1. Einleitung

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Das Spermium ist eine hoch spezialisierte Zelle, die der Fortpflanzung dient. Um letztlich die Verschmelzung des genetischen Materials von Spermium und Eizelle zu ermöglichen, muss in der intakten Spermienzelle eine zeitlich und räumlich koordinierte Zellaktivierung stattfinden. Das Spermium muss (1) rechtzeitig zum Ort der Befruchtung gelangen, (2) aktiv die Eizellhüllen durchdringen und schließlich (3) mit der Plasmamembran der reifen Eizelle fusionieren. Ein befruchtungsfähiges Spermium sollte demnach eine stabile Motilität und eine auf die Befruchtung vorbereitete, fusogene Zell- und Akrosommembran aufweisen.

Die Organisation der Phospholipide in der Plasmamembran tierischer Zellen und deren Bedeutung für Homöostasis, Signaltransduktion und Fusion sind seit vielen Jahren Thema intensiver Forschungen und wurde auch an Spermien untersucht. Man geht heute von einer transversalen und lateralen Ungleichverteilung der Phospholipide in der Zellmembran von Spermien aus.

Die vorliegende Arbeiten beschäftigt sich mit Untersuchungen zur transversalen und lateralen Organisation und Dynamik der Phospholipide in der Zell- und Akrosommembran von Spermien während der Genese. Es soll geklärt werden, ob Änderungen der Phospholipidorganisation in diesen Membranen vorkommen, und inwieweit dies eine Voraussetzung für eine Akrosomreaktion, Wechselwirkungen zwischen den Spermien untereinander und die Zell-Zell-Erkennung an den Eizellhüllen ist.

1.1  Das Spermium und die Entwicklung seiner Befruchtungsfähigkeit

1.1.1  Eberspermien

1.1.1.1  Morphologie

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Die morphologische Differenzierung von Säugerspermien erfolgt generell in Kopf und Schwanz (Abb. 1). Der Kopf eines Eberspermiums ist ca. 8 µm lang, 4 µm breit und 0,8 µm dick, die Schwanzlänge beträgt ca. 40 µm mit einem Durchmesser von 0,8 (Mittelstück) - 0,1 µm (Endstück).

Der Kopf enthält vor allem den dicht gepackten Zellkern mit einem haploiden Chromosomensatz. Man unterscheidet einen akrosomalen und einen postakrosomalen Kopfabschnitt. Der akrosomale Abschnitt wird durch eine den Zellkern bedeckende Kopfkappe (das Akrosom) gekennzeichnet, die bei intakten Spermien eine apikale Randverdickung (NAR) aufweist. Das Akrosom entsteht während der Differenzierung aus dem Golgi-Apparat der Spermatiden und enthält, umgeben von den Akrosommembranen, mehrere hydrolytische Enzyme in saurem Milieu. Den dem Zellkern zugewandten Abschnitt bezeichnet man als innere Akrosommembran (iAM), den der Plasmamembran (PM) zugewandten Abschnitt hingegen als äußere Akrosommembran (äAM). Im Äquatorialbereich, am unteren Rand des Akrosoms, gehen die beiden Membranen ineinander über. Den hinteren Teil des Spermienkopfes, auch postakrosomaler Bereich genannt, bildet die Becherhülse. In diesem Bereich wird der Zellkern von Säugerspermien von einer zytoskeletalen Struktur umrandet, die unmittelbar der PM anliegt.

Abb. 1: Schematische Darstellung eines Säugerspermiums: Angepasst nach Rüsse and Sinowatz (1998).

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Der bewegliche Schwanz des Spermiums ist eine lange Geißel. Er kann in vier Regionen unterteilt werden: (i) den Hals, der die Verbindung zum Kopf bildet und die Zentriolen enthält, (ii) das Mittelstück, gekennzeichnet durch eine Mitochondrienscheide, (iii) das Haupt- und (iv) das Endstück. Den zentralen Teil der gesamten Geißel bildet das Axonem. Es stellt den eigentlichen Bewegungsapparat des Spermiums dar. Zusätzlich zum üblichen 9+2-Mikrotubuli-Aufbau wird das Axonem von neun weiteren dichten Fasern, die hauptsächlich aus Keratin bestehen, umgeben. Die Plasmamembran umgibt die gesamte Spermienzelle als Grenze zum umgebenden Milieu.

1.1.1.2 Reifung im männlichen und weiblichen Genitaltrakt

Die männlichen Keimzellen entwickeln sich unter hormoneller Steuerung zunächst im Hoden und erfahren während der Nebenhodenpassage einen intensiven Reifungsprozess Dacheux, et al. (1991). Als sichtbares Zeichen der Reifung gilt der Erwerb der gerichteten Fortbewegung und der Verlust des Zytoplasmatropfens, der vom oberen Spermienschwanz abgestreift wird. Ausgereifte Spermien werden im Nebenhoden bis zur Ejakulation gespeichert und sind prinzipiell in der Lage (i) im männlichen und weiblichen Genitaltrakt zu überleben sowie nach entsprechender Stimulation (ii) die sekundäre Reifung (Kapazitation) zu durchlaufen und (iii) eine reife Eizelle zu befruchten.

Ein Ejakulat setzt sich in der Hauptsache aus Absonderungen des Nebenhodens und verschiedener Geschlechtsdrüsen (Seminalplasma) zusammen und enthält außer den reifen Spermien weitere feste Bestandteile, wie z.B. unreife Samenzellen, Epithelzellen und Leukozyten Schülke (1982). Das Seminalplasma als flüssiger Bestandteil des Ejakulats enthält neben Ionen und Energiesubstraten, die für Homöostasis und Stoffwechsel der Spermien bedeutsam sind, Hormone, Lipide und Proteine. Diese assoziieren z.T. fest an der Spermienoberfläche und bewirken eine allgemeine Stabilisierung der Zelle, schützen die Zellmembran vor Komponenten des weiblichen Genitaltraktes (z.B. Proteasen) und bewirken dort eine Immunsuppression.

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Ejakulierte Spermien sind morphologisch völlig ausgereift, jedoch noch nicht sofort in der Lage, eine Eizelle zu befruchten. Erst das Passieren des weiblichen Genitaltraktes versetzt in vivo einen Teil der Spermien in den physiologischen Status eines befruchtungsfähigen Gameten. Durch diesen nachgeschalteten zweiten Reifungsprozess (Kapazitation) kann die Spermienfunktion mit der Ovulation der Eizelle koordiniert werden. Die Passage des weiblichen Genitaltraktes stellt für die überwiegende Mehrzahl aller ejakulierten Spermien ein unüberwindbares Hindernis dar. Sie müssen mechanische Barrieren (Falten, Zilien), physikochemische Barrieren (Zervixschleim) und immunologische Abwehrvorgänge überwinden. Von ca. 1010 Spermien eines Ejakulats erreichen ca. 104 Zellen den Ort der Speicherung intakter Spermien (Isthmus – der Gebärmutter zugewandte Teil des Eileiters) und ca. 102 Zellen den Ort der Befruchtung (Eileiterampulle) Töpfer-Petersen and Waberski (2001). Der Isthmus bildet somit einerseits ein Spermienreservoir, andererseits finden dort die wesentlichen Schritte der sekundären Reifung statt. Die notwendigen Veränderungen der Spermien nach Ejakulation wurden erstmals 1951 von Austin und Chang Austin (1951) beschrieben und werden nach Austin Austin (1952) als Kapazitation bezeichnet. Bis heute sind die zugrundeliegenden molekularen Prozesse der Kapazitation noch immer weitgehend unverstanden. Ein deutlich sichtbarer Effekt der Kapazitation ist die Änderung der Bewegungsform (Hyperflagellation) der Spermien. Zahlreiche molekulare Kapazitationseffekte wurden beschrieben, sie betreffen: (i) den Stoffwechsel, z.B. den Anstieg der Respirationsrate; (ii) die intrazellulären Ionenkonzentrationen, z.B. den Anstieg der Kalziumkonzentration und vor allem (iii) zahlreiche Veränderungen der Zellmembran, wie z.B. Fluidität oder Permeabilität. Die kapazitationsbedingten Veränderungen der Zellmembran werden in einem extra Kapitel (1.4, S.24ff) beschrieben.

Die Motilität und Befruchtungsfähigkeit der an die Epithelien des Eileiters gebundenen Spermien bleibt für einige Stunden bis Tage erhalten. Es wird diskutiert, dass die Energieversorgung und Motilität der Spermien über ihre enge Wechselwirkung mit den Epithelzellen reguliert wird. Eventuell kann somit eine frühzeitige Kapazitation unterdrückt werden Pollard, et al. (1991). Es ist bisher noch nicht klar, ob die Kapazitation der Säugerspermien vor, während oder nach der Eileiterbindung stattfindet. Eine zeitlich und räumlich abgestimmte Befruchtung könnte sowohl durch eine stochastische als auch durch eine induzierte Kapazitation erklärt werden. Einerseits könnte immer eine begrenzte Spermienzahl an den Befruchtungsort entlassen werden, andererseits berichten Hunter et al. von einer induzierten Ablösung vollständig kapazitierter Spermien durch Follikelflüssigkeit (Progesteron) nach Ovulation der Eizelle Hunter (1987). Die Dauer der In-vivo-Kapazitation variiert in Abhängigkeit vom Intervall zwischen Besamung und Ovulation und beträgt i.d.R. einige Stunden.

1.1.1.3 Wechselwirkung mit der Eizelle

Kapazitierte Spermien sind relativ instabil und kurzlebig, so dass der Transport zur Eizelle und die folgende Befruchtung sehr schnell erfolgen müssen Yanagimachi (1994). Der Eileiter transportiert die Spermienzellen und die Eizelle nahezu gleichzeitig aufeinander zu. Die Geschwindigkeit des Spermientransportes hängt neben der Eigenbewegung der Spermien von der Peristaltik des Eileiters, Flüssigkeitsströmen und Zilienaktivität ab. Durch verschiedene Barrieren wird die Spermienzahl nochmals stark reduziert, so dass Polyspermie in vivo weitestgehend verhindert wird. Der erste Kontakt der Spermien mit der Eizelle findet an den Eizellhüllen (Kumulus, Zona pellucida) statt. Hier erfolgt die artspezifische Erkennung und primäre Bindung der Spermien an die Eizelle, beim Schwein wahrscheinlich an ZPC (ZP3) - ein Zona-pellucida-Protein. Spermadhesine sind spezifische Proteine des Seminalplasmas, die auf der Spermienoberfläche, an Heparin aber auch an die Zona pellucida binden. Sie könnten somit die Wechselwirkung zwischen Spermien und Zona pellucida vermitteln. Glykoproteine der Zona pellucida können des weiteren die Akrosomreaktion in kapazitierten Spermien auslösen Bleil and Wassarman (1983);Töpfer-Petersen (1989); Benoff (1997);Hunter (2003). An zahlreichen Punkten kommt es zum Verschmelzen von äußerer Akrosommembran und der ihr überlagerten Plasmamembran. Dieser exozytotische Prozess führt zur Freigabe proteolytischer Enzyme des Akrosoms (z.B. Akrosin und Hyaluronidase) an die Spermienoberfläche, welche die Zona pellucida chemisch zersetzen. Dem hyperflagellierenden Spermium wird somit der Durchtritt zur reifen Eizelle ermöglicht Kopf and Wilde (1990). Die Fusion mit der Zellmembran der Eizelle beginnt am Äquatorialsegment von akrosomreagierten Spermien Bedford (1969).

1.1.1.4 Stoffwechselregulation und Motilität

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Eine zentrale Rolle bei der Regulation von Säugerspermien wird, analog zu anderen Zellen, zyklischen Nukleotiden zugeschrieben Hoskins and Casillas (1975). Sie beeinflussen vor allem in Verbindung mit Kalziumionen entscheidend den Stoffwechsel. Die Hauptkomponenten des Enzymsystems (Adenylatzyklase, Phosphodiesterase) zur Regulation der Konzentration von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) sowie cAMP-abhängige (PKA) und cAMP-unabhängige (PKC) Proteinkinasen und Proteinphosphatasen, die in Form einer Reaktionskaskade schließlich zur Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung von Stoffwechselenzymen führen und diese in ihrer Aktivität beeinflussen, sind in Säugerspermien vorhanden.

Die Beteiligung zyklischer Nukleotide (cAMP, cGMP – zyklisches Guanosinmonophosphat) wird sowohl für die Regulation der Spermienmotilität als auch für die Signaltransduktion während der Kapazitation und Akrosomreaktion von Säugerspermien beschrieben. So konnte z.B. an Bullenspermien ein Kalziumeinstrom über zyklische Nukleotid-gesteuerte Kanäle nachgewiesen werden Wiesner, et al. (1998). Wahrscheinlich dienen sie der rhythmischen Steuerung des Geiselschlages. Eine Chemotaxis, wie sie für Seeigelspermien (Ca2+-, cGMP-abhängig) schon länger beschrieben wurde, konnte unlängst für Säugerspermien nachgewiesen werden Garbers (1989); Spehr, et al. (2003). Dabei kommt es durch Bindung eines Lockstoffes an ein Geruchsrezeptormolekül kalziumabhängig zur Aktivierung einer Adenylatzyklase. Über die Struktur und Lokalisation der Adenylatzyklase (im Zytoplasma gelöst und/oder membrangebunden) in Säugerspermien gibt es bis heute keine eindeutigen Erkenntnisse. Im Gegensatz zu anderen Zellen, erfolgt die Aktivierung der Adenylatzyklase in Spermien, scheinbar nicht über Hormone. Als gesichert gilt, dass eine Stimulierung der Adenylatzyklase während der Kapazitation von Eberspermien direkt durch Bikarbonat (HCO3 -) erfolgt Okamura, et al. (1985). Einige Autoren berichten auch über eine direkte Beeinflussung der Adenylatzyklase durch Kalzium und Calmodulin Gross, et al. (1987). Übliche Hemmstoffe für G-Proteine (Regulation der Adenylatzyklase durch Dissoziation der Untereinheiten) bewirkten in Säugerspermien keine Änderung des intrazellulären cAMP-Gehalts, was auf einen anderen Regulationsmechanismus oder strukturell abweichende G-Proteine in Spermien hinweisen könnte (review: Harrison (2003) ;Visconti, et al. (2002)).

Weitere in der Literatur diskutierte Regulationsmechanismen beziehen sich auf die Aktivierung von Phospholipasen, einen Entzug von Cholesterol aus der Plasmamembran, eine Aktivierung von Ionentransportprozessen über die Zellmembran und pH-Verschiebungen durch Veränderungen des extrazellulären Milieus Langlais and Roberts (1985) ;Visconti, et al. (2002). Die während der Kapazitation stattfindenden Membranveränderungen werden im Kapitel 1.4 dargestellt. Bis heute ist die Sequenz der molekularen Regulationsschritte in Säugerspermien nicht geklärt.

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Eine kontinuierliche Energiebereitstellung für alle energieverbrauchenden Prozesse (Motilität, Biosynthese, aktiver Transport von Molekülen in der Zelle und über die Zellmembran) erfolgt in tierischen Zellen prinzipiell durch die Synthese von Adenosintriphosphat (ATP) über Glykolyse und Atmung. Eberspermien bauen vorhandene Substrate fast ausschließlich über aerobe Atmung ab. Dabei sind sie in der Lage, selbst bei niedrigem Sauerstoffpartialdruck eine optimale Atmung sowohl im weiblichen Genitaltrakt als auch unter In-vitro-Bedingungen aufrecht zu erhalten. Sowohl zelleigene als auch extrazelluläre Substrate werden abgebaut. Es wird angenommen, dass bei Säugerspermien vorwiegend Fettsäuren aus den Plasmalogenen als endogene Energielieferanten dienen Scott (1973). Diese werden durch Phospholipasen freigesetzt und über die β-Oxidation und den Zitratzyklus abgebaut. Als extrazelluläre Substrate kommen glykosylierbare Zucker sowie verschiedene Fett- und Aminosäuren in Frage, die in den Sekreten des männlichen und weiblichen Genitaltraktes vorkommen. Unter aeroben Bedingungen stellt bei Eberspermien fast ausschließlich die in der inneren Mitochondrienmembran gelegene Atmungskette die notwendige Energie bereit. Die Mitochondrien der Spermien haben gegenüber anderen Zellen die Besonderheit, Laktat über ein Isoenzym der Laktatdehydrogenase intramitochondrial zu Pyruvat zu dehydrieren. Eberspermien sind nur in Gegenwart von Sauerstoff motil und verfügen wahrscheinlich über eine besonders schnelle Laktatoxidation. Das ausschließlich in den Mitochondrien synthetisierte ATP muss zu den distal gelegenen Verbrauchsorten transportiert werden Schülke (1982).

1.1.1.5 Kapazitation und Akrosomreaktion in vitro

Die meisten Untersuchungen an Säugerspermien werden in-vitro durchgeführt. Dabei simulieren die verwendeten Kapazitationsmedien die Ionenzusammensetzung, Osmolarität und den pH-Wert der Eileiterflüssigkeit im weiblichen Genitale. Zur Stabilisierung des pH-Wertes wird ein Puffersystem (z.B. HEPES) eingesetzt. Der Zusatz von Substraten für den Energiestoffwechsel (Laktat, Glukose, Pyruvat) sichert die Homöostasis und Motilität der Spermien über einen längeren Inkubationszeitraum. Kapazitationsmedien enthalten immer Bikarbonat (10-25 mM), meist einen Cholesterolakzeptor (z.B. Rinderserumalbumin - BSA: 1-5 mg/ml), und i.d.R. Kalzium (2-3 mM). BSA erhält scheinbar über Wechselwirkungen mit Membranproteinen die Stabilität und Motilität der Spermienzelle während der Kapazitation Davis, et al. (1979). Die Inkubationsbedingungen variieren z.T. beträchtlich. Eberspermien werden bei 37-39°C für 30 min bis 8 h bei einer Zellkonzentration zwischen 106-109 Spermien/ml mit oder ohne Heparin kapazitiert. Die Inkubation erfolgt häufig im Zellkulturschrank (5% CO2). Die molekularen Prozesse der Kapazitation gelten prinzipiell als reversibel Yanagimachi (1994). Mit zunehmender Inkubationsdauer in kalziumhaltigem Medium steigt jedoch der Anteil der Spermien, bei denen spontan die Akrosomreaktion abläuft, an. Morphologisch entsprechen die entstehenden Vesikel denen einer In-vivo-Akrosomreaktion Watson, et al. (1992). Viele Autoren definieren die vorzeitige Akrosomreaktion jedoch als Artefakt der In-vitro-Kapazitation und Zeichen des Absterbens Yanagimachi (1994).

Zur Auslösung der Akrosomreaktion in vitro wird bei Eberspermien entweder ein Kalziumionophor (A-23187; 1-10 µM; Yanagimachi (1994)) oder Lysophosphatidylcholin (100-250 µM Fazeli, et al. (1999);Maxwell and Johnson (1997)) verwendet. Es ist weiterhin möglich, verschiedene Effektoren des weiblichen Genitales (z.B. Progesteron, Zona pellucida, Kumuluszellen) einzusetzen. Die Anwesenheit von extrazellulärem Kalzium ist für das Auslösen der Akrosomreaktion unabdingbar, während die Kapazitation von Eberspermien zumindest teilweise auch in kalziumfreiem Medium abläuft.

1.1.2 Forellenspermien

1.1.2.1  Morphologie

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Auch Forellenspermien sind generell in Kopf und Schwanz differenziert (Abb. 2). Der Kopf des reifen Spermiums ist ca. 2,5 µm lang und 1,5 µm breit, die Schwanzlänge beträgt 35 µm.

Abb. 2: Schematische Darstellung eines Forellenspermiums nach Billard (1983).

Der Zellkern füllt nahezu den gesamten Kopf des Spermiums aus. Das in der Genese zunächst noch vorhandene Akrosom wird vollständig zurückgebildet. Im Mittelstück befindet sich ein einzelnes ringförmiges, nicht geschlossenes Mitochondrium. Durch eine Einschnürung der Zellmembran ist das Mittelstück deutlich von Schwanz abgegrenzt. Der Schwanz zeigt zwei laterale zytoplasmatische Erweiterungen mit Vesikeln im Inneren.

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1.1.2.2 Reifung im männlichen Genitaltrakt und Aktivierung der Motilität

Die Genese der Forellenspermien ist ein saisonaler Prozess, der in der Zeit von März bis Mai beginnt Scott and Sumpter (1989). Die Regulation erfolgt hormonell und führt im Sommer und Herbst zu einem starken Wachstum der Gonaden. Im September/Oktober werden die vollständig ausgereiften Spermatozoiden in das Lumen der Samenstränge abgegeben. Während der Passage der Samenstränge sind die Zellen vom Seminalplasma und Sekreten der Samenstränge umgeben Billard (1979). Sie werden bis zur Ejakulation in der Laichzeit mehrere Wochen gespeichert. Die Motilität der Spermien wird erst durch die Ejakulation in Wasser und die damit verbundene 100- bis 1000fache Verdünnung der Kaliumkonzentration ausgelöst. Die Verringerung der externen Kaliumkonzentration bewirkt einen Kaliumausstrom und daran gekoppelt einen Kalziumeinstrom in die Zelle Tanimoto and Morisawa (1988). Es kommt zur Umwandlung von ATP in cAMP und zur Proteinphosphorylierung im Spermienschwanz Morisawa and Ishida (1987). Einmal aktiviert, zeigen die Forellenspermien eine sehr intensive Bewegung, die nach ca. zwei Minuten wieder erlischt, da der ATP-Gehalt drastisch sinkt. Das Spermium bleibt funktionsfähig und kann seinen ATP-Gehalt regenerieren, ohne dass jedoch die Motilität wiederkehrt Christen, et al. (1987). Forellenspermien besitzen neben der Fähigkeit zur Glykolyse Lahnsteiner, et al. (1993) einen ausgeprägten oxydativen Stoffwechsel. Der Sauerstoffverbrauch ist auch im immobilen Zustand sehr hoch.

1.1.2.3 Wechselwirkung mit der Eizelle

Die Forellenweibchen legen ihre Eier während der Laichzeit alle auf einmal ab. Jede Eizelle ist von einer Hülle umgeben, die an einer Stelle einen Kanal ausbildet. Diese Mikropyle hat einen Durchmesser, der in etwa dem eines Spermienkopfes entspricht. Während der kurzen Zeit, in der die Spermien nach der Ejakulation motil sind, müssen sie durch die Mikropyle wandern, um die Eizelle zu befruchten Ginsburg (1963). Ähnlich der Befruchtung bei Säugern löst das erste Spermium, das durch diese Pore gelangt ist, nach der Fusion mit der Eizellmembran einen Kaskade aus, die den Durchtritt weiterer Spermien verhindert Nakano (1969).

1.2  Lipidorganisation in tierischen Membranen

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Die Zellmembran bildet die äußere Grenze tierischer Zellen zum umgebenden Milieu. Sie dient der Aufrechterhaltung der Homöostasis und fungiert als Grenzfläche für Energie-, Stoff- und Informationsaustausch der Zelle mit der Umgebung. Lange Zeit diente das Fluid-Mosaik-Modell Singer and Nicolson (1972) als Grundvorstellung der Membranorganisation. Entsprechend diesen Modells bilden die Lipide einen fluiden Bilayer, mit dem zahlreiche Proteine und Kohlenhydrate assoziiert sind. In dieser Lipiddoppelschicht können die einzelnen Lipide sehr schnell lateral diffundieren und sind prinzipiell zufällig und gleichförmig verteilt. In den letzten zwei Jahrzehnten verdichteten sich die Daten, dass die Lipide zahlreicher tierischer Membranen in übergeordneten Domänen organisiert sind und sich sowohl lateral als auch transversal inhomogen über die Membran verteilen (review: Daleke (2003) ;Somerharju, et al. (1999)). Die Phospholipide (Phosphatidylcholin – PC, Phosphatidylethanolamin – PE, Phosphatidylserin – PS, Phosphatidylinositol – PIn, Sphingomyelin – SM) stellen den größten Anteil der Membranlipide. Weitere wichtige Lipidkomponenten biologischer Membranen sind Glykolipide und Cholesterol (CHO), deren Anteil zwischen verschiedenen Membranen sehr variiert. Generell werden den Membranlipiden neben ihrer strukturbildenden Eigenschaft zahlreiche funktionelle Aufgaben zugeschrieben.

1.2.1  Transversale Asymmetrie der Phospholipide

1.2.1.1  Charakterisierung der transversalen Phospholipidasymmetrie

Untersuchungen zur transversalen Asymmetrie von Phospholipiden erfolgen i.d.R. mit Hilfe von fluoreszenz-, spin- oder radioaktivmarkierten Phospholipidanaloga, deren Einbau und Translokation in der Membran verfolgt werden kann Devaux, et al. (2002). Neuere Arbeiten nutzen die spezifische Bindung fluoreszenzmarkierter Proteine an Phospholipide. So bindet AnnexinV spezifisch an PS, das Peptid Ro09-0198 an PE.

In Analogie zu den folgenden Erläuterungen zur Zell- und Akrosommembran von Spermien werden zunächst die Eigenschaften der homologen Membranen anderer intensiver untersuchter Zellen zusammengefasst. Die Akrosommembranen können, entsprechend ihrer Entstehung, mit einer Membran des Golgi-Apparates verglichen werden.

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Man geht heute davon aus, dass die Phospholipide im endoplasmatischen Retikulum über die beiden Monolayer gleich verteilt sind, während die Verteilung der Phospholipide über die tierische Zellmembran eine charakteristische Asymmetrie aufweist. Die Aminophospholipide PS und PE sind auf der zytoplasmatischen Seite angereichert, die cholinhaltigen Phospholipide (PC und SM) befinden sich hingegen zum überwiegenden Teil im exoplasmatischen Monolayer der Plasmamembran.

Der Golgi-Apparat bildet hinsichtlich der Phospholipidasymmetrie in den Membranen eine wichtiges Entwicklungszentrum. Hier werden zahlreiche Glykolipide und Glykoproteine verändert und sortiert. Auf der dem endoplasmatischen Retikulum zugewandten cis-Seite des Golgi-Apparates befinden sich die Phospholipide wahrscheinlich gleichförmig über den Bilayer verteilt. Mit zunehmender Glykosylierung von Lipiden und Proteinen während des Transportes zur trans-Seite des Golgi-Apparates wird eine Membranasymmetrie aufgebaut. Vom Golgi-Apparat entlassene, sekretorische Vesikel zeigen eine asymmetrische Verteilung der Phospholipide, mit einer Anreicherung von PS und PE auf der zytoplasmatischen Seite Holthuis, et al. (2003).

1.2.1.2 Bewegung von Phospholipiden über die Membran

Die transversale Bewegung der Phospholipide kann allgemein über passive Diffusion (Halbwertszeiten von Stunden), erleichterte Diffusion (proteinabhängig, kein Verbrauch von Stoffwechselenergie) oder aktiven Transport (proteinabhängig, Verbrauch von Stoffwechselenergie) erfolgen Herrmann, et al. (1991).

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Erleichterte Diffusion – endoplasmatisches Retikulum/Golgi-Apparat

Die Bewegung der Phospholipide über die Membran des endoplasmatischen Retikulums erfolgt bidirektional, kopfgruppenunabhängig und sehr schnell (Halbwertszeit von einigen Sekunden bis Minuten). Diese schnelle Flip-Flop-Bewegung ist proteinabhängig, benötigt aber keine Stoffwechselenergie Buton, et al. (1996). Es ist noch unklar, ob ein einzelnes oder verschiedene Proteine diese schnelle transversale Phospholipidbewegung vermitteln. Allein der Einbau kleiner membrandurchspannender Proteinabschnitte (Helices) kann in bestimmten cholesterolarmen Membranen einen schnellen Flip-Flop der Phospholipide bewirken. Die Anreicherung von Cholesterol in den Membranen des Golgi-Apparates (cis ♢ trans) könnte somit das Fehlen einer schnellen bidirektionalen Phospholipidbewegung in sekretorischen Vesikeln und in der Plasmamembran erklären Kol, et al. (2003).

Aktiver, unidirektionaler Transport - ATPasen

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Arbeiten der letzten Jahre deuten auf eine Beteiligung bestimmter P-Typ-ATPasen (Drs2p, ATPase II) am Aufbau der transversalen Phospholipidasymmetrie in den Trans-Golgi-Zisternen und in dessen sekretorischen Vesikeln hin (review: Holthuis, et al. (2003)).

In der Plasmamembran transportieren Flippasen abhängig von Adenosintriphosphat (ATP) Phospholipide zur zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran, während Floppasen den zur exoplasmatischen Seite gerichteten ATP-abhängigen Phospholipidtransport vermitteln. Ein aktiver Transport von Aminophospholipiden (PS, PE) wurde erstmals an Erythrozyten nachgewiesen Seigneuret and Devaux (1984). Das dafür verantwortliche Protein wird seitdem als Aminophospholipidtranslokase (APLT) bezeichnet, wurde bis heute jedoch noch nicht identifiziert. Die Aktivität eines solchen Transportproteins wurde weiterhin in der Plasmamembran von Thrombozyten, Lymphozyten, Fibroblasten, Spermien u.a. Zellarten nachgewiesen Devaux and Zachowski (1994). Die APLT transportiert mit Halbwertszeiten von einigen Minuten sowohl PS als auch PE auf die zytoplasmatische Seite der Plasmamembran, wobei ihre Affinität zu PS etwa 10fach höher ist als zu PE Zachowski, et al. (1986). Die Aktivität der APLT ist für den Aufbau und den Erhalt einer stabilen Asymmetrie der Phospholipide im Fließgleichgewicht ausreichend, Wechselwirkungen mit Proteinen des Zytoskeletts sind nicht erforderlich, können aber auch nicht ausgeschlossen werden Heinrich, et al. (1997). Die Transportaktivität der APLT wird durch verschiedene intrazelluläre Effektoren (z.B. [ATP]↓, [Ca2+]↑) inhibiert. Eine unspezifische, ATP-abhängige Floppase gleicht den Phospholipidtransport der APLT in Erythrozyten aus Connor, et al. (1992).

Aktiver, unidirektionaler Transport - ABC-Transporter

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Ursprünglich wegen ihrer Eigenschaften als Antibiotikatransporter untersucht, konnte für einige ABC- (ATP-bindende Kassette) Transporter in den letzten Jahren ein direkter Transport von Lipiden über die Membran (i.d.R. von der zytoplasmatischen zur exoplasmatischen Seite - Floppasen) gezeigt werden. Meist sind die untersuchten ABC-Transporter spezifisch für wenige Substrate. So transportiert z.B. ABCB4 (MDR3) in Hepatozyten hoch spezifisch PC über die Kanalicularmembran ins Lumen. Im Gegensatz dazu zeigt der ABCB1-Transporter (MDR1) eine sehr geringe Substratspezifität und erleichtert den Transport vieler kurzkettiger Phospholipidanaloga über die Membran van Helvoort, et al. (1996). Dieser Transporter könnte somit die transversale Verteilung der zytoplasmatisch angereicherten endogenen Aminophospholipide beeinflussen. ABCA1 wurde auch mit einer Exposition von PS auf der exoplasmatischen Seite der Plasmamembran apoptotischer Zellen und phagozytierender Makrophagen in Zusammenhang gebracht Hamon, et al. (2000). Einige ABC-Transporter (A1, B1, G1, 5, 8) scheinen zudem am Cholesterolefflux aus der Membran beteiligt zu sein (review: Tannert, et al. (2003)). Untersuchungen zum Lipidtransport von ABCA1 deuten auf einen möglichen Zusammenhang zwischen Cholesteroltransport und kalziumabhängigem Phospholipidtransport über die Zellmembran hin. Einerseits bewirkt eine Mutation im ABCA1-Gen einen Defekt des Auswärtstransportes zellulären Cholesterols über die Plasmamembran (Tangier disease, Makrophagen), andererseits zeigen Erythrozyten und Fibroblasten von ABCA1-knockout-Mäusen eine Störung der kalziuminduzierten, transversalen Umverteilung der Phospholipide und damit verbunden eine Exposition von PS Sims and Wiedmer (2001).

Erleichterte, kalziumabhängige Diffusion - Scrambling

Als sogenanntes „Scrambling“ wird eine kalziumabhängig, bidirektionalen Bewegung aller Phospholipide über die Plasmamembran bezeichnet. Eine derartige schnelle (Halbwertszeit von einigen Sekunden), von ATP unabhängige Flip-Flop-Bewegung führt in einigen Zellen (z.B. aktivierte Thrombozyten) zu einer Aufhebung bzw. Verminderung der transversalen Phospholipidasymmetrie. Diese wurde durch Exposition von PS auf dem exoplasmatischen Monolayer der Plasmamembran charakterisiert und ist häufig mit der Bildung kleiner Membranvesikel verbunden. Verschiedene molekulare Effekte könnten ein solches Scrambling erklären. So wurde z.B. die kalziumabhängige Inhibierung der APLT, gekoppelt an die Aktivierung eines ABC-Transporters, diskutiert Bitbol, et al. (1987) ;Hamon, et al. (2000). Weiterhin könnte die direkte Wechselwirkung von freiem Kalzium mit PS deren Verteilung über die Membran beeinflussen. Auch die Ausbildung von Nichtbilayerstrukturen in der Plasmamembran kann in diesem Zusammenhang nicht ausgeschlossen werden. Viele Autoren gehen heute allerdings von der Aktivierung eines kalziumsensitiven Proteins aus. Aus humanen Erythrozyten konnte unlängst ein Protein (PLSCR1) isoliert und geklont werden, das nach Rekonstitution in Liposomen eine Phospholipid-Scramblase-Aktivität aufwies. PLSCR1 enthält eine C-terminale Transmembrandomäne, eine Proteinkinase C Phosphorylierungsseite sowie Domänen zur Wechselwirkung mit Kalzium und anderen Proteinen (review: Bevers, et al. (1999) ;Sims and Wiedmer (2001)). In Blutzellen von PLSCR1-knockout-Mäusen konnte allerdings trotzdem ein Scrambling der Phospholipide ausgelöst werden Zhou, et al. (2002).

1.2.1.3 Physiologische Relevanz der transversalen Phospholipidasymmetrie

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Die Tatsache, dass eine Zelle auf Kosten ihrer Stoffwechselenergie die transversale Ungleichverteilung der Phospholipide aufrechterhält, wirft die Frage nach der physiologischen Bedeutung dieser Asymmetrie auf. Die folgenden Prozesse lieferten wiederholt Hinweise dafür, dass die Anordnung der Lipide nicht nur für die Homöostasis einer Zelle wichtig ist, sondern vielmehr eine funktionelle Bedeutung für intra- und interzelluläre Wechselwirkungen hat (review: Herrmann, et al. (1991)).

Zell-Zell-Wechselwirkung

PS exponierende Erythrozyten binden an Makrophagen Tanaka and Schroit (1983) und Endothelzellen Schlegel and Willianson (1987) und werden selektiv aus der Blutbahn entfernt. Obwohl der Mechanismus dieser Zell-Zell-Wechselwirkung zunächst unklar blieb, gaben diese Beobachtungen Anlass, der Ursache einer solchen Exposition von PS auf dem äußeren Monolayer der Zellmembran nachzugehen. Eine Verminderung der Phospholipidasymmetrie wurde z.B. bei gealterten Erythrozyten Connor, et al. (1994), bei Thrombozyten nach Stimulation der Gerinnungskaskade Zwaal, et al. (1992) und an verschiedenen apoptotischen Zellen Fadok, et al. (1992) gefunden. Man geht heute davon aus, dass die Exposition von PS als Signal zur Entfernung apoptotischer Zellen durch Phagozytose wirkt Fadok, et al. (2000).

▼ 15 

Fusionsprozesse, Endo- und Exozytose

In der Regel fusionieren intakte Zellen, mit bestehender Phospholipidasymmetrie, nicht miteinander. Fusionsprozesse intrazellulärer Vesikel mit der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran können hingegen ständig ablaufen. Eine transversale Asymmetrie der Phospholipide in der Plasmamembran könnte dafür ein entscheidender Faktor sein. So beeinflussen die verschiedenen Phospholipide in unterschiedlichem Maße die fusogenen Eigenschaften einer Membran. Wichtige hierfür sind die effektive Molekülform (kegelförmig, zylinderförmig), der Sättigungsgrad der assoziierten Fettsäuren, das Maß der Hydration der Kopfgruppen sowie deren elektrische Ladung. Aminophospholipide vereinen alle Eigenschaften, die eine Membranfusion erleichtern und sie können zudem in Anwesenheit von Kalzium Nichtbilayerstrukturen ausbilden. Die Änderung ihrer Verteilung über die Membran kann somit deren Fusogenität entscheidend beeinflussen. Eine zytoplasmatische Anreicherung der Aminophospholipide in synaptischen Vesikeln chromaffiner Granulae unterstützt wahrscheinlich deren kalziumabhängige Anlagerung an die zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran und anschließende Fusion. In Myoblasten wurde hingegen eine Exposition der Aminophospholipide auf dem exoplasmatischen Monolayer der Plasmamembran beschrieben. Die Fusion von Myoblasten untereinander führt während der Embryonalentwicklung zur Ausbildung der Skelettmuskulatur, eine fusogene Oberfläche der Myoblasten ist somit in der Genese essentiell (review: Herrmann, et al. (1991)). Entsprechend dem „Bilayer-Couple“-Modell könnte außerdem die kontrollierte Aktivität von Phospholipidtranslokasen an bestimmten Punkten der Plasmamembran zu einer Ungleichverteilung von Membranlipiden zwischen den beiden Monolayern, somit zu örtlichen Membrankrümmungen und schließlich zum Abschnüren von Vesikeln führen. Auch dies könnte eine Kontrolle von Endo- und Exozytoseprozessen über die Phospholipidasymmetrie erklären Devaux and Zachowski (1994). Die Verringerung der APLT-Aktivität geht z.B. bei aktivierten Thrombozyten mit der Aufhebung der Phospholipidasymmetrie und einem Abschnüren von Membranvesikeln einher.

Fluidität und Zellform

▼ 16 

Bedingt durch die unterschiedliche Fettsäurezusammensetzung der einzelnen Phospholipide und deren asymmetrische Verteilung innerhalb der Membran unterscheidet sich die Fluidität der zytoplasmatischen von der exoplasmatischen Seite. Die Fluidität der Zellmembran von Erythrozyten könnte zudem in engem Zusammenhang mit ihrer Zellform stehen Seigneuret and Devaux (1984).

Protein-Aktivität

Die transversale Asymmetrie beeinflusst des weiteren die laterale Beweglichkeit von integralen und verankerten Proteinen und damit auch ihre Aktivität. Zahlreiche membrangebundene Proteine (z.B. PKC, G-Proteine, AnnexinV) benötigen für ihre Aktivität die unmittelbaren Nachbarschaft von PS. Viele Proteine des Zytosols müssen an die Plasmamembran binden, um Funktion und Informationsaustausch zu ermöglichen. Die Bindung erfolgt häufig an geladene Lipide, die bevorzugt im inneren Monolayer angereichert sind. Andererseits wird für ein Seminalplasmaprotein des Bullen (PDC-109) die Bindung an die ungeladene Kopfgruppe des PC beobachtet Müller, et al. (1998). Eine Änderung der Phospholipidasymmetrie könnte somit direkt die Aktivität von Proteinen beeinflussen.

1.2.2 Lateral inhomogene Verteilung von Membranlipiden

1.2.2.1  Charakterisierung der lateralen Lipidverteilung

▼ 17 

Untersuchungen zur lateralen Asymmetrie in biologischen Membranen erfolgen zum überwiegenden Teil mit Hilfe von markierten Lipidanaloga bzw. lipophilen Markern, die sich in den Bilayer einbauen. Der differenzielle Einbau und die Diffusion solcher Reporter kann mit verschiedenen Techniken verfolgt werden. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden häufig präparative Methoden zur Untersuchung lateraler Lipiddomänen angewandt. Sie nutzen die unterschiedliche Resistenz von Membrandomänen gegenüber Detergenzien aus.

Die laterale Asymmetrie einzelner Membranbestandteile entwickelt sich wahrscheinlich analog zur transversalen Asymmetrie im Golgi-Apparat während der Passage von der cis- zur trans-Seite. Die Glykosylierung von Lipiden und Proteinen bewirkt zunehmend eine laterale Segregation in Membrandomänen. Man geht heute davon aus, dass im endoplasmatischen Retikulum die Membranlipide lateral gleichförmig verteilt sind, während sie in der Plasmamembran charakteristische Domäne bilden Holthuis, et al. (2003).

Entscheidend für diese asymmetrische Anordnung ist, im Gegensatz zur transversalen Asymmetrie der Phospholipide, die rein physikochemische Wechselwirkung zwischen spezifischen Lipiden, die zur Phasenseparation führen kann. Sowohl in Modellmembranen als auch in biologischen Membranen wurde gezeigt, dass Sphingolipide (Sphingomyelin und Glykosphingolipide) sich bevorzugt mit Cholesterol zusammenlagern und eine geordnet-fluide Phase bilden. Diese koexistiert stabil mit oder in der ungeordnet-fluiden Phase, in der sich vorwiegend ungesättigte Glycerolipide anreichern Brown and London (1998). Basierend auf der Vorstellung stabiler Lipiddomänen in einer sonst fluiden Membran entstand der Begriff der sogenannten „Rafts“ (Floß) Simons and Ikonen (1997).

▼ 18 

Die auf der exoplasmatischen Seite der Plasmamembran geclusterten Sphingolipide haben i.d.R. lange, gesättigte Fettsäureketten, die bis in den zytoplasmatischen Monolayer hinein reichen können. Den starken Zusammenhalt solcher Lipiddomänen führt man auf ein ausgeprägtes Netzwerk von Wasserstoffbrücken zwischen den langgestreckten Fettsäureketten zurück. Der Platzbedarf der Glykosphingolipidkopfgruppen ist groß. Wahrscheinlich füllen Cholesterolmoleküle die Freiräume zwischen den gestreckten Fettsäureketten aus. Ob auf der zytoplasmatischen Seite spezielle Phospholipide angereichert sind, ist noch nicht bekannt. Es wurde aber diskutiert, dass Phospholipide mit überwiegend gesättigten Fettsäureketten die Packung einer solchen Mikrodomäne optimieren könnten Simons and Ikonen (1997). In einigen Zellmembranen scheinen gesättigte Fettsäureketten vor allem mit PS und PE assoziiert zu sein Schneiter, et al. (1999). Diese Phospholipide könnten, in dem sonst sehr fluiden Monolayer, die zytoplasmatische Gegenseite von Rafts bilden Holthuis, et al. (2003). Mit Lipidrafts assoziieren charakteristische, häufig mit einer gesättigten Fettsäurekette im Bilayer verankerte Membranproteine. Als typische Raftproteine gelten Glykosylphosphatidylinositol- (GPI) verankerte Proteine und zweifachacylierte Tyrosinkinasen der Src-Familie. Es wurden weiterhin einige Transmembranproteine mit Rafts assoziiert gefunden Simons and Ikonen (1997). GPI-verankerte Proteine werden häufig als morphologische Marker für das Vorhandensein von Rafts auf der Zelloberfläche genutzt.

Über die Größe, Form und Dynamik lateraler Lipiddomänen gibt es nach wie vor weit auseinander gehende Meinungen (< 50-700 nm, gesamte apikale Plasmamembran von Epithelzellen). Dies liegt zum einen an der Vielzahl der genutzten Untersuchungstechniken, zum anderen aber auch am Fehlen einer genauen Definition. Einig ist man sich allerdings, dass man aus der Größe isolierter Lipiddomänen nicht auf die tatsächlich in vivo vorhandene Größe solcher Strukturen schließen kann Hooper (1999). Eine präparative Isolation von Rafts (oder allgemein, geordnet-fluiden Lipiddomänen) kann über die Lyse der Membran in kaltem, nichtionischem Detergens (z.B. Triton) und eine anschließende Dichtezentrifugation erfolgen. Membrandomänen mit hohem Sphingolipid- und Cholesterolanteil können nicht solubilisiert werden, da sie von starken Van der Waals-Kräften zusammengehalten werden. Sie sind durch eine geringe Dichte charakterisiert (enthalten relativ wenig Proteine) und steigen während der Ultrazentrifugation im Dichtegradienten auf Hooper (1999). Eine teilweise Detergensunlöslichkeit wurde allerdings auch für Membranen beschrieben, deren einheitliche Lipidphase sich zwischen der geordnet-fluiden und der ungeordnet-fluiden befand Brown and London (1998).

1.2.2.2 Physiologische Relevanz lateralen Lipiddomänen

Den wichtigsten Hinweis auf die Beteiligung lateraler Lipiddomänen an der zellulären Regulation gaben funktionelle Untersuchungen. So beeinflusst der Einbau oder Entzug von Cholesterol in die Plasmamembran nicht nur deren Fluidität und laterale Organisation, sondern auch die Aktivität verschiedener Proteine und andere zelluläre Prozesse.

▼ 19 

Lipid- und Proteinsortierung in sekretorischen Vesikeln

Die Sphingolipidsynthese findet überwiegend im Golgi-Apparat statt und ist damit räumlich von der Synthese der Phospholipide und des Cholesterols im endoplasmatischen Retikulum getrennt. Dies ist ein in allen Eukaryonten konserviertes Prinzip van Meer (1998) und scheint für die Membrangenese entlang des Golgi-Apparates von wesentlicher Bedeutung zu sein. Verbunden mit der lateralen Segregation von Sphingolipiden und Cholesterol nimmt auch die Dicke der Membranen zur trans-Seite des Golgi-Apparates zu. Es wurde ein Modell vorgeschlagen, nach dem sich die Proteine entsprechend ihrer hydrophoben Wechselwirkungen mit dem Lipidbilayer selbst organisieren Bretscher and Munro (1993). So haben typische Golgi-Enzyme grundsätzlich kürzere Transmembranregionen als Proteine der Plasmamembran und reichern sich dem entsprechend in sphingolipid- und cholesterolfreien Membranabschnitten an. Somit könnte man auch die unterschiedliche Zusammensetzung sekretorischer Vesikel entsprechend ihres Zielortes erklären (review: Holthuis, et al. (2003).

Fusionsprozesse, Endo- und Exozytose

▼ 20 

Caveolae sind 50-70 nm große Membranflecken, denen eine besondere Rolle bei der Endo- und Exozytose, dem Lipidtransport und der Signaltransduktion in vielen Zellen zukommt. Sie sind durch die enge zytoplasmatische Assoziation mit einem cholesterolbindenden Protein namens Caveolin gekennzeichnet und können als in Detergens unlösliche Membranstrukturen isoliert werden. Caveolin assoziiert mit GPI-verankerten Proteinen und einem charakteristischen Sphingolipid (GM1) Parton (1994) ;Rothberg, et al. (1990). Obwohl Caveolae die bisher am besten untersuchte Membranstruktur darstellen, ist auch hier die genaue Lipidzusammensetzung noch unklar. Das Vorhandensein von Caveolin in Transportvesikeln führte zu der Annahme, dass es eine wesentliche Rolle bei der Vesikelbildung hat Andersen (1998). Die Endozytose erfolgt in MDCK-Zellen über zwei verschiedene Wege. Es kann zwischen einer clathrinabhängigen und einer clathrinunabhängigen Endozytose unterschieden werden. Letztere kann durch den Entzug von Cholesterol beeinflusst werden und gilt daher als Raft-assoziiert Simons and Ikonen (1997). Vor kurzem konnte auch für SNARE-Proteine (soluble N-ethylmaleimide-sensitive attachment protein receptors) eine Organisation in cholesterolabhängigen Mikrodomänen gezeigt werden. Man nimmt an, dass sie die „docking“ und Fusionsstellen für die Exozytose darstellen Lang, et al. (2001).

Signalübertragung

Sowohl für Transmembranproteine (z.B. IgE-Rezeptor, T-Zell-Rezeptor) als auch für zahlreiche GPI-verankerte Proteine (z.B. CD16, Kontaktin, uPAR) wurde eine Signalübertragung auf die mit diesen Proteinen assoziierten Tyrosinkinasen (Src-Familie) beschrieben. Die Aktivierung einer Signalkaskade wurde wiederholt durch Aggregation von GPI-verankerten Proteinen ausgelöst Brown and London (1998). Der Mechanismus der Signalübertragung von mit dem exoplasmatischen Monolayer assoziierten GPI-verankerten Proteinen auf die im zytoplasmatischen Monolayer gelegene Tyrosinkinasen ist unklar. Ein Vermittlung zwischen zytoplasmatischer und exoplasmatischer Seite könnte sowohl durch Transmembranproteine als auch durch die langen FS-Ketten der Lipide erfolgen Dietrich, et al. (2001).

1.3  Phospholipide in der Zell- und Akrosommembran von Spermienzellen

▼ 21 

Die Differenzierung der Spermienzelle in verschiedene morphologisch zu unterscheidende Kompartimente (akrosomaler Bereich, Äquatorialsegment, postakrosomaler Bereich, Mittelstück, Schwanz) setzt sich auf molekularer Ebene fort. Die Zellmembran umgibt die gesamte Zelle, bildet jedoch kein Kontinuum. Da die Membranen eines Spermiums dicht benachbart und jeweils nur durch einen schmalen Zwischenraum voneinander getrennt sind, werden Untersuchungen zur Zusammensetzung und Organisation der Membranen erschwert.

Abb. 3: Phospholipidorganisation in der Zell- und Akrosommembran von Säugerspermien: Während die Plasmamembran (PM) in Analogie zu anderen Säugerzellen eine charakteristische transversale Asymmetrie und wahrscheinlich eine lateral inhomogene Verteilung der Phospholipide aufweist, gibt es über die Lipidorganisation der inneren und äußeren den Akrosommembran (iAM/äAM) bisher kaum Erkenntnisse.

▼ 22 

Am intensivsten wurde die Plasmamembran (PM) von Spermien, speziell der die Kopfkappe überdeckende Teil, analysiert. Nur wenige Arbeiten untersuchten die Lipidzusammensetzung der Akrosommembranen. Abbildung 3 soll einen Überblick zum heutigen Kenntnisstand der Organisation der Phospholipide in Zell- und Akrosommembran von Säugerspermien geben.

1.3.1  Zusammensetzung und Organisation der Akrosommembranen

Das Akrosom entsteht während der Differenzierung der Spermatiden aus Vesikeln des Golgi-Apparates. Man unterscheidet zwischen innerer (dem Zellkern zugewandt, iAM) und äußerer (der Plasmamembran zugewandt, äAM) Akrosommembran. Im Äquatorialbereich, am unteren Rand des Akrosoms, bilden beide Membranen eine haarnadelartige starre Struktur und gehen ineinander über. Einige Autoren vergleichen das Akrosom morphologisch mit einem riesigen sekretorischen Vesikel Tulsiani and Abou-Haila (2004). Dementsprechend würde man für beide Akrosommembranen eine asymmetrische Organisation und Zusammensetzung, vergleichbar mit der Plasmamembran, erwarten. Andererseits können Diffusionsbarrieren im Äquatorialsegment eine unterschiedliche Struktur von innerer und äußerer Akrosommembran bewirken bzw. erhalten. Die wenigen Untersuchungen zur Lipidcharakteristik der äußeren Akrosommembran konnten tendenziell eine Phospholipidzusammensetzung vergleichbar mit der Plasmamembran zeigen (siehe Tabelle 1), wobei scheinbar ein Teil des PC in der äußeren Akrosommembran durch SM ersetzt wird. Zur Phospholipidzusammensetzung der inneren Akrosommembran gibt es bisher keine Literaturangaben.

Tab. 1: Zusammensetzung ausgewählter Spermienmembranen: relativer Protein- und Lipidgehalt sowie prozentualer Anteil der Phospholipidklassen (bezogen auf Gesamt-PL-Gehalt) in isolierten Membranen (äußere Akrosommembran – äAM, Plasmamembran die den Bereich der Kopfkappe überdeckt - Kopf-PM).

Bulle Parks, et al. (1987)

Meer-schwein Stojanoff, et al. (1988)

Eber Nikolopoulou, et al. (1985)

Eber Nikolopoulou, et al. (1986)

Kopf-PM

äAM

Kopf-PM

äAM

Kopf-PM

PM-äAM #

Protein/PL [w/w]

0,66

2,48 *

n.d.

n.d.

<1,92

1,92

CHO/PL [mol/mol]

0,38

0,26

n.d.

n.d.

0,26

0,26

PC

50

42

39

33

40

27

SM

13

17

18

18

23

31

PE

10

7

15

15

28

29

PIn

3

3

6

9

4

3

LysoPC

2

2

18

21

-

1

PS

1

2

4

4

3

9

* fest mit der äAM assoziierte dichte Strukturen ließen sich nicht abtrennen
# Mischvesikel aus PM und äAM nach Induktion der AR mittels Ionophor

▼ 23 

Einige Anhaltspunkte zur Membranorganisation der äußeren Akrosommembran (äAM) lieferten des weiteren mikroskopische und enzymatische Untersuchungen an verschiedenen Säugerspermien. So untersuchten Kan und Lin die Phospholipidverteilung in den Membranen von Eberspermien mittels Gefrierbruchtechnik, kombiniert mit einer PhospholipaseA2-Gold-Markierung. Diese Versuche zeigten unter anderem, dass die Dichte der PhospholipaseA2-Markierung von der Kernmembran über die innere und äußeren Akrosommembran zur Plasmamembran hin abnimmt Kan and Lin (1996). In Eberspermien wurde vor allem mit der zytoplasmatischen Seite der äAM assoziiertes Kalzium nachgewiesen. Dies könnte auf eine Anreicherung anionischer Lipide in diesem Monolayer hindeuten. Weiterhin konnte eine gleichförmige Markierung der äAM mit Neomycin, einem Marker für PIn, beobachtet werden Berruti and Franchi (1986). Elektronenmikroskopische Bilder von Eberspermien nach Gefrierbruch zeigten außerdem eine kompakte Aufreihung hexagonaler, globulärer Partikel auf der zytoplasmatischen Seite der äAM Forsman and Pinto da Silva (1989). Sowohl die iAM als auch die äAM besitzen kovalent gebundene Zucker, die durch Bindung verschiedener Lektine nachgewiesen wurden Huang and Yanagimachi (1985) ;Töpfer-Petersen, et al. (1983). Fest mit der periplasmatischen Seite der äAM assoziiert ist ein elektronendichtes Material, das nur schwer abgetrennt werden kann. Selbst nach Kavitation und Tritonlyse bleiben diese Strukturen der äAM erhalten. Eine saubere Aufreinigung der iAM scheitert ebenfalls an der sehr stabilen Struktur der Membran an sich und ihren Verbindungen zu anderen subzellulären Strukturen (akrosomale Matrix, Perforatorium). Die iAM widersteht sowohl einer Lyse in nichtionischem Detergens als auch einer Ultraschallbehandlung und enthält sehr viele integrale Partikel, die teilweise parakristalline Bereiche ausbilden. Die Fluidität der Membran ist wahrscheinlich relativ gering Huang and Yanagimachi (1985) ;Toshimori (1998).

Während zahlreiche Proteine der iAM und der äAM beschrieben wurden und deren Funktion für die Zell-Zell-Wechselwirkung mit der Eizelle diskutiert wird, ist die Lipidorganisation in den Akrosommembranen noch immer weitgehend unklar. Weder für die innere noch für die äußere Akrosommembran wurde bisher eine transversale Asymmetrie oder ein Transport von Phospholipiden gezeigt.

1.3.2 Die Zellmembran von Spermienzellen

1.3.2.1  Zusammensetzung

Die Phospholipidzusammensetzung der Plasmamembran von Spermien verschiedener Spezies ist ähnlich und prinzipiell vergleichbar mit anderen Membranen tierischer Zellen. Tabelle 2 zeigt im Überblick die prozentualen Anteile der häufigsten Phospholipide (PL) in der Plasmamembran von Eber- und Forellenspermien. Im Vergleich zu humanen Erythrozyten ist der Anteil an PC erhöht, dafür macht PS einen deutlich geringeren Anteil der Membranphospholipide aus. Die Plasmamembran der Forellenspermien enthält kaum SM. Von den Sterolen in der Plasmamembran stellt das Cholesterol (CHO) die Hauptkomponente dar. Sowohl Eberspermien als auch Forellenspermien zeichnen sich durch einen relativ geringen Cholesterolanteil in ihrer Plasmamembran aus. Das CHO/PL-Verhältnis beträgt 0,26 bzw. 0,33 während humane Spermienzellen z.B. ein CHO/PL von 0,83 aufweisen (humane Erythrozyten 0,89).

▼ 24 

Tab. 2: Vergleich der Zusammensetzung der Plasmamembran verschiedener tierischer Zellen.

Eber-spermien §

Forellen-spermien #

humane

Spermien $

humane Erythrozyten &

Protein/PL [w/w]

1,26

2,64

k.A.

k.A.

CHO/PL [mol/mol]

0,26

0,33

0,83

0,89

PC

39

49

36

29

SM

22

3

20

27

PE

24

31

31

27

PIn

3

4

4

1

LysoPC

4

3

k.A.

1

PS

6

10

8

13

§ Buhr, et al. (1994) ;Parks and Lynch (1992); # berechnet aus Quelldaten von Labbé, et al. (1995); $ Angaben für Gesamtzellsuspension Grizard, et al. (2000) ;Mack, et al. (1986); & Alouf and Freer (1992) ;Baldini, et al. (1989)

Die Zellmembran von Eberspermien enthält im Vergleich zu anderen tierischen Zellen einen hohen Anteil an PC- und PE-Plasmalogenen. Diese sind durch eine veretherte, gesättigte Fettsäure (meist 16:0 oder 18:0) am C1 und eine veresterte, mehrfach ungesättigten Fettsäure (20:4, 22:5, 22:6) am C2 des Glyzerolgerüstes charakterisiert. Ungesättigte Fettsäuren findet man zudem häufig mit PS assoziiert, während PIn, Diacylglyzerin und wahrscheinlich SM zum überwiegenden Teil gesättigte Fettsäuren (SM zu 53%, 20:0) tragen Buhr, et al. (1994) ;Nikolopoulou, et al. (1986) ;Parks and Lynch (1992). Brenton et al. berichten jedoch vom Vorkommen extrem langkettiger, ungesättigter Fettsäuren (Eber: n-6; C20-34; 3-5 Doppelbindungen) am SM verschiedener Säugerspermien Robinson, et al. (1992). Die Fettsäurezusammensetzung der einzelnen Phospholipidklassen scheint bei den Forellenspermien vergleichbar mit Eberspermien zu sein. PC und PE sind jeweils mit einer kurzen, gesättigten oder einfach ungesättigten Fettsäure (16:0, 18:1) und einer längeren mehrfach gesättigten Fettsäure (22:6, 20:5, 20:4) assoziiert. PS trägt zum überwiegenden Teil ungesättigte Fettsäuren (18:1, 22:6), PIn hingegen überwiegend gesättigte (16:0, 18:0, 18:1) Fettsäuren Labbé, et al. (1995).

1.3.2.2 Transversale Asymmetrie

In der Plasmamembran der Spermien von Forelle, Schafbock, Ziege, Bulle und Eber wurde eine charakteristische transversale Asymmetrie der Phospholipide nachgewiesen. Diese Asymmetrie beruht, wie bei anderen Zellen, auf der Aktivität einer Aminophospholipidtranslokase (APLT). Die Aminophospholipide PS und PE werden sehr schnell und effizient auf die zytoplasmatische Seite der Plasmamembran transportiert Müller, et al. (1994) ;Nolan, et al. (1995). Für Forellenspermien zeigten Müller et al. mit spinmarkierten Phospholipidanaloga, dass mehr als 90% des PS und 80-85% des PE auf der zytoplasmatischen Seite angereichert werden. Sie konnten mit diesen Messungen des weiteren eine höhere Fluidität des inneren Monolayers im Vergleich zum äußeren nachweisen Müller, et al. (1994). Gadella et al. zeigten für die Zellmembran von Eberspermien, dass sich 96% des PS, 80% des PE, 18% des PC und 4% des SM im inneren Monolayer der Plasmamembran befinden. Die Bewegung der Phospholipide von der inneren zur äußeren Membranseite erfolgt in intakten Zellen sehr langsam Gadella, et al. (1999). Erst kürzlich gelang es eine ATP abhängige APLT zu identifizieren, die ausschließlich in der akrosomalen Region von Mäusespermien exprimiert wird Wang, et al. (2004). Nach Ausschalten des entsprechenden Enzyms fanden die Autoren die Spermien dieser Knockout-Mäuse morphologisch und hinsichtlich der Motilität unverändert. Im Gegensatz zum Wildtyp zeigten zahlreiche Spermien der Knockout-Mäuse eine intensive AnnexinV-Bindung, was für eine Exposition von PS auf der exoplasmatischen Seite der Plasmamembran spricht Wang, et al. (2004).

1.3.2.3 Laterale Ungleichverteilung

▼ 25 

In den 70er Jahren fand man erste Anhaltspunkte für eine laterale Heterogenität der Zellmembran von Spermien. So wurde zunächst eine über den Spermienkopf differenzierte Lektinbindung und eine polarisierte Verteilung von integralen Membranproteinen beobachtet. Diese laterale Organisation der Zellmembran in Domänen konnte schließlich auch für anionische Lipide (Polymyxin B) und Sterole (Filipin) gezeigt werden Bearer and Friend (1980) ;Suzuki and Yanagimachi (1989). Sowohl Polymyxin als auch Filipin markierten den apikalen Bereich der Kopfkappe besonders intensiv. Für ein fluoreszenzmarkiertes Seminolipid wurde bei Eberspermien die gleiche Anreicherung im apikalen Randbereich beschrieben Gadella, et al. (1994). Die Lipidpackungsdichte variiert ebenfalls zwischen verschiedenen Bereichen der Zellmembran. So markiert Merocyanin (M540) vor allem den Bereich über dem Akrosom und Mittelstück Schlegel, et al. (1986). Es wird diskutiert, ob die Ausbildung von solchen Gebieten unterschiedlicher Lipid- und Proteinzusammensetzung durch Wechselwirkungen mit der Glykokalyx oder dem Zytoskelett bedingt ist Flesch and Gadella (2000).

Zahlreiche Untersuchungen zur Fluidität der Zellmembran von Säugerspermien weisen des weiteren auf eine Phasenseparation der Membranlipide hin. So fanden z.B. Wolf et al. bei Schafbockspermien mittels Differential-Scanning-Kaliometrie zwei endotherme Phasenübergänge bei 26°C und 60°C, die auf eine Separation der Lipide innerhalb der flüssigkristallinen Phase hindeuten. Für Eberspermien wurden vergleichbar Phasenübergänge bei 24°C und 36°C beschrieben. Verschiedene Fluoreszenzlabel zeigten zudem eine eingeschränkte laterale Diffusion (FRAP) in der Zellmembran und in rekonstituierten Bilayern aus diesen Membranlipiden, was auf laterale Diffusionsbarrieren hinweist. Die Ursache für eine Phasenseparation der Membranlipide in Spermienzellen wurde unter anderem einem spermienspezifischen Glykolipid und den Plasmalogenen zugeordnet Parks and Lynch (1992) ;Wolf (1995). Neuere Arbeiten ließen allerdings Zweifel aufkommen, ob man von diesen Versuchen tatsächlich auf das Vorhandensein koexistierender Lipidphasen in der Zellmembran intakter Spermien schließen kann. Vielmehr scheinen die Unterschiede (i) vom differentiellen Einbau der Marker in intrazellulären Membranen und toten Zellen, oder (ii) von Präparationsartefakten herzurühren Flesch and Gadella (2000). In verschiedenen Säugerspermien wurde die gleichförmige Markierung einer einheitlichen flüssig-kristallinen Phase (Laudan) und eine 90%ige Fluoreszenzherstellung nach Fluoreszenzlöschung (FRAP) in lebenden Zellen beobachtet Ladha, et al. (1997) ;Wolfe, et al. (1998). Sowohl aus Seeigel, als auch aus Meerschweinchen- und Mäusespermien konnten aber in Triton unlösliche Membranfraktionen charakteristischer Zusammensetzung isoliert werden, was wiederum für das Vorhandensein von Lipiddomänen (sogenannten Rafts) spricht Ohta, et al. (2000) ;Travis, et al. (2001) ;Trevino, et al. (2001). Zur laterale Lipidorganisation in der Zellmembran von Forellenspermien gibt es bisher keine Untersuchungen.

1.4 Membranveränderungen während der Kapazitation und Akrosomreaktion

Es sei hier noch einmal darauf hingewiesen, dass man unter einer Kapazitation allgemein die Vorbereitung der Säugerspermien auf die Akrosomreaktion versteht. Die genaue Abfolge einzelner Prozesse und deren unmittelbare Wirkung ist bis heute nicht geklärt. Die Destabilisierung der Plasmamembran und der Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration gelten jedoch für alle Säugerspermien als Schlüsselereignisse von Kapazitation und Akrosomreaktion.

1.4.1  Entfernung assoziierter Proteine von der Spermienoberfläche

▼ 26 

An der Oberfläche frisch ejakulierter Eberspermien binden viele Millionen Seminalplasmaproteine, die durch Selbstaggregation eine mehrschichtige Proteinhülle über dem vorderen Teil des Spermienkopfes bilden. Diese basischen Proteine, Spermadhäsine (12-14 kDa) genannt, lösen sich zusammen mit ebenfalls assoziierten Proteaseinhibitoren im Laufe der Kapazitation zu mehr als 90% wieder von der Spermienoberfläche ab. Spermadhäsine sind multifunktionelle Proteine, die in Abhängigkeit von ihrem Aggregationszustand an bestimmte Phospholipide (z.B. AWN-1 in seiner monomeren Form selektiv an PE), an Heparin, Glykosaminoglukane und die Zona pellucida binden Töpfer-Petersen, et al. (1996). Es ist allerdings noch unklar, wodurch die Ablösung der Oberflächenproteine ausgelöst wird. Denkbar wäre z.B. eine mechanische Ablösung infolge der aktiven Schwimmbewegung der Spermien und/oder bedingt durch die kompetitive Assoziation dieser Proteine mit Heparin oder Glykosaminoglukanen, die beide die Kapazitation von Eberspermien fördern Martínez and Morros (1996). Die Entfernung der Proteine bildet wahrscheinlich den ersten Schritt zur Destabilisierung der Zellmembran und kann zum einen den Entzug von Cholesterol aus der Plasmamembran erleichtern, zum anderen aber auch direkt deren Permeabilität beeinflussen.

1.4.2 Entzug und Umverteilung von Cholesterol

Für verschiedene Säugerspermien wurde gezeigt, dass deren Kapazitation mit der Verringerung des CHO/PL der Zellmembran einhergeht (review: Cross (1998) ;Visconti, et al. (1999). Einen damit verbundenen Cholesterolentzug vermitteln wahrscheinlich lipidbindende Proteine des weiblichen Genitaltraktes, in vitro kann dies auch durch Rinderserumalbumin (BSA) erfolgen Davis, et al. (1979) ;Ehrenwald, et al. (1988). Eine Veränderung der Filipin-Sterol-Komplexe in der den Spermienkopf überdeckenden Plasmamembran nach Kapazitation wurde ebenfalls beobachtet. In Goldhamsterspermien nahm die Dichte der Komplexe im akrosomalen Bereich ab Cross (1998). Für Humanspermien wurde die Ausbildung von kleinen sterolfreien Gebieten in dem sonst unverändert dicht markierten Bereich der Kopfkappe beobachtet. Der postakrosomale Bereich kapazitierter Spermien enthielt nur sehr wenige Filipin-Sterol-Komplexe Tesarík and Fléchon (1986). Bisher nahm man an, dass einem Cholesterolentzug bei Eberspermien keine Bedeutung zukommt, da ihre Kapazitation auch in BSA-freiem Medium möglich ist. Flesch et al. beobachteten allerdings an kapazitierten Eberspermien einen völligen Sterol-Verlust aus dem postakrosomalen Bereich, während die Dichte der Filipin-Sterol-Komplexe im akrosomalen Bereich unverändert erschien. Der analytisch-biochemisch nachgewiesene BSA-vermittelte Cholesterolentzug aus der Plasmamembran war auf eine relativ kleine Subpopulation kapazitierter Eberspermien mit geringer Lipidpackungsdichte der Zellmembran (Merocyanin) beschränkt. In den restlichen Zellen blieb der Cholesterolgehalt unverändert. Die Abnahme der Lipidpackungsdichte der Plasmamembran in einem Teil der Zellen war von der Anwesenheit von Bikarbonat im Medium abhängig Flesch, et al. (2001).

1.4.3 Permeabilität der Membran

Untersuchungen an Fibroblasten zeigen, dass der Cholesterolgehalt der Zellmembran die Aktivität eines /-Antiporters und in Erythrozyten die eines /-Austauschers moduliert. Ähnliche Effekte auf die Ionenpermeabilität könnte ein Cholesterolentzug aus der Plasmamembran von Säugerspermien haben Cross (1998). Im Zuge der Kapazitation wurde teilweise ein Anstieg vom intrazellulären Kalzium und cAMP sowie eine pH-Erhöhung beobachtet. Über die Zusammenhänge dieser Effekte gibt es noch wenig Klarheit. Man geht allerdings von einer oder mehreren bikarbonatinduzierten kalziumabhängigen intrazellulären Reaktionskaskaden aus Visconti, et al. (2002). So soll Bikarbonat die Kapazitation von Eberspermien insofern fördern, als es die Aufnahme von Kalzium in die Zelle unterstützt. Der Anstieg des intrazellulären Kalziums erfolgt während der Kapazitation zunächst langsam, wofür die Deaktivierung einer Ca2+-ATPase verantwortlich sein könnte Fraser (1995). Im Zusammenhang mit der in einigen Säugerspermien beobachteten Hyperpolarisation der Zellmembran wird hingegen die Beteiligung von Kaliumkanälen und spannungsabhängigen Kalziumkanälen diskutiert Visconti, et al. (2002). Bikarbonat aktiviert des weiteren eine Adenylatzyklase, deren Aktivität zum Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration führt Okamura, et al. (1985).

1.4.4 Phosphorylierung und Umverteilung von Membranproteinen

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Kapazitationsbedingte Änderungen der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung wurden in zahlreichen Säugerspermien nachgewiesen. Bei allen Arten, auch beim Eber, wurde eine Abhängigkeit der Phosphorylierung von BSA, Bikarbonat, Kalzium sowie die Beteiligung einer cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) beschrieben Visconti, et al. (2002). Die Phosphorylierungsreaktionen beeinflussen die Spermienbindung an die Zona pellucida, die Akrosomreaktion und die Hyperaktivierung der Spermien. Flesch et al. wiesen an kapazitierten Eberspermien die Tyrosin-Phosphorylierung von Proteinen der Plasmamembran nach, die eine hohe Bindungsaffinität zu Komponenten nativer Zona pellucida zeigten Flesch, et al. (1999). Des weiteren kommt es, während der Kapazitation zur lateralen und transversalen Umverteilungen von Membranproteinen. Für humane Spermien wurde beispielsweise die Translokation eines an der Zona-pellucida-Bindung beteiligten Proteins aus dem Inneren der Zelle auf die äußere Seite der Plasmamembran beschrieben Benoff, et al. (1993). Mittels Immunohistochemie konnte außerdem eine Umorientierung (Kopf ♢ Schwanz) und Aggregation bestimmter Proteine sowie die Ausbildung proteinfreier Areale im Bereich der Kopfkappe beobachtet werden Saxena, et al. (1986) ;Töpfer-Petersen, et al. (1996). Eng verbunden mit der Umverteilung von Membranproteinen ist wahrscheinlich die Veränderungen der Lipidorganisation in der Zellmembran.

1.4.5 Lipide – Umverteilung, laterale Diffusion, Packungsdichte, fusogene Lipide

Analog zur Umverteilung von Membranproteinen wurden laterale und transversale Veränderungen der Lipidstruktur beschrieben. Gadella et al. zeigten z.B. eine kalziumabhängige Umverteilung eines spermienspezifischen Glykolipides (Seminolipid) vom apikalen Rand in das Äquatorialsegment Gadella, et al. (1994). Damit verbunden könnten laterale Lipiddomänen, hervorgerufen durch Phasenseparation, aufgehoben werden.

Einige Arbeiten deuten auf eine kapazitationsbedingte Beschleunigung der lateralen Diffusion von Membranlipiden hin. So beobachteten Wolf et al. in Mäusespermien einen Anstieg der Diffusionsgeschwindigkeit eines Lipidanalogons im vorderen Kopfbereich, Mittelstück und Schwanz, während im postakrosomalen Bereich die Diffusionsgeschwindigkeit abnahm Wolf, et al. (1986).

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Als weiterer wesentlicher Kapazitationseffekt wird die Abnahme der Lipidpackungsdichte (Merocyanin) im Bereich der Kopfkappe beschrieben. Harrison et al. beobachteten dies zuerst an kapazitierten Eberspermien Harrison, et al. (1996). In späteren Arbeiten wurde die Intensitätszunahme der Merocyaninmarkierung kapazitierter Spermien in Verbindung mit einem Scrambling der Phospholipide in der Plasmamembran diskutiert Gadella and Harrison (2000). Die Arbeiten von Wang et al. schließen hingegen einen direkten Zusammenhang von intensiver Merocyaninmarkierung und PS-Exposition auf der exoplasmatischen Seite der Plasmamembran (AnnexinV-Bindung) aus. Durch homologe Rekombination wurde das Enzym einer APLT ausgeschaltet. Mäusespermien vom Wildtyp zeigten kapazitationsbedingt eine deutliche Intensitätszunahme der Merocyaninmarkierung zahlreicher Zellen, während nur relativ wenige Spermien eine schwache AnnexinV-Bindung aufwiesen. Im Gegensatz dazu konnte AnnexinV, unabhängig von der vorherigen Inkubation der Zellen, an zahlreiche Spermien der Knock-out-Mäuse binden. Eine intensive Merocyaninmarkierung wurde jedoch an diesen Zellen nie beobachtet Wang, et al. (2004).

Eine kapazitationsbedingte Akkumulation anionischer Lipide im Bereich der Kopfkappe wurde als Voraussetzung für die nachfolgende Akrosomreaktion postuliert Langlais and Roberts (1985). Elektronenmikroskopische Untersuchungen an Meerschweinspermien zeigten eine Zunahme der Bindung von Polymyxin B an der apikalen Plasmamembran nach Kapazitation Bearer and Friend (1982). In Humanspermien fanden Tesarik et al. jedoch keine kapazitationsbedingte Anreicherung anionischer Lipide Tesarík and Fléchon (1986). Für die Ausbildung fusogener Lipidbereiche in der apikalen Plasmamembran wird einerseits die kalziumabhängige Aktivierung der Phospholipase A2 verantwortlich gemacht. Die enzymatische Hydrolyse der am C2 des Glyzerolgerüstes gebundenen Fettsäuren verursacht eine vorrübergehende, örtliche Anreicherung von ungesättigten Fettsäuren und Lysophospholipiden, die beide eine Membranfusion fördern Langlais and Roberts (1985). Andererseits wurde die Synthese und Anreicherung von Cardiolipin und Phosphatidsäure in kapazitierten Meerschweinspermien nachgewiesen Bearer and Friend (1982). Ein Scrambling der Phospholipide in der apikalen Plasmamembran könnte eine Anreicherung anionischer Lipide in der äußeren Lamelle der Plasmamembran erklären Flesch and Gadella (2000).

1.4.6 Akrosomreaktion

Unter einer Akrosomreaktion versteht man allgemein die Fusion von Plasmamembran und äußeren Akrosommembran an mehreren Punkten Yanagimachi (1994). Sie wird häufig mit der kalziumabhängigen Exozytose in somatischen Zellen verglichen Tulsiani and Abou-Haila (2004). Während der Kapazitation kommt es wahrscheinlich unterstützt durch die Polymerisation von F-Aktin zur Zusammenlagerung von Zell- und Akrosommembran Breitbart (2002). Induziert durch einen massiven Kalziumeinstrom erfolgt schließlich die Exozytose des akrosomalen Inhalts.

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Das Äquatorialsegment verbleibt nach der Akrosomreaktion als starre Struktur, geformt aus Resten der inneren und äußeren Akrosommembran sowie der verbleibenden Plasmamembran, und bildet den Ausgangspunkt für die Fusion des Spermiums mit der Eizelle Bedford (1969). Die Fusion mit der Eizelle ist wahrscheinlich ein proteinvermittelter Prozess ähnlich der Virusfusion, wobei die daran beteiligten Proteine möglicherweise erst nach erfolgreicher Akrosomreaktion auf der Spermienoberfläche zugänglich sind Arts, et al. (1997).

Phospholipidvesikel, die negativ geladene Lipide enthalten, fusionieren nach erfolgreicher Akrosomreaktion fast ausschließlich mit dem Äquatorialsegment frisch ejakulierter Spermien vom Rind bzw. Menschen Arts, et al. (1993). Für Lipidanaloga, die im Äquatorialsegment von akrosomreagierten Humanspermien durch Fusion mit Phospholipidvesikeln eingebaut wurden, konnte eine Diffusionsschranke in der inneren und äußeren Membranlamelle nachgewiesen werden. Die Stabilität dieser Transmembranbarriere wird von der Anwesenheit bivalenter Kationen bestimmt. Es ist unklar, ob es sich um Proteinbarrieren oder andere Strukturen handelt Arts, et al. (1994).

Veränderungen in der Organisation der Membranlipide scheinen für das Erlangen der Befruchtungsfähigkeit Voraussetzung zu sein und beeinflussen entweder unmittelbar die Fusionskompetenz der Membran oder führen zu Modifikationen der Protein-Lipid-Wechselwirkungen.

1.5 Ziel der Arbeit

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Die transversale Asymmetrie der Phospholipide in der Zellmembran von Spermien wird durch die Aktivität einer APLT aufrecht gehalten. Dies gilt als wichtige Voraussetzung für die Homöostasis und die volle Funktionsfähigkeit der Zelle. Auch lateral findet man über die verschiedenen Strukturbereiche der Zelle (akrosomaler Bereich, Äquator, Postakrosom, Mittelstück, Schwanz) eine heterogene Organisation der Membran. Widersprüchlich sind hingegen die Ergebnisse zur Existenz von Lipiddomänen und Diffusionsbarrieren in der Zellmembran von Säugerspermien. Eine transversale und laterale Ungleichverteilung der Phospholipide in der äußeren Akrosommembran kann in Analogie zu sekretorischen Vesikeln des Trans-Golgi-Netzwerkes somatischer Zellen angenommen werden, wurde aber bisher nicht untersucht.

Zahlreiche Untersuchungen weisen auf eine transversale und laterale Umverteilung von Lipiden und Proteinen während der Kapazitation hin. Dies ist wahrscheinlich eine wesentliche Voraussetzung für die Schaffung fusogener Membrandomänen in der Zell- und Akrosommembran. Während man unter der Kapazitation einen bisher nicht klar zu definierenden Reifungsprozess ejakulierter Spermien versteht, ist die Akrosomreaktion relativ deutlich durch eine Membranfusion im akrosomalen Bereich des Spermienkopfes gekennzeichnet. Allgemein gilt die Akrosomreaktion als ein Exozytoseprozess, bei dem die zytoplasmatischen Seiten von Plasmamembran und äußerer Akrosommembran fusionieren.

Ausgangspunkt dieser Arbeit bildeten folgende Fragestellungen:

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Wird die bestehende Asymmetrie der Phospholipide der Plasmamembran lebender Spermien kapazitationsbedingt aufgehoben bzw. vermindert?

Findet eine schnelle, kalziumabhängige Umverteilung der Phospholipide in der Plasmamembran statt, die auf eine „Scramblase“-Aktivität schließen lässt?

Weisen die Phospholipide in der inneren und/oder der äußeren Akrosommembran eine transversale Asymmetrie auf?

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Ändert sich die transversale Organisation der Phospholipide in den Akrosommembranen während der Kapazitation?

Ist eine kapazitationsbedingte Änderung der Phospholipidorganisation in den untersuchten Spermienmembranen Voraussetzung für die folgende Akrosomreaktion und/oder die Wechselwirkungen mit den Eizellhüllen?

Wie sind die Phospholipide in den Fusionsvesikeln (zwischen Zell- und Akrosommembran) organisiert?

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Kann man daraus auf den Mechanismus des Fusionsprozesses schließen?

Existieren oder entstehen laterale Phospholipiddomäne in Zell- und Akrosommembran?


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17.08.2007