-silico Kandidatengene und beschriebenen aberranten STS-Marker für Brusttumore von proximal 11q12 nach distal 11q23 mit Angaben der zytogenetischen Bande und der physikalischen Position auf dem Chromosomenabschnitt in Megabasen (MB). Die Spalte Expression/ Aberration zeigt die charakteristischen Eigenschaften der differenziell exprimierten Gene und beschriebenen STS-Marker in den Brusttumoren (rotes Feld, auf: überexprimiert; grünes Feld, ab: unterexprimiert; rote Schrift, Amp: amplifiziert; grüne Schrift, LOH: Verlust der Hetreozygotie) mit Angaben der Ergebnisse des elektronischen Northern (P-Wert<0,05) und der Aberrationsstudien (verschlüsselte Referenz, siehe Anhang G.2).
Tab. 20: Beschreibung der in-silico differenziellen Gene aus der chromosomalen Region 1q32.q41. Die Angabe der Signifikanz (E-Wert) bezieht sich auf das Ergebnis des Vergleichs der assemblierten Sequenz mit der Nukleinsäure-Datenbank (BLASTN).
Tab. 21: Ergebnisse der chromosomalen Kartierung der Gene in 1q32-q41 über Radiation Hybrid Mapping (RHdb) oder ePCR mit Angabe der Wahrscheinlichkeit (LOD_Score), des statistisch ermittelten Abstandes (in cRs) und der Angabe der zytogenetischen Bande nach der genomischen Datenbank (GDB) bzw. der aktuellen genomischen Sequenzdatenbank (UCSC). Die Größe des Transkriptes ergab sich aus dem Northernblot (Abb.30).
Tab. 22: Ergebnisse des elektronischen Northern der Gene in 1q32-q41 bezüglich der differenziellen Expression in Brust- und Ovargewebe.
Tab. 23: Auswertung der Taqman-Analyse zur Expression von PPP2R5A in den mikrodissezierten Brustgeweben.
Tab. 24: Auswertung der Taqman-Analyse zur Expression von PPP2R5A in 22 verschiedenen Normalgeweben und neun Zelllinien.
Tab. 25: Referenzangaben zu Tab.1 (Kap.A.2.4) und zu Tab.19 (Kap.C.4).
Tab. 26: Weitere Angaben zu in-silico Kandidatengenen und STS-Markern aus LOH- und Amplifikationsstudien. Name der Gene und Marker mit geläufigen Abkürzungen, Genbankeintrag des ESTs repräsentierend für das Assembly, Genbankeintrag der BAC-Sequenz auf dem das Gen bzw. der Marker lokalisiert ist und Ergebnisse des elektronischen Northern einschließlich des P-Wertes.
Tab. 27: Auswahl an Referenzen für Aberrationen (LOH, Amplifikation) in Brusttumoren mit Angabe von Kandidatengenen und Assoziationen bestimmter Aberrationen zur Histologie und Progression der Tumore. Referenzen dienten als Grundlage des Progressionsmodells (Kapitel A.2.1, Abb.2) und zur Gegenüberstellung von Aberrationsdaten mit den 330 kartierten in-silico Kandidatengenen (Kapitel C.2, Abb.11.1/.2).
Tab. 28: Auswahl an Referenzen für Aberrationen (LOH, Amplifikation) in Ovarialtumoren und endometrialen Tumoren mit Angabe von Kandidatengenen und Assoziationen bestimmter Aberrationen zur Histologie und Progression der Tumore. Referenzen dienten als Grundlage des Progressionsmodells (Kapitel A.2.2, Abb.3) und zur Gegenüberstellung von Aberrationsdaten mit den 330 kartierten in-silico Kandidatengenen (Kapitel C.2, Abb.11.1/.2).

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Lobulus als milchproduzierende Endstruktur des Brustepithels
Abb. 2: Progressionsmodell des Mammakarzinoms am Beispiel des häufigsten duktalen Typs auf der Grundlage ausgewerteter Aberrationsstudien (Anhang: G3, Tab.27). Oben sind die histologisch differenzierbaren Stadien dargestellt, unten werden die Ereignisse chromosomaler Aberrationen wie Deletionen (-) und Amplifikationen (+) bestimmten Phasen der Tumorprogression zugeordnet.
Abb. 3: Progressionsmodell des epithelialen Ovarialkarzinoms mit den histologisch differenzierbaren Stadien auf der Grundlage ausgewerteter Aberrationsstudien (Anhang G3, Tab.28). Unten angegeben die Deletionen ( - ) bzw. Amplifikationen (+) in entsprechenden Phasen der Tumorprogression.
Abb.4: Fließdiagramm über die Vorgehensweise in dieser Arbeit.
Abb.5: Darstellung der in-silico Expressionsanalyse mittels der bioinformatischen Programme AUTEX und eNORTHERN (Schmitt et al., 1999).
Abb.6: Das Prinzip des Radiation Hybrid Mapping beruht auf 83 DNA-Hybriden, bestehend aus den grün dargestellten Hamsterchromosomen, in die die rot dargestellten humanen Chromosomenbruchstücke integriert wurden. Nach der PCR und der Elektrophorese ergibt sich ein binärer 0-1 Code, je nach positivem (1) oder negativem Erbgebnis (0) für alle 83 Proben (P-Positivkontrolle, N-Negativkontrolle).
Abb.7: Vorgehensweise der lasergestützten Mikrodissektion. Die linken Bilder zeigen die mit dem Laser umfahrenen Tumorareale der Brust (oben: IDC; unten: DCIS). In den rechten Bildern ist der Gewebeschnitt nach Abnahme des Caps mit den ausgeschnittenen Arealen dargestellt.
Abb.8: Prinzip der Taqman-PCR basierend auf 5‘-3‘-Exonuklease-Aktivität der Taq Polymerase.
Bei der Extension wird der Reporter-Farbstoff (R) vom Quencher-Farbstoff (Q) abgespalten und erzeugt ein Fluoreszenzsignal.
Abb.9: Vergleich der Expression von YAP65 und dem putativen Calpain in verschiedenen Normalgeweben zwischen elektronischem Northern (Tabelle) und MTN-Northernblot. Im elektronischen Northern beziehen sich die EST-Zahlen der Gene, die die Expressionstärke in den Geweben repräsentieren, auf eine definierte Bibliotheksgröße von 100.000 ESTs (Freq/100.000). Zur Quantifizierung der Gewebe des Northernblots ist die Hybridisierung mit ß-Aktin dargestellt.
Abb.10: Vergleich der differenziellen Expression von YAP65 und dem putativen Calpain in Brust- und Ovarialtumoren zwischen den Methoden des elektronischen Northern und des radioaktiv markiertem cDNA-Arrays. Die Werte unter den cDNA-Arrays geben die densitometrisch ermittelten Expressionsverhältnisse (T/N) der Probenpaare wieder, die zuvor auf die ß-Aktin-Expression normiert wurden.
Abb.11.1: Teil 1 der Übersicht über die chromosomale Verteilung von 330 Kandidatengenen für gynäkologische Tumore im Vergleich mit beschriebenen Aberrationen.
Abb.11.2: Teil 2 der Übersicht über die chromosomale Verteilung von 330 Kandidatengenen für gynäkologische Tumore im Vergleich mit beschriebenen Aberrationen. Die Literaturhinweise sind im Anhang nach den Chromosomen geordnet (G.3,Tab.27) wiedergegeben. Die Legende gibt Auskunft über Expressionscharakter der Gene für die entsprechenden Gewebe.
Abb.12: Cytogenetische Lokalisation der Kandidatengene in 11q12-q23. Die in-silico differenziell exprimierten Genen (rechte Spalte) wurden entsprechend der annotierten Genomdatenbank (UCSC) chromosomal kartiert. Dazu sind schon beschriebene tumorassoziierte Gene wie MEN1, CCND1, FGF4, FGF3, EMS1 (11q13 Amplikon) und ATM angegeben.
Abb.13: Übersicht über das Expressionsmuster der Gene aus 11q12-q23 im MTN-Northernblot (linke Bilderspalte) mit 16 verschiedenen Gewebetypen und im cDNA-Array (beide rechte Bildspalten) mit korrspondierenden Normal (N)- und Tumorproben (T) von Brust- und Ovargewebe. Unter den cDNA-Arrays sind die densitometrisch ermittelten Expressionsverhältnisse (T/N) in Bezug zur ß-Aktin-Expression angegeben (n.d.-nicht definiert). Für das Gen CLNS1A ist nur die Hybridisierung des cDNA-Arrays dargestellt, da die cDNA-Sonde bereits validiert vorlag.
Abb.14: Expression von ELBT auf dem ’’Cancer Profiling Array’’
Abb.15: Expression von ß-Aktin auf dem ’’Cancer Profiling Array’’
Abb.16: Darstellung der relativen Expression (T/N) von ELBT im Säulendiagramm für 52 Probenpaare mit Unterteilung der Brusttumore in histologische Typen. Die Tabelle gibt die statistische Auswertung der signifikant geringeren Expression in IDCs und ILCs wieder.
Abb.17: Darstellung der relativen Expression von 21 mikrodissezierten Brusttumoren und Normalepithelien im Säulendiagramm mit Unterteilung der histologischen Typen. Die statistische Auswertung der signifikant geringeren Expression in Tumoren bezieht sich auf die Referenzprobe B19.
Abb.18: Optimierung der PCR für 8 Primerpaare zur Amplifikation der Exons von ELBT in den Tumor-DNA-Proben. In den oberen Bildern sind die PCR-Amplifikate für Exon 1, 2 und 3-8 bei unterschiedlichen PCR-Bedingungen gezeigt. Im unteren Bild sind exemplarisch für Exon 4 die Amplifikate der 71 Tumorproben und der Plazentakontrolle (Nr.48) gezeigt. Als Längenstandard diente ein 100bp Marker.
Abb.19: Darstellung der Expression von ELBT in verschiedenen Geweben im Säulendiagramm. Der relative Expressionslevel bezieht sich auf den DeltaCT-Wert der Brust-Probe. Es zeigt sich eine spezifische Expression in Leber, Brust und Hoden.
Abb.20: Fragmente der Antisense (A)- und Sense (S)-Sondenpräparation von ELBT (Klon H25327) nach der Linearisierung und der in-vitro Transkription (IVT).
Abb.21: Expression von ELBT im Drüsenepithel der Brust. Die beiden Ausschnitte in der oberen Reihe zeigen die Expressionssignale nach der Antisense-Sonden-Hybridisierung visualisiert durch den blauen Niederschlag von BM Purple. Die mittleren äquivalenten Auschnitte aus dem Präparat, hybridisiert mit der Sense-Sonde, stellen die Negativkontrolle des Experimentes dar. In der unteren Reihe sind die Gewebeareale zur histologischen Beurteilung nach Hämalaun-Eosin-Färbung dargestellt. In der linken Spalte ist ein Lobulus in der 200fachen mikroskopischen Vergrößerung gezeigt, in der rechten Spalte ein Ausschnitt der Epithelzellen (Pfeile) in 400facher Vergrößerung.
Abb.22: Expression von ELBT in verschiedenen Tumoren. Im Brusttumor (IDC) konnte keine Expression von IDC nachgewiesen werden (linke Bildreihe). Eine schwache Expression konnte in Zellen des Leberkarzinoms detektiert werden (rechte Bildreihe).
Abb.23: Expression von ELBT in Hautanteilen des Brustgewebe-Präparates. Es zeigt sich in der oberen Reihe ein sehr spezifisches Signal in den Hautschichten Stratum granulosum und Stratum lucidum an der Grenze zur Stratum corneum (Pfeile).
Abb.24: Expression von ELBT in den sekretorischen Zellen von Schweißdrüsen (Pfeile) in der Haut. In der linken Bilderspalte ist die Schweißdrüse tiefer im Gewebe angeschnitten, in der rechten Bilderspalte ist die positive Schweißdrüse direkt unter der Epidermis lokalisiert.
Abb.25: Ergebnis der RACE-PCR zur Verifizierung des 5’-Endes (R1) und der Amplifikation von ELBT-Fragmenten (P1, P2) zur Klonierung der kodierenden Sequenz.
Abb.26: Chromosomale Lokalisation und genomische Struktur von ELBT. Oben ist die physikalische Lokalisation des Gens in 11q13.5 angegeben (A.). Das Gen ELBT wird von den BACs AP000649 und AC021221 der genomischen Sequenzdatenbank UCSC abgedeckt (B.). Innerhalb der Region liegt ELBT zwischen den Genen FLJ22644 und UVRAG (C.). Das Gen besteht aus 8 Exons (Kästen) mit einer Transkriptlänge von insgesamt 2408bp und umspannt etwa 30kb (D.).
Abb.27.1: 1. Abschnitt des Sequenzvergleichs der ELBT-Proteinfamilie.
Abb.27.2: 2. Abschnitt des Sequenzvergleichs der ELBT-Proteinfamilie.
Abb.28: Vergleich der Lokalisation beschriebener aberranter Loci (grüne quergestreifte Balken = LOH-Region; rote quergestreifte Balken = amplifizierte Region) und der über den positionalen Ansatz identifizierten in-silico Kandidatengene (grüne Balken= im Tumor herunterreguliert; rote Balken= in Tumor hochreguliert). Die Kandidatengene bzw. Nummern entsprechen den Angaben der Tab.19. Die Gene MEN1, CCND1, FGF3, FGF4, EMS1 und ATM stellen schon beschriebene tumorassoziierte Gene dar.
Abb.29: Cytogenetische Lokalisation der Kandidatengene in 1q32-q41. Die in-silico differenziell exprimierten Genen (rechte Spalte) wurden entsprechend der annotierten Genomdatenbank (UCSC) chromosomal kartiert. Die getrennt dargestellten Gene ELF3 und MDM4 wurden in verschiedenen Tumoren als häufig amplifiziert beschrieben (Tymms et al., 1997; Riemenschneider et al., 1999).
Abb.30: Übersicht über das Expressionsmuster der Gene aus 1q32-q41 im MTN-Northernblot (linke Bilderspalte) mit 16 verschiedenen Gewebetypen und im cDNA-Array (beide rechte Bildspalten) mit korrespondierenden Normal (N)- und Tumorproben (T) von Brust- und Ovargewebe. Für die Gene ELF3 und DAF lagen die Sonden schon validiert vor und es sind nur die Hybridisierung des cDNA-Arrays dargestellt. Unter den cDNA-Arrays sind die Expressionsverhältnisse (T/N) angegeben.
Abb.31: Übersicht der Expressionslevel von PPP2R5A in 17 mikrodissezierten Tumoren bezogen auf eine Normalepithelprobe (B19). Die Tabelle gibt die Fraktionen der Tumore nach IDC und ILC getrennt wieder, die differenziell exprimiert (Unterexpression: T/N < 0,5; Überexpression: T/N > 2) waren.
Abb.32: Darstellung der Expression von PPP2R5A in 22 unterschiedlichen Normalgeweben und neun Tumorzelllinien im Säulendiagramm.
Abb.33: Sondenpräparation für die RNA in-situ Hybridisierung des Gens PPP2R5A. Für die Linearisierung und in-vitro Transkription wurde der Klon AA486712 eingesetzt.
Abb.34: RNA in-situ Hybridisierung der PPP2R5A-Sonde auf Brustgewebe-Paraffinschnitte. Das Gen PPP2R5A ist sowohl in normalem Brustepithel (linke Bilderspalte, Pfeile), als auch in invasiv duktalen Karzinomen (IDC, rechte Bilderspalte, Pfeile) exprimiert. Die Negativ-Kontrollpräparate zeigen keine Färbung (PPP2R5A Sense). In den HE-Schnitten sind die blaugefärbten Zellkerne erkennbar. Der HE-Schnitt des Normalepithels zeigt aufgrund der Entfernung zu den beiden hybridisierten Schnitten nicht mehr die gleiche Drüsenstruktur.
Abb.35: Die RNA in-situ Hybridisierung der PPP2R5A-Sonde ergab die Expression im invasiv lobulären Typ (ILC) des Brustkarzinoms. In der linken Bilderspalte sind die stark positiven kompakten Tumormassen des ILC dargestellt (Pfeile). Eine Expression von PPP2R5A zeigte sich auch in kleineren Tumorzellhaufen in Lymphgefäßen und im Bindegewebe (rechte Bilderspalte, Pfeile; Doppelpfeil markiert venöses Gefäß).

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Thu Jan 30 14:01:20 2003