Organisation und Dynamik der Phospholipide in der Zell- und Akrosommembran von Eberspermien während der Kapazitation und Akrosomreaktion

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
im Fach Biophysik

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Humboldt-Universität zu Berlin

von
Frau Dipl.-Biophys. Anke Kurz

geboren am 16.01.1973 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin:
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Andreas Herrmann
2. Prof. Dr. Ingolf Bernhardt
3. Prof. Dr. Edda Töpfer-Petersen

eingereicht am: 13.10.2004

Tag der mündlichen Prüfung: 02.02.2005

Zusammenfassung

Eine wichtige Eigenschaft der Plasmamembran eukaryotischer Zellen, einschließlich derer von Eber- und Forellenspermien, ist eine stabile transversale Asymmetrie der Phospholipide, charakterisiert durch die zytoplasmatische Anreicherung der Aminophospholipide Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin. Diese gilt als wichtige Voraussetzung für die Homöostasis der Zellen und wird energieabhängig durch die Aktivität einer Aminophospholipidtranslokase aufrechterhalten. Die Plasmamembran einiger Säugerzellen weist zudem laterale Lipiddomänen auf, denen eine wesentliche Bedeutung bei der Signaltransduktion zugeschrieben wird. Die transversale und laterale Ungleichverteilung der Membranlipide ist für zahlreiche intra- und interzelluläre Wechselwirkungen von funktioneller Bedeutung.

Säugerspermien stellen hoch spezialisierte Zellen dar, deren Membranen während der Genese intensive Veränderungen durchlaufen. Um die Bedeutung der Phospholipidasymmetrie für die Funktion der Spermien zu untersuchen, wurde die Lokalisation und Dynamik von Phosphatidylserin in der Zell- und Akrosommembran von Eberspermien im Verlauf von Kapazitation und Akrosomreaktion betrachtet. Unter Ausnutzung der selektiven, kalziumabhängigen Bindung von AnnexinV an endogenes Phosphatidylserin konnte dessen Lokalisation an morphologisch differenzierten Zellen verfolgt werden. Eine Markierung der Zellen mit fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga lieferte zudem Informatione n zur Dynamik der Phospholipide in der Plasmamembran. Die morphologische Differenzierung der Zellen erfolgte entweder am Durchflusszytometer oder fluoreszenz- bzw. elektronenmikroskopisch nach entsprechender Markierung. Propidiumjodid wurde zur Unterscheidung lebender und toter Zellen genutzt, ein selektiv an die äußere Akrosommembran bindendes Lektin (PNA) zur Differenzierung der Membranen im Bereich der Kopfkappe der Spermien.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen sowohl auf eine transversale als auch laterale Ungleichverteilung der Lipide in der Zell- und Akrosommembran während der Genese der Spermien hin. Die Plasmamembran flüssigkonservierter Eberspermien weist eine stabile transversale Phospholipidasymmetrie auf, die u.a. durch eine Anreicherung von Phosphatidylserin im zytoplasmatischen Monolayer charakterisiert ist. Erstmals konnte eine zytoplasmatische Lokalisation von Phosphatidylserin auf der äußeren Akrosommembran nachgewiesen werden. Somit akkumulieren die beiden einander zugewandten zytoplasmatischen Monolayer von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran Phosphatidylserin. Auch während der Kapazitation und nach Induktion der Akrosomreaktion mit einem Kalziumionophor exponieren lebende Eberspermien Phosphatidylserin nicht auf der Zelloberfläche. Die Translokation von NBD-Phosphatidylserin in lebenden, kapazitierten Zellen ist zwar verlangsamt, die transversale Asymmetrie des Phosphatidylserin in der Plasmamembran bleibt jedoch erhalten. Im postakrosomalen Bereich der Eberspermien weist die Plasmamembran eine hohe Stabilität auf. Eine Wechselwirkung des zytoplasmatisch akkumulierten Phosphatidylserin mit Elementen des Zytoskeletts erscheint vor allem in diesem Bereich wahrscheinlich. Mit Hilfe der Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie konnte gezeigt werden, dass es kapazitationsbedingt zu einer engen Wechselwirkung zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran kommt. Wahrscheinlich ist eine Ausbildung lateraler Membrandomänen in Plasmamembran und äußerer Akrosommembran, in denen Phosphatidylserin zytoplasmatisch akkumuliert, Voraussetzung für diese enge Assoziation, die letztendlich an vielen Orten zur punktuellen Fusion beider Membranen führen kann. Hinweise auf eine funktionelle Bedeutung lateraler Lipiddomänen in der Plasmamembran von Spermienzellen lieferten die vorrangig methodisch ausgerichteten Arbeiten zur Präparation von sogenannten Raftdomänen in der Plasmamembran von Forellenspermien. Die Isolierung einer Membranfraktion mit erhöhtem Cholesterol/Phospholipid-Verhältnis und charakteristischem Proteinmuster diente unter anderem als Ausgangspunkt für zukünftige Arbeiten an Säugerspermien, wo eine Beteiligung lateraler Lipiddomänen an den Prozessen der Kapazitation und Akrosomreaktion im Hinblick auf die stattfindenden Fusionsprozesse und die Eizellerkennung von besonderem Interesse ist.

Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern die Bedeutung der transversalen Phospholipidasymmetrie für die Funktionsfähigkeit der Spermien auch während der Kapazitation und Akrosomreaktion. Die zytoplasmatische Lokalisation von Phosphatidylserin könnte an der Vermittlung der Fusion zwischen Plasmamembran und äußerer Akrosommembran während der Akrosomreaktion beteiligt sein.

Eigene Schlagworte: Spermien, Phospholipide, Plasmamembran, Akrosommembran, Kapazitation, Akrosomreaktion, Durchflusszytometrie, Mikroskopie

Abstract

One of the essential qualities of cell membranes in Eucaryotae, including boar and trout sperm, is a stable transverse phospholipid asymmetry. Cytoplasmatic accumulation of the aminophospholipids, phosphatidylethanolamine and phosphatidylserine characterises this asymmetry and is a major prerequisite for cell homeostasis. It is regulated and maintained by ATP-dependent action of an aminophospholipid translocase. The plasma membranes of several mammalian cells show moreover lateral lipid domains, which are imputed to play a significant role in signal transduction. The transverse and lateral distribution of membrane lipids is of functional importance for numerous intra- and intercellular interactions.

Mammalian spermatozoa are highly specialised cells and their membranes undergo significant changes during genesis. The localisation and dynamics of phosphatidylserine in the cell as well as acrosome membranes of boar sperm cells was studied during capacitation and acrosome reaction to assess the relevance of lipid asymmetry for sperm function. The localisation of endogenous phosphatidylserine in morphologically differentiated cells was followed using the selective calcium depending binding of annexinV. Information on the transverse dynamics of phospholipids in the plasma membrane was obtained by labelling the cells with a NBD-phospholipid analogues. The morphological status of the cells was assessed by flow cytometry, fluorescence and electron microscopy. Propidium iodide was used to discriminate between living and dead cells. PNA, a lectin which binds selectively to the outer acrosome membrane, was applied to distinguish the membranes in the acrosome region of the sperm cell.

The results of this study indicate both a transversal and lateral inhomogenous distribution of lipids in the cell membrane as well as in the outer acrosome membrane during sperm genesis. The plasma membrane of freshly ejaculated, liquid-preserved, boar sperm shows a stable transversal lipid asymmetry characterised among other things by an accumulation of phosphatidylserine in the cytoplasmic monolayer. Moreover a cytoplasmic localisation of phosphatidylserine on the outer acrosome membrane could be detected for the first time. Therefore the two facing cytoplasmic leaflets of the outer acrosome and cell membrane contain phosphatidylserine. Neither during capacitation nor after induction of acrosome reaction with calcium ionophore do living spermatozoa expose phosphatidylserine on their surface. The translocation of NBD-phosphatidylserine in living capacitated cells is certainly slowed down, but its transverse asymmetry in the cell membrane is maintained. Applying fluorescence and electron microscopy substantiated the hypothesis that there are close interactions between the cell membrane and the outer layer of the acrosome membrane because of capacitation. The cytoplasmic accumulation of phosphatidylserine in lateral lipid domains is probably essential for the strong association of plasma and outer acrosome membrane finally leading to local fusions of both membranes. In the postacrosomal region of the boar sperm cell the plasma membrane shows an excellent structural stability. Especially in this region an interaction between cytoplasmically accumulated phosphatidylserine and proteins and/or cytoskeletal elements may be attributed to its stabilisation.

An indication for the functional meaning of lateral lipid domains in membranes of sperm cells was deduced from the mainly methodical works on preparations of so called “raft domains” in membranes of trout sperm cells. The isolation of a membrane fraction with increased cholesterol to phospholipid ratio and characteristic protein pattern served as a starting point for futher investigations on mammalian sperm cells. The involvement of lateral lipid domains in capacitation and acrosome reaction with regard to the occuring fusion processes and the recognition of the oocyte is of particular interest.

The results of the present work substantiate the importance of the transverse phospholipid asymmetry in sperm cell function, during capacitation and acrosome reaction as well. The cytoplasmic localisation of phosphatidylserine could mediate the fusion between cell membrane and outer acrosome membrane during acrosome reaction.

Keywords: sperm, phospholipids, plasma membrane, acrosome membrane, capacitation, acrosome reaction, flowcytometry, microscopy

Inhaltsverzeichnis

• 1. Einleitung
  • 1.1  Das Spermium und die Entwicklung seiner Befruchtungsfähigkeit
    • 1.1.1  Eberspermien
      • 1.1.1.1  Morphologie
      • 1.1.1.2 Reifung im männlichen und weiblichen Genitaltrakt
      • 1.1.1.3 Wechselwirkung mit der Eizelle
      • 1.1.1.4 Stoffwechselregulation und Motilität
      • 1.1.1.5 Kapazitation und Akrosomreaktion in vitro
    • 1.1.2 Forellenspermien
      • 1.1.2.1  Morphologie
      • 1.1.2.2 Reifung im männlichen Genitaltrakt und Aktivierung der Motilität
      • 1.1.2.3 Wechselwirkung mit der Eizelle
  • 1.2  Lipidorganisation in tierischen Membranen
    • 1.2.1  Transversale Asymmetrie der Phospholipide
      • 1.2.1.1  Charakterisierung der transversalen Phospholipidasymmetrie
      • 1.2.1.2 Bewegung von Phospholipiden über die Membran
      • 1.2.1.3 Physiologische Relevanz der transversalen Phospholipidasymmetrie
    • 1.2.2 Lateral inhomogene Verteilung von Membranlipiden
      • 1.2.2.1  Charakterisierung der lateralen Lipidverteilung
      • 1.2.2.2 Physiologische Relevanz lateralen Lipiddomänen
  • 1.3  Phospholipide in der Zell- und Akrosommembran von Spermienzellen
    • 1.3.1  Zusammensetzung und Organisation der Akrosommembranen
    • 1.3.2 Die Zellmembran von Spermienzellen
      • 1.3.2.1  Zusammensetzung
      • 1.3.2.2 Transversale Asymmetrie
      • 1.3.2.3 Laterale Ungleichverteilung
  • 1.4 Membranveränderungen während der Kapazitation und Akrosomreaktion
    • 1.4.1  Entfernung assoziierter Proteine von der Spermienoberfläche
    • 1.4.2 Entzug und Umverteilung von Cholesterol
    • 1.4.3 Permeabilität der Membran
    • 1.4.4 Phosphorylierung und Umverteilung von Membranproteinen
    • 1.4.5 Lipide – Umverteilung, laterale Diffusion, Packungsdichte, fusogene Lipide
    • 1.4.6 Akrosomreaktion
  • 1.5 Ziel der Arbeit
• 2. Material und Methoden
  • 2.1  Chemikalien
  • 2.2 Lösungen
  • 2.3 Eberspermien
    • 2.3.1  Kapazitation
    • 2.3.2 Akrosomreaktion
    • 2.3.3 Zona-pellucida-Bindungsassay
    • 2.3.4 Kavitation
    • 2.3.5 Markierungen
      • 2.3.5.1  Lebend-Tot-Färbung mit Propidiumjodid
      • 2.3.5.2 Färbung der Mitochondrien mit Rhodamin 123 (R123)
      • 2.3.5.3 Bindung von Lektinen an akrosomale Zuckerstrukturen
      • 2.3.5.4 AnnexinV-Bindung an endogenes Phosphatidylserin
      • 2.3.5.5 Einbau und Translokation von fluoreszenzmarkierten Phospholipidanaloga in die Zellmembran der Spermien
    • 2.3.6 Fluoreszenzspektroskopie
    • 2.3.7 Durchflusszytometrie
    • 2.3.8 Mikroskopie
      • 2.3.8.1  Fluoreszenzmikroskopie
      • 2.3.8.2 Elektronenmikroskopie
  • 2.4 Forellenspermien
    • 2.4.1  Isolation von Triton-unlöslichen Membranfraktionen
    • 2.4.2 Lipid- und Proteinanalysen
      • 2.4.2.1  Lipidextraktion
      • 2.4.2.2 Phosphatbestimmung
      • 2.4.2.3 Cholesterolbestimmung
      • 2.4.2.4 Proteinbestimmung
  • 2.5 Berechnungen und Statistik
• 3. Ergebnisse
  • 3.1  Vorbereitende Versuche zur Markierung von Eberspermien mit Fluoreszenzlabeln
    • 3.1.1  Lebend-Tot-Färbung mit Propidiumjodid
      • 3.1.1.1  Optimierung der PI-Färbung für kapazitierte Spermien
    • 3.1.2 Einbau NBD-markierter Phospholipide in die Plasmamembran
    • 3.1.3  Kombination verschiedener Fluoreszenzmarker
      • 3.1.3.1  Wechselwirkungen zwischen den Markern
      • 3.1.3.2 Farbkompensierung am Durchflusszytometer
  • 3.2  Die transversale Lokalisation der Phospholipide in der Plasmamembran von Eberspermien während der Genese - Durchflusszytometrische Analysen
    • 3.2.1  Transversale Organisation fluoreszenzmarkierter Phospholipidanaloga
      • 3.2.1.1  Einwärtstranslokation der NBD-Phospholipide
      • 3.2.1.2 Auswärtstranslokation der NBD-Phospholipide
    • 3.2.2 Exposition von endogenem PS: FITC-AnV/PI-Markierung von Eberspermien
      • 3.2.2.1  Veränderung der FITC-AnV/PI-Markierung im Verlauf der Inkubation
      • 3.2.2.2 Variabilität der FITC-AnV/PI–Markierung kapazitierter Eberspermien
      • 3.2.2.3 Einflussfaktoren auf die FITC-AnV/PI–Markierung kapazitierter Eberspermien
  • 3.3  Die transversale und laterale Lokalisation von PS in Eberspermien – mikroskopische Untersuchungen zur Zell- und Membranmorphologie
    • 3.3.1  Transversale Organisation von NBD-PS in kapazitierten Eberspermien
    • 3.3.2 Lokalisation von endogenem PS in lebenden Eberspermien
    • 3.3.3 Lokalisation von endogenem PS in motilen Eberspermien
    • 3.3.4 Lokalisation von endogenem PS an morphologisch intakte und defekte Eberspermien - Lektinbindung an akrosomale Strukturen
    • 3.3.5 Feinstruktur der Zell- und Akrosommembran - Elektronenmikroskopie
    • 3.3.6 Zona-pellucida-Bindungsassay
  • 3.4  Untersuchungen zu lateralen Lipiddomänen in Spermienzellen - Präparation Triton-unlöslicher Membranfraktionen
    • 3.4.1  Charakterisierung der Lysate
    • 3.4.2 Charakterisierung der Membranbanden nach Ultrazentrifugation
• 4. Diskussion
• Abkürzungen
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Publikationen
• Poster und Vorträge
• Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Zusammensetzung ausgewählter Spermienmembranen: relativer Protein- und Lipidgehalt sowie prozentualer Anteil der Phospholipidklassen (bezogen auf Gesamt-PL-Gehalt) in isolierten Membranen (äußere Akrosommembran – äAM, Plasmamembran die den Bereich der Kopfkappe überdeckt - Kopf-PM).
• Tab. 2: Vergleich der Zusammensetzung der Plasmamembran verschiedener tierischer Zellen.
• Tab. 3: Zusammensetzung der eingesetzten Lösungen: BTS - modifizierte Beltsville-Thawing-Lösung, TALP – modifiziertes Tyrodemedium, HBT – Hank’s gepuffertes Tyrodemedium; BP – Bindungspuffer; alle in Aqua bidest; pH 7,4; 300mOsmol.
• Tab. 4: Übersicht über die verwendeten Marker und Label: Molekulargewicht (MW) in Dalton (d), Absorbtionsmaxima (λ_abs), Emmisionsmaxima (λ_em), Extinxtionskoeffizient (ε); Desoxyribonukleinsäure (DNS), Plasmamembran (PM), äußere Akrosommembran (äAM).
• Tab. 5: PI-Färbung von Eberspermien: Überblick über die zur Lebend-Tot-Färbung von Eberspermien getesteten PI-Konzentrationen. Die Zellzahl pro Färbungsansatz betrug ca. 1*106 Zellen.
• Tab. 6: Entwicklung der AnV/PI–Markierung von Eberspermien im Zeitverlauf der In-vitro-Kapazitation und Akrosomreaktion: Ausgewertet wurden 12 unabhängige Einzelversuche, deren durchflusszytometrische Ergebnisse als Mittelwert und Standardabweichung der prozentualen Anteile der jeweiligen Zellenkategorie angegeben sind. Der gepaarte t-Test der Ausgangsdaten ergab zwischen den gekennzeichneten Gruppen signifikante Unterschiede (Pa/b<0,0005; Pc/d<0,005; Pe/f<0,05).
• Tab. 7: Einfluss einer Percollaufbereitung der Spermien auf den Anteil AnV- und PI-markierter Zellen nach Kapazitation: Die Inkubation der Spermien erfolgte für 45 min im WB. Angegeben sind die prozentualen Anteile markierter Zellen nach Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen zweier gepaarter Versuche.
• Tab. 8: Einfluss von BSA und CO₂ auf die FITC-AnV/PI Markierung kapazitierter Spermien: Angegeben sind die prozentualen Anteile markierter Zellen nach Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen bzw. die Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 gepaarten Versuchen.
• Tab. 9: Einfluss von Heparin auf die FITC-AnV/PI-Markierung kapazitierter Spermien: Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen der prozentualen Anteile markierter Zellen nach Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen von 6 gepaarten Versuchen. Der gepaarte t-Test ergab bezüglich des Anteils PI-gefärbter Zellen einen signifikanten Unterschied (Pa/b=0,02) zwischen den beiden Versuchsvarianten.
• Tab. 10: Einfluss der Inkubationszeit auf den Anteil AnV- und PI-markierter Spermien nach Kapazitation: Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen der prozentualen Anteile markierter Zellen nach Auswertung der durchflusszytometrischen Messungen. Der t-Test ergab bezüglich der AnV-Markierung signifikante Unterschiede (Pa/b=0,06; Pc/d=0,03) zwischen den beiden Versuchsvarianten.
• Tab. 11: AnV/PNA-Markierung kavitierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.
• Tab. 12: AnV/PNA-Markierung kapazitierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.
• Tab. 13: AnV/PNA-Markierung kapazitierter und anschließend kavitierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.
• Tab. 14: AnV/PNA-Markierung akrosomreagierter Eberspermien: Ausgewiesen sind die prozentualen Anteile (i) der den einzelnen Kategorien (siehe Abb.18) zugeordneten Spermien, (ii) aller AnV-bindenden Zellen (∑AnV=B+D+F) sowie (iii) der Spermien mit AnV-Bindung an der Becherhülse (unabhängig von deren Zellmorphologie). In drei unabhängigen Versuchen wurden je 200 Zellen ausgewertet. Die untere Zeile gibt die aus den Einzelversuchen resultierenden Mittelwerte und Standardabweichungen an.
• Tab. 15: Lipid- und Proteingehalt von Forellenspermien: Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen von n unabhängigen Einzelbestimmungen (CHO, PL: n=10; Protein: n=6).
• Tab. 16: Effektivität der Tritonlyse von Forellenspermien: Die Lyse der Spermien erfolgte in 1%igem Triton. Angegeben ist der prozentuale Anteil der Lipide im Überstand nach Abtrennung schwerer Zelltrümmer bezogen auf die eingesetzte Gesamtlipidmenge des Lysates (Wiederfindungsrate).
• Tab. 17: Lipidbestimmungen an Forellenspermien: Einfluss der Triton- und Saccharosekonzentration suspendierter Forellenspermien (1x109 Zellen/ml) auf die CHO- und PL-Bestimmungen.

Bilder

• Abb. 1: Schematische Darstellung eines Säugerspermiums: Angepasst nach Rüsse and Sinowatz (1998).
• Abb. 2: Schematische Darstellung eines Forellenspermiums nach Billard (1983).
• Abb. 3: Phospholipidorganisation in der Zell- und Akrosommembran von Säugerspermien: Während die Plasmamembran (PM) in Analogie zu anderen Säugerzellen eine charakteristische transversale Asymmetrie und wahrscheinlich eine lateral inhomogene Verteilung der Phospholipide aufweist, gibt es über die Lipidorganisation der inneren und äußeren den Akrosommembran (iAM/äAM) bisher kaum Erkenntnisse.
• Abb. 4: Strukturformeln verwendeter Fluoreszenzmarker: nach Molecular Probes bzw. Avanti Polar Lipids.
• Abb. 5: Raftpräparation aus Spermienzellen: Isolierung von in Triton unlöslichen Membranfraktionen, die sich durch eine geringere Dichte auszeichnen und somit im Dichtegradienten aufsteigen. Kursiv geschriebene Angaben wurden variiert und sind im Ergebnisteil angegeben.
• Abb. 6: Durchflusszytometrische Erfassung von kapazitierten Eberspermien nach Markierung mit PI und R123. Das Histogramm zeigt das Ergebnisse der Einzelfärbungen mit PI, das 2-Parameter-Diagramm die Auswertung der Doppelfärbung (1µl R123 20min bei RT inkubiert und ausgewaschen, 2,5µl PI in Küvette 5min vor Messung).
• Abb. 7: PI-Färbung von kapazitierten Eberspermien: Aufspaltung der vom Durchflusszytometer aufgezeichneten Fluoreszenzpeaks in Abhängigkeit von der eingesetzten PI-Konzentration. Die Markierung der Spermien erfolgte direkt in der Messküvette für 5min bei 38,5°C. Die jeweilige PI-Konzentration und molare PI-Menge pro Zelle ist in Tabelle 1 angegeben.
• Abb. 8: PI-Färbung von kapazitierten Eberspermien: Einfluss der Inkubationsbedingungen (Konzentration und Temperatur) während der PI-Färbung kapazitierter Eberspermien auf den Anteil (PI++)-gefärbter Zellen und auf die Fluoreszenzintensität des (PI++)-Peaks. Die PI-Konzentration und molare PI-Menge pro Zelle sind in Tabelle 1 angegeben. Die Spermien wurden jeweils 5min mit PI inkubiert und anschließend zügig am Durchflusszytometer gemessen. Die mit einem Pfeil markierten Säulen kennzeichnen die Versuchsbedingungen, bei denen eine deutliche Trennung der PI-Peaks erreicht wurde, ohne das der Anteil (PI++)-gefärbter Zellen massiv anstieg.
• Abb. 9: Zeitabhängigkeit der PI-Färbung kapazitierter Eberspermien: Die Markierung der Spermien erfolgte im Eppendorfgefäß bei 38,5°C. Angegeben sind Mittelwert und Standardabweichung von 3 Spermienproben, die an einem Tag untersucht wurden (▼ 0,5 µl PI; ∆ 1,0 µl PI; ● 2,5 µl PI).
• Abb. 10: Kinetiken des Einbaus von NBD-PS in die Zellmembran von Eberspermien: Bei gleichbleibender Spermienkonzentration (~5*106 Zellen/ml) wurde die Konzentration des NBD-Labels variiert (a) 0,12 µM, (b) 0,24 µM, (c) 0,36 µM, (d) 0,48 µM und dessen Einbau verfolgt. Die letzten 120 sec zeigt die Fluoreszenzintensität nach Zugabe von Triton (1%).
• Abb. 11: Einbau NBD-markierter PL in die Membran von Eberspermien: In TALP gewaschene Spermien wurden vor (a, c) und nach (b, d) Kapazitation der Zellen mit NBD-PL markiert. Im Laufe der Markierung wurde je ein Aliquot der Spermiensuspension entnommen in der Messküvette für 2 min mit 2,5 µl PI gefärbt und am Durchflusszytometer gemessen. Gefüllte Symbole kennzeichnen (PI++)-Zellen, offene Symbole hingegen (PI-)-Zellen (▲∆ NBD-PS, ●○ NBD-PC).
• Abb. 12: Vergleich von Einzel- und Doppelmarkierung von Eberspermien mit FITC-AnV (○) und PI (●). Im linken Diagramm sind die arithmetischen Mittelwerte der Fluoreszenzpeaks (FITC bzw. PI) markierter Spermien aufgetragen, im rechten Diagramm dagegen der prozentuale Anteil der jeweils fluoreszenzmarkierten Zellen. Die Regressionsgeraden sollen die Tendenzen verdeutlichen. Für jeden Messpunkt wurde zunächst ein Aliquot der nur FITC-AnV markierten Spermien bzw. eines der nur PI-gefärbter Zellen vermessen. Im Anschluss wurde ein Aliquot der FITC-AnV markierten Spermien mit PI komarkiert und vermessen. Die PI-Färbung erfolgte für 5min in der Messküvette mit 2,5µl PI (1,88µM).
• Abb. 13: Spektren von mit FITC-AnV und PI markierten Spermien: Die Zellen wurden wie in Material und Methoden beschrieben markiert und je 25µl der markierten Spermiensuspension in 2ml Puffer im Fluoreszenzspektrometer gemessen. Spaltbreite FITC-Fluoreszenz (oben): 5/10, PI-Fluoreszenz (unten): 10/20 PI (— —), FITC-AnV/PI (——), FITC-AnV (—٠٠—).
• Abb. 14: Auswertung durchflusszytometrischer Messungen zur Translokation von NBD-PL: In TALP gewaschene Eberspermien wurden für 5 min mit NBD-PS und PI (1,8 µM) markiert und ein Aliquot in 2 ml TALP am Durchflusszytometer analysiert (obere Abb.). Direkt in die Messküvette wurde im Anschluss an die erste Messung 10 mM Dithionit gegeben und die Probe nach 1 min noch einmal gemessen (untere Abb.). Im 2-Parameter-Plot der Fluoreszenzen wurden die Populationen lebender (∗) und toter (†) Zellen festgelegt. Im Histogramm der NBD-Fluoreszenz wird die Verschiebung des Intensitätspeaks (angegeben ist der arithmetische Mittelwert) intakter Spermien deutlich sichtbar. Die Markierung und Messung erfolgte bei Raumtemperatur.
• Abb. 15: Kinetik der Translokation NBD-markierter PL in der Zellmembran von Eberspermien. Dargestellt sind Mittelwerte (NBD-PS: n=5, ●○; NBD-PC: n=3, ■□) und Standardabweichung. Die Translokationsdaten für NBD-PS wurden an eine monoexponentielle Funktion angepasst. Geschlossene Symbole kennzeichnen die Werte für frisch gewaschene Spermien, offene Symbole hingegen Werte für kapazitierte Zellen.
• Abb. 16: Zusammenhang zwischen der Gleichgewichsverteilung des NBD-PS in der PM und dem Anteil lebender Zellen in den untersuchten Spermienproben: Dargestellt sind die Ergebnisse von 10 unabhängigen Einzelversuchen (● frische, ○ kapazitierte Eberspermien). In Proben, in denen viele tote (PI++) Zellen enthalten sind, wird auch in den lebenden (PI-) Spermien NBD-PS in geringerem Ausmaß auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran akkumuliert.
• Abb. 17: Auswärtsbewegung NBD-markierter PL in der Zellmembran von Eberspermien. Dargestellt sind je 2 unabhängige Versuche. Geschlossene Symbole kennzeichnen die Werte für frisch gewaschene, bei RT inkubierte Spermien, offene Symbole hingegen Werte für kapazitierte Spermien.
• Abb. 18: Markierung von Eberspermien im Verlauf der In-vitro-Inkubation der Zellen: Dargestellt sind das veränderte AnV-Bindungsverhalten, die zunehmende Destabilität der Plasmamembran (PI-Färbung) sowie die Akrosomreaktion – gekennzeichnet durch eine PSA-Bindung an Komponenten des akrosomalen Inhalts. Die Eberspermien wurden entsprechend des Protokolls „Kapazitation IFN“ 45 min kapazitiert. Anschließend wurde die Akrosomreaktion durch Zugabe eines Kalziumionophors ausgelöst. Die Markierung erfolgte entsprechend der Angaben im Methodikteil. Im linken Diagramm sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der prozentualen Anteile markierter Zellen von 12 unabhängigen Versuchen dargestellt. Das rechte Diagramm verdeutlicht hingegen am Beispiel einer Spermienprobe mit sehr stabiler Lebensfähigkeit die Auslösbarkeit der Akrosomreaktion in lebenden, kapazitierten (*) Spermien durch Ionophorzugabe. Der Anteil AnV-bindender Zellen war in dieser Probe über den gesamten Inkubationszeitraum sehr niedrig.
• Abb. 19: AnV-Markierung und PI-Färbung kapazitierter Eberspermien: Die Inkubation der Spermien erfolgte entweder für 45 min bei 38,5°C im Wärmeblock (●) oder für 2 h im Zellkulturschrank bei 38,5°C (○), die nachfolgende Markierung für 5 min bei 38,5°C im Dunkeln (1 µg/ml FITC-AnV, 1,9-6 µM PI).
• Abb. 20: Variabilität der AnV / PI – Markierung verschiedener Spermienproben nach Kapazitation: Dargestellt sind die 2-Parameter-Diagramme der FITC und der PI Fluoreszenz durchflusszytometrisch untersuchter Eberspermien. Die Inkubation der Zellen erfolgte nach dem Protokoll „Kapazitation IFN“, die nachfolgende Markierung für 5min bei 38,5°C im Dunkeln (1µg/ml FITC-AnV, 3µM PI).
• Abb. 21: Mit NBD-PS markierte Eberspermien nach kapazitativer Inkubation: Die Zellen wurden mit NBD-PS markiert (siehe Material und Methoden) und für 45 min bei 38,5°C in BSA-haltigem TALP kapazitiert. Unmittelbar vor Entnahme der Probe zur Mikroskopie wurde die NBD-Fluoreszenz zugänglicher Label mit Dithionit gelöscht. Die linke Bildhälfte zeigt jeweils das Phaseninterferenzbild zur morphologischen Differenzierung der Zellen, die rechte hingegen das NBD-Fluoreszenzbild der untersuchten Spermien.
• Abb. 22: FITC-AnV/PI-Markierung kapazitierter Eberspermien: Die dargestellten Mikroskopiebilder wurden bei 38,5°C aufgenommen. Die linke Bildhälfte zeigt jeweils das Phaseninterferenzbild zur morphologischen Differenzierung der Zellen, die rechte hingegen die Überlagerung von FITC- und PI- Fluoreszenzen der untersuchten Spermien. (a) Typische Zellagglutinate, in denen die Spermien zum überwiegenden Teil unmarkiert sind. (b) Bei einem Teil der PI-gefärbten Zellen, die morphologisch intakt erscheinen, bindet FITC-AnV im Bereich der Kopfkappe. (c) An Eberspermien im Schwanzbereich assoziierte Zytoplasmatropfen zeigen nur dann eine AnV-Bindung, wenn die Zelle PI aufnimmt. Bei einem vorzeitig akrosomreagierten Spermium lösen sich Membranvesikel vom apikalen Bereich der Kopfkappe. Diese binden teilweise FITC-AnV, ebenso die Becherhülse.
• Abb. 23: FITC-AnV/PI-Markierung Akrosomreagierter Eberspermien: Das dargestellte Mikroskopiebild wurde bei 38,5°C aufgenommen. Die linke Bildhälfte zeigt das Phaseninterferenzbild zur morphologischen Differenzierung, die rechte hingegen die Überlagerung von FITC- und PI- Fluoreszenzen. Während an den Spermien keine spezifische AnV-Bindung zu erkennen ist, zeigen abgelöste vesikuläre Membranstrukturen eine FITC-Markierung.
• Abb. 24: Bindungsmuster von FITC-AnV und Alexa-PNA an Eberspermien: Es wurden die Kategorien A-G unterschieden. Alle mikroskopisch untersuchten Spermien wurden entsprechend ihrer Morphologie im Phasenkontrast und ihren Bindungseigenschaften für FITC-AnV und Alexa-PNA eingeteilt. Dabei wurden nur die Merkmale der Kopfkappe, nicht aber teilweise vorhandene Markierungen der Becherhülse und/oder des Schwanzes berücksichtigt.
• Abb. 25: Charakteristische Bindungsmuster von FITC-AnV und Alexa-PNA an Eberspermien: Die Einteilung der Kategorien A-G erfolgte entsprechend der Abb. 24 und den Erläuterungen im Text. Die linke Bildhälfte zeigt jeweils das Phaseninterferenzbild, die rechte hingegen die Überlagerung von FITC-AnV und Alexa-PNA Fluoreszenzen. Unter den Abbildungen ist die prozentuale Häufigkeit jeder Kategorie angebeben.
• Abb. 26: Elektronenmikroskopische Aufnahme kavitierter Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. (a) Übersichtsbild zeigt ein Spermium mit fest assoziiertem Akrosom und mehrere mit expandierter äußerer Akrosommembran (äAM), die Plasmamembran (PM) ist jeweils vollständig abgelöst; (b) an der Becherhülse assoziierte PM und sich einrollende äußere Akrosommembran; (c) Spermium mit wellenförmig expandierter äußerer Akrosommembran und Reststruktur der abgelösten PM.
• Abb. 27: AnV-Bindung an kavitierten Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. Die Pfeile kennzeichnen goldmarkierte Antiköper gegen Biotin-AnV (a) an der äußeren Akrosommembran, (b) an abgelösten Membranvesikeln. Das Spermium mit intakter Plasmamembran (b) zeigt hingegen keine Goldmarkierung.
• Abb. 28: Elektronenmikroskopische Aufnahme kapazitierter Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. Abgebildet sind charakteristische Aufnahmen kapazitierter Eberspermien: (a) Spermium mit intakter, teilweise expandierter Plasmamembran; (b) Ausschnittsvergrößerung von a), Pfeile markieren Bereiche, in denen Plasmamembran und äußere Akrosommembran eng miteinander assoziiert sind; (c) Plasmamembran ist eng mit der äußeren Akrosommembran assoziiert und weist in Abständen Löcher auf (Pfeile); (d) akrosomintaktes Spermium mit vom Kopf abgelöster Plasmamembran, Pfeile markieren Beginn der Becherhülse; (e, f) vorzeitig akrosomreagierte Spermien mit Vesikulation von Kopf und/oder äußerer Akrosommembran, Pfeile markieren Beginn der Becherhülse.
• Abb. 29: AnV-Bindung an kapazitierten Eberspermien: Die Länge der eingezeichneten Balken entspricht 500 nm. Die Pfeile kennzeichnen goldmarkierte Antiköper an (a) Störstellen der Plasmamembran, (b) wellenförmigen Membranausstülpungen, (c) abgelösten Membranfetzen.
• Abb. 30: Zona-pellucida-Bindungsassay: Zuvor kapazitierte und mit FITC-AnV markierte Eberspermien wurden mit isolierten Zonae für 15 min zusammen inkubiert. Im Anschluss wurden nicht gebundene Spermien durch vorsichtiges Aufsaugen der Zonae in eine mit vorgewärmten TALP gefüllte Kapillare abgetrennt, die Zonae in einen Tropfen frisches, vorgewärmtes TALP überführt und fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Abgebildet sind links die Phaseninterferenzbilder und rechts die Fluoreszenzbilder des FITC-AnV (grün) einer Zona in zwei Bildebenen (Aufsicht, Querschnitt).
• Abb. 31: Zona-pellucida-Bindungsassay: Zuvor kapazitierte und mit FITC-AnV und Alexa-PNA markierte Eberspermien wurden mit isolierten Zonae für 15 min zusammen inkubiert. Im Anschluss wurden nicht gebundene Spermien durch vorsichtiges Aufsaugen der Zonae in eine mit vorgewärmten TALP gefüllte Kapillare abgetrennt, die Zonae in einen Tropfen frisches, vorgewärmtes TALP überführt und fluoreszenzmikroskopisch untersucht. Abgebildet ist die Überlagerung von Phaseninterferenzbild und den beiden Fluoreszenzbildern des FITC-AnV (grün) und Alexa-PNA (rot).
• Abb. 32: Auftrennung der lysierten Membranfraktionen über eine Gradientenzentrifugation: Angegeben sind die Variationen der einzelnen Versuchsansätze (mit Ausnahme von M und P jeweils Doppelbestimmungen): Schichtung des Gradienten // eingesetzte Spermienkonzentration // Tritonkonzentration bei der Lyse // Dauer der Ultrazentrifugation (UZ) und die Bandenauftrennungen aller durchgeführter Versuche.
• Abb. 33: Isolierung einer Membranbande geringer Dichte mit signifikant erhöhtem CHO/PL-Verhältnis. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen von 4 Versuchsansätzen. Lyse von 109 Zellen/ml in 1%igem Triton und anschließende Ultrazentrifugation (Präparationen I, K, N,O).
• Abb. 34: Schematische Zusammenfassung möglicher Membraninteraktionen während der Genese von Eberspermien: (a) In frisch gewaschenen, lebenden Eberspermien ist PS auf der zytoplasmatischen Seite von Plasmamembran (PM) und äußerer Akrosommembran (äAM) akkumuliert, während spezifische Lektinbindungsorte lediglich auf der zytoplasmatischen Seite der äAM lokalisiert sind. (b, e) Während der Inkubation der Spermien kommt es zunehmend zum Absterben der Zellen, die Integrität der PM wird gestört. Teilweise kommt es zur Ablösung der PM, die sich eventuell später zu vesikulären Strukturen zusammenlagert. (c) Kapazitationsbedingt kommt es örtlich zu einer dichten Zusammenlagerung von PM und äAM. Dies erfolgt wahrscheinlich kalziumvermittelt über ein Bindeglied. Bei diesem postulierten Bindeglied könnte es sich um endogene Annexine, SNARE-Proteine, Zytoskelett-Elemente u.a. handeln. In den elektronenmikroskopischen Bildern kapazitierter Spermien erscheinen teilweise Löcher in der PM. Solche Fehlstellen können präparationsbedingt entstehen, stellen aber mit Sicherheit laterale PM-Domänen dar, die besonders fragil sind. (d, i) Ein Ablösen der PM führt zur Exposition der äAM, auf deren zytoplasmatischer Seite einerseits PS akkumuliert ist, andererseits PNA an spezifische Zuckerstrukturen bindet. Teilweise kommt es auch zur Vesikulation der äAM. (f-g) Mischvesikel, deren Bildung nach Fusion von PM und äAM entstehen könnten.