Organisation und Dynamik der Phospholipide in der Zell- und Akrosommembran von Eberspermien während der Kapazitation und Akrosomreaktion

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biophysik

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Humboldt-Universität zu Berlin

von
Frau Dipl.-Biophys. Anke Kurz

geboren am 16.01.1973 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Andreas Herrmann
2. Prof. Dr. Ingolf Bernhardt
3. Prof. Dr. Edda Töpfer-Petersen

eingereicht am: 13.10.2004

Tag der mündlichen Prüfung: 02.02.2005

Zusammenfassung

Eine wichtige Eigenschaft der Plasmamembran eukaryotischer Zellen, einschließlich derer von Eber- und Forellenspermien, ist eine stabile transversale Asymmetrie der Phospholipide, charakterisiert durch die zytoplasmatische Anreicherung der Aminophospholipide Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin. Diese gilt als wichtige Voraussetzung für die Homöostasis der Zellen und wird energieabhängig durch die Aktivität einer Aminophospholipidtranslokase aufrechterhalten. Die Plasmamembran einiger Säugerzellen weist zudem laterale Lipiddomänen auf, denen eine wesentliche Bedeutung bei der Signaltransduktion zugeschrieben wird. Die transversale und laterale Ungleichverteilung der Membranlipide ist für zahlreiche intra- und interzelluläre Wechselwirkungen von funktioneller Bedeutung.

Säugerspermien stellen hoch spezialisierte Zellen dar, deren Membranen während der Genese intensive Veränderungen durchlaufen. Um die Bedeutung der Phospholipidasymmetrie für die Funktion der Spermien zu untersuchen, wurde die Lokalisation und Dynamik von Phosphatidylserin in der Zell- und Akrosommembran von Eberspermien im Verlauf von Kapazitation und Akrosomreaktion betrachtet. Unter Ausnutzung der selektiven, kalziumabhängigen Bindung von AnnexinV an endogenes Phosphatidylserin konnte dessen Lokalisation an morphologisch differenzierten Zellen verfolgt werden. Eine Markierung der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga lieferte zudem Informatione n zur Dynamik der Phospholipide in der Plasmamembran. Die morphologische Differenzierung der Zellen erfolgte entweder am Durchflusszytometer oder fluoreszenz- bzw. elektronenmikroskopisch nach entsprechender Markierung. Propidiumjodid wurde zur Unterscheidung lebender und toter Zellen genutzt, ein selektiv an die äußere Akrosommembran bindendes Lektin (PNA) zur Differenzierung der Membranen im Bereich der Kopfkappe der Spermien.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen sowohl auf eine transversale als auch laterale Ungleichverteilung der Lipide in der Zell- und Akrosommembran während der Genese der Spermien hin. Die Plasmamembran flüssigkonservierter Eberspermien weist eine stabile transversale Phospholipidasymmetrie auf, die u.a. durch eine Anreicherung von Phosphatidylserin im zytoplasmatischen Monolayer charakterisiert ist. Erstmals konnte eine zytoplasmatische Lokalisation von Phosphatidylserin auf der äußeren Akrosommembran nachgewiesen werden. Somit akkumulieren die beiden einander zugewandten zytoplasmatischen Monolayer von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran Phosphatidylserin. Auch während der Kapazitation und nach Induktion der Akrosomreaktion mit einem Kalziumionophor exponieren lebende Eberspermien Phosphatidylserin nicht auf der Zelloberfläche. Die Translokation von NBD-Phosphatidylserin in lebenden, kapazitierten Zellen ist zwar verlangsamt, die transversale Asymmetrie des Phosphatidylserin in der Plasmamembran bleibt jedoch erhalten. Im postakrosomalen Bereich der Eberspermien weist die Plasmamembran eine hohe Stabilität auf. Eine Wechselwirkung des zytoplasmatisch akkumulierten Phosphatidylserin mit Elementen des Zytoskeletts erscheint vor allem in diesem Bereich wahrscheinlich. Mit Hilfe der Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass es kapazitationsbedingt zu einer engen Wechselwirkung zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran kommt. Wahrscheinlich ist eine Ausbildung lateraler Membrandomänen in Plasmamembran und äußerer Akrosommembran, in denen Phosphatidylserin zytoplasmatisch akkumuliert, Voraussetzung für diese enge Assoziation, die letztendlich an vielen Orten zur punktuellen Fusion beider Membranen führen kann. Hinweise auf eine funktionelle Bedeutung lateraler Lipiddomänen in der Plasmamembran von Spermienzellen lieferten die vorrangig methodisch ausgerichteten Arbeiten zur Präparation von sogenannten Raftdomänen in der Plasmamembran von Forellenspermien. Die Isolierung einer Membranfraktion mit erhöhtem Cholesterol/Phospholipid-Verhältnis und charakteristischem Proteinmuster diente unter anderem als Ausgangspunkt für zukünftige Arbeiten an Säugerspermien, wo eine Beteiligung lateraler Lipiddomänen an den Prozessen der Kapazitation und Akrosomreaktion im Hinblick auf die stattfindenden Fusionsprozesse und die Eizellerkennung von besonderem Interesse ist.

Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern die Bedeutung der transversalen Phospholipidasymmetrie für die Funktionsfähigkeit der Spermien auch während der Kapazitation und Akrosomreaktion. Die zytoplasmatische Lokalisation von Phosphatidylserin könnte an der Vermittlung der Fusion zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran während der Akrosomreaktion beteiligt sein.

Eigene Schlagworte: Spermien, Phospholipide, Plasmamembran, Akrosommembran, Kapazitation, Akrosomreaktion, Durchflusszytometrie, Mikroskopie

Abstract

One of the essential qualities of cell membranes in Eucaryotae, including boar and trout sperm, is a stable transverse phospholipid asymmetry. Cytoplasmatic accumulation of the aminophospholipids, phosphatidylethanolamine and phosphatidylserine characterises this asymmetry and is a major prerequisite for cell homeostasis. It is regulated and maintained by ATP-dependent action of an aminophospholipid translocase. The plasma membranes of several mammalian cells show moreover lateral lipid domains, which are imputed to play a significant role in signal transduction. The transverse and lateral distribution of membrane lipids is of functional importance for numerous intra- and intercellular interactions.

Mammalian spermatozoa are highly specialised cells and their membranes undergo significant changes during genesis. The localisation and dynamics of phosphatidylserine in the cell as well as acrosome membranes of boar sperm cells was studied during capacitation and acrosome reaction to assess the relevance of lipid asymmetry for sperm function. The localisation of endogenous phosphatidylserine in morphologically differentiated cells was followed using the selective calcium depending binding of annexinV. Information on the transverse dynamics of phospholipids in the plasma membrane was obtained by labelling the cells with a NBD-phospholipid analogues. The morphological status of the cells was assessed by flow cytometry, fluorescence and electron microscopy. Propidium iodide was used to discriminate between living and dead cells. PNA, a lectin which binds selectively to the outer acrosome membrane, was applied to distinguish the membranes in the acrosome region of the sperm cell.

The results of this study indicate both a transversal and lateral inhomogenous distribution of lipids in the cell membrane as well as in the outer acrosome membrane during sperm genesis. The plasma membrane of freshly ejaculated, liquid-preserved, boar sperm shows a stable transversal lipid asymmetry characterised among other things by an accumulation of phosphatidylserine in the cytoplasmic monolayer. Moreover a cytoplasmic localisation of phosphatidylserine on the outer acrosome membrane could be detected for the first time. Therefore the two facing cytoplasmic leaflets of the outer acrosome and cell membrane contain phosphatidylserine. Neither during capacitation nor after induction of acrosome reaction with calcium ionophore do living spermatozoa expose phosphatidylserine on their surface. The translocation of NBD-phosphatidylserine in living capacitated cells is certainly slowed down, but its transverse asymmetry in the cell membrane is maintained. Applying fluorescence and electron microscopy substantiated the hypothesis that there are close interactions between the cell membrane and the outer layer of the acrosome membrane because of capacitation. The cytoplasmic accumulation of phosphatidylserine in lateral lipid domains is probably essential for the strong association of plasma and outer acrosome membrane finally leading to local fusions of both membranes. In the postacrosomal region of the boar sperm cell the plasma membrane shows an excellent structural stability. Especially in this region an interaction between cytoplasmically accumulated phosphatidylserine and proteins and/or cytoskeletal elements may be attributed to its stabilisation.

An indication for the functional meaning of lateral lipid domains in membranes of sperm cells was deduced from the mainly methodical works on preparations of so called “raft domains” in membranes of trout sperm cells. The isolation of a membrane fraction with increased cholesterol to phospholipid ratio and characteristic protein pattern served as a starting point for futher investigations on mammalian sperm cells. The involvement of lateral lipid domains in capacitation and acrosome reaction with regard to the occuring fusion processes and the recognition of the oocyte is of particular interest.

The results of the present work substantiate the importance of the transverse phospholipid asymmetry in sperm cell function, during capacitation and acrosome reaction as well. The cytoplasmic localisation of phosphatidylserine could mediate the fusion between cell membrane and outer acrosome membrane during acrosome reaction.

Keywords: sperm, phospholipids, plasma membrane, acrosome membrane, capacitation, acrosome reaction, flowcytometry, microscopy

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17.08.2007